Роль потенціал-керованих кальцієвих каналів в гальмівній синаптичній передачі культивованих нейронів гіпокампу щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

20

Національна Академія Наук України

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Роль потенціал-керованих кальцієвих каналів в гальмівній синаптичній передачі культивованих нейронів гіпокампу щурів

03.00.13- фізіологія людини та тварин

Ісаєва Олена Валентинівна

Київ-1999 р.

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник:

Доктор біологічних наук Веселовський Микола Сергійович провідний науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти:

Академік НАН України, доктор біологічних наук, зав. відділом фізико-хімічної біології клітинних мембран інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України Кришталь Олег Олександрович

Доктор медичних наук, керівник Центру доклінічного вивчення лікарських засобів Фармакологічного комітету МОЗ України Соловйов Анатолій Іванович

Провідна установа інститут герантології АМН України, м.Київ

Захист відбудеться “ 8 ” червня 1999 р. о 14-00 годині на засідані спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН

України, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці інституту фізіології ім. О.О. Богомольця,м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий " 23 " квітня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор біологічних наук З.О. Сорокіна-Маріна

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. Згідно з сучасними уявленнями, в основі складної функціональної організації центральної нервової системи лежить тонка взаємодія між двома основними процесами - збудженням та гальмуванням. Як збудження, так і гальмування у ЦНС забезпечується хімічними нейропередатчиками (медіаторами), здатними взаємодіяти з відповідними рецепторними утвореннями нейрональних мембран. Стан медіаторних процесів, постійна взаємодія між ними має принципове значення для нормального функціонування мозку.

У фізіології здійснення синаптичної передачі нейронів центральної нервової системи існує велика кількість нерозв'язаних питань, що стосуються контролю вивільнення нейромедіатора опосередкованого входом іонів Са2+ у пресинаптичне закінчення через потенціал-керовані кальцієві канали. Оскільки пресинаптичні нервові закінчення більшості нейрональних типів клітин є недосяжними для прямих електрофізіологічних досліджень, біофізичні властивості кальцієвих каналів, локалізованих у пресинаптичних терміналях, вивчені тільки на невеликої кількості об'єктів безхребетних (Edmonds et al., 1990; Augustine et al., 1987) та хребетних (Lemos and Nowycky, 1989; Yawo, 1990; Stanley and Goping, 1991). Для ідентифікації різноманітних типів кальцієвих каналів, які опосередковують синаптичну передачу, найбільш часто використовують фармакологічний підхід (Taschenberger et al., 1995; Wheeler et al., 1994; Akaike, 1997). Більшість досліджень у цій галузі присвячено збуджуючій синаптичній передачі, тоді як участь кальцієвих каналів в гальмівній синаптичній передачі вивчена не достатньо. В останній час стало відомо, що як для різноманітних типів нейронів, так і в межах однієї і тієї ж популяції нервових клітин, вивільнення одного і того ж медіатора може контролюватися різноманітними типами кальцієвих каналів. Фізіологічна роль такого різноманіття ще не до кінця виявлена. Ця обставина, поряд з найважливішою роллю синаптичних процесів у численних фізіологічних реакціях організму зумовлює необхідність ретельного дослідження загальних властивостей синаптичної передачі, її механізму та пошуку засобів вибіркового фармакологічного впливу на процеси, які лежать в її основі.

Модельним об'єктом для наших досліджень була обрана первинна культура малої щільності нейронів гіпокампу щурів. Така модель для дослідження гальмівної синаптичної передачі має багато переваг: присутність інтернейронів (гальмівних пресинаптичних клітин) та пірамідних нейронів (постсинаптичних клітин) в культурі та можливість дослідженння гальмівної синаптичної передачі індивідуальної пари нейронів, можливість локальної стимуляції поодинакого нейрита (аксона) та локальної перфузії на обмежену площину, у яку входила тільки пара нейронів, що досліджувалась. Більш того, на мембрані гальмівних нейронів гіпокампу була виявлена одночасна наявність декількох типів потенціал-керованих кальцієвих каналів (Lambert and Wilson, 1996), що дає можливість дослідження участі різних типів кальцієвих каналів в гальмівній синаптичній передачі.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було дослідження викликаних гальмівних постсинаптичних струмів (вГПСС) у процесі розвитку культури нейронів гіпокампу щурів, вивчення їхніх основних электрофізичних та фармакологічних характеристик, а також з'ясування ролі різноманітних потенціал-керованих кальцієвих каналів у гальмівній синаптичній передачі.

Задачі:

1. З використанням методики “петч-клемп” у конфігурації “ціла клітина” і засобу прямої позаклітинної стимуляції нейритів вивчити властивості гальмівних постсинаптичних струмів в процесі розвитку нейронів in vitro.

2. Ідентифікувати типи потенціал-керованих кальцієвих каналів, що лежать в основі кальцієвої провідністі нейронів гіпокампу.

3. Дослідити участь потенціал-керованих кальцієвих каналів у гальмівній синаптичній передачі.

Наукова новизна одержаних результатів. Реєстрація кінетичних характеристик іоних струмів та статистичний аналіз флуктуацій ГПСС на різних етапах культивування дозволили простежити динаміку розвитку гальмівних синаптичних зв'язків in vitro. Досліджено вплив різноманітних блокаторів кальцієвої провідності на гальмівну синаптичну передачу. Вперше показано, що нифедіпін блокує синаптичну передачу.

Теоретичне та практичне значення одержаних результатів. Робота має передусім фундаментальний інтерес, оскільки дозволяє глибше зрозуміти закономірності, що лежать в основі утворення синаптичних зв'язків між нейронами в період раннього онтогенеза. Отримані результати також дозволяють істотно поширити уявлення про роль різноманітних потенціал-керованих кальцієвих каналів у гальмівній синаптичній передачі. Нові дані з цього питання є важливими у плані формування більш повного уявлення про механізм, що лежить в основі міжклітинної комунікації. Результати досліджень вказують також на необхідність урахування впливу фармакологічних препаратів, спрямованих на модуляцию кальцієвих струмів, на гальмівну синаптичну передачу.

Особистий внесок здобувача. Приготування культури нейронів гіпокампу та експерименти по дослідженню ролі потенціал-керованих кальцієвих каналів у гальмівній синаптичній передачі були виконаними автором особисто. Експерименти по дослідженню властивостей гальмівних постсинаптичних струмів нейронів у процесі розвитку культури нейронів гіпокампу проводилися спільно з асп. Сидоренко В. Г. У розробці концепції роботи активну участь приймали інші співавтори друкованих робіт.

Апробація результатів дисертації. Основні положення роботи викладались та обговорювались на : ХХVIII Annual Meeting of Neuroscience Society (Los Angeles, 1998); International workshop “Intracellular signaling” (Kiev, 1997); семінарі ін-та Фізіології ім. О. О. Богомольця (1998).

Публікації. За результатами роботи опубліковано три статті та тези двох доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел зі 206 найменувань. Робота викладена на 104 сторінках та ілюстрована 17 рисунками.

Основний зміст дисертації

Матеріали та методи досліджень.

Приготування культури нейронів гіпокампу. Первинна культура нейронів гіпокампу була отримана від новонароджених щурів лінії Вістар. Після обробки 0,025%-тним тріпсином у безкальцієвому та безмагнієвому розчині з фосфатним буфером тканину гіпокампу механічно диспергували за допомогою Пастеровських пипеток. Отриману суспензію клітин висаджували з щільністю 35000 од./см2 на покриті ламініном та полі-L-орнитином чашки Петрі. Нейрони росли та морфологічно диференціювалися впродовж двох тижнів в мінімальній середі Ігла з доданням 10% кіньської сироватки, інсуліну (6 мкг/мл) та антібіотиків при 370С у атмосфері, що містила 5% СО2. Функціональні зв'язки між нейронами утворювалися на 4-6 день куьтивування.

Реєстрація викликаних гальмівних постсинаптичних струмів. Електрофізіологічні дослідження проводилися на 7, 11-14 і 21 день після посадки культури. Для реєстрації гальмівних постсинаптичних струмів використовувалася методика “петч-клемп” у конфігурації “ціла клітина”. Базовий розчин містив (у мМ): NaCl - 140; KCl-3; CaC12 - 2; MgCl2 - 2; HEPES - 20; глюкоза - 30; pH=7,3. В позаклітинний розчин додавалися блокатори НМДА та неНМДА-рецепторів - DNQX та D-APV у кількості 20 мкМ кожний, які блокували збуджуючі постсинаптичні струми. Для заповнення “петч-пипетки” (R=4-6MОм) використовувався розчин наступного складу (у мМ): К-глюконат-100; KCl - 50; MgCl2 - 10; EGTA - 10; HEPES - 20; pH=7,4. Підтримуваний потенціал складав -70 мВ. Стимуляція пресинаптичної клітки здійснювалася позаклітинно з частотою 0,2 Гц за допомогою скляної микропипетки приблизно того ж діаметру, що і “петч-пипетка” (R= 2-4 МОм), заповненої позаклітинним розчином. Нейрит пресинаптичної клітки подразнювався прямокутними імпульсами струму тривалістю 1 мс та амплітудою 0,05 - 1 мкА.

Реєстрація потенціал-керованих кальцієвих струмів. Експерименти проводилися на нейронах 10-12-ти денної культури. Реєстрація кальцієвих струмів проводилася з допомогою методики “петч-клемп” у конфігурації “ціла клітина”.

Позаклітинний розчин мав той самий склад, що і при реєстрації вГПСС. Для пригнічення потенціал-керованих натрієвих каналів у розчин додавався тетродотоксин (ТТХ) у концентрації 1мкМ. Внутрішньопипеточний розчин мав такий склад (у мМ): СsCl - 130, ТЕА-Cl - 10, MgCl2 - 5, CaCl2 - 1, ЕGТА- 10, Tris-Cl - 10; рН доводили до 7,3 додаванням СsОН. Опір петч-пипетки складав 4-8 МОм. Підтримуваний потенціал вариював у залежності від мети експерименту. Струми, що реєструвались, фільтрувались з частотою зрізу 5 кГц та оцифровувались на частоті 1 кГц. Послідовний опір компенсувався апаратно на 50-70 %.

Аплікація блокаторів ГПСС та кальцієвих каналів. Для ідентифікації постсинаптичних рецепторів використовувся блокатор ГАМКА рецепторів - бікукулин. Для фармакологічного розділу кальцієвих струмів використовувались неорганичний блокатор Сd2+, а також специфічні органічні блокатори високопорогових кальцієвих каналів: ніфедіпін - блокатор каналів L-типу, -CTx-GVIA (1мкМ)- селективний блокатор каналів N-типу та -Aga-IVA (200нМ) - блокатор каналів Р-/ Q- типів. Блокатори аплікувались на площу 70-100 мкм2 за засобом, який був описаний раніше [Veselovsky et al., 1996 ].

Обробка одержаних результатів. Обчислення параметрів струмів вироблялося програмою Datasel і AxoScop, а подальша математична обробка даних і побудова рисунків ­ Origin і PageMaker 6.5. Статистична обробка результатів проводилася за допомогою програми Origin.

Результати досліджень

Кінетичні та фармакологічні властивості викликаних гальмівних постсинаптичних струмів. Дослідження властивостей викликаних гальмівних постсинаптичних струмів (вГПСС), що виникають на постсинаптичній мембрані при стимуляції пресинаптичної клітини, були проведені на нейронах культури понад 14 днів in vitro.

При аплікації 1мкM тетродотоксина (TTX) постсинаптична відповідь повністю та зворотно блокувалася, що свідчить про те, що синаптична передача, яка спостерігалася в наших експериментах, була ініційована потенціалом дії, що індуціювався пресинаптичним стимулюванням (рис.1А).

Вольт-амперна характеристика постсинаптичного струму була лінійною у діапазоні зміни підтримуваного потенціалу від -90 до +20 мВ (рис.1В). Потенціал реверсії вГПСС (-14±5 мВ), одержаний експериментальним шляхом, незначно відрізнявся від рівновісного потенціалу для іонів Cl-, розрахованого по рівнянню Нернста (-19 мВ).

Викликані ГПСС мали повільний спад, що апроксимувався однією експонентою, з постійною часу 21±5 мс.

Прикладання бікукулина у концентрації 20 мкМ викликало повне блокування вГПСС (рис. 1Б).

ВГПСС нейронів у процесі розвитку культури гіпокампу щурів. Для оцінки загальних змін гальмівної синаптичної передачі у процесі диференціювання клітин струми, що реєструвались, усереднювались для кожної вікової групи кліток. Було встановлено, що середня амплітуда вГПСС достовірно збільшувалася з часом культивування нейронів (р< 0,05) (рис.2А).

В процесі культивування нейронів гіпокампу спостерігалося збільшення діапазону варіабельності амплітуд вГПСС (рис. 2Б). Якщо у нейронів першого тижня in vitro розкид амплітуд струмів складав 60 - 230 пА, другого тижня - від 100 до 760 пА, то у клітин третього тижня - від 200 пА до 1,6 нА.

Для оцінки флуктуацій амплітуд вГПСС розраховувалося відносне середнє відхилення значень амплітуд струмів, що реєструвались від кожної пари кліток, для різних етапів культивування (Урбах, 1964). Статистично достовірної зміни цієї характеристики не спостерігалося, і вона вариювала в межах 16,5-18% (рис.2В) .

Участь іонів кальція у гальмівній синаптичній передачі. Крива залежності амплітуди вГПСС від різних концентрацій позаклітинного Ca2+ описувалася рівнянням Хілла, яке забезпечувало адекватну апроксимацію даних (р<0,05) з концентрацією, при якій спостерігалося половинне блокування, 1,68 мМ і коефіцієнтом Хілла 2,64 (рис. 3). Нелінійність відношення між концентрацією позаклітинного Ca2+ і амплітудою вГПСС вказує на “кооперативну” дію іонів кальція на процес вивільнення нейромедіатора.

Два типа кальцієвих струмів у культивованих нейронах гіпокампу. У більшості кліток у розчині, який містив ТТХ, у відповідь на східчасті деполяризучі зміщення мембраного потенціалу від підтримуваного потенціалу -90 мВ виникав Ca2+ струм, який мав на вольт-амперній характеристиці два характерних максимуми при -45±4 мВ і -17±6 мВ, які відповідають низькопороговому та високопороговому Ca2+ струмам (рис. 4). Дія неорганічного блокатора кальцієвих каналів Cd2+ на амплітуду Ca2+ струмів соми та вГПСС. Для дослідження можливої ролі низькопорогового компоненту Ca2+ струму у гальмівній синаптичній передачі використовувався неорганічний блокатор Ca2+ струмів Cd2+. На рис.5А показані вольт-амперні характеристики Ca2+ струмів в контролі та під впливом 10, 20 та 50 мкM Cd2+. Типова реєстрація, що показує зменшення амплітуди вГПСС у результаті аплікації 5 мкM Cd2+ представлена на рис 5Б. На рис. 5В показано доза-залежне пригнічення амплітуди Ca2+ струмів та вГПСС при прикладанні різних концентрацій Cd2+. Видно, що прикладання малих концентрацій цього неорганічного блокатора (10 мкM) викликало сильне зменшення амплітуди високопорогових Ca2+ струмів та вГПСС, і не мало вагомого ефекту на амплітуду низькопорогового компоненту Ca2+ струму.

Дія органічних блокаторів Ca2+ каналів на амплітуду високопорогового Ca2+ струму та вГПСС. Дослідження фармакологічних властивостей різних компонентів високопорогового Ca2+ струму проводилося при зміщенні підтримуваного потенціалу до -60 мВ для досягнення повної стаціонарної інактівації низькопорогових Ca2+ струмів. Для фармакологичного розділення високопорогових Ca2+ струмів та дослідження участі різних типів Ca2+ каналів у гальмівній синаптичній передачі ми використовували специфічні блокатори Ca2+ каналів: ніфедіпін, -CTx-GVIA та -Aga-IVA.

На рисунку 6А показана дія різних концентрацій ніфедіпіна на амплітуди Ca2+ струмів та вГПСС. Видно, що ніфедіпін, що є специфічним блокатором L-типу Ca2+ каналів у концентрації “насичення” - 10 мкM пригнічував амплітуду високопорогового Ca2+ струму на 23±5 %. Амплітуда вГПСС при цьому зменшувалася лише на 4±6%. При аплікації більш високих концентрацій ніфедіпіна (50,100 мкM) амплітуда високопорогового Ca2+ струму блокувалася на 35±11 % та 42±7 %, а вГПСС на 17±3 % та 34±7 %, відповідно. (рис. 6А). Апроксімація кривої доза-ефект впливу ніфедіпіна на амплітуду Ca2+ струму та вГПСС за допомогою рівняння Хілла була статистично не достовірна (p>0,05).

При аплікації 1мкM -CTх-GVIA амплітуда Ca2+ струму зменшувалася на 30 ±5 %, а вГПСС - на 39±6 % (рис. 6Б). Цікаво, що блокування як амплітуди високопорогового Ca2+ струму, так і вГПСС в результаті спільної аплікації 1мкM -CTх-GVIA і 100 мкM ніфедіпіна була нижче, ніж алгебраїчна сума блоку при додатку кожного блокатора окремо. Так, алгебраїчна сума ефектів, при окремому прикладанні ніфедіпіна і -CTх-GVIA була рівна приблизно 72 % для амплітуди Ca2+ струму і 73 % для вГПСС, хоча при спільній аплікації цих двох органічних блокаторів амплітуда Ca2+ струму пригнічувалася на 56±12 %, а вГПСС - на 49±3 % (рис. 6Г). При аплікації -Aga-IVA (200нM) амплітуда Ca2+ струму і вГПСС в середньому зменшувалася на 37±13% і 42 ±6 % (рис.6В).

Спільна аплікація ніфедіпіна (100 мкM), -CTх-GVIA (1мкM) та -Aga-IVA (200нM) викликала зменшення амплітуди Ca2+ струму і вГПСС на 84±5 % і 86±7 %, відповідно (рис. 6Д). На рис. 7 представлена дія різних органічних блокаторів протягом послідовної аплікації на амплітуду вГПСС нейрона гіпокампу на 11 день in vitro.

Обговорення

Гальмівні постсинаптичні струми в культивованих нейронах гіпокампу. Струми, що досліджувались в наших експериментах, були ідентифіковані як хлорні струми, що виникають при активації ГАМК-рецепторів типу А, за потенціалом реверсії та чутливістю до специфічного блокатора цих рецепторів - бікукулину (Barker and Owen, 1986; Curtis, 1970).

В процесі вивчення вГПСС в культурі, що розвивається, було виявлене збільшення середньої амплітуди та діапазона розкиду амплітуд постсинаптичних струмів зі збільшенням віку культури. Як збільшення середніх амплітуд струмів, так і збільшення їхнього розкиду з віком нейронів у культурі можна пояснити збільшенням кількості синаптичних зв'язків між окремими нейронами та ускладненням структури нейрональной мережі в процесі росту і диференцировки нейронів в культурі (Kraszewski and Grantyn, 1992).

В наших дослідженнях амплітуда всіх вГПСС флуктуювала, як це було описано і в попередніх роботах [Bekkers еt al., 1990; Frerking et al., 1995 ]. Ці флуктуації можуть пояснюватися принаймні двома причинами: неоднорідністю розповсюдження потенціалу дії по аксону в силу різних кабельних властивостей окремих його гілок [Grantin et al.,1983], або квантовими властивостями окремих синаптичних контактів [Kettenmann et al.,1992]. Враховуючи те, що з віком культури суттєво змінюється архітектоніка окремих нейронів і структура синаптичних зв'язків між ними [Banker and Goslin,1991; Warton et al.,1990], можна було б припустити, що це відіб'ється в зміні варіабельністі відповідей окремих синаптичних зв'язків. Проте амплітуди постсинаптичної відповіді для кожної окремої пари нейронів мали постійний рівень флуктуацій як при простій (молода культура), так і при складній (доросла культура) нервовій мережі, який складав в середньому 17 %. Виходячи зі сказаного можна вважати, що флуктуації амплітуд вГПСС в кожній окремій реєстрації в наших експериментах були обумовлені ні неоднорідністю розповсюдження потенціалу дії, а, по всій видимості, квантовими властивостями окремих синаптичних контактів.

Участь різних потенціал-керованих Ca2+ каналів у гальмівній синаптичній передачі. Виходячи з одержаних даних, в соматичній мембрані більшості нейронів гіпокампу на 10-12 день культивування були присутні низькопороговий та високопороговий компоненти Ca2+ струму, що відповідає одержаним раніше даним на нейронах, що культивувались, і свіжоізольованих нейронах гіпокампу щурів (Bley et al., 1987; Yaary et al., 1987; Doerner et al., 1988; Meyers and Barker, 1989).

Для дослідження можливої ролі низькопорогового компоненту Ca2+ струму у гальмівній синаптичній передачі використовувався неорганічний блокатор Ca2+ струмів Cd2+. Відомо, що кадмій у високих концентраціях є неселективним блокатором Ca2+ каналів, тоді як до низьких концентрацій кадмія низькопорогові канали менш чутливі, ніж високопорогові (Ozawa et al., 1989; Mogul and Fox., 1991). Прикладання малих концентраций цього неорганічного блокатору (10 мкM) викликало суттєве зменшення амплітуди високопорогових Ca2+ струмів і вГПСС, і не мало істотного ефекту на амплітуду низькопорогового компоненту Ca2+ струму. Виходячи з цих даних можна зробити висновок, що низькопорогові Ca2+ канали, можливо, не беруть участі у синаптичній передачі в досліджених нами нейронах, що відповідає одержаним раніше даним на нейронах таламуса щурів і нейронах спинальних ганглієв курчат (Pfrieger et al., 1992; Holtz et al., 1988). Цікаво, що Лемос и Новіцкі (Lemos and Nowycky,1989) не виявили низькопорогових Ca2+ каналів в пресинаптичних терминалях хребетних.

Існують численні дослідження, які підтверджують, що декілька типів високопорогових Ca2+ струмів, включаючи N- і P-/Q- типи, беруть участь в вивільненні нейромедіатора в гальмівних та збуджуючих синапсах (Luebke et al., 1993; Wheeler et al., 1995; Scholz and Miller, 1995). Високопороговий Ca2+ струм соматичної мембрани в наших дослідженнях за фармакологічними властивостями можна було поділити на ніфедіпін-, -CTx-GVIA-, -Aga-IVA - чутливі компоненти і нечутливий до цих блокаторів компонент Ca2+ струму.

Дигидропиридинчутливий Ca2+ струм раніше був описаний в роботах на свіжоізольованих нейронах гіпокампу, зрізах і культурі високої щільності (Lambert and Wilson, 1995; Akaike et al., 1997). Ніфедіпін в малих концентраціях 0,5-1 мкM блокував 30-60% L-типу Ca2+ струмів нейронів гіпокампу, що культивувалися (Meyers and Barker, 1989). Оскільки в наших експериментах також був зареєстрований Ca2+ струм, чутливий до невеликих концентрацій ніфедіпіну, то можна стверджувати, що в досліджених нейронах також був присутній L-тип Ca2+ каналів.

Прикладання 10 мкМ ніфедіпіну (селективна концентрація для L-типу Ca2+ каналів) не викликало істотного ефекту на амплітуду вГПСС, що свідчить про те, що L-тип Ca2+ каналів, можливо, не бере участі в гальмівній синаптичній передачі. Подібні дані були одержані для збуджуючих синапсів нейронів таламуса і гіпокампу і гальмівних синапсів нейронів ганглієв сітківкі (Pfrieger et al., 1992; Wheeler et al., 1994; Taschenberger and Grantin, 1995).

Відомо, що -CTx-GVIA є специфічним блокатором N-типу нейрональних Ca2+ каналів (Plummer et al., 1989). Через те, що в інтегральному Ca2+ струмі досліджених нейронів був зареєстрований -CTx-GVIA-чутливий компонент, можна зробити висновок, що в цих нейронах був присутній N-тип Ca2+ каналів.

Прикладання -CTx-GVIA в концентрації 1 мкM призводило до зменшення амплітуди вГПСС приблизно на 30%, що свідчить про зв'язок N-типу Ca2+ каналів з синаптичною передачею. Результати наших досліджень узгоджуються з даними одержаними раніше на нейронах гіпокампу, де -CTx-GVIA пригнічував синаптичну передачу в СА1 і СА2 регіонах гіпокампу (Kamiya et al., 1988; Dutar et al., 1989; Horne and Kemp, 1991).

Високопороговий компонент Ca2+ струму був чутливий до -Aga-IVA, хоча ступінь блокування Ca2+ струму цим токсином надто вариювала. Присутність такого -Aga-IVA-чутливого компоненту Ca2+ струму в нейронах зрізів гіпокампу щурів раніше була показана в роботі Акаіке (Akaike et al., 1997).

В наших дослідженнях нетривале прикладання -Aga-IVA викликало сильне зменшення амплітуди вГПСС. Ці дані погодяться із раніше одержаними даними, де -Aga-IVA блокував збуджуючу синаптичну передачу в СА3-СА1 регіонах гіпокампу ( Luebke et al., 1993; Takahashi and Momiyama, 1993) та зменшував вхід Ca2+ в синаптосоми мозку (Mintz et al., 1992b; Geer et al., 1993). В попередніх дослідженнях було показано, що великі концентрації -Aga-IVA (200-800нМ) не блокували T-, L- та N-типи Ca2+ каналів симпатичних нейронів (Mintz and Bean, 1993). -Aga-IVA-чутливий компонент Ca2+ струму в пресинаптичних терминалях нейронів гіпокампу (Wu and Saggau, 1994) і в сомі нейронів з різних відділів ЦНС (Mintz et al., 1992a, b; Mintz and Bean, 1993) був ідентифікований як Р-тип Ca2+ струмів. Проте, також було показано, що великі концентрації -Aga-IVA блокували Q-тип Ca2+ каналів (Randall et al., 1993; Sather et al., 1993). Також було висловлене припущення, що Q-тип Ca2+ каналів може знаходитися в пресинаптичних терминалях нейронів СА1 регіону гіпокампу щурів (Randall et al., 1993). Ми не можемо сказати, чи є досліджений нами -Aga-IVA-чутливий компонент Ca2+ струму Р-, Q-типом або обома типами Ca2+ струмів, тому ідентифікували Ca2+ струми, що блокуються цим токсином, як -Aga-IVA-чутливий компонент Ca2+ струму.

В наших дослідженнях 16±5 % амплітуди соматичного Ca2+ струму і 14±7% вГПСС були не чутливими до високих концентрацій ніфедипину, -Aga-IVA та -CTx-GVIA при їхній спільній аплікації. У наших дослідженнях ми використовували великі концентрації цих органічних блокаторів Са2+ каналів, тому резистентний струм, по-видимому, не можна віднести до N -, L - і P -/Q-типів Ca2+ струмів, хоча ми не можемо стверджувати це напевно. Наявність резистентного струму можна пояснити присутністю в нейронах гіпокампу Ca2+ каналів R-типу або інших неідентифікованих типів. Цікаво, що компонент Ca2+ струму, що не блокувався одночасною присутністю блокаторів L -, N -, P -\Q - типів Ca2+ струмів був знайдений в мембрані нейронов різних відділів ЦНС, включаючи нейрони гіпокампу [Akaike, 1997; Dolphin et al., 1993; Mintz et al., 1992a].

Відомо, що ніфедіпін в концентраціях більше 10 мкM неспецифічно блокує різні типи Ca2+ каналів (Waard et al., 1996). Як було показано вище, прикладання 50, 100 мкМ ніфедіпіну сильно зменшувало амплітуду як соматичного високопорогового Ca2+ струму, так і амплітуду вГПСС. Криві залежності між різними концентраціями ніфедіпіцну і амплітудою Ca2+ струму і ГПСС погано апроксимувались рівнянням Хілла (р>0,05), що свідчить про те, що ніфедіпін в концентраціях, що застосовувались нами, неспецифично блокував Ca2+ струм. При спільному прикладанні ніфедіпіну в концентрації 100 мкM і -CTx-GVIA (1мкM) амплітуда високопорогового Ca2+ струму і вГПСС блокувалась, відповідно, на 17% і 23% менше, ніж алгебраїчна сума усредненої дії цих двох блокаторів при їх окремому прикладанні. Таким чином, можна зробити висновок про те, що ніфедіпін у великих концентраціях неселективно пригнічував w-CTx-GVIA-чутливий компонент Ca2+ струму. Більш того, в наших експериментах завжди був присутній компонент Ca2+ струму, чутливий до великих концентрацій ніфедіпіну і нечутливий до -CTx-GVIA і -Aga-IVA.

Одержані дані свідчать про те, що гальмівна синаптична передача в нейронах гіпокампу in vitro головним чином опосередковується високопороговими Ca2+ струмами, що за фармакологічними властивостями можна поділити на чотири компонента: -CTx-GVIA- (N-тип), -Aga-ІVA- (P -\Q-типи) чутливі компоненти, компонент чутливий до високих концентрацій ніфедіпіну і нечутливий до цих органічних блокаторів компонент Ca2+ струму.

Висновки

1. На культурі низької щільності з використанням методики "петч-клемп" в конфігурації "ціла клітина" і методу прямої позаклітинної стимуляції аксонів вивчені властивості гальмівних постсинаптичних струмів в процесі розвитку нейронів in vitro і роль потенціал-керованих кальцієвих каналів в гальмівній синаптичній передачі в синаптичному сполученні між двома візуально ідентифікованими нейронами гіпокампу щурів.

2. Встановлено, що із збільшенням тривалості культивування нейронів середня амплітуда викликаних гальмівних постсинаптичних струмів та їхня амплітудна гетерогенність статистично достовірно збільшувались.

3. Розкид середньої амплітуди струмів, що реєструвалися від поодинокої пари нейронів і є характеристикою ефективності синаптичної передачі між двома нейронами, не змінювався в процесі культивування.

4. На соматичній мембрані нейронів гіпокампу на 10-12 день культивування виявлена присутність високопорогового і низькопорогового кальцієвих струмів. Експерименти з органічними блокаторами каналів показали, що принаймні чотири компонента високопорогових Ca2+ струмів присутні в більшості нейронів (дигидропиридин-, -CTx-GVIA -, -Aga-IVA-чутливі та нечутливий до цих блокаторів компонент).

5. Не виявлено участі низькопорогових кальцієвих струмів у гальмівній синаптичній передачі нейронів, що досліджувалися.

6. Показано, що гальмівна синаптична передача в нейронах гіпокампу in vitro головним чином опосередкується високопороговими Ca2+ каналами. На основі чутливості до специфічних блокаторів встановлено, що L-тип кальцієвих струмів (блокувався 10 мкМ нифедіпіну) не зв'язаний з гальмівною синаптичною передачею, тоді як -CTx-GVIA (N-тип), -Aga-ІVA (P -\Q-типи) чутливі компоненти, компонент чутливий до високих концентрацій ніфедіпіну і нечутливий до цих органічних блокаторів компонент Ca2+ струму беруть участь в гальмівній синаптичній передачі нейронів, що досліджувалися.

Перелік опублікованих праць здобувача за темою дисертації

Статті

1. Васильєв Д. B., Iсаєва О.В., Федулова С.А., Веселовський М.С. Пресинаптична регуляція гальмівної синаптичної передачі нейронів гіпокампу щурів блокаторами калієвих каналів // Нейрофізіологія, 1998.-т.30,№4- стор.336-340.

2. Iсаєва О.В., Федулова С.А., Веселовський М.С. Потенціал- залежні кальцієві канали в культивованих нейронах гіпокампу щурів // Нейрофізіологія.-1998. -т.30, №5 -стор.361-365.

3. Iсаєва О.В. Вплив ніфедіпіну у високих концентраціях на гальмівну синаптичну передачу // Нейрофізіологія.- 1999 -т.31, №1-стор.64-67.

Тези доповідей

1. Isaeva E. V., Vasilyev D. V., Fedulova S. A., Veselovsky N.S. Evoked and spontaneous excitatory postsynaptic currents in cultured hippocampal neurons // Neurophysiology. - 1997. -29, 4/5. - p.369

2. Vasilyev D. V., Fedulova S. A., Isaeva E. V., Veselovsky N.S. Effect of different concentration of the extracellular Ca2+ effect on evoked inhibitory postsynaptic currents at single synapses of cultured hippocampal neurons. ХХVIII Annual Meeting of Neuroscience Society. 1998. Abstract Book.

рецептор щур трансмембранний електрострум нейрон

Анотації

Ісаєва О.В. Роль потенціал-керованих кальцієвих каналів в гальмівній синаптичній передачі культивованих нейронів гіпокампу щурів.- Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидату біологічних наук за спеціальністю 03.00.13- фізіологія людини та тварин. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України. Київ - 1999.

Дисертація присвячена дослідженню основних электрофізичних та фармакологічних характеристик викликаних гальмівних постсинаптичних струмів у процесі розвитку культури нейронів гіпокампу щурів і ролі різноманітних потенціал-керованих Са2+ каналів у гальмівній синаптичній передачі. Результати проведених досліджень показали, що із збільшенням тривалості культивування нейронів середня амплітуда викликаних гальмівних постсинаптичних струмів та їхня амплітудна гетерогенність статистично достовірно збільшувались, тоді як розкид середньої амплітуди струмів, що реєструвалися від одиничної пари нейронів, не змінювався. Показано, що гальмівна синаптична передача в нейронах гіпокампу in vitro головним чином опосередкується високопороговими Ca2+ каналами. На основі чутливості до специфічних блокаторів встановлено, що L-тип Ca2+ струмів (блокувався 10 мкМ нифедіпіну) не зв'язаний з гальмівною синаптичною передачею, тоді як -CTx-GVIA (N-тип), -Aga-ІVA (P -\Q-типи) чутливі компоненти, компонент чутливий до високих концентрацый нифедіпіну і нечутливий до цих органічних блокаторів компонент Ca2+ струму беруть участь в гальмівній синаптичній передачі нейронів, що досліджувалися.

Ключові слова: гальмівна синаптична передача, потенціал-керовані кальцієві канали, ГАМКА рецептори, гіпокамп.

Исаева Е.В. Роль потенциал-управляемых кальциевых каналов в тормозной синаптической передаче культивируемых нейронов гиппокампа крыс. - Рукопись.

Дисертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. - Институт физиологии им. А. А.Богомольца НАН Украины. Киев - 1999.

Диссертация посвящена исследованию основных электрофизических и фармакологических характеристик вызванных тормозных постсинаптических токов в ходе развития культуры нейронов гиппокампа крыс и роли различных потенциал-управляемых Са2+ каналов в тормозной синаптической передаче. Исследованные в настоящей работе постсинаптические токи демонстрировали известные свойства таких токов, регистрируемых в тормозных синапсах. Их потенциал-зависимость хорошо описывалась уравнением Нернста для ионов Сl-, являющимися основным переносчиком трансмембранного тока при активации ГАМК-рецепторов. вТПСТ полностью блокировались бикукуллином, что свидетельствовует о том, что рецепторы постсинаптической мембраны исследованных нейронов относились к ГАМК рецепторам типа А .

Результаты проведенных исследований показали, что с увеличением длительности культивирования нейронов средняя амплитуда вызванных тормозных постсинаптических токов и их амплитудная гетерогенность статистически достоверно увеличивались, тогда как коэффициент вариации максимальной амплитуды токов, регистрируемых от единичной пары нейронов, не изменялся. Как увеличение средних амплитуд токов, так и увеличение их разброса с возрастом нейронов в культуре можно объяснить увеличением количества синаптических связей между отдельными нейронами и усложнением структуры нейрональной сети в процессе роста и дифференцировки нейронов в культуре. Тот факт, что относительное среднее отклонение значений максимальных амплитуд токов, регистрируемых от каждой отдельной пары клеток, как при простой (молодая культура), так и при сложной (взрослая культура) нервной сети, не менялось, может свидетельствовать о том, что оно обеспечивается не неоднородностью распространения потенциала действия по аксону в силу различных кабельных свойств отдельных его ветвей, а, по всей видимости, квантовыми свойствами отдельных синаптических контактов.

Исходя из полученных данных, в нейронах гиппокампа на 10-12 день культивирования присутствовали низкопороговый и высокопороговый компоненты кальциевого тока. Высокопороговый компонент по фармакологической чувствительности к органическим блокаторам Са2+ каналов, был разделен на нифедипин-, -CTx-GVIA, -Aga-IVA -чувствительные компоненты и компонент не чувствительный к примененным блокаторам. Для исследования возможной роли низкопорогового компонента кальциевого тока в тормозной синаптической передаче использовался неселективный блокатор кальциевых каналов Cd2+. Приложение малых концентраций этого неорганического блокатора (10 мкM) вызывало сильное уменьшение амплитуды высокопороговых кальциевых токов и вТПСТ, и не имело существенного эффекта на амплитуду низкопорогового кальциевого тока. Исходя из этих данных был сделан вывод о том, что низкопороговые кальциевые каналы, по-видимому, не участвуют в синаптической передаче исследованных нейоронов. Для исследования участия различных типов высокопороговых кальциевых каналов в тормозной синаптической передаче использовались селективные концентрации органических кальциевых блокаторов: 10мкM нифедипина (блокатор L-типа Ca2+ каналов), 1мкM -CTx-GVIA (блокатор N-типа Ca2+ каналов), 200нM -Aga-IVA (блокатор P-\Q-типов Ca2+ каналов). Показано, что нифедипин, являющийся специфическим блокатором L-типа Ca2+ каналов в концентрации 10мкM не оказывал существенного эффекта на амплитуду вТПСТ, тогда как при аппликации более высоких концентраций нифедипина (50, 100 мкM) амплитуда высокопорогового Ca2+ тока блокировалась на 17% и 34%, соответственно. ТПСТ были чувствительны к -CTx-GVIA, -Aga-IVA. При совместной аппликации высоких концентраций нифедипина, -CTx-GVIA и -Aga-IVA 15% вТПСТ не блокировалось, что свидетельствует о том, что другие типы кальциевых токов нечувствительные к блокаторам L-, N-, P-\Q- типов Ca2+ каналов (T-,R-типы или другие неидентифицированные типы) присутствуют интегральном Ca2+ токе, обеспечивающем вход Са2+ в пресинаптическую терминаль и запуск механизма выброса медиатора. Полученные данные позволили сделать вывод о том, что L-тип Ca2+ каналов не связан с синаптической передачей, тогда как -CTx-GVIA (N-тип)-, -Aga-IVA (P-\Q-тип)-чувствительные компоненты, компонент чувствительный к высоким концентрациям нифедипина и нечувствительный к этим органическим блокаторам компонент Са2+ тока участвуют в тормозной синаптической передаче исследованных нейронов.

Ключевые слова: тормозная синаптическая передача, потенциал-управляемые кальциевые каналы, ГАМКА рецепторы, гиппокамп.

Isaeva E. V. The participation of voltage-activated Ