Введення в культуру in vitro тису ягідного (Taxus baccata L.) і отримання таксол-продукуючих калюсних ліній

Размещено на http://www.allbest.ru/

25

Національна Академія наук України

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ВВЕДЕННЯ В КУЛЬТУРУ IN VITRO ТИСУ ЯГІДНОГО (TAXUS BACCATA L.) І ОТРИМАННЯ ТАКСОЛ-ПРОДУКУЮЧИХ КАЛЮСНИХ ЛІНІЙ

03.00.22 - клітинна біологія

ФІЛОНОВА Лада Генріївна

Київ - 1999

Дисертацією є рукопис Робота виконана в Інституті клітинної біології і генетичної інженерії НАН України

Науковий керівник - член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук,Блюм Ярослав Борисович Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, заступник директора

Офіційні опоненти - член-кореспондент НАН України, доктор біологічних наук, професор, Кунах Віктор Анатолійович, Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, завідуючий відділ кандидат біологічних наук, ассистент кафедри фізіології та екології рослин Панюта Ольга Олександрівна,

Київський універсітет ім. Тараса Шевченка

Провідна установа - Центральний ботанічний сад імені М. М. ГришкаНАН України.

Захист відбудеться “22” квітня 1999 року о 14 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.202.01 при Інституті клітинної біології і генетичної інженерії НАН України за адресою:

252143, Київ, вул. академіка Заболотного, 148

З дисертацією можна ознайомитись у біібліотеці Інституту клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, Київ, вул. академіка Заболотного, 148.

Автореферат розісланий “17“ березня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої радиЛ. В. Тарасенко

АНОТАЦІЯ

Філонова Л.Г. Введення в культуру in vitro тису ягідного (Taxus baccata L.) і отримання таксол-продукуючих калюсних ліній. -- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 -- клітинна біологія. -- Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 1999.

Мета даної роботи -- вивчення закономірностей калюсоутворення та продукування протиракового препарату таксолу в культурах клітин тису ягідного (Taxus baccata L.).

Вивчено розподіл вмісту таксолу між окремими частинами рослин тису в 15-ти клонах T. baccata і 3-х клонах T. cuspidata. Встановлено міжклональну варіабельність вмісту таксолу в корі стовбура, річних клонах та хвої досліджуваних видів. Найбільший вміст таксолу та найменша його міжклональна варіабельність характерні для кори стовбура.

Розроблена методика отримання калюсу з вегетативних бруньок, пиляків, насіння та пагонів
T. baccata. Підібраний оптимальний склад поживних середовищ та умови культивування для кожного типу експлантів. Виявлено, що для культури тису баланс співвідношення амонію до нітрату важливіший, ніж загальний вміст неорганічного азоту в середовищі.

Гістологічний аналіз клітин тису показав, що найбільша проліферативна активність in vitro характерна для камбію і паренхіми флоеми.

Розроблена процедура культивування протопластів T. baccata. Мікроколонії проявляли проліферативну активність протягом перших 7-14 діб. Потім клітинний поділ припинявся, але мікроколонії зберігали життєздатність протягом 2-х тижнів.

Аналіз вмісту таксолу в отриманих калюсних лініях T. baccata за допомогою високоефективної рідинної хроматографії -- обернений варіант -- показав наявність у них речовини в кількостях, що характерні для рослин-донорів.

Отримані калюсні лінії T. baccata, що стабільно ростуть і зберігають біосинтетичну активність при тривалому культивуванні.

Ключові слова: тис ягідний (Taxus baccata L.), калюсна культура, протопласти, гістологічний аналіз, біосинтез таксолу.

Филонова Л. Г. Введение в культуру in vitro тисса ягодного (Taxus baccata L.) и получение таксол-продуцирующих каллусных линий. -- Рукопись.

АННОТАЦИЯ

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 -- клеточная биология. -- Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 1999.

Цель данной работы -- изучение закономерностей каллусообразования и продуцирования противоракового препарата -- таксола в культуре клеток тисса ягодного (T. baccata L.).

Изучено распределение содержания таксола между отдельными частями растений в 15-ти клонах T. baccata и 3-х клонах T. cuspidata. Установлена межклональная вариабельность содержания таксола в коре ствола, годичных побегах и хвои этих видов. Наибольшее содержание таксола и наименьшая его межклональная вариабельность характерны для коры ствола.

Разработана методика получения каллуса из вегетативных почек, пыльников и побегов T. baccata. Подобран оптимальный состав питательных сред и условия культивирования для каждого типа эксплантов. Установлено, что для культуры тисса баланс соотношения аммония к нитрату более важен, чем общее содержание неорганического азота в среде.

Гистологический анализ клеток тисса показал, что наибольшая пролиферативная активность in vitro характерна для камбия и паренхимы флоэмы.

Разработана процедура культивирования протопластов T. baccata. Микроколонии проявляли пролиферативную активность в течение 7-14 дней. Затем клеточное деление прекращалось, но микроколонии сохраняли жизнеспособность в течение 2-х недель. Анализ содержания таксола в полученных каллусных линиях T. baccata при помощи высокоэффективной жидкостной хроматографии показал наличие в них вещества в количествах, характерных для растений-доноров. Получены каллусные линии T. baccata, которые стабильно растут и сохраняют биосинтетическую активность при длительном культивировании. Ключевые слова: тисс ягодный (Taxus baccata L.), каллусная культура, протопласты, гистологический анализ, биосинтез таксола.

Filonova L. G. Introduction in vitro culture of Taxus baccata L. and obtaining of taxol produced callus lines. -- Manuscript.

Thesis for gaining a scientific degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 03.00.22 -- Cell Biology, Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy Science of Ukraine, Kiev, 1999.

The diterpenoid taxol belongs to the class of efficient antineoplastics drugs, taxoids. Taxol promotes abnormal microtubule assembly and stabilizes the previously formed microtubules. Further spindle formation is arrested. Due to this unique antimitotic mechanism, this natural compound has become a well known anticancer drug.

The only known source of taxol is from Taxus species. Family Taxaceae is represented by ancient slowly growing species with narrow natural habitats, and the levels of taxol production by intact plants do not exceed 0.1% on the dry weight basis. Large-scale exploitation of natural stands of Taxus spp. for taxol production will eventially lead to complete disappearance of these species. Development of alternative ways of taxol production is required to meet current demands of medicine. Cell culture of Taxus spp. attracts much attention as a promising alternative tool to produce sufficient amounts of taxol.

In Ukraine and other European countries, the only indigenously growing Taxus spp. is Taxus baccata L. Cell culture of T. baccata was studied less deeply, than other species. The aim of the present study is to describe peculiarities of callusogenesis and taxol production in vitro cultured cells of Common yew (Taxus baccata L.).

Distribution of taxol content in different parts of the plant has been analysed for 15 genotypes of T. baccata and 3 genotypes of T. cuspidata. The highest levels of taxol have been found in the bark, what is 10-fold higher than in the needles and one-year-old twigs. Concentration of taxol varies significantly depending on the genotype. The least variation has been demonstrated for the bark. Also, both T. baccata and T. cuspidata exhibited high interclonal variation of taxol content in three types of samples analysed. A veraged values of taxol content in two Taxus spp. differed significantly for needle samples only.

The culture protocols have been developed to establish callus cultures from different types of explants. The temporal pattern and frequency of callus formation from shoot segments, vegetative buds and pollen have been shown to be independent on the time of collecting plant material. In contrast, degree of seed maturity determines both parameters with the highest callusogenic activity occuring in September. Primary seed-originated callus was less susceptible to necrotic process than shoot-originated callus which, however, grew faster.

Five basal nutrient compositions routinely used for culturing coniferous species have been tested. The best medium was SH (Shenk, Hilderbrandt, 1972) showing 2 to 2.5 times higher frequency of callus formation (91%) compared to other media. Experiments have shown that ammonium/nitrate molar ratio is more important factor than the total concentration of inorganic nitrogen.

Optimization of the balance between exogenous auxin and cytokinin has shown that the use of NAA with or without cytokinin has no effect on induction of callusogenesis whereas combined application of cytokinin and 2.4-D exerted stimulatory effect.

The pattern of influence of plant growth regulators on cell proliferation was ambiguous, and depended on basal medium composition and plant genotype. Biomass increase, averaged over six growth regulator treatments and cell lines, originated from two genotypes of T. baccata, was higher on SH medium. Interestingly, cytokinins promoted growth of all long-term cell lines. Under the best culture conditions, biomass increase of some cell lines was as high as 350%, that corresponded to production of 3 g of fresh weight callus from a single stem segment within 3-week sybculture interval.

The callus started to develop after approximately 20 days for stem explants and after 50 days for seeds. Histological annalysis has revealed that the cambium and phloem of shoot explants are the primary tissues participating in callus formation. All the cell types of seed including even multinucleate gametophytic cells can dedifferentiate in vitro to give rise callus. Callus, originated from these cells was homogenous, whereas embryo-originated callus revealed zonal structure. The clear indications of xylogenesis in zygotic embryo-originated callus were found in areas of hypocotil and cotyledons. These early cell differentation events underlyng callusogenesis in yew are similar to with those found during adventitious bud formation in other coniferous species (e.g., spruce).

The procedure for T. baccata protoplast culture has been elaborated. Colonics of protoplasts held proliferative activity for the first 7 to 14 days of culture, followed by ceasing cell divisions without the loss of cell viability for the next 7 days.

The established culture procedure enabled to obtain stable-growing callus lines retaining biosynthetic activity under long-term subculturing. The level of taxol accumulation in callus lines of T. baccata checked well with the content of drug found in donor plants, and varied in the range of 0.0003-0.001%. When studying dynamics of the biosynthesis of taxol in peak at 28th day of culture. A strong positive correlation found between biomass increase and taxol accumulation level in callus cultures of T. baccata (R=0.9; p0.01) appears an adequate evidence of the need for preselection of fast growing cell lines for biotechnological production of taxol.

Key words: Taxus baccata L., callus culture, protoplasts, histological analysis, biosynthesis of taxol.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Представники родини тисових (Taxaceae) привертають до себе підвищену увагу вчених через їх здатність синтезувати таксол -- унікальний дитерпеновий алкалоїд, що характеризується особливим антимітотичним механізмом дії.

На відміну від антимітотичних агентів типу вінбластіну та колхіцину, які руйнують веретено поділу, таксол індукує утворення мікротрубочок, викликаючи незворотну полімеризацію молекул тубуліну, що блокує поділ клітини при переході в мітоз (Shiff et al., 1979). Хімічні аналоги і похідні таксолу, таксани, можуть проявляти подібну активність (Blechert et al., 1991).

Ці властивості зумовлюють підвищений інтерес до вивчення таксолу як представника протиракових препаратів нового покоління (Сragg et al., 1993). Дві його лікувальні форми -- таксол і доцетаксел -- уже сьогодні застосовуються в практичній онкології в більш ніж 50 країнах світу (Goldspiel, Kohler, 1994).

Вперше таксол був виділений із кори тису тихоокеанського Taxus brevifolia (Wani, Taylor, 1971). Вміст таксолу складає лише 0,0001-0,00001% від сухої маси матеріалу (Vidensek et al., 1971). Загальна ж потреба в таксолі тільки для лікування хворих, які страждають раком яєчників, вже найближчим часом складе близько 200 кг/рік (Stokigt, 1995), а для одержання 1 кг речовини необхідно 7200 кг кори 50-60-літніх дерев (умовно -- 2-3 дорослих дерева на пацієнта (Donovan, 1995).

Тис належить до древніх видів, що повільно ростуть, із вузькими ареалами поширення (Козубов, Муратова, 1986). Масова промислова експлуатація природних насаджень ставить під загрозу існування цієї цінної рослини, занесеної в списки видів, що охороняються. Найбільш рентабельним сьогодні є виділення попередників таксолу -- бакатину-III і диацетилбакатину-3 із хвої і паростків тису ягідного з подальшим синтезуванням з них таксолу (Donovan, 1995). Біотехнологія пропонує 2 альтернативних шляхи одержання таксолу: з культур групи таксол-синтезуючих грибів та з клітинної культури самого тису (Heinstein et al., 1994). Проте в культурі гриба таксол накопичується в незначних кількостях і його біосинтезом керувати складно (Jaziri et al., 1996). Культура клітин і тканин тису in vitro відкриває можливість розробки біотехнологічної системи, що поєднує в собі принципи ефективності і контролю біосинтезу таксолу (Shuler et al., 1992). Рослинні клітини можуть бути джерелом цілого спектру таксанів, що також мають антимітотичну активність.

