АТФ-індуковані струми в нейронах підслизового сплетіння тонкого кишечнику морської свинки

Рис.1 Два типи вхідних АТФ-індукованих струмів. (Пояснення в тексті).

Десенситизація пуринорецепторів ніяк не впливала на АХ-індуковані струми . Аплікація ацетилхоліну (100 мкмоль/л) одразу після аплікації АТФ (50 мкмоль/л), при інтервалі між аплікаціями менше 20 с викликала струми такі ж, як і в контролі (струми, отримані перед і після аплікацій АТФ (50-100 мкмоль/л) з інтервалами між аплікаціями в кілька хв. ), у той час коли, у випадку парних аплікацій АТФ (50 мкмоль/л) тривалістю 1 с з таким же інтервалом між аплікаціями, друга аплікація не викликала появи струму. Для повного відновлення амплітуди АТФ-індукованого струму при парних аплікаціях тривалістю 1 с було потрібно не менше 3_4 хв.

Повільні вихідні АТФ-індуковані струми . При іонофоретичних аплікаціях АТФ тривалістю декілька секунд і при використанні калієвого внутрішньоклітинного розчину, крім швидких деполяризуючих струмів у 3 нейронах з 26 досліджених спостерігались вихідні струми з повільною активацією та повільною інактивацією. Вихідний струм спостерігали через кілька секунд від початку аплікації АТФ (Рис.2А). У випадку парних аплікацій АТФ, коли друга аплікація відбувалася на фоні повільного вихідного струму, амплітуда сумарної відповіді дорівнювала алгебраїчній сумі значень вхідного і вихідного струмів (Рис.2Б). Вихідний струм, який виникав після другої аплікації, мав таку ж величину, як і після попередньої. Амплітуда повільних АТФ-індукованих струмів поступово зменшувалась під час реєстрації, тобто спостерігався так званий ефект “rundown”. Повільний вихідний струм повністю зникав через 40-50 хв. від моменту встановлення конфігурації ”ціла клітина”, і цей процес значно прискорювався, коли внутрішньоклітинний розчин не містив АТФ і ГТФ. У таких умовах генерація вихідного струму припинялась вже через 5-7 хв. від початку реєстрації.

Рис.2 Повільний вихідний АТФ_індукований струм.

А _запис струму, викликаного іонофоретичною аплікацією АТФ. Б _АТФ-індуковані струми, викликані парною аплікацією АТФ.

Концентраційна залежність вхідних АТФ-індукованих струмів. Концентраційну залежність вивчали шляхом аплікації АТФ у діапазоні концентрацій 1_1000 мкмоль/л до тієї ж самої клітини при потенціалі на мембрані _50 мВ. Аналіз концентраційної залежності показав, що доза, яка викликає напівмаксимальну відповідь (ЕС₅₀), дорівнює 45.7±3.5 мкмоль/л (з графіка Лайнуівера_Берка). Коєфіцієнт Хілла складав в середньому 2 (з графіка Хілла).

Потенціалозалежність вхідних АТФ-індукованих струмів. Залежність амплітуди АТФ-індукованого струму від потенціалу на мембрані визначали шляхом аплікацій АТФ тривалістю 1_2 с у концентраціях 50 мкмоль/л та 1 ммоль/л при підтримуваних мембранних потенціалах необхідної величини; інтервали між аплікаціями становили 90 с. Для усунення активації калієвих провідностей при позитивних мембранних потенціалах у дослідах використовували внутрішньоклітинний розчин, основим катіоном в якому був Cs⁺. Потенціал реверсії АТФ-індукованого струму залежав від концентрації АТФ і мав значення відповідно 16.7±2.7 (n=3) і 27.5±3.3 (n=3) при концентраціях АТФ _ 50 мкмоль/л і 1 ммоль/л. В області позитивних потенціалів нахил графіків вольт_амперної залежності зменшувався, що нагадувало так званий ефект випрямлення, властивий нейрональним НХР. При позитивних потенціалах спостерігався незначний вихідний АТФ-індукований струм. Аплікації ацетилхоліну (50_100 мкмоль/л) при позитивних потенціалах не викликали появи струму.

Ефект двовалентних катіонів. Вилучення із зовнішньоклітинного розчину двовалентних катіоннів Са²⁺ та Mg²⁺ призводило до збільшення АТФ-індукованого струмуу, і середня амплітуда струму в цьому випадку складала 117±6% (n=3) від контрольного значення. Той факт, що АТФ_індуковані струми спостерігаються, коли клітини знаходяться в розчині, де відсутні двовалентні катіони говорить про те, що дані струми виникають за рахунок взаємодії з рецептором АТФ у формі аніона, а не комплексу MgАТФ або СаАТФ.

Eфекти структурних аналогів АТФ.

Для визначення підтипу пуринорецепторів було проведено серію експериментів по вивченню дії селективних агоністів та структурних аналогів АТФ.

