Розробка методу діагностики інфекційного ларинготрахеїту і хвороби Ньюкасла за допомогою флуоресцентних зондів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська академія аграрних наук

Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини

УДК 619:616.98:578.825.1:616.98:578.831.1:616-076

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Розробка методу діагностики інфекційного ларинготрахеїту та хвороби Ньюкасла за допомогою флуоресцентних зондів

Біла Наталія Валеріївна

Харків - 1999

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: доктор ветеринарних наук, професор Бабкін Валерій Федорович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії індикації збудників інфекційних захворювань

Офіційні опоненти:

- доктор ветеринарних наук, професор, академік УААН Красніков Геннадій Андрійович, Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, завідувач лабораторії патоморфології

- кандидат ветеринарних наук Панікар Ігор Ігоревич, Полтавський державний сільськогосподарський інститут, в. о. доцента кафедри інфекційної патології

Провідна установа: Білоцерківський державний аграрний університет Міністерства агропромислового комплексу України, кафедра мікробіології, вірусології та зоології, м. Біла Церква

Захист відбудеться "22" червня 1999 р. о 17-00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01 при Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН (310023, Харків-23, вул. Пушкінська, 83)

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН (310023, Харків-23, вул. Пушкінська, 83).

Автореферат розісланий "20" травня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор ветеринарних наук, професор Конаржевський К.Є.

Анотації

Біла Н.В. Розробка методу діагностики інфекційного ларинготрахеїту і хвороби Ньюкасла за допомогою флуоресцентних зондів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Інститут експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, Харків, 1999.

Дисертація присвячена розробці методу флуоресцентних зондів для діагностики інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби. У роботі вперше досліджено накопичення вірусу інфекційного ларинготрахеїту і вірусу ньюкаслської хвороби при співкультивуванні на курячих ембріонах. Для діагностики асоційованих інфекцій у курей використано метод флуоресцентних зондів. Вперше розроблено і запропоновано спосіб використання флуоресцентного зонду ДСП-13 з метою виявлення збудників інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби птиці. Отримані результати вивчення особливостей культивування вірусу інфекційного ларинготрахеїту на курячих ембріонах були використані при конструюванні живої ліофілізованої вакцини зі штаму ВНДІХП-У проти інфекційного ларинготрахеїту.

Показано, що метод флуоресцентних зондів дозволяє значно прискорити індикацію збудників інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби птиці у порівнянні з іншими лабораторними тестами.

Ключові слова: птиця, інфекційний ларинготрахеїт, ньюкаслська хвороба, флуоресцентний зонд, діагностика, співкультивування, біологічні властивості.

Белая Н.В. Разработка метода диагностики инфекционного ларинготрахеита и болезни Ньюкасла с помощью флуоресцентных зондов. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03. - ветеринарная микробиология и вирусология. - Институт экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, Харьков, 1999.

Диссертация посвящена разработке метода флуоресцентных зондов для диагностики инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни.

В работе впервые в Украине для диагностики ассоциированных инфекций (ИЛТ и НБ) у кур использован метод флуоресцентных зондов. При этом показано, что из исследованных 10 новых флуоресцентных зондов, с учётом фотометрических показателей, наиболее приемлемым для индикации и идентификации возбудителей инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни является ДСП-13.

При использовании указанного зонда для диагностики инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни определена его конечная концентрация (20 мкМ), а также выведен статистически достоверный показатель снижения интенсивности флюоресценции проб при взаимодействии со специфическими сыворотками (К), который равнялся 1,5.

Изучена динамика и особенности накопления вирусов инфекционного ларинготрахеита и ньюкаслской болезни при сокультивировании на развивающихся куриных эмбрионах. При этом констатировано выраженное отставание в росте и развитии куриных эмбрионов, зараженных обоими вирусами в сравнении с теми, которые были инфицированы только одним из них, а также отсутствие интерференции во время их репликации по уровню гемагглютинирующих титров.

Определены биологические свойства вируса инфекционного ларинготрахеита при культивировании его на развивающихся куриных эмбрионах. При этом установлено следующее.

1. Особенности макроскопических изменений на ХАО, вызванные размножением возбудителя, зависят от дозы заражения и штамма вируса.

2. Патогенность является стабильным признаком как для вакцинного, так и вирулентного штамма вируса инфекционного ларинготрахеита.

3. Репродуктивные свойства вируса инфекционного ларинготрахеита оптимизируются при культивировании его при +39 С.

4. На протяжении 3 пассажей происходило нарастание гемагглютинирующей активности возбудителя инфекционного ларинготрахеита с последующей ее стабилизацией.

Полученные результаты изучения особенностей культивирования вируса инфекционного ларинготрахеита на куриных эмбрионах были использованы для конструирования живой лиофилизированной вакцины из штамма ВНИИБП-У против инфекционного ларинготрахеита (ТУ У 46.15.304-98).

Таким образом, можно сделать вывод, что данный тест обладает высокой специфичностью и чувствительностью, является экспрессным, характеризуется стабильностью воспроизведения, что обуславливает его практическую значимость.

Ключевые слова: птица, инфекционный ларинготрахеит, ньюкаслская болезнь, флуоресцентный зонд, диагностика, сокультивование, биологические свойства.

Belaya N. V. The development of the method of infectious laryngotracheitis and Newcastle disease diagnosis by means of fluorescent probe. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree in veterinary sciences by speciality 16.00.03. - Veterinary microbiology and virology. - Institute of experimental and clinical veterinary medicine UAAS, Kharkov, 1999.

The dissertation is devoted to the development of the method of fluorescent probe for the diagnosis of infectious laryngotracheitis and Newcastle disease. The accumulation of infectious laryngotracheitis virus and Newcastle disease virus under condition of co-cultivation on the chicken - embryos has been investigation first. The method of fluorescent probes has been used for diagnosis of associated infections in hens. It has been developed and proposed the new fluorescent probe DSP-13 for the detection of infectious laryngotracheitis and Newcastle disease agents. The findings about features of infectious laryngotracheitis virus cultivation on chicken embryos has been used when the live lyophilised vaccine against infectious laryngotracheitis was constructed from VNIIDP-U strain.

It has been shown that the method of fluorescent probes makes the indication of infectious laryngotracheitis and Newcastle disease agents more rapid in comparison with other laboratory tests.

Key words: poultry, infectious laryngotracheitis, Newcastle disease, fluorescent probe, diagnosis, co-cultivation, biological features.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Серед інфекційних хвороб у птахівництві в цей час мають особливе економічне значення інфекційний ларинготрахеїт (ІЛТ) і ньюкаслська хвороба (НХ) (Макогон и др., 1985; Gork et al., 1989; King, 1996).

У зв'язку з широким розповсюдженням захворювань вірусної етіології першочерговим завданням при проведенні заходів профілактики і ліквідації ІЛТ та НХ залишається своєчасна постановка діагнозу. Велику роль має експрес-діагностика, особливо при дослідженні значної кількості проб патологічного матеріалу від тварин з різними формами прояву хвороби, а також одномоментна ідентифікація обох збудників (Сюрін, Чистова, 1962).

Методи прискореної лабораторної діагностики інфекційних хвороб розвиваються на основі класичних схем вірусологічного аналізу, які зводяться до виділення ізоляту вірусу з наступною ідентифікацією за біологічними, морфологічними та антигенними властивостями. Багатоетапність цих робіт обумовлює їх тривалість і практично виключає експресність, яка б задовольняла практику (Adair et al., 1989; Cadman et al., 1997).

Іноді неможливість детекції вірусного антигену у патологічному матеріалі пов'язана не з низькою чутливістю діагностичної методики, а з відсутністю у реакційній суміші оптимальних кількостей і співвідношень імунореагентів, внаслідок чого навіть при утворенні комплексу антиген-антитіло або фіксації компонентів на комплексі антиген-антитіло, макроскопічна реакція (гемаглютинація, преципітація або нейтралізація) може не проявитися. Крім того, значним недоліком цих реакцій є нестабільність і, у ряді випадків, неспецифічність отриманих даних. У свою чергу відсутність можливості інструментального обліку результатів вносять суб'єктивізм у їх оцінку (Toth et al., 1977).

Одним з можливих методологічних підходів до вирішення цієї проблеми є використання методу флуоресцентних зондів (МФЗ), який дозволяє швидко виявити збудника та дає можливість поставити заключний діагноз протягом 1 години (Shibata et al., 1991; Williams et al., 1992).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана тема входить до плану науково-дослідних робіт ІЕКВМ УААН, зокрема, до зареєстрованої наукової тематики 07.08. "Розробити комплексний набір для діагностики вірусних захворювань птиці за допомогою флуоресцентних зондів" (номер державної реєстрації 0197U000760).

Мета та задачі дослідження. Мета досліджень: розробити критерії діагностичної ефективності методу флуоресцентних зондів для індикації збудників ІЛТ та НХ у сільськогосподарської птиці та провести порівняльну оцінку її відносно існуючих лабораторних тестів.

Для досягнення поставленої мети потрібно було вирішити такі завдання:

- дослідити особливості моно- та співкультивування вірусів інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби;

- визначити вплив температури культивування на біологічні властивості вірусу інфекційного ларинготрахеїту;

- вивчити рівні накопичення вірусу ІЛТ (ВІЛТ) при співкультивуванні з вірусом НХ (ВНХ);

- отримати компоненти діагностичного набору для індикації збудників інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби методом флуоресцентних зондів;

- провести підбір зондів та удосконалити метод ФЗ для індикації вірусів ІЛТ і НХ;

- порівняти діагностичну ефективність методу флуоресцентних зондів з існуючими лабораторними тестами (ІФА, РГА, РЗГА).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні для діагностики асоційованих інфекцій (ІЛТ та НХ) у курей запропоновано метод ФЗ.

Вперше досліджено і запропоновано використання найбільш ефективного за фотометричними показниками флуоресцентного зонду ДСП-13.

Вивчено динаміку та особливості накопичення вірусів ІЛТ та НХ при співкультивуванні на курячих ембріонах.

Практичне значення одержаних результатів. Практична цінність роботи полягає в тому, що вперше запропоновано метод використання флуоресцентного зонду ДСП-13 з метою виявлення збудників ІЛТ і НХ птиці. Виготовлено компоненти, що входять до діагностичного набору для індикації вказаних інфекційних агентів за допомогою методу ФЗ.

Застосування методу флуоресцентних зондів у порівнянні із стандартними реакціями (РГА, РЗГА, ІФА та ін.) прискорює термін діагностичних досліджень збудників інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби у 10-12 разів, що свідчить про його експресність і, відповідно, надає можливість ветеринарній службі своєчасно не тільки поставити діагноз, але й прогнозувати розвиток епізоотичної ситуації.

Для індикації збудників інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби в умовах науково-практичних лабораторій розроблено проект "Тимчасової настанови по діагностиці ІЛТ і НХ за допомогою флуоресцентних зондів".

Визначена температурна залежність вакцинного штаму ВНДІХП-У (стабільність репродукції при 39 С) внесена до технологічного регламенту виготовлення живої вірус-вакцини проти ІЛТ (ТУ У 46.15.304-98).

Особистий внесок здобувача. Дисертантом повністю і самостійно виконано весь обсяг науково-виробничих робіт, спостережень і експериментальних досліджень, проведена їх статистична обробка. На підставі аналізу отриманих результатів дисертантом сформульовані положення, що виносяться на захист:

- дослідити особливості моно- та співкультивування вірусів інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби;

- отримати компоненти діагностичного набору для індикації збудників інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби методом флуоресцентних зондів;

- порівняти діагностичну ефективність методу флуоресцентних зондів з існуючими лабораторними тестами (ІФА, РГА, РЗГА).

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації доповідались та апробовані на:

- засіданнях та звітних сесіях Вченої ради ІЕКВМ УААН 1997-1998 рр. (по розгляду матеріалів річних звітів і по результатам аспірантури);

- засіданнях методичної ради ІЕКВМ УААН (1996-1998 рр.);

- Міжнародній науково-практичній конференції "Діагностика хвороб птиці" (22-24 липня 1997 р., м. Дніпропетровськ);

- Міжнародній науково-практичній конференції "Розвиток ветеринарної науки в Україні: здобутки та проблеми" (24-26 вересня 1997 р., м. Харків);

- проведені міжлабораторні комісійні випробування "Способу індикації інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби методом флуоресцентних зондів", які оформлені відповідними документами.

Структура і обсяг дисертації. Матеріали дисертаційної роботи викладені на 138 сторінках машинописного тексту і містять вступ, огляд літератури, власні дослідження, висновки, практичні пропозиції, список використаних джерел і додатки. Список використаної літератури включає 169 джерел, в тому числі 70 - іноземних авторів.

Робота ілюстрована 20 таблицями та 13 рисунками.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 наукові роботи у фахових виданнях.

Матеріали і методи. У роботі використовували:

1. Культури клітин: СНЕВ (культура перещеплюваної лінії клітин нирки свиней); ППК-66б (культура перещеплюваної лінії клітин нирок поросят); ПСГК-30 (культура перещеплюваної лінії клітин нирки сибірського гірського козерогу); ФЕК (первинно трипсинізована культура фібробластів курячих ембріонів); ВНК-21 (культура перещеплюваної лінії клітин нирки новонародженого сірійського хомячка); ПК (культура перещеплюваної лінії клітин нирки великої рогатої худоби); Vero (культура перещеплюваної лінії клітин нирки зеленої мавпи); МК (культура перещеплюваної лінії клітин макаки-резуса); ПТ (культура перещеплюваної лінії клітин нирки телят); Hep-2 (культура перещеплюваної лінії клітин епітеліоїдного раку гортані людини); Hela (культура перещеплюваної лінії клітин епітеліоїдного раку шийки матки людини); RH (культура перещеплюваної лінії клітин нирки ембріона людини).

2. Віруси: ньюкаслської хвороби, вакцинний штам Ла-Сота; інфекційного ларинготрахеїту, штами: вірулентний Г і вакцинний ВНДІХП-У; коронавірус ВРХ; ротавірус мавп.

3. Гіперімунні специфічні сироватки: до вірусів ньюкаслської хвороби та інфекційного ларинготрахеїту птиці, ротавірусу мавп; коронавірусу ВРХ, ембріональна ВРХ та нормальна від кролів і птиці, яких утримували в умовах, близьких до СПФ.

4. Флуоресцентні зонди двох рядів:

1) кумаринові: МДК; ФТК; АФК; ФТОК; АТОК; метоксікумарин;

2) піримідинові: ДСМ; ДСП-6; ДСП-1; ДСП-13; ДОП-2.

5. Лабораторні тварини та інші біологічні об'єкти. При проведенні дослідів було використано 30 курчат 90-110-денного віку, 1 коза, 21 кролик, 3 півня, 2500 курячих ембріонів 9-10-денної інкубації.

Обробка інфекційного матеріалу. Для вірусологічних і серологічних досліджень антигену вірусу ІЛТ (штами Г та ВНДІХП-У) від експериментально зараженої птиці (курчат 90-110-денного віку) відбирали зразки тканин органів дихання (трахея, бронхи, легені і повітряносні міхури), які зберігали при температурі мінус 12-18 С. При тестуванні вірусу зразки патматеріалу обробляли шляхом суспендування у розчині Хенкса за загальноприйнятими методиками.

Вірусологічні методи. Культивування вірусів ІЛТ і НХ на курячих ембріонах, які розвиваються. Вірус ньюкаслської хвороби культивували на 9-добових ембріонах, яких заражали у алантоїсну порожнину у дозі 0,2 смі та інкубували протягом 72 годин при +37 та +39 С. Культивування вірусу ІЛТ здійснювали на 10-11-денних курячих ембріонах; зараження проводили на хоріоналантоїсну оболонку у об'ємі 0,2 смі, а інкубацію - протягом 120 годин при +37 та +39 С.

Співкультивування вірусів ІЛТ (вакцинний і вірулентний штами) та НХ (штам Ла-Сота). Співкультивацію здійснювали на біосистемі - курячий ембріон, з випробуванням двох методів. За першим методом (метод І) використовували суміш однакових десятиразових розведень (10-1-10-7) кожного вірусу, якою інфікували ембріони з подальшою інкубацією протягом 72 та 120 годин і далі враховували кінцевий титр гемаглютинації для кожного вірусу. За другим методом (метод ІІ) використовували суміш рівних об'ємів низького розведення одного вірусу з рівними об'ємами 10-разових розведень іншого. Термін інкубації - як при методі І.

Обробку результатів проводили за такими показниками:

- динаміка загибелі курячих ембріонів;

- характер змін на ХАО та ембріоні для кожного вірусу;

- наявність або відсутність гемаглютинації;

- індикація збудників за даними РЗГА, МФЗ, ІФА.

Серологічні методи. Для виявлення вірусів ІЛТ та НХ були використані: РГА, РЗГА, ІФА, МФЗ.

Очистка і концентрація вірусів ІЛТ і НХ. Для очистки і концентрування вірусів інфекційного ларинготрахеїту застосовували загальноприйняті у вірусології методи. При цьому використовували різні хімічні речовини (фреон-113, 10%-вий сульфат амонію, хлороформ (1:3)), а також ультрацентрифугування (центрифуга РС-6).

Визначення антигенів вірусів ІЛТ і НБ за допомогою флуоресцентних зондів. Проведення цих досліджень складалось з 2-х етапів: контрольної флуорометрії клітин та індикації вірусів за МФЗ.

Контрольна флуорометрія інтактних клітин. До 0,5 смі суспензії культури досліджуваних клітин на середовищі 199 з вмістом 1 млн. клітин/смі додавали 0,1 смі 10%-вого водного розчину зонду ДСП-13 до кінцевої концентрації 20 мкМ, після чого інкубували 15-20 хвилин при +37 С з подальшою флуорометрією за допомогою люмінесцентного мікроскопа ЛЮМАМ 1-1 з фотометричною насадкою ФМЕЛ-1А. За одиницю виміру флуоресценції приймали середнє значення флуоресценції 10-20 клітин (F) (Добрецов, 1989).

Визначення антигену вірусу ІЛТ за допомогою ФЗ. До 0,5 смі суспензії однієї з досліджуваних культур клітин додавали 0,2 смі проби, яку контролювали, суміш інкубували 30 хвилин при +37 С, після чого вносили 0,1 смі водного розчину одного з зондів. В подальшому проводили флуорометрію. Величина вимірювання флуоресценції умовна, вона виражається у мВ. Розраховували середню арифметичну величину флуоресценції 10 клітин експериментальної проби - експ.. Наявність інфекційного агента визначали за показниками інтенсивності флуоресценції К, розрахованому за формулою:

К=досліда / контроля

Значення показника інтенсивності флуоресценції К, яке дорівнювало 1,5 або вище свідчило про наявність вірусу у досліджуваній пробі.

Для підтвердження специфічності виявленого інфекційного агента використовували гомо- та гетерологічні гіперімунні сироватки у відповідному розведенні. З цією метою до 0,1 смі проби додавали 0,1 смі специфічної сироватки та 0,5 смі клітинної суспензії. Отриману суміш інкубували протягом 30 хвилин при 37 С, потім додавали 0,1 смі розчину флуоресцентного зонду і проводили флуорометрію за вищевказаною методикою. Наявність вірусів вважається доведеною при значенні показника інтенсивності флуоресценції К нижче 1,5.

Визначення антигену вірусу ньюкаслської хвороби за допомогою ФЗ. Методика аналогічна вищеописаній щодо виявлення антигену вірусу інфекційного ларинготрахеїту з тією лише різницею, що для підтвердження специфічності використовували гомологічну сироватку.

Методи статистичної обробки. Результати експериментів статистично обробляли на комп'ютері типу IBM PC/АТ, з використанням пакету програм "Stadia" (1992 р.).

Результати досліджень

ларинготрахеїт діагностика вірус вакцина

Вивчення біологічних властивостей вірусу ІЛТ. При вивченні біологічних властивостей вірусу інфекційного ларинготрахеїту було встановлено, що особливості макроскопічних змін на ХАО, викликані розмноженням збудника, залежать від дози і штаму вірусу. Так, при введенні курячим ембріонам в однаковій дозі штам Г зумовлював утворення великих вогнищ некрозу, в той час як вакцинний штам - більш дрібних вузликів або їх повну відсутність при значній зоні набряку у місці введення вірусу.

Що стосується патогенності вірусу у відношенні до курячих ембріонів, слід відзначити, що при зараженні штамом Г реєстрували підвищення рівня загибелі ембріонів із збільшенням кількості проведених пасажів, та підвищенням інфекційного титру вірусу з 5,3 до 6,8 lg ЕІД 50/0,2 смі. Інфекційний титр вакцинного штаму збільшувався з 4,7 до 5,7 lg ЕІД 50/0,2 смі і при подальшому культивуванні підвищення титру не спостерігали.

Одночасно було встановлено, що при серійному пасажуванні при +37 С відбувалось підвищення рівня накопичення вірусу інфекційного ларинготрахеїту тільки до 3-4 пасажів.

В той же час було констатовано, що культивування обох штамів вірусу ІЛТ при температурі +39 С супроводжувалось збільшенням кількості вірусу штаму Г на 2 lg ЕІД 50/0,2 смі, а штаму ВНДІХП-У - на 1,3 lg ЕІД 50/0,2 смі у порівнянні з культивуванням при +37 С.

Інфекційна активність вірусу інфекційного ларинготрахеїту при зберіганні ХАО, відібраних від заражених ембріонів, у алантоїсній рідині, а також у вигляді 10%-вої суспензії на фізіологічному розчині при багаторазовому заморожуванні - відтаюванні (температура мінус 12 С) знижувалась на 2-3 lg ЕІД 50/0,2 смі. Оптимальна збереженість активності вірусу інфекційного ларинготрахеїту протягом 6 місяців була зареєстрована при температурі мінус 18 С.

При вивченні гемаглютинуючих властивостей збудника інфекційного ларинготрахеїту (штам ВНДІХП-У) було встановлено, що протягом 3 пасажів гемаглютинуюча активність його зростала з подальшою стабілізацією. Крім того, було зафіксовано більш високий титр гемаглютинінів вірусу при температурі культивування інфікованих ембріонів +39 С у порівнянні з +37 С (відповідно 3,21130,12 та 2,20750,12 lg).

Встановлено, що загибель ембріонів залежала від дози зараження і штаму вірусу. Так, вакцинний штам ВНДІХП-У у титрі 4,5 lg ЕІД 50/0,2 смі викликав загибель 20% інфікованих ембріонів, а штам Г при дозі зараження 4,3 lg ЕІД 50/0,2 смі - 80%.

Співкультивування вірусів інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби на курячих ембріонах. При проведенні дослідів по співкультивуванню було встановлено, що макроскопічні зміни у вигляді великих і дрібних некротичних ділянок на хоріоналантоїсних оболонках, характерних для розвитку вірусу інфекційного ларинготрахеїту, визначали тільки у ембріонів, заражених вірусом інфекційного ларинготрахеїту нативним (5,3 lg ЕІД 50/0,2 смі) і у розведенні до 10-3 (2,3 lg ЕІД 50/0,2 смі). У вищих розведеннях (до 10-5, 0,3 lg ЕІД 50/0,2 смі) спостерігали некротичні ділянки розміром від 2 до 3 мм з зоною набряку у місці інокуляції вірусу або відсутність подібних уражень.

Необхідно підкреслити, що при співкультивуванні вірусів ембріони значно відставали у розвитку від зародків, заражених одним із вірусів, а особливо від контрольних.

Як свідчать отримані дані, при інокуляції нативного вірусу інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби у розведеннях 100-10-5 коливання загибелі курячих ембріонів становили від 100 до 20%. По мірі зменшення концентрації вірусу інфекційного ларинготрахеїту у інокульованій суміші рівень патогенності для зародків знижувався. Зокрема, при введенні суміші, яка включала вірус ІЛТ у розведенні 10-1-10-2 та вірус НХ - 10-3-10-5, загибель ембріонів не реєстрували. Аналогічні результати отримані при зараженні зародків збудником інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби відповідно у концентрації 10-3-10-5 та 10-1-10-5. Матеріали вивчення патогенності збудників інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби при співкультивуванні в біосистемі подані у таблиці 1.

Виділення вірусів після співкультивування. Після співкультивування вірусів інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби, матеріал з ембріонів досліджували у РЗГА для індикації збудників інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби, а при відсутності одного з антигенів, додатково - у ІФА і МФЗ, а також на КЕ після обробки матеріалу сироваткою, гомологічною виділеному вірусу. При співкультивуванні у більшості досліджуваних проб встановлено накопичення обох вірусів. Виключення склали суміші, в яких не було виявлено збудника інфекційного ларинготрахеїту (включали наступні розведення: 100-10-3 ВІЛТ та 10-7 -ВНХ; 10-5, 10-6 -ВІЛТ та 100-10-2 - ВНХ; 10-6 - ВІЛТ і ВНХ), а також збудника ньюкаслської хвороби (100-10-3 - ВІЛТ та 10-7 - ВНХ). Після інокуляції вірусу інфекційного ларинготрахеїту у розведенні 10-6, а вірусу ньюкаслської хвороби - 10-7 у зразках не було виявлено жодного з них. Зазначені данні наведені у таблиці 2.

Таблиця 1. Вивчення патогенності вірусів інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби при співкультивуванні на курячих ембріонах, що розвиваються (Fm)

Розведення вірусу ІЛТ	Розведення вірусу ньюкаслської хвороби і відсоток загиблих ембріонів
	100	%	10-1	%	10-2	%	10-3	%	10-4	%	10-5	%
100	10/10	100	5/5	100	5/2	40	5/1	20	5/1	20	5/1	20
10-1	10/10	100	5/4	80	5/2	40	5/0	0	5/0	0	5/0	0
10-2	10/5	50	5/1	20	5/1	20	5/0	0	5/0	0	5/0	0
10-3	10/3	30	5/0	0	5/0	0	5/0	0	5/0	0	5/0	0
10-4	10/2	20	5/0	0	5/0	0	5/0	0	5/0	0	5/0	0
10-5	10/1	10	5/0	0	5/0	0	5/0	0	5/0	0	5/0	0

Примітки: 1. Чисельник - кількість інфікованих ембріонів.

2. Знаменник - кількість загиблих ембріонів.

Таблиця 2. Результати виявлення вірусів ІЛТ та НХ при співкультивуванні

Розведення ВІЛТ	Розведення вірусу НХ
	100	10-1	10-2	10-3	10-4	10-5	10-6	10-7
100	Загибель	Загибель	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/-
10-1	Загибель	Загибель	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/-
10-2	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/-
10-3	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/-
10-4	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/-
10-5	-/НХ	-/НХ	-/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/-
10-6	-/НХ	-/НХ	-/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	ІЛТ/НХ	-/НХ	-/-

Примітки:

1. ІЛТ/НХ - співкультивування вірусів за методикою І.

2. ІЛТ/НХ - співкультивування вірусів за методикою II.