За останні роки отримано калюсні та суспензійні культури деяких видів тису, насамперед T. brevifolia і T. cuspidata, і показано, що окремі калюсні лінії продукують таксол у кількостях, характерних для інтактних рослин (Fett-Neto et al., 1992; Wickremesinhe, Arteca, 1993), а в деяких випадках вміст таксолу в калюсних лініях переважає такий у вихідному матеріалі (Wiсkremesinhe et al., 1992). Складною залишається проблема стабілізації росту зовнішніх і розташованих всередині калюсної культури клітин тису, оскільки прогресуюче старіння in vitro, що властиве для всіх хвойних (Ширяєва та ін., 1992), особливо виражене для представників роду Taxus (Gibson et al., 1993; Fett-Neto et al., 1992).

В Україні у природних умовах росте тільки тис ягідний (Taxus baccata L.), прийоми культивування для якого не розроблені. Це й обумовило вибір нами T. baccata як головного досліджуваного об'єкта.

Мета роботи -- введення в культуру in vitro T. baccata і вивчення динаміки накопичення таксолу в калюсі. Відповідно до мети були поставлені конкретні завдання:

- визначити ступінь варіабельності вмісту таксолу в різних частинах рослин між окремими клонами у популяціях T. baccata і T. cuspidata, інтродукованих у Центральному ботанічному саду ім. М.М. Гришка НАН України;

- визначити умови для успішного культивування in vitro вегетативних і репродуктивних тканин і органів T. baccata;

- провести гістологічне дослідження особливостей будови пагона та насіння тису ягідного, а також змін структури в процесі дедиференціювання та проліферації клітин T. baccata in vitro;

- вивчити можливості одержання життєздатних протопластів T. baccata, що діляться;

- порівняти вміст таксолу в калюсі й у тканинах рослин-донорів.

Наукова новизна. Вперше проведено аналіз вмісту таксолу в популяції T. baccata, показано високий ступінь варіабельності вмісту речовини між клонами і частинами окремої рослини.

Встановлено пряму кореляцію між інтенсивністю проліферації клітин і вмістом таксолу в довготривало пасованих калюсних лініях. Вперше вивчена можливість одержання і культивування протопластів, показані спільні з іншими хвойними закономірності їх поведінки в культурі in vitro.

На підставі гістологічного аналізу формування калюсу з пагонів і насіння T. baccata отримана динаміка структурних змін різних тканин у процесі дедиференціювання клітин при індукції калюсогенезу.

Проведена робота -- перший в Україні досвід успішного отримання стабільних калюсних культур T. baccata, що містять таксол і мають стійку біосинтетичну активність.

Практична цінність роботи полягає в розробці методики введення в культуру in vitro T. baccata. Ефективність методики визначається можливістю широкого вибору типів експлантів, низькою частотою їх інфікування та високою частотою формування калюсу. Оптимізація умов культивування калюсу дозволила отримати довготривало пасовані калюсні лінії, що містять таксол. Розроблена методика виділення і культивування протопластів T. baccata дозволяє одержати життєздатні протопласти, що утворюють колонії.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації представлені у 14 публікаціях. Матеріали обговорювалися на: II з'їзді Укр. Товариства фiзiологiв рослин, Київ, 1993; VIII International Congress of International Association Plant Tissue Culture, Firenze, Italy, 1994; Simposium Plant. Cell, Tissus and Organ Culture in Liquid Media, Prague, 1994; 44th Annual Congress on Medicinal Plant Research, Prague, 1996; Simposium Principles Regulating Biosynthesis and Storage of Secondary Products, halle, 1996; XVIII Congress of SPPS the Scandinavian Society for Plant Physiology, Uppsala, Sweden, 1997; International Conference Problems and Perspectives of Biotechnology Development in ornamental Gardening and Horticnlture, Yalta, Ukraine, 1997; II International Symposium on Natural Drugs, Maratea, Italy, 1997; VII Международной конференции “Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда”, Москва, Россия, 1997.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 109 сторінках, включає 7 таблиць, 15 малюнків, містить вступ, три розділи (огляд літератури, експериментальну частину, результати та обговорення), заключення, висновки та список літератури, який включає 218 джерел.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ

Рослинний матеріал

Для введення в культуру in vitro використовували різні тканини й органи T. baccata із колекції дендрарію Центрального ботанічного саду ім. М.М. Гришка НАН України. Збір річних пагонів проводили щомісяця, вегетативних бруньок і пиляків -- у квітні-травні, насіння і арилусів -- щомісяця з червня по жовтень. В одному з експериментів використовували річні пагони двох чітко фенотипово відмінних генотипів T. baccata -- хлорофіл-дефектного (CD) і нормального щодо синтезу хлорофілу (N). Матеріал зберігався при +4С не більше, ніж три тижні.

Експланти стерилізували 9%-ним розчином гіпохлориту натрію (NaClО). Тривалість опрацювання розчином NaClО склала 60 хв. для сегментів пагонів довжиною 1,5-2 см; 15 хв. -- для вегетативних бруньок та очищених від насінної оболонки макрогаметофітів; 4-5 хв. -- для пиляків і арилусів. Рослинний матеріал поміщали в чашки Петрі діаметром 120 мм на агаризовані поживні середовища. У кожному досліді використовували не менше, ніж 50 експлантів кожного типу.