Аплікації аденозину (100_300 мкмоль/л), _Ме_АТФ (100 мкмоль/л), _Ме_АТФ (100 мкмоль/л) і _імідо_АТФ (100_300 мкмоль/л) не викликали появи трансмембранних струмів. При аплікації АТФ (100 мкмоль/л) у присутності _Ме_АТФ (100 мкмоль/л) амплітуда АТФ-індукованого струму складала близько 50% контрольного значення (n=3). Даний ефект був оборотним. Речовини _Ме_АТФ, _імідо_АТФ і аденозин у цьому аспекті були неактивними. Аплікація -Me-ATP до нейронів з відповідями на АТФ з швидким спадом також викликала вхідні струми. Амплітуда відповіді на -Me-ATФ (100 мкмоль/л) була такою ж, як і у випадку ATФ (100 мкмоль/л). Приведені результати дозволяють висунути припущення, що струми з повільним і швидким спадом викликані в результаті активації різних P_2X-пуринорецепторів. Дія блокаторів Р₂_пуринорецепторів. Блокатор Р₂_пуринорецепторів сурамін у концентрації 50_300 мкмоль/л з преінкубацією протягом 1_3 хв. не виявляв помітного впливу на струми, що були викликані аплікацією АТФ (100 мкмоль/л) через перфузію (Рис.3А), а також на АХ-індуковані струми . При апплікації АТФ під тиском у насичуючій концентрації (200 мкмоль/л) у присутності сураміну (100 мкмоль/л) спостерігався вплив на кінетику активації АТФ-індукованого струму, без помітного впливу на амплітуду струму (Рис.3Б).

Рис. 3 Дія сураміну на АТФ_ струми.

А_ відсутність впливу сураміну на струм, викликаний аплікацією АТФ через перфузію; Б- фрагмент АТФ-індукованого струму в присутності та у відсутності сураміну (200 мкмоль/л) (позначення біля кривих відповідно “сурамін+” і “сурамін_”).

Блокатор Р_2Y_пуринорецепторів реактив синій 2 (30_100 мкмоль/л) (Abbracchio and Burnstock, 1994), у випадку преінкубації до 4 хв. оборотно збільшував амплітуду АТФ-індукованого струму в порівнянні з контрольним значенням (n=7). Коли реактив синій 2 аплікували одночасно з АТФ, амплітуда струму складала 110_130% від контрольного значення. При аплікації реактиву синього 2 у відсутності АТФ активації трансмембранного струму не спостерігалось. При довготривалій (понад 4 хв. ) преінкубації нейронів у розчині реактиву синього 2 спостерігалось поступове зниження амплітуди АТФ-індукованого струму. Через 20 хв. амплітуда АТФ-індукованого струму складала близько 80% контрольного значення. Після відмивання протягом 10_15 хв. амплітуда залишалась на такому ж рівні (n=3). Реактив синій 2 у вищезгаданних концентраціях оборотно пригнічував ацетилхолінові струми. Амплітуда струму в присутності реактива синього 2 (40 мкмоль/л) складала 61±3% і 58±5% від контрольного значення відповідно у вприсутності та у відсутності АТФ (1 ммоль/л) та ГТФ (0.2 ммоль/л) у внутрішньоклітинному розчині.

Вплив АТФ на АХ-індуковані струми .

При іонофоретичних аплікаціях ацетилхоліну під час аплікації АТФ через перфузію амплітуда сумарного струму (АТФ+АХ-індукованого струму) не перевищувала амплітуди струму, що був викликаний аплікацією тільки ацетилхоліну (Рис.4).

Рис. 4 АХ-індуковані струми на фоні тривалих аплікацій АТФ в різних коцентраціях.

При аплікаціях ацетилхоліну під час АТФ-індукованого струму, і навпаки, амплітуда сумарного АТФ+АХ-індукованого струму не перевищувала контрольного значення АХ-індукованого струму або АТФ-індукованого струму, в залежності від того, яка величина струму була в момент аплікації другої речовини, інакше кажучи, спостерігалась “оклюзія” струмів. Пригнічення АХ-індукованих струмів АТФ спостерігалось тільки в нейронах, що відповідали на аплікацію АТФ появою струму. У нейронах, які не генерували АТФ-індукованих струмів, АХ-індукований струм у присутності АТФ (100_500 мкмоль/л) був таким же, як і в контролі (Рис.5). У випадку вихідних струмів, що виникають в результаті активації мускаринових холінорецепторів ефекту “оклюзії” не спостерігалось.

Дія структурних аналогів АТФ на АХ-індуковані струми . АХ-індуковані струми , що були викликані аплікаціями ацетилхоліну в присутності _Ме_АТФ (100 мкмоль/л), _Ме_АТФ (100 мкмоль/л), _імідо_АТФ (100_300 мкмоль/л), а також аденозину (100_300 мкмоль/л), не відрізнялись від АХ-індукованих струмів у контролі, в той час, як при аплікації ацетилхоліну в присутності АТФ (100_250 мкмоль/л) спостерігалась “оклюзія” АХ-індукованого струму. Відсутність впливу аденозину свідчить, що ефект “оклюзії” не є наслідком активації аденозинових рецепторів.

Рис. 5 Відсутність впливу АТФ на АХ-індуковані струми в нейронах, які не генерують струмів у відповідь на аплікацію АТФ.

Залежність пригнічення АХ-індукованих струмів від концентрації АТФ та ацетилхоліну. Амплітуда АТФ+АХ-індукованого струму не залежала від концентрації АТФ і дорівнювала амплітуді АХ-індукованого струму в контролі. У випадку тривалих аплікацій АТФ спостерігалось поступове зменшення амплітуди АТФ-індукованого струму внаслідок десенситизації пуринорецепторів. При аплікаціях ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму амплітуда сумарного АТФ+АХ-індукованого струму залишалась на постійному рівні незалежно від амплітуди АТФ_в момент аплікації ацетилхоліну (Рис.4). При аплікації різних доз ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму амплітуда сумарних відповідей у всіх випадках не превищувала амлітуди АХ-індукованих струмів, які були викликані відповідними дозами ацетилхоліну у відсутності АТФ (Рис.6).

Рис. 6 Вплив різних доз ацетилхоліну на пригнічення ацетилхолінового струму АТФ.