3. "-" - вірус не виявлено.

Титри гемаглютинінів після співкультивування суттєво не відрізнялись від титрів при монокультивуванні як вірусу інфекційного ларинготрахеїту, так і вірусу ньюкаслської хвороби. Середня геометрична титру гемаглютинінів вірусу інфекційного ларинготрахеїту при монокультивуванні була 5,90,3 lоg2, а при співкультивуванні склала 5,770,02 lоg2, вірусу ньюкаслської хвороби - 9,970,02 lоg2 і 9,730,02 lоg2, відповідно.

Приймаючи до уваги вищезазначене, можна зробити наступні висновки.

1. При проведенні спільного культивування вірусів інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби у одній біологічній системі не зареєстровано прояву інтерференції під час їх реплікації. Однак було відмічено, що ембріони, заражені обома вірусами, значно відставали у розвитку в порівнянні із зародками, інфікованими одним з них, та особливо з контрольними.

2. Інокуляція суміші, до складу якої входили вірус ІЛТ у розведенні 10-3-10-4 та НХ у розведенні 10-1-10-5, не викликала загибелі курячих ембріонів. Приймаючи до уваги, що в цьому випадку виявлялись обидва збудники, співвідношення їх розведень можна вважати оптимальними для зараження зародків з метою подальших досліджень по розробці асоційованої вакцини проти інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби.

Використання методу флуоресцентних зондів для діагностики ІЛТ і НХ. Підбір флуоресцентної речовини і визначення її робочої концентрації. З урахуванням експериментів по вивченню інтенсивності свічення свіжоприготовлених зондів найбільш придатними з випробуваних флуорохромів були ДСП-1, ДСП-13 і ДОП-2.

Через 6 місяців зберігання при +4 С у темному місці було визначено, що у розведенні 10-1 М показники світіння всіх розчинів вказаних зондів не змінювались. Фотометричні показники флуоресцентних зондів піримідинового ряду значно знизились у порівнянні з початковою флуоресценцією, а саме: у розведенні 10-3 М зонд ДСП-1 знизив світіння у 5,5 разів, а ДСП-13 - у 1,4 рази, ДОП-2 - в 30 разів. Таким чином, найбільш стабільним зондом виявився ДСП-13. У звязку з тим, що ДОП-2 значно знизив свою активність, тобто був нестійким флурохромом, далі його у дослідженнях не використовували.

За результатами подальших експериментів встановлено, що кінцева концентрація флуоресцентних речовин для ДСП-1 склала 14 мкМ, а для ДСП-13 - 20 мкМ.

Підбір за допомогою флуоресцентного зонду тест-культур для індикації вірусу ІЛТ і НХ. До вірусу ньюкаслської хвороби і вірусу інфекційного ларинготрахеїту виявились чутливими три лінії культур клітин: ППК-66б, СНЕВ і ПСГК-30. Перевага була віддана культурі клітин СНЕВ, тому що вона найбільш освоєна та поширена в роботі виробничих лабораторій.

Визначення специфічності сироваток до ВІЛТ і ВНХ. Принцип дослідження специфічності гіперімунних сироваток полягав у тому, що у результаті нейтралізації вірусу специфічними антитілами, збудник втрачав здатність зв'язуватися з рецепторами клітини. При цьому стан мембран клітин-мішенів не змінювався і показник інтенсивності флуоресценції (К) не перевищував контрольного значення. У випадку відсутності у сироватці специфічних антитіл, нейтралізації вірусу не відбувалось, антиген сорбувався на рецептори плазмолеми, що призводило до функціональних змін клітин і показник інтенсивності флуоресценції К дорівнював або перевищував 1,5. Матеріали цих досліджень представлені у таблиці 3.

Таблиця 3. Результати вивчення специфічності гіперімунних сироваток до вірусів ІЛТ і НХ методом флуоресцентних зондів у СНЕВ

Характеристика досліджуваного матеріалу	Досліджувані віруси
	Негативний антиген	ІЛТ (вакцинний)	ІЛТ (Г)	НХ	Рота (мавп)	Корона (ВРХ)
Без сироватки	1,02	1,78	1,96	2,11	1,62	1,56
Ембріональна сироватка ВРХ	1,04	1,83	1,92	2,03	1,57	1,60
Специфічна сироватка до ІЛТ	1,07	1,10*	1,04*	2,00	1,56	1,58
Специфічна сироватка до НХ	1,06	1,85	1,90	1,15*	1,63	1,55
Специфічна сироватка до ротавірусів мавп	1,02	1,81	1,93	2,16	1,03*	1,64
Специфічна сироватка до коронавірусів ВРХ	1,05	1,89	1,96	2,05	1,59	1,02*
Культура клітинбез вірусу	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0	1,0

Примітка. * - зниження показника інтенсивності флуоресценції К у зразках, які містять вірус і гомологічну сироватку.

Індикація і ідентифікація вірусів ІЛТ і НХ методом ФЗ у інфекційному матеріалі. При індикації вірусу інфекційного ларинготрахеїту методом флуоресцентних зондів у зразках патологічного матеріалу, отриманого від заражених ембріонів і експериментально інфікованих курчат (тобто у пробах, до складу яких входив матеріал, що містить вірус, і нормальна сироватка) показник К коливався від 1,75 до 5,09. Середній показник К першої вибірки (М) - 2,4, середня статистична помилка (m) - 0,09, дисперсія (S2) - 0,39, t=2,0.

Після внесення специфічної сироватки середній показник інтенсивності флуоресценції К склав 1,57, середня статистична помилка - 0,06, дисперсія - 0,2, t=2,0.