Поживні середовища і методи культивування

Для визначення оптимального мінерального складу поживного середовища пагони культивували на середовищах SH (Schenk, Hilderbrandt, 1972); МS (Murashige, Skoog, 1962); LP (von Arnold, Eriksson, 1982); B₅ (Gamborg et al., 1968); DBM2 -- РР (Gresshoff, Doy, 1972) з додаванням інозиту (50 мкМ), нікотинової кислоти (0,8 мкМ), піридоксину-HCl -- В₆ (0,5 мкМ), тіаміну-HCl -- В₁ (3 мкМ), 2,4-дихлорфеноксиоцтової кислоти (2,4-Д; 10 мкМ), кінетину (5 мкМ), 3% сахарози і 0,7% агару. Для культивування інших типів експлантів основним було середовище SH. Культури інкубували в темноті при 22-26С, пасували на свіжі середовища через кожні 2-3 тижні.

Вплив різних комбінацій ауксинів (2,4-Д і -нафтилоцтової кислоти -- НОК) і цитокінінів (6-бензиламінопурину -- БАП і кінетину) на індукцію та інтенсивність росту калюсу вивчався на калюсі, отриманому з пагонів і вегетативних бруньок. Як базове використовували середовище SH.

При вивченні впливу основного складу поживного середовища і його фітогормонального балансу на ріст довготривало пасованого калюсу з пагонів двох генотипів T. baccata як базове використовували середовище INM10 (Bozhkov et al., 1993) і SH. Обидва середовища були доповнені 7,4 мкМ В₁, 8,1 мкМ РР, 2,4 мкМ В₆, 0,55 мМ інозиту, 3 мМ глутаміну, 1 мМ аспарагіну і 2% сахарози. Калюс у даному експерименті був отриманий на середовищі SH із додаванням 5 мкМ 2,4-Д. Через 6 тижнів культивування калюс переносили на середовища SH і INM10 з додаванням 1% ПВП, 10 мкМ 2,4-Д, 1 мкМ НОК, 1 мкМ БАП, 1 мкМ кінетину в 12 різних комбінаціях.

Усі середовища стерилізували автоклавуванням. Розчини аспарагіну та глутаміну стерилізували за допомогою фільтрування через мембранні фільтри “Millipore” (США) з діаметром пор 0,45 мкм.

Гістологічний аналіз формування калюсу

В експерименті використовували частини пагонів та очищене насіння після 0, 7, 14 і 35 діб культивування на середовищі SH. Матеріал фіксували хром-ацето-формолом (10:1:4) за Навашиним (1985), дальшу обробку проводили за методикою Паушевої (1970). Препарати фарбували реактивом Шиффа за Фельгеном з підфарбовуванням світлим зеленим.

Виділення і культивування протопластів

Протопласти виділяли з первинного (вік 3 тижні) і довготривало пасованого калюсу (вік 27 тижнів). Ферментний розчин містив 0,4 М сахарози, 0,2 М глюкози,
5 мМ CaCl₂, 0,5% сироваткового альбуміну (БСА), 0,5% пектинази і 1% целюлази "Onozuka". Протопласти відмивали сумішшю такого ж складу із додаванням 0,7 мМ NaH₂PO₄ без БСА. Всі розчини готували на 3 мМ розчині фосфатного буферу або 2-N-морфоліноетансульфонової кислоти (МЕС), рН 5,9. Ферментний склад і базовий розчин були модифіковані на основі запропонованих для виділення протопластів Pinus oocarpa (Laine et al., 1988), P. banksiana (Tautorus et al., 1990) і P. contorta (Hakman, von Arnold, 1983).

Після 12-15 год. інкубації калюсу в розчині ферментів при температурі 25С в інкубаційну суміш, що складалася з протопластів і фрагментів калюсу, добавляли такий же об'єм розчинника ферменту. Отриманий розчин піддавався грубому очищенню через капроновий фільтр (300 мкм). Фільтрат переносили у пробірку, поверх нашаровували 1 мл 0,5%-ного розчину сахарози і центрифугували 4-5 хв. Прошарок протопластів відбирали стерильною піпеткою, поміщали в іншу пробірку і добавляли суміш для відмивання. Гомогенат центрифугували протягом 5 хв. Осад поміщали в рідке поживне середовище SH, модифіковане шляхом збільшення вмісту CaCl₂ до 5 мМ і додаванням 0,4 М маніту та 0,2 М сорбіту (рН 5,9).

Протопласти культивували в темноті в чашках Петрі (діам. 40 мм) при 26С. Культуру розбавляли через кожні 10-14 днів свіжим поживним середовищем того ж складу, але із зменшеною вдвічі концентрацією осмотиків, у пропорції 1:1. Прижиттєве фарбування здійснювали трепановим синім. Підрахунок отриманих протопластів проводили в камері Горяєва.

Аналіз росту і розвитки культур

У зв'язку з різними термінами індукції калюсу з різних типів експлантів частоту калюсогенезу визначали через 4 тижні культивування для відрізків пагонів і через 6 тижнів -- для вегетативних бруньок і макрогаметофітів (тобто через 2 тижні після ініціації калюсу), як процентне співвідношення кількості експлантів із калюсом до загальної кількості експлантів. У випадку генотипів N і CD приріст калюсу визначався за 3-тижневий пасаж після 24 тижнів культивування, як [(кінцева сира маса) -- (початкова сира маса)/ початкова сира маса] x100%.

Аналіз вмісту таксолу за допомогою високоефективної рідинної хроматографії (ВЕРХ)

Для визначення вмісту таксолу всі зразки піддавали конвекційному висушуванню при 35С (настоювання 2 доби). Потім зразки тричі екстрагували при кімнатній температурі в 10 мл сухого ацетону, екстракти поєднували й ацетон випаровували в потоці азоту. Отриманий сухий залишок тричі обробляли по 2 мл гексану. Гексанові витяжки відкидали, осад перерозчиняли в 2 мл 90%-ного метанолу. Потім препарат тричі екстрагували по 2 мл сухого хлороформу. Хлороформні витяжки об'єднували. Після випаровування розчинника в потоці азоту залишок розчиняли в 2 мл ацетонітрилу. Розчин фільтрували і використовували для аналізу вмісту таксолу за допомогою ВЕРХ.

Вміст таксолу в отриманих екстрактах визначали методом високоефективної рідинної хроматографії (обернено-фазовий варіант) на рідинному хроматографі "Міліхром-4" (Орел, Росія), використовуючи колонку 2x80 мм, заповнену SEPARON-SGX-RP/S, 5 мкм. Швидкість елюювання -- 50 мкл/хв., об'єм проби -- 2 мкл.