Доза ацетилхоліну виражена як величина іонофоретичного струму (показана в дужках в нА). Інтервали між кожними двома аплікаціями ацетилхоліну були приблизно однакові.

Залежність ефекту пригнічення АХ-індукованого струму від відносної величини АТФ_ та АХ-індукованих струмів . Результати, що були описані вище, стосуються випадків, коли амплітуда АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну була нижча, ніж амплітуда АХ-індукованого струму в контролі. В таких умовах величина АХ-індукованого струму визначалась різницею між амплітудою АХ-індукованого струму в контролі і величиною АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну в більшості нейронів (в деяких нейронах величина АХ-індукованого струму в присутності АТФ була дещо вищою). У незначної кількості нейронів відповіді на аплікацію АТФ (50_100 мкмоль/л) через перфузію перевищували за амплітудою відповіді на іонофоретичні аплікації ацетилхоліну. Такі відповіді спостерігались незалежно від того, який внутрішньоклітинний розчин застосовувався в експерименті: були чи не були присутні у внутрішньоклітинному розчині трифосфати (АТФ (2 ммоль/л) і ГТФ (0.2 ммоль/л)); а також від того, за допомогою якої методики була проведена реєстрація: стандартної методики петч_клемп в конфігурації “ціла клітина” або модифікованої методики “perforated patch”. У таких випадках аплікації ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму викликали відповіді, які були значно менші по величині, ніж відповіді в контролі, хоча сумарний АТФ+АХ-індукований струм був вищим, ніж амплітуда струмів, викликаних аплікаціями тільки АТФ або тільки ацетилхоліну.

При одночасній аплікації ацетилхоліну і АТФ під тиском, значення АТФ+АХ-індукованого струму дорівнювало значенню більшого струму, що спостерігався при аплікації тільки ацетилхоліну чи тільки АТФ при різних концентраціях даних речовин.

Вплив реактиву синього 2 на ефект пригнічення АХ-індукованого струму АТФ. Реактив синій 2 викликав підвищення амплітуди АТФ-індукованого струму і часткове пригнічення АХ-індукованого струму (розглянуто вище). При аплікаціях ацетилхоліну на фоні АТФ-індукованого струму в присутності реактиву синього 2 спостерігалось зменшення амплітуди АХ-індукованого струму пропорціонально до величини АТФ-індукованого струму, за контрольне значення приймали амплітуду АХ-індукованого струму в розчині реактиву синього 2 у відсутності АТФ. За величину АТФ-індукованого струму приймали значення струму в момент аплікації ацетилхоліну.

Дія форсколіну на АХ_ та АТФ-індуковані струми . Відомо, що фізіологічні ефекти АТФ можуть бути опосередковані активацією або пригніченням аденілат циклази (Sato et al., 1992; Zimmerman, 1994). Було проведено серію експериментів по вивченню можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на АХ_ та АТФ-індуковані струми. Було проведено серію експериментів по вивченню можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на АХ_ і АТФ-індуковані струми. Підвищення внутрішньоклітинної концентрації цАМФ викликали шляхом преінкубації нейронів протягом 5_20 хв. у розчині форсколіну, акти-ватора аденілат циклази (10_20 мкмоль/л). Форсколін у вищезазначених концентраціях не мав впливу на струми , що були викликані аплікаціями АТФ (3 нейрони) та ацетилхоліну (7 нейронів).

Дія блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми . Оскільки при одночасній аплікації ацетилхоліну і АТФ амтлітуда сумарного струму не перевищувала значення одного з двох (АХ_ або АТФ_індукованих струмів), і не спостерігалось сумації струмів, була розглянута можливість того, що АТФ або безпосередньо активує НХР, або через активацію пуринорецепторів керує іонним каналом НХР. Для перевірки цієї гіпотезу були використані НХР. Триметафан (30 мкмоль/л, n=5)-- конкурентний блокатор НХР (Asher et al., 1979; Меліщук, 1993) (Рис.7) та блокатори відкритого іонного каналу гексаметоній (50 мкмоль/л, n=6) (Vanner and Suprenant, 1990; Меліщук, 1993) та d тубокурарин (20 50 мкмоль/л, n=4) (Меліщук, 1993) ніяк не впливали на АТФ-індуковані струми (50 100 мкмоль/л).

Рис. 7 Дія триметафану на АТФ_ та АХ-індуковані струми.

У той же час дані блокатори у вищезгаданих концентраціях повністю оборотно блокували АХ-індуковані струми у присутності і у відсутністі АТФ. Відсутність впливу блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми показує, що дані струми, а також, “оклюзія” АХ-індукованого струму, не є наслідком активації НХР АТФ або відкрвання іонних каналів НХР в результаті активації пуринорецепторів.

ОБГОВОРЕННЯ

Два типи вхідних АТФ-індукованих струмів, що швидко наростають. Відомо, що ацетилхолін є основним швидким збуджуючим передавачем у нейронах ентеральних гангліїв (Wood, 1989). Тому не виключалась можливість. що в нейронах ПС АТФ-індуковані струми виникають у результаті активації НХР. Але, як показали результати експериментів, АТФ-індуковані струми є результатом активації специфічних пуринорецепторів. Ці рецептори відмінні від НХР, тому що: а) АТФ-індуковані струми виникають у відповідь на аплікацію АТФ в умовах, коли НХР знаходяться в десенситизованому стані внаслідок тривалої аплікації ацетилхоліну; б) АТФ-індуковані струми не пригнічуються як конкурентними, так і неконкурентними блокаторами НХР; в) АТФ-індуковані струми і АХ-індуковані струми реверсують при різних потенціалах (в умовах, коли основним внутрішньоклітинним катіоном є Cs⁺, потенціал реверсії АТФ-індукованого струму складав 27.5±2.5 і 16.7±2.7 мВ в залежності від концентрації АТФ відповідно 50 мкмоль/л і 1 ммоль/л, коли для ацетилхолінового струму потенціал реверсії становив 2.8±1.1 мВ (Меліщук, 1993). г) канали НХР та пуринорецепторів мають різну проникність для катіонів, оскільки при позитивних мембранних потенціалах аплікація ацетилхоліну не викликала появи струму, в той час коли аплікація АТФ викликала вихідні струми амплітудою до 50% амплітуди вихідного АТФ-індукованого струму при мембранному потенціалі _50 мВ.