Аналогічні експерименти були проведені по ідентифікації вірусу ньюкаслської хвороби із патматеріалу інфікованих ембріонів. Так, за результатами фотометричних досліджень зразків патматеріалу з нормальною сироваткою, середній показник інтенсивності флуоресценції (К) склав 2,6, середня статистична помилка - 0,2, дисперсія - 1,25, t=2,0, а після взаємодії з специфічною сироваткою: середній показник інтенсивності флуоресценції (К) був 1,4, середня статистична помилка - 0,09, дисперсія - 0,3, t=2,0.

Можна зробити висновок про те, що показник інтенсивності світіння (К) досліджуваної проби, яка містить вірус ІЛТ або НХ, після взаємодії із специфічною сироваткою знижувався у 1,5 і більше разів, що свідчить про достовірність специфічно виявленого вірусного агента. Ймовірність помилки в цьому випадку складає 0,01%.

Таким чином, результати використання методу флуоресцентних зондів для індикації і ідентифікації вірусу інфекційного ларинготрахеїту і вірусу ньюкаслської хвороби підтверджують його специфічність і чутливість. Крім того, за швидкістю отримання результатів цей метод можна віднести до категорії експрес-методів. Однією з позитивних особливостей методу флуоресцентних зондів є також можливість ідентифікації збудників не тільки при моно-, а й при асоційованих захворюваннях.

Визначення діагностичної ефективності методу флуоресцентних зондів у порівнянні з іншими лабораторними тестами. Матеріали порівняльної оцінки лабораторних тестів: ІФА, МФЗ, РЗГА та ізоляції вірусу ІЛТ у біологічній системі подані у таблиці 4.

Таблиця 4. Оцінка ефективності ІФА, МФЗ і РЗГА у порівнянні з виділенням вірусу ІЛТ на курячих ембріонах, що розвиваються

Реакція методів	Позитивних проб	Негативних проб	Всього	Відсоток співпадіння
				Позитивні/ Негативні	Всього
Виділення вірусу на КЕ	68	28	96
ІФА +	66	8	74	97,11,72	89,63,31*
-	2	20	22	71,44,64
МФЗ +	58	1	59	85,33,63	88,53,48
-	10	27	37	96,41,91
РЗГА +	36	7	43	52,95,12	59,36,56
-	32	21	53	75,04,44

P < 0,05

Примітка. - кількість позитивних або негативних зразків, які співпали з аналогічними пробами при виділенні вірусу на КЕ.

З приведених у таблиці 4 даних видно, що найбільш високі показники співпадіння результатів відмічені при ізоляції вірусу ІЛТ на курячих ембріонах і використанні імуноферментного аналізу: 89,63,31%, а також методу флуоресцентних зондів і виділення вірусу на курячих ембріонах - 88,53,48%. Як бачимо, відсоток співпадіння імуноферментного аналізу і методу флуоресцентних зондів не має вірогідної різниці (при p<0,05). Слід відзначити, що відсоток негативних результатів цих двох методів у порівнянні з виділенням на курячих ембріонах суттєво відрізнявся: імуноферментний аналіз - 71,44,64% і метод флуоресцентних зондів - 96,41,91%. Так, з 28 негативних проб при виділенні на курячих ембріонах і у імуноферментному аналізі співпало тільки 20 (71,4%), а у методі флуоресцентних зондів - 27 проб (96,4%). Таким чином, при дослідженні зразків у МФЗ і отриманні негативного результату, можна стверджувати, що проба не містить вірусного антигену. Співпадіння результатів реакції затримки гемаглютинації і виділення на курячих ембріонах невисоке, а саме: при позитивних результатах 52,95,12% та негативних 75,04,44%, що можна пояснити його найменшою чутливістю.

Результати порівняння співпадінь позитивних і негативних реакцій при діагностиці НХ наведені у таблиці 5.

Таблиця 5. Оцінка ефективності РЗГА і МФЗ у порівнянні з виділенням вірусу ньюкаслської хвороби на курячих ембріонах

Тест	Позитивних проб	Негативних проб	Всього	Відсоток співпадінь
				Позитивні/ Негативні	Всього
Виділення вірусу на КЕ	83	11	94
РЗГА +	36	4	40	43,45,1	53,55,2
-	47	7	54	63,65,25
МФЗ +	65	1	66	78,35,0	84,63,7
-	18	10	28	90,93,0

Примітка. - кількість позитивних або негативних зразків, які співпали з аналогічними пробами при виділенні вірусу на КЕ.

Як видно з представлених у таблиці даних, відсоток співпадінь позитивних результатів у реакції затримки гемаглютинації склав 43,45,1%, а у методі флуоресцентних зондів - 78,35,0%. Співпадіння негативних результатів у цих методів дещо вище, ніж позитивних, а саме: у реакції затримки гемаглютинації - 63,65,25%, у методі флуоресцентних зондів - 90,93,0%. Загальне співпадіння результатів реакції затримки гемаглютинації було 53,55,2%, а методу флуоресцентних зондів - 84,63,7%.

Узагальнюючи вищевикладене, можна відзначити, що з метою підвищення ймовірності визначення діагнозу, слід використовувати не менше двох тестів (зокрема, метод флуоресцентних зондів) для дослідження кожної проби, щоб виключити можливість отримання неспецифічних результатів.

Як відомо, для діагностики інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби можна використовувати такі методи: реакцію затримки гемаглютинації, імуноферментний аналіз, виділення на курячих ембріонах і метод флуоресцентних зондів. Нами проведена оцінка кожного з цих методів за шістьома критеріями по десятибальній шкалі. Результати цих досліджень наведені у таблиці 6.

Таблиця 6. Порівняльна характеристика методів діагностики ІЛТ і НХ

Метод	Чутливість	Специфічність	Економічність	Швидкість	Простота	Доступність	Всього, балів
РЗГА	3	5	5	3	5	7	28
ІФА	7	7	4	6	2	2	28
Виділення вірусу на КЕ	9	10	2	1	2	5	29
ФЗ	7	7	3	8	4	4	33

Отримані данні свідчать про те, що реакція затримки гемаглютинації хоча і поступається іншим методам у специфічності і чутливості, але завдяки простоті виконання, економічності і доступності, вона знаходить широке застосування у роботі практичних лабораторій. Імуноферментний аналіз досить інформативний, експресний, економічний при скринінгових дослідженнях, але потребує відповідного рівня кваліфікації виконавців і спеціального інструментального обладнання. Метод флуоресцентних зондів за рядом критеріїв не поступається ІФА: специфічний, чутливий, доступний та досить простий у постановці. В той же час, він найбільш експресний у порівнянні з іншими лабораторними тестами.

Таким чином, проводячи порівняльну оцінку лабораторних методів, які використовуються для діагностики інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби, слід зробити висновок, що з цією метою можна застосовувати усі вищезазначені реакції. В той же час, при виборі методу потрібно враховувати складність епізоотичної ситуації, терміни і умови отримання патологічного матеріалу, а також особливості кожного із тестів.

Як показало порівняння лабораторних тестів, при індикації вірусів інфекційного ларинготрахеїту і ньюкаслської хвороби перевага методу флуоресцентних зондів над реакцією затримки гемаглютинації очевидна. Слід відзначити також, що виділення вірусів у біологічній системі, імуноферментний аналіз і метод флуоресцентних зондів - тести, які за інформативністю практично не відрізняються.

При цьому, метод флуоресцентних зондів за швидкістю отримання заключного результату перевищує ці методи, а також є стабільним при відтворенні і виключає суб'єктивізм у оцінці даних. Названі показники свідчать про перспективність його для впровадження у практику дослідницьких і діагностичних лабораторій у випадку діагностики та диференційної діагностики інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби птиці, які віднесені до економічно значущих хвороб.

Висновки

1. Вперше встановлена активність та специфічність методу флуоресцентних зондів при ідентифікації штамів вірусів ІЛТ та НХ, як в експериментальних, так і у лабораторно-виробничих умовах.

2. Застосування методу флуоресцентних зондів у порівнянні із стандартними тестами (реакції гемаглютинації, затримки гемаглютинації, імуноферментний аналіз та інші) значно прискорює термін діагностичних досліджень збудників інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби, що зумовлено його високою специфічністю та чутливістю, високою швидкістю отримання результатів, можливістю ідентифікації збудників ІЛТ та НХ при моно- і асоційованих інфекціях.

3. Досліджено нові флуоресцентні зонди, серед яких за фотометричними показниками найбільш ефективним для діагностики інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби є ДСП-13 у кінцевій концентрації 20 мкМ. Виведено статистично достовірний показник зниження інтенсивності флуоресценції (К) зразків при взаємодії із гомологічною сироваткою. Зменшення показника інтенсивності світіння у 1,5 рази свідчить про присутність антигенів інфекційного ларинготрахеїту або ньюкаслської хвороби в патологічному матеріалі.

4. Визначено основні біологічні властивості вакцинного та вірулентного штамів вірусу інфекційного ларинготрахеїту при культивуванні на курячих ембріонах. Встановлено, що особливості макроскопічних змін на ХАО, а також патогенність по відношенню до зародків залежать від дози зараження і штаму вірусу.

5. Не виявлено інтерференції збудників інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби при співкультивуванні у біологічній системі (курячих ембріонах).

6. Встановлено, що оптимізація репродуктивних властивостей вірусу інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби має місце при культивуванні на ембріонах курей при +39 С.

7. Доцільним способом зберігання вірусу інфекційного ларинготрахеїту на протязі 6 місяців є температурний режим мінус 18 С.

8. Розроблено проект тимчасової настанови по діагностиці інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби із застосуванням методу флуоресцентних зондів. Отримано компоненти діагностичного набору для індикації збудників інфекційного ларинготрахеїту та ньюкаслської хвороби.

Публікації

1. Прохорятова О., Бабкін В., Біла Н. Співкультивування герпес- та параміксовірусів птахів на курячих ембріонах // Вет. медицина України. - 1999. - № 3. - С. 16-17.

2. Прохорятова Е.В., Белая Н.В. Индикация и идентификация болезней Ньюкасла и инфекционного ларинготрахеита с помощью метода флуоресцентных зондов // Вет. медицина: Міжвід. тематич. наук. зб. - Х., 1998. - Вип. 73. - С. 42-44.

3. Отримання ліофілізованної вірус-вакцини зі штаму "ВНДІХП-У" проти інфекційного ларинготрахеїту птиці / В.Ф. Бабкін, В.В. Герман, Н.В. Біла, Є. В. Герман // Пробл. зооінженерії та вет. медицини. - 1998. - Т. 2, вип. 4. - С. 89-90.

4. Говтвян Н.В. Ефективність дослідного зразка вакцини проти хвороб Гамборо і Ньюкасла // Вет. медицина України. - 1997. - № 1. - С. 19.

Размещено на Allbest.ru

...