Для елюювання використовували ступінчатий градієнт ацетонітрилу (фаза В) у 20 мМ водного розчину ортофосфорної кислоти (фаза А): 2 хв. -- 0% В в А; 2 хв. -- 17% В в А; 4 хв. -- 33%; 6 хв. -- 50%; 6 хв. -- 67%; 4 хв. -- 83%; 20 хв. -- 100% В.

З метою максимального відслідковування УФ-поглинання таксолу детектування проводилося по 5 каналах на довжинах хвиль 202, 212, 228, 270, 300 нм. Для оцінки вмісту таксолу в зразках використовували метод абсолютного калібрування для концентрацій 0,01, 0,05 і 1 мг/л стандарту. Опрацювання хроматограм і розрахунок площі піків, що відповідають таксолу, проводили з використанням програми Мультихром 2,6 ("Мультихром", Москва, Росія) на довжині хвилі 228 нм (другий максимум поглинання таксолу).

Статистичне опрацювання результатів

Експерименти проводили в 2-3-кратній повторності, у кожному використовувалося не менше 50 експлантів кожного типу. Всі цифрові дані подані у вигляді: середнє (x) середнє квадратичне відхилення (Sx).

Похибка аналітичного визначення таксолу не перевищувала 20%.

РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ

Аналіз вмісту таксолу в інтактних рослинах

В експерименті використовувались весняна хвоя, річні пагони і кора нижньої частини стовбура 15-ти клонів T. baccata і 3-х клонів T. cuspidata із колекції дендрарію ЦБС ім. М.М. Гришка НАН України, зібрані одночасно (табл. 1).

Таблиця 1. Характеристика рослинних зразків

Вид	T. baccata	T. cuspidata
клон	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12	13	14	15	16	17	18
к-ть дерев у клоні	6	1	3	4	4	6	6	8	1	6	9	1	2	4	5	1	9	1

За вмістом таксолу проаналізовані нами клони можна умовно розділити на чотири групи (мал. 1):

1) клони, для яких характерний приблизно однаковий вміст таксолу в стеблах і хвої (2, 4, 8, 12, 15, 17);

2) клони з мінімальним вмістом таксолу в пагонах (5, 6, 9, 10, 11, 13, 18);

3) клони з мінімальним вмістом таксолу в хвої (1, 14);

4) клони, для яких характерна наявність таксолу тільки в корі (3).

Наявні в нашому розпорядженні клони T. baccata, подібно до T. brevifolia (Videncek et al., 1990; Fett-Neto et al., 1992), містили максимальну кількість таксолу в корі стовбура, яка була на порядок вищою, ніж у пагонах і хвої. Для клонів T. cuspidata виявлена подібна тенденція, що суперечить висновкам більшості авторів, які відзначають максимальне накопичення речовини у хвої (Witherup et al., 1990; Kwak et al., 1995). Однак, всі наявні роботи присвячені вивченню вмісту таксoлу в рослинах, відібраних в ареалах їх природного зростання. З огляду на значний вплив умов зростання на процеси синтезу і накопичення таксoлу (Wheeler et al., 1992; Kwak et al., 1995), можна припустити, що переважне його накопичення в корі T. cuspidata у нашому випадку пов'язане з інтродукцією рослини в Україну. Виявлена значна варіабельність вмісту таксолу між різними тканинами в межах одного клону (мал. 1). Це не дає можливості виділити окремий клон-суперпродуцент таксолу, що відзначалося і раніше при вивченні популяцій T. brevifolia і T. cuspidata (Wheeler et al., 1992; Choi et al., 1995).

Найменша варіабельність характерна для кори стовбура. Відзначена також висока міжклональна варіабельність вмісту таксолу в обох видів у всіх трьох типах зразків (мал. 1).

При порівнянні середніх значень вмісту таксолу в корі, хвої та однорічних пагонах двох видів тису статистично значуща різниця виявлена лише у випадку хвої (табл. 2).

Таблиця 2 Середня оцінка вмісту таксолу в різних частинах рослин T. baccata і T. cuspidada

Вид	Вміст таксолу, % сухої маси*
	кора	пагони	хвоя
T. baccata	0,0114+0,0015a	0,0005+0,0001a	0,001+0,0002б
T. cuspidata	0,0149+0,0024a	0,0007+ 0. 0002a	0,0027+0,0002a

* -- середні значення в стовпчиках, що супроводжуються однаковими буквами, відрізняються несуттєво при <=0,05 (t-тест).

Виявлено незначну позитивну кореляцію між вмістом таксолу в корі і хвої T. baccata (R=0,5).

Індукція калюсу з експлантів T. baccata різного походження

Вивчена здатність до калюсоутворення із вегетативних бруньок, пиляків, насіння і відрізків пагонів T. baccata. Утворення калюсу на відрізках пагонів, бруньках і пиляках починалося на 15-30 добу культивування, з насіння --
на 40-60 добу, залежно від ступеня його зрілості. Інтенсивне калюсоутворення спостерігалося лише в базальній основі бруньок та на брунькових лусочках і не відбувалося з апікальної меристеми. При культивуванні пиляків калюс також формувався на пилякових нитках. Калюсоутворення з пилкових зерен не спостерігалося.

Терміни індукції утворення калюсу і частота калюсогенезу з вегетативних органів не залежали від часу їх збору. У випадку введення в культуру очищеного від щільної шкірки насіння максимальна частота калюсоутворення спостерігалася у зрілого насіння осінніх зборів. Аналогічні результати були отримані протягом трьох років. Найбільш калюсогенними виявилися відрізки річних пагонів.

При порівнянні шести поживних середовищ, що традиційно використовуються для культивування хвойних, кращим для індукції калюсу з пагонів виявилося середовище SH, частота калюсоутворення на якому складала у середньому 91% (табл. 3). Частота калюсоутворення на середовищах МS, DBM-2 і В5 була в 2-2,5 раза нижча. Найменша частота відзначалася на середовищі LP (табл. 3).