Швидка активація цих струмів і незначна затримка між початком аплікації та початком струму, яка була такою ж, як і для АХ-індукованих струмів, говорять про те, що пуринорецептори в нейронах ПС належать до родини йонотропних рецепторів. На користь цього висновку також свідчить стабільність протягом одної_двох годин вхідних АТФ-індукованих струмів, що швидко наростають, у дослідах, що були проведенні з використанням внутрішньоклітинних розчинів, які не містили трифосфатів (АТФ (2 ммоль/л) та ГТФ (0.2 ммоль/л.)) і у випадку заміщення ГТФ на ГТФS. Така стабільність відповідей на дію агоністів характерна для струмів, що виникають у результаті активації йонотропних рецепторів (Derkach et al., 1989).

Два типи вхідних струмів можуть свідчити про існування двох різних підтипів пуринорецепторів. Наші результати можна порівняти з даними, що були отримані на міентеральних нейронах, де також спостерігалось два типи відповідей на АТФ, що мали, як і в нашому випадку, різну десенситизацію, і які крім того, мали різний профіль активності агоністів (Zhou and Galligan, 1996). На основі цих даних більш вірогідним здається існування в нейронах ПС двох різних підтипів Р_2X_пуринорецепторів, які є йонотропними рецепторами.

Повільні вихідні АТФ-індуковані струми . Той факт, що повільні вихідні АТФ-індуковані струми спостерігались, після виключення аплікації, коли АТФ був відсутній у зовнішньоклітинному середовищі, свідчить, що генерація даних струмів пов`язана з активністю внутрішньоклітинних вторинних посередників. Такі струми мали місце лише у випадку використання внутрішньоклітинного розчину на основі іонів К⁺, і їх стабільність у процесі реєстрації залежала від присутності у внутрішньоклітинному розчині АТФ та ГТФ. В експериментах із застосуванням внутрішньоклітинних досліджень в деяких нейронах аплікація АТФ викликала повільну гіперполяризацію внаслідок активації Са²⁺_залежних К⁺_каналів (Katayama and Morita, 1989; Barajas-Lopez et al., 1994), і відкривання цих каналів здійснюється за участю G_білків у результаті активації особливих Р_2Y_пуринорецепторів Такі рецептори є у частини АН_нейронів ПС (Barajas-Lopez et al., 1994) та міентерального сплетіння (Katayama and Morita, 1989), і відмінні від іонотропних пуринорецепторів, які також присутні в даних нейронах. Порівнюючи результати, які були отримані в даній роботі, з даними, отриманими за допомогою внутрішньоклітинних відведень, можна припустити, що повільні вихідні струми виникають в результаті активації Р_2Y_пуринорецепторів, які через активацію G_білків керують Са²⁺_залежною К⁺_провідністю. Той факт, що повільні вихідні струми спостерігались лише у незначної частини нейронів, узгоджується з відносно малою долею АН_нейронів у ганліях ПС (Surprenant, 1984a,b).

Концентраційна залежність АТФ-індукованих струмів

Пуринорицептори нейронів ПС мали чутливість до АТФ, близьку до чутливості пуринорецепторів деяких вегетативних гангліїв, наприклад, верхнього шийного ганглія щура. Пуринорецептори нейронів ПС були менш чутливі до АТФ ніж пуринорецептори нейронів гангліїв дорсальнних корінців (Robertson et al., 1996), симпатичних нейронів жаби_бика (Bean et al., 1990), нейронів вузловатого ганглія щура, сонячного сплетіння морської свинки (Khakh et al., 1995a), сенсорних нейронів щура та кішки (Krishtal et al., 1983) і нейронів спірального органа морської свинки (Nakagawa et al., 1990) ЕC₅₀ для цих об'єктів складала від 2.7 до 12 мкмоль/л. Але пуринорецептори ПС були значно більш чутливі до АТФ, ніж пуринорецептори нейронів центральної нервової системи_ трігемінального мезенцефального ядра (ЕС₅₀=437 мкмоль/л).

Ефекти двовалентних катіонів

Підвищення амплітуди АТФ-індукованого струму після вилучення двовалентних катіонів спостерігалось і на інших об`єктах, але цей ефект був більш вагомим, ніж у представлених результатах. На культуральних нейронах інтракардіальних парасимпатичних гангліїв щура спостерігалось двократне збільщення амплітуди АТФ-індукованих струмів після вилучення Са<sup>2+</sup> і Mg<sup>2+</sup> із зовнішньоклітинного розчину (Fiber and Adams, 1991). Вхідні АТФ-індуковані струми в безкальцієвому зовнішньоклітинному розчині були вищими за струми в нормальному розчині і в зовнішніх волоскових клітинах спірального органа морської свинки (Raybould and Housley, 1997). Пригнічення АТФ-індукованого струму підвищенням зовнішньоклітинної концентрації іонів Са<sup>2+</sup> в межах 0.3_30 ммоль/л спостерігалось у клітинах, які експресували Р<sub>2Х2</sub>_пуринорецептори клітин РС12, у той же час, у клітинах які експресували Р<sub>2Х1</sub>_пуринорецептори міоцитів сечового міхура людини, такого ефекту зареєстровано не було (Evans et al., 1996). Рівень десенситизації пуринорецепторів в сенсорних нейронах, що були експресовані в ооцитах Xenopus laevis, залежав від присутності іонів Са<sup>2+</sup> у зовнішньоклітинному розчині (King et al., 1997). Ефект зменшення амплітуди струму в присутності двовалентних катіонів характерний не тільки для пуринорецепторів, а і інших іонотропних рецепторів, зокрема, НХР смугастих м`язів. Цей ефект може бути пояснений більш повільним проходженням двовалентних катіонів у порівнянні з іонами Na⁺ через неселективний катіонний канал , і в момент проходження двовалентним катіоном канал закритий для проходження Na⁺, що приводить до зменшення середнього струму через іонний канал. Другий можливий механізм пригнічення струму може полягати в наявності ділянки зв`язування двовалентних катіонів Са²⁺ або Mg²⁺ в межах катіонного каналу (Hille, 1984).

Ефекти агоністів та структурних аналогів АТФ.

Той факт, що аплікація аденозину не викликала помітних відповідей, і у той час, аплікація АТФ обумовлювала генерацію трансмембранного струму, говорить про те, що АТФ-індуковані струми виникають у результаті активації пуринорецепторів Р₂_підтипу. Відомі агоністи Р_2Х_пуринорецепторів _Ме_АТФ та _Ме_АТФ (Khakh et al., 1995b) не викликали струму в концентрації 100 мкмоль/л. Відсутність ефекту (або дуже низька ефективність) при аплікації _Ме_АТФ та _Ме_АТФ характерна для більшості нейрональних пуринорецепторів (Khakh et al., 1995a, 1997; Fieber and Adams, 1991; Allen and Burnstock, 1990; Barajas_Lopez et al., 1994, 1995; Ueno et al., 1992; Buell et al., 1995; Lewis et al., 1995; Seguela et al.,1996; Soto et al., 1996; Bo et al., 1995). Поясненням зменшення АТФ-індукованого струму в присутності _Ме_АТФ може бути десенситизація популяції пуринорецепторів (Khakh et al., 1995; Fieber and Adams, 1990; Аllen and Burnstock, 1991) або антагоністичний ефект _Ме_АТФ (Khakh et al., 1995).

Ефекти блокаторів Р2_пуринорецепторів.

Неселективний блокатор Р₂_пуринорецепторів сурамін у даній роботі не справляв помітного впливу на величину АТФ-індукованих струмів, хоча і прискорював їх наростання. Відсутність блокуючої дії сураміну спостерігалась також і в нейронах міентерального сплетіння, де сурамін, навпаки, підсилював струми, що були викликані аплікацією АТФ (Barajas_Lopez et al., 1993; Barajas_Lopez et al., 1996)

У нейронах обох ентеральних сплетінь, пiдслизового та мiентерального, дiя сурамiну на АТФ_iндукованi струми вiдрiзнялась вiд його ефектiв на АТФ_керованi iоннi канали iнших об'єктів таких, як гладенькi м'язи (Dunn et al., 1988; Leff et al., 1990; Urbanek et al., 1990), клiтини PC12 (Inoue et al., 1991), нейрони симпатичних (Nakazawa, 1994a; Cloues et al., 1993; Evans et al., 1994; Khakh et al., 1995a) та сенсорних (Li et al., 1993; Li et al., 1997b) ганглiiв, нейронів центральної нервової системи (Inoue et al., 1992; Khakh et al., 1997), а також на рекомбiнантнi рецептори (Seguela et al., 1996).

Блокатор Р_2Y_пуринорецепторів реактив синій 2 (Abbracchio and Burnstock, 1994) викликав незначне пригнічення АТФ-індукованого струму лише при тривалій преінкубації (до 20 хв. ) нейронів у розчині блокатора. Коли реактив синій 2 добавляли в розчин разом з АТФ, або аплікацію АТФ проводили після короткотривалої преінкубації нейронів у розчині цього блокатора, спостерігалось помітне підсилення АТФ_відповіді. Подібний ефект реактив синій 2 проявляв на культурі інтракардіальних нейронів морської свинки (Allen and Burnstock, 1991) і нейронах міентерального сплетіння (Barajas_Lopez et al., 1996). На деяких інших об`єктах реактив синій 2 проявляв блокуючий ефект на АТФ-індуковані струми. Наприклад, у нейронах гангліїв дорсальних корінців жаби_бика (Li et al.,1997) і у культурі нейронів верхнього шийного і вузловатого гангліїв щура та сонячного сплетіння морської свинки (Khakh et al., 1995a).

Сурамін та реактив синій 2 потенціювали відповіді на аплікацію агоністів і в дослідах з експресованими Р_2Х2_пуринорецепторами (Bo et al., 1995). Відсутність сильної блокуючої дії реактиву синього 2 на АТФ-індуковані струми в наших експериментах свідчать, що пуринорецептори в нейронах ПС не належать до підтипу_Р_2Y.

Пригнічення АХ-індукованих струмів АТФ.

Ефект “оклюзії” спостерігався тільки у випадку струмів, які були викликані в результаті активації НХР. При аплікації АТФ на фоні повільних вихідних струмів, які з`являлись у результаті активації мускаринових холінорецепторів або Р<sub>2Y</sub>_пуринорецепторів, величина сумарного струму визначалась алгебраїчною сумою цих струмів. Для пояснення “оклюзії” АТФ-індукованих струмів і АХ-індукованих струмів можна припустити або пряму взаємодію АТФ з НХР, або дію АТФ через активацію пуринорецепторів, тобто існує зв`язок між НХР і пуринорецепторами_ безпосередній чи через систему вторинних посередників. На деяких об`єктах ефекти АТФ можна пояснити безпосередньою активацією НХР (Nakazawa, 1994a; Nakazawa and Inoue, 1993; Igusa, 1988).

Було проведено серію експериментів для перевірки прямої дії АТФ на НХР і, як показали результати цих досліджень, ефект пригнічення АХ-індукованого струму неможливо пояснити такою взаємодією, а також блокуванням АТФ _ пізнаючого центра чи іонного каналу НХР. Доказами відсутності такої взаємодії є: а) відсутність дії болкаторів НХР, як конкурентного-- триметафану так і неконкурентних-- d_тубокурарину та гексометонію; б) залежність пригнічення АХ-індукованого струму від величини АТФ-індукованого струму в момент аплікації ацетилхоліну, а не від концентрації АТФ; в) відсутність впливу АТФ на АХ-індукований струм у нейронах, що не відповідали на АТФ і відсутність впливу на АХ-індуковані струми неактивних аналогів АТФ. З другого боку, цей ефект неможливо пояснити блокуванням пуринорецепторів ацетилхоліном, оскільки АТФ-індуковані струми в присутності ацетилхоліну, під час тривалих аплікацій, мали таке ж значення, як і в контролі, у той час, коли в результаті десенситизації НХР АХ-індуковані струми не спостерігались.

Не виключена можливість, що ефект пригнічення АХ-індукованого струму АТФ здійснюється у результаті залучення інших рецепторів, які активуються АТФ. В ентеральних нейронах, зокрема у нейронах міентерального сплетіння, присутні метаботропні Р_2Y_пуринорецептори, яктивація яких призводить до підвищення внутрішньоклітинної концентрації іонів Са²⁺; ці рецептори чутливі до блокатора Р_2Y_пуринорецепторів реактиву синього 2 (Christofi et al., 1997; Kimball et al., 1996). У нейронах обох ентеральних сплетіннь є аденозинові рецептори. Біологічний ефект активації цих рецепторів зійснюється шляхом активації аденілатциклази і, як наслідок, підвищення внутрішньоклітинного рівня цАМФ (Wood et al., 1985; Barajas_Lopez, 1993; Xia et al., 1997). Для перевірки гіпотези про залучення вищезгаданих рецепторів було вивчено вплив реактиву синього 2 на ефект пригнічення АХ-індукованого струму, а також дію аденозину на АХ-індуковані струми . Як показали результати експериментів, припущення про участь цих рецепторів не підтвердилось.

АТФ може здійснювати біологічні ефекти шляхом активації або пригнічення аденілатциклази (Sato et al.,1992). Влив АТФ на НХР за участю вторинних посередників спостерігався в клітинах скелетних м`язів (Lu and Smith, 1991). Для вивчення можливого впливу внутрішньоклітинного рівня цАМФ на швидкі АТФ_ та АХ-індуковані струми , було дослідженно дію форсколіну, активатора аденілатциклази (Seamon and Daly, 1981; Kilmer and Garsen, 1984; Laurenza et al., 1989). У представлених результатах форсколін не впливав ні на АХ_, ні на АТФ-індуковані струми. Ці дані свідчать, що в регуляцію активності НХР та Р₂_пуринорецепторів не включаються механізми за участю цАМФ. “Оклюзію” АХ-індукованого струму неможливо пояснити дією вторинних посередників, оскільки ефект розвивається за дуже короткий час (менший ніж час наростання АТФ_ чи АХ-індукованого струму до пікового значення). Для ефектів, які здійснюються за участю вторинних посередників, потрібний значно більший час. З другого боку, ефект пригнічення залишається незмінним (відсутній “rundown”) в процесі тривалої (1_3 год) реєстрації петч_клемп у конфігурації “ціла клітина” в умовах, коли у внутрішньоклітинному розчині відсутні АТФ і ГТФ, або присутній ГТФ--S.

Отже, найбільш вірогідним поясненням ефекту “оклюзії” є припущення про існування прямого зв`язку між НХР та Р₂_пуринорецепторами. Активація одного рецептора, НХР або Р₂_пуринорецептора, робить неактивним інший, або обумовлює закривання іонного каналу, що керується іншим рецептором.

Ефекти блокаторів НХР.

Відсутність дії гексаметонію на АТФ-індуковані струми узгоджується з результатами дослідів на культурі нейронів ПС, що були проведені методом внутрішньоклітинних відведень, де АТФ_індукована деполяризація була резистентною до дії даного блокатора (Barajas Lopez et al., 1994). Відсутність дії блокаторів НХР на АТФ-індуковані струми свідчить, що ці струми не є результатом дії АТФ на нікотинові холінорецептори. У протиположність цьому, на об`єктах, де АТФ безпосередньо активував НХР, АТФ-індуковані струми пригнічувались блокаторами НХР (Igusa, 1988)

Можлива фізіологічна роль пуринорецепторів у нейронах ПС

Припущення про можливу участь АТФ у синаптичній передачі між нейронами ПС підтверджує також той факт, що АТФ може виділятися із ентеральних нервів у фізіологічних умовах (Burnstock 1972, 1981; White, 1982, 1988; White and Leslie, 1982). Присутність іонотропних Р₂_пуринорецепторів на мембрані соми нейронів ПС дозволяє припустити, що АТФ може приймати участь у швидкій збуджуючій нехолінергічній передачі в ролі нейропередавача в міжнейрональних синапсах гангліїв ПС. Існування нейронів, які містять пуринорецептори і не містять НХР, дає підстави вважати пуринергічну передачу в цих нейронах основною збуджуючою передачею. На основі отриманих результатів можна припустити, що АТФ також може виконувати роль повільного гальмівного нейропередавача в деяких нейронах (можливо АН_нейронах) гангліїв ПС тонкого кишечника морської свинки.

Порівняння пуринорецепторів нейронів ПС з пуринорецепторами інших об`єктів

Р_2X_пуринорецептори, що швидко десенситизуються, по кінетичним характеристикам схожі на клоновані пуринорецептори Р_2Х1_ та Р_2Х3_підтипів, а також на нативні пуринорецептори гладеньких м'язів та сенсорних нейронів (Krishtal et al., 1983; Bean et al., 1990; Bean, 1992), які десенситизуються протягом секунд у присутності АТФ. Р_2X_пуринорецептори ПС, що десенситизуються повільно, по ряду активності агоністів та десенситизації нагадують клоновані пуринорецептори Р_2Х2 та Р_2Х5 підтипів, а також пуринорецептори клітин РС12, інтракардіальних парасимпатичних і, у меншій мірі, симпатичних нейронів.

ВИСНОВКИ

1. За допомогою стандартного методу фіксації потенціалу петч_клемп у конфігурації “ціла клітина” та модифікованої методики “perforated patch” було досліджено АТФ-індуковані струми в нейронах підслизового сплетіння тонкого кишечнику морської свинки. Показано, що аплікація АТФ викликає в більшості нейронів вхідні катіонні струми, пов`язані з підвищенням провідності мембрани внаслідок активації специфічних пуринорецепторів. Вперше показано наявність у даних нейронах двох підтипів іонотропних Р_2X_пуринорецепторів-- з швидкою та повільною десенситизацією. Досліджено електрофізіологічні властивості Р_2X_пуринорецепторів з повільною десентизацією, які присутні в більшості нейронів підслизового сплетіння. Дані пуринорецептори за електрофізіологічними та фармакологічними властивостями схожі з Р₂_пуринорецепторами інших інтрамуральних гангліїв і за фармакологічним профілем відмінні від пурнинорецепторів екстрамуральних гангліїв.

2. Вперше для даних нейронів методом петч_клемп зареєстровані повільні вихідні К⁺_струми, які виникають у деяких нейронах внаслідок активації Р_2Y_пуринорецепторів, що зв`язані з G_білками.

3. Вивчено дію на АТФ-індуковані струми блокаторів Р₂_пуринорецепторів сураміну та реактиву синього 2, а також класичних блокаторів нікотинових холінорецепторів триметафану, гексаметонію та d_тубокурарину. Показано, що реактив синій 2 підвищує амплітуду АТФ-індукованого струму, а сурамін прискорює наростання струму без впливу на амплітуду. Блокатори нікотинових холінорецепторів не впливають на відповіді на аплікацію АТФ, і в той же час повністю пригнічують ацетилхолінові струми як в присутності, так і у відсутності АТФ. Дані результати свідчать, що АТФ діє через рецептори, які відмінні від НХР, і дані рецептори мають унікальні фармакологічні характеристики.

4. Вперше зареєстровано ефект пригнічення АХ-індукованих струмів АТФ, який не пов'язаний із взаємодією АТФ безпосередньо з НХР. Висунуто припущення, що пуринорецептори та НХР функціонують у взаємному зв'язку.

5. Результати роботи дозволяють припустити, що АТФ може приймати участь у синаптичній передачі в якості швидкого збуджуючого нейропередавача в більшості нейронів підслизового сплетіння, діючи на іонотропні Р₂_пуринорецептори двох типів, а також у деяких нейронах може діяти як повільний гальмівний передавач, підвищуючи рівень К⁺_провідності в результаті активації метаботропних Р_2Y_пуринорецепторів.

Перелік робіт, опублікованих за матеріалами дисертації

Статті:

Глушаков А.В., Мелищук А.И., Скок В.И. АТФ_индуцированные токи в нейронах подслизистого сплетения морской свинки// Нейрофизиология. _1996. _Т. 28. _№ 2/3. _С. 100_110.

Глушаков О.В., Глушакова О.Ю., Скок В.І. Два типи Р_2х_пуринорецепторів у нейронах підсли-зового сплетеннятонкого кишечнику морської свинки// Нейрофизиология. _1998. _№ 4/5. _С. 301_304.

Glushakov A.V., Glushakova H.Y., Skok V.I. Modulation of nicotinic acethylcholine receptor activity in submucous neurons by intracellular messengers// J. Auton. Nerv. Syst. -1999 _Т. 75. _С. 16-22.

Glushakov A., Glushakova H., The role of phosphorylation in тicotinic acetylcholine receptor activity// Neurophysiology _1997. _Т. 29. _№ 4/5. _С. 367.

АНОТАЦІЯ

Глушаков А.В. АТФ_индуцированные токи в нейронах подслизистого сплетения тонкого кишечника морской свинки. - Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02_биофизика, Институт физиологии им. А.А. Богомольца, НАН Украины, Киев, 1999.

При помощи метода фиксации потенциала пэтч_клэмп в стандартной конфигурации “целая клетика” и модифицированной-- “perforated patch”, исследованы АТФ_индуцированные токи в диссоциированных нейронах подслизистого сплетения тонкого кишечника морской свинки. При потенциале на мембране -50 мВ аппликации АТФ (50_500 мкмоль/л) через перфузирующий раствор вызывала трансмембранные токи, связанные с повышением проводимости мембраны, в 68% (n=82) нейронов. При исспользовании аппликации АТФ под давлением в концентрации 50_1000 мкмоль/л, или ионофоретической аппликации наблюдались два типа входящих АТФ_индуцированных токов с быстрым наростанием в большинстве исследованых нейронов (98%, n=56). Кроме того, в некоторых нейронах (10%, n=26) наблюдались также медленные выходящие K⁺_токи, вызванные в результате активации связанных с G_белками P_2Y_пуринорецепторов. Ко всем исследованным нейронам применяли также аппликации ацетилхолина (АХ) ионофоретические или под давлением в концентрации 50-300 мкмоль/л, которые вызывали в большинстве нейронов быстрые входящие катионные токи, связанные с активацией никотиновых холинорецепторов (НХР), а также в некотрых нейронах- медленные выходящие K⁺_токи, в результате активации мускариновых холинорецепторов. В большинстве нейронов наблюдались ответы как на АТФ, так и на АХ (103 из 146 исследованных нейронов), но имели место нейроны, которые отвечали только на АТФ (8 из 146), или только на АХ (30 из 146), или не отвечали ни на одно из данных веществ. Быстрые АТФ- и АХ_индуцированные токи возникали независимо от того присутствовали или нет во внутриклеточном растворе ГТФ (0.2 ммоль/л)и АТФ (2 ммоль/л), или когда ГТФ был замещен ГТФS в еквимолярной концентрации. 90% нейронов, чувствительных к АТФ, содержали P_2X_пуринорецепторы, которые характеризовались медленной десенситизацией. В данных нейронах полной десенситизации P_2X_пуринорецепторов не наблюдалось при длительных (несколько минут) аппликациях АТФ (200 мкмоль/л). Аппликации через перфузирующий раствор аналогов АТФ: _имидо_АТФ, _метилен_АТФ и _метилен_АТФ в концентрациях 100 мкмоль/л, а также активатора Р₁_пуринорецепторов аденозина (100-300 мкмоль/л)не вызывали в данных нейронах генерации ионных токов. Концентрация, вызывающая полумаксимальный ответ (ЕС₅₀) составляла 45.73.5 мкмоль/л, коэффициетнт Хилла равен в среднем 2. Избирательный блокатор Р_2Y_пуринорецепторов реактив синий 2 (30_100 мкмоль/л) увеличивал амплитуду АТФ_индуцированного тока, а также частично обратимо угнетал АХ-индуцированный ток. Амплитуда АТФ_индуцированного тока в присутствии реактива синего 2 (30 мкмоль/л) составляла110-130% контрольного значения. Неселективный блокатор Р2_пуринорецепторов сурамин (50_200 мкмоль/л) уменьшал время наростанния АТФ_ индуцированного тока до максимального значения без влияния на амплитуду тока и не оказывал влияния на АХ_индуцированные токи. В 10% нейронов, чувствительных к АТФ, P_2X_пуринорецепторы характеризовались быстрой десенситизацией. АТФ (50 мкмоль/л) и _метилен_АТФ (100 мкмоль/л) вызывали в данных нейронах подобные токи с быстрым (около секунды) спадом в присутствии АТФ. Время полного восстановления этих рецепторов из десенситизированого состояния составляло несколько минут. Во всех случаях АТФ и АХ не вызывали перекрестной десенситизации соответственно НХР и пуринорецепторов. При аппликациях АТФ одновременно с АХ во всех исследованных нейронах наблюдалась генерация токов (АТФ+АХ-индуцированные токи), амплитуда которых не была равна сумме контрольных значений АТФ- и АХ-токов. В большинстве случаев амплитуда АТФ+АХ_индуцированного тока не превышала амплитуды большего тока- АТФ- или АХ_индуцированного тока, то есть наблюдалась взаимная окклюзия этих токов. Данный эффект наблюдался как в присутствии, так и в отсутствии во внутриклеточном растворе ГТФ (или ГТФS, 0.2 ммоль/л) и АТФ (2 ммоль/л). Не наблюдалось взаимной окклюзии в случае АТФ_индуцированного тока и медленных АТФ- или АХ-индуцированных K⁺_токов. В нейронах, которые не генерировали АТФ_индуцированных токов аппликации АХ в присутствии АТФ (100_500 мкмоль/л) вызывала такие же ответы, как и в контроле. Аналоги АТФ: _имидо_АТФ, _метилен_АТФ и _метилен_АТФ в концентрациях 100 мкмоль/л, а также активатор Р₁_пуринорецепторов аденозина (100_300 мкмоль/л), которые не вызывали ионных токов, не оказывали заметного влияния на АХ_индуцированный ток. Блокатор P_2Y_пуринорецепторов реактив синий 2 (30 мкмоль/л не устранял эффекта окклюзии. Активатор аденилат циклазы форсколин (10 мкмоль/л) не оказывал заметного влияния ни на АТФ_, ни на АХ_индуцированные токи. Блокаторы НХР триметафан (30 мкмоль/л), гексаметоний (50 мкмоль/л)и d_тубокурарин (40 мкмоль/л)не оказывали влияния на АТФ-индуцированные токи, но в тоже время полностью блокировали АХ-индуцированные токи как в присутствии, так и в отсутствии АТФ. Данные результаты показывают, что угнетение активности НХР и Р_2X_пуринорецепторов в результате активации этих рецепторов АТФ- не связан с взаимодействием АТФ непосредственно с НХР.