Як відомо, співвідношення NH₄⁺/NO₃^- і сумарна кількість неорганічного азоту в складі поживного середовища значно впливають на процеси проліферації тканин in vitro (Durzan et al., 1982). У нашому експерименті найвищий відсоток калюсогенезу спостерігався на середовищах SH і В5, співвідношення NH₄⁺/NO₃^- в яких складало 0,1 при загальному вмісті неорганічного азоту 27 мМ в обох середовищах. На середовищах MS і DBM-2 співвідношення NH₄⁺/NO₃^-складало 0,5, на середовищі LP -- 0,4, при значних розходженнях у загальному вмісті азоту: 60, 38 і 26 мМ відповідно. Тобто, у випадку культивування тису баланс співвідношення амонію до нітрату важливіший, ніж загальна кількість азоту в середовищі.

Таблиця 3 Індукція калюсу з пагонів T. baccata на поживних середовищах різного складу

Поживне середовище	SH	MS	DBM-2	LP	B5
Кількість експлантів	465	184	196	100	261
Частота калюсогенезу, %	916,2	352,0	251,6	3,60,18	406,1

В експерименті щодо впливу типу і співвідношення ауксинів і цитокінінів на індукцію калюсу у випадку використання НОК були отримані однакові результати як при додаванні цитокініну в середовище, так і при його відсутності (табл. 4). Спільне використання кінетину і сильнішого ауксину -- 2,4-Д -- давало значний позитивний ефект.

Таблиця 4. Вплив екзогенних регуляторів росту на калюсогенез у культурі вегетативних бруньок T. baccata

№	Регулятори росту, мкМ	Частота
експ.	2,4-Д	НОК	БАП	Кін	калюсогенезу, %
1	10	-	-	-	33б11*
2	10	-	1,0	-	26б2
3	10	-	-	1,0	81а14
4	-	10	-	-	90а17
5	-	10	1,0	-	94а17
6	-	-	10	-	33б4
7	-	-	10	-	22б7

* -- середні значення, що супроводжуються спільними буквами, відрізняються несуттєво при 1%-ному рівні значущості.

Примітка. У експ. № 6 проводилася індукційна обробка 10 мкМ БАП протягом діб із наступним пасуванням на середовище експ. № 2. У експ. № 7 проводилася та ж обробка з наступним пасуванням на середовище експ. № 3.

Попереднє культивування бруньок на середовищі з 10 мкМ БАП протягом п'яти діб із наступним пасуванням на середовище з ауксином і цитокініном не дало позитивних результатів (табл. 4), як це мало місце при ініціації калюсогенезу в інших хвойних (Attree et al., 1990; Lelu et al., 1990). Перенесення калюсу на середовище без фітогормонів призводило до припинення його росту та швидкого старіння.

Гістологічний аналіз калюсоутворення з пагонів і насіння T. baccata

Емпіричний добір умов для одержання стабільної калюсної культури тису, що продукує таксол, може виявитися малоефективним без точних знань регуляторних механізмів біосинтезу на молекулярному, клітинному і тканинному рівнях. Це потребує з'ясування гістологічних особливостей калюсогенезу, пов'язаного з дедиференціюванням окремих клітин експланту. Проте, дослідженням ембріології та анатомії тисових приділяється мало уваги, і таких робіт мало (Eckenwalder, 1976; Wang et al., 1979; Brukhin, Bozhkov, 1996). Такою ж фрагментарною є інформація про проліферативну активність різних тканин і органів представників роду Taxus in vitro (Le Page-Degivry et al., 1973; Rohr, 1973, 1982; Monacelli et al., 1995). Це і стимулювало нас до вивчення гістологічних особливостей утворення калюсу в тису.

Основний об'єм пагона займає масивна серцевина; вторинна ксилема не містить справжніх судин і складається з трахеїд з облямованими порами, зібраними в промені, що характерно для всіх хвойних (мал. 2а). Формування калюсу на відрізках пагонів починається на ділянках експланту, що не контактують із поживним середовищем, приблизно на 20-30 добу. Спочатку калюс утворюється з паренхімних клітин кори, клітини витягуються і збільшуються в розмірах до 12-14 мкм, і їх розташування стає більш пухким (мал. 2б). Пізніше в калюсоутворенні беруть участь клітини камбію, а також паренхіма флоеми і навіть ксилеми (мал. 2 в, г). Розмір клітин у паренхімних променях складає в середньому 2 мкм, у калюсі паренхімного походження -- до 5 мкм. Трахеїди стискаються променевими клітинами, що розростаються, і участі в калюсогенезі не беруть. Найбільшу проліферативну активність in vitro у вегетативних тканин тису мають камбій і паренхіма флоеми (мал. 2 в, г). Цим пояснюється той факт, що у випадку введення в культуру пиляків і бруньок, калюс утворювався тільки з нитки пиляка і базальної основи бруньки. Найбільш калюсогенним типом експлантів виявилися, відповідно, молоді пагони, камбіальний прошарок і зона флоеми.

У макрогаметофітах T. baccata виявлено тканинну зональність, характерну для незрілого насіння всіх видів хвойних (мал. 3а). Більшість клітин макрогаметофіту багатоядерні, що властиво тільки для древніх видів хвойних, наприклад, для модрини (Тренін, 1988) (мал. 3б). Калюс із макрогаметофіту порівняно однорідний, його консистенція пухка, калюсні клітини мають округлу або овальну форму (d=10 мкм) та звивисті оболонки; основний об'єм клітин займає вакуоля (мал. 3в).

Зародок тису має дві сім'ядолі (мал. 3г). У формуванні зародкового калюсу беруть участь клітини всіх частин зародка, особливо клітини сім'ядолей і гіпокотиля. На відміну від порівняно однорідного калюсу з макрогаметофіту у зародковому калюсі виділяються зони великих за розміром (d=11 мкм) клітин, що неорганізовано розташовані в області гіпокотиля, і дрібніших (d=8 мкм) клітин, впорядковано розташованих в області сім'ядолей (мал. 3д). Останні утворюють щільну тканину, в якій виявляються чіткі ознаки ксилогенезу у вигляді утворення трахеїд (мал. 3е).

Подібне явище було описано у випадку культивування ізольованих зародків ялини європейської (Лебеденко та ін., 1992). Очевидно, що ранні клітинні процеси адвентивного органогенезу в ялини і калюсоутворення в тису подібні.

Стабілізація росту довготривало пасованого калюсу

Складність одержання життєздатних довготривало пасованих клітинних ліній у хвойних пов'язана зі швидким старінням клітин in vitro (Ширяєва та ін., 1991). 24-тижневе культивування CD і N генотипів T. baccata на середовищах SH і INM-10 показало, що середовище INM-10 забезпечує вищу підтримуючу здатність, оскільки спричинює меншу секрецію фенолів. Проте, приріст біомаси (за середніми даними для шести варіантів комбінацій регуляторів росту) обох генотипів на середовищі SH був значно вищим, хоча калюс на цьому середовищі у більшій мірі піддавався некрозу (мал. 4). Приріст біомаси калюсу генотипу N на середовищі SH із 1 мкМ НОК складав 350%, що відповідало утворенню приблизно 3 г калюсу за один тритижневий пасаж (мал. 4).

Отримані нами дані щодо впливу фітогормонального балансу на ріст калюсу CD і N генотипів дуже суперечливі і залежать як від складу основного поживного середовища, так і від генотипу. Так, найвищий приріст біомаси відзначався при культивуванні генотипу CD на середовищі SH із додаванням 10 мкМ НОК або на середовищі INM-10 із додаванням 10 мкМ НОК і 1 мкМ кінетину. Калюс генотипу N ріс краще на середовищі SH, доповненому 10 мкМ 2,4-Д або 1 мкМ НОК і 1 мкМ кінетину, і на середовищі INM10, доповненому 10 мкМ 2,4-Д і 1 мкМ кінетину.

Загальних тенденцій, як і у випадку з T. brevifolia (Gibson et al., 1993), виявити не вдалося. Таким чином, необхідний індивідуальний підбір фітогормонів для кожної клітинної лінії тису.

Отримання протопластів тису

Феномен проліферації клітин тису, що характеризуються здатністю синтезувати речовину сильний цитостатик, дотепер залишається невивченим. Адекватною моделлю для вивчення цього явища може служити культура протопластів. Розроблена нами методика дозволила одержати життєздатні протопласти тису, що діляться (мал. 5а).

Перші клітинні поділи спостерігалися на 3-5 добу культивування (мал. 5б). Ріст мікроколоній продовжувався протягом 7-14 діб, потім клітинні поділи припинялися, але мікроколонії зберігали життєздатність протягом щонайменше 2-х тижнів (мал. 5в, г).

Подібна динаміка була описана для культур протопластів Pinus pinaster (Faye, David, 1993), P. contorta (Hakman, von Arnold, 1983) і Pseudotsuga menziesii (Kirby, Cheng, 1979). На відміну від покритонасінних, тривало життєздатними та мітотично активними у хвойних є тільки мікроколонії клітин, отримані через протопласти ембріогенного калюсу (Attree et al., 1989). Розроблена нами методика отримання протопластів T. baccata може використовуватися для вивчення питань динаміки внутрішньоклітинного біосинтезу і компартменталізації таксолу.

Аналіз вмісту таксолу в калюсних лініях

Аналіз отриманих нами клітинних ліній T. baccata за допомогою методу ВЕРХ показав присутність у них таксолу в кількостях, характерних для інтактних пагонів, з яких ці лінії були отримані (табл. 5).

Таблиця 5. Порівняння вмісту таксолу в рослинній сировині і калюсі пагонового походження (вік калюсу -- 35 діб)

	Вміст таксолу, %
№ генотипу	Інтактні рослини	Пагоновий
	кора	пагони	хвоя	калюс
1	0,0034	0,0006	0,0002	0,0005
4	0,0047	0,0005	0,0004	0,0012
7	0,0135	0,0004	0,0011	0,0009
18	0,0116	0,0007	0,0008	0,0013

Вивчено також динаміку біосинтезу таксолу в первинній культурі пагонового походження, яка не пересаджувалась. Пік накопичення таксолу спостерігався на 28 добу культивування (мал. 6). Саме так був визначений приблизний термін нарощування біомаси, що містить таксол, при двоетапному культивуванні. На першому етапі такого культивування, коли баланс між біосинтетичною активністю і ростом біомаси зміщений у бік останнього (Fett-Neto et al., 1993), доцільно використовувати різні стимулятори росту біомаси (Collins-Pavao et al., 1996; Jha et al., 1998). Другий етап припускає стимулювання підвищеного синтезу таксанів за допомогою неорганічних і органічних еліситорів (Collins-Pavao et al., 1996; Jaziri et al., 1996).

Розроблена нами методика культивування дозволила одержати калюсні лінії, що стабільно ростуть і зберігають біосинтетичну активність при тривалому культивуванні. Вміст таксолу в калюсних тканинах генотипів N і CD варіював у межах 0,0003-0,001% від сухої маси (табл. 6) і був вищим у калюсі генотипу CD, що швидко росте при культивуванні як на середовищі SH, так і на середовищі INM-10 (обидва середовища містили 10 мкМ НОК). Регресивний аналіз показав значну позитивну кореляцію (R=0,9; p=0,01) між інтенсивністю росту калюсу та вмістом таксолу. Між рівнем вмісту таксолу та інтенсивністю проліферації калюсу в таких лініях існує сильна позитивна кореляція (R=0,9)

Таблиця 6. Вміст таксолу в довготривало пасованих калюсних тканинах генотипів N і CD на середовищах SH і INM-10 (27 тижнів культивування)

Основне середовище	Генотип	Вміст таксолу, %
SHm-2	CD	0,0010
SHm-2	N	0,0006
INM-10	CD	0,0009
INM-10	N	0,0003

Дуже важливим, на наш погляд, є той факт, що у довготривало пасованих калюсних тканинах T. baccata рівень вмісту таксолу істотно не знижується. Тому виправданим може бути селективний добір метаболічно активних популяцій клітин на ранніх стадіях культивування.

ягідний тис протираковий препарат таксон

ВИСНОВКИ

1. Досліджено розподіл таксолу між окремими частинами рослин тису в 15-ти клонах T. baccata і 3-х клонах T. cuspidata. Виявлено, що у корі стовбура кількість цього дитерпеноїда на порядок вища, ніж у хвої та однорічних пагонах. Встановлено високу між- та внутрішньоклональну варіабельність вмісту таксолу в корі стовбура, річних пагонах і хвої T. baccata і T. cuspidata.

2. Вивчена здатність до калюсоутворення різних тканин і органів T. baccata. Найбільш калюсогенними виявились відрізки річних пагонів. Інтенсивне калюсоутворення спостерігалось лише в базальній основі бруньок та на брунькових лусочках. Калюсоутворення з пилкових зерен не відбувалося, формування калюсу спостерігалось лише на тичинкових нитках.

3. Підібрані оптимальні умови культивування та склад поживних середовищ для отримання довготривало пасованих калюсних ліній T. baccata. Виявлено, що для культури тису баланс співвідношення амонію до нітрату важливіший, ніж загальний вміст неорганічного азоту в середовищі.

4. Гістологічний аналіз показав, що у формуванні калюсу з вегетативних тканин T. baccata беруть участь клітини камбію та паренхіми флоеми, чим і пояснюється максимальна калюсогенна активність однорічних пагонів рослин і формування калюсу лише на тичинкових нитках та базальній основі бруньок. У калюсоутворенні з насіння беруть участь клітини макрогаметофіта, більшість з яких багатоядерні.

5. Вперше розроблена методика виділення та культивування життєздатних протопластів, T. baccata, які діляться. Виявлено, що довготривало пасований калюс є кращим джерелом протопластів, ніж первинний. Дана методика може бути використана для вивчення питань внутрішньоклітинного синтезу і локалізації таксолу.

6. Вміст таксолу в калюсі T. baccata відповідає кількості речовини у вихідному рослинному матеріалі. Біосинтетична активність калюсу зберігалася при тривалому культивуванні. Виявлена значна позитивна кореляція між інтенсивністю росту та рівнем вмісту в ньому таксолу.

Матеріали дисертації подані в 14 публікаціях

1. Филонова Л. Г., Малышева Л. В, Блюм Я. Б. Особенности регуляции каллусогенеза и биосинтез таксола in vitro у тисса ягодного // Биотехнология. -- 1996.-- №8. -- С. 38-44.

2. Brukhin V. B., Moleva I. R., Filonova L. H., Grakhov V. P., Blume Ya. B., Bozhkov P. V. Proliferative activity of callus cultures of Taxus baccata L. in relation to anticancer diterpenoid taxol biosynthesis // Biotechnology Letters. -- 1996. -- V. 18, № 11. -- P. 1309-1314.

3. Філонова Л. Г., Блюм Я. Б. Отримання таксолу в культурі тканин in vitro тису ягідного (Taxus baccata L.) // “Наукові записки” Тернопільского державного педагогічного університету імені Володимира Гнатюка. Серія 4: Біологія, №4; 1999. -- С. 89-94.

4. Малышева Л. В., Филонова Л. Г., Хведынич О. А., Блюм Я. Б. Цитологическая характеристика формирования каллусной ткани у тисса ягодного, Taxus baccata L. 1. Индукция каллуса из побегов // Цитология. -- 1999. -- 42, №2. -- С. 150-154.

5. Филонова Л. Г., Грахов В. П., Малышева Л. В., Блюм Я. Б. Внутри- и межклональная вариабельность содержания паклитаксела у двох видов тисса // ДАН Украины. -- 1999. -- №4. С. 132-134.

6. Філонова Л.Г.,. Малишева Л.В, Блюм Я.Б.. Особливості введення в культуру in vitro представників роду Taxus // Тези доп. ІІ з'їзду Укр. т-ва фізіологів рослин. -- Київ, 1993. -- Т. 2. -- С. 114-115.

7. Malysheva L. V., Filonova L. G., Blume Ya. B.. In vitro culture of common yew // VIII International of Congress of International Association Plant Tissue Culture, Firenze, Yune 12-14, Italy, 1994. -- P. 24.

8. Filonova L. G., Grakhov V. P., Malysheva L. V., Blume Ya. B.. Taxus baccata сell Cсlture as a source of taxol // Symposium Plant Cell, Tissus and Organ Culture in Liquid Media, Prague, Yuly 8-11, Czech Republic, 1994. -- P. 87-89.

9. Malysheva L. V., Filonova L. G., Blume Ya. B. Callus culture from the buds of Taxus baccata:induction and maintenance // 44^th Annual Congress on Medicinal Plant Research, Prague, Sept. 3-7, 1996. -- P. 91.

10. Malysheva L. V., Filonova L. G., Blume Ya. B. Studies on the cytological origin of the calli induced on stems and seeds of Taxus baccata L. // Symposium Principles Regulating Biosynthesis and Storage of Secondary Products, Halle, Sept. 26-28, 1996. -- P. 34.

11. Filonova L., Malysheva L., Grakhov V., Brukhin V., Bozhkov P., Blume Ya. Genetic and non-genetic control over biosynthesis of taxol in Taxus baccata L. // XVIII Congress of SPPS the Scandinavian Society for Plant Physiology, Uppsala, Sweden, Yune 12-17, 1997. -- P. 192.

12. Filonova L. G., Malysheva L. V., Khedynich O. A., Blume Ya. B. On proliferative activity of tissues and organs of Taxus baccata L. cultured in vitro // International Conference Problems and Perspectives of biotechnology Development in ornamental Gardening and Horticulture, Yalta, Ukraine, Sept. 25-26, 1997. -- P. 61.

13. Lada Filonova and Peter Bozhkov. From in vitro Cultured Taxus Celes to Production of Anticancer Drug Paclitaxel: Passed way and met obstacles. Second International Symposium on Natural Drugs, Maratea. Italy, Sept. 28-October 1. 1997. -- P. 29.

14. Филонова Л. Г., Малышева Л. В., Хведынич О. А., Блюм Я. Б. Пролиферативная активность in vitro тканей и органов // Тезисы докладов VII Международной конференции “Биология клеток растений
in vitro, биотехнология и сохранения генофонда”. -- Москва, Россия, 25-28 ноября 1997. -- С. 175.

Размещено на Allbest.ru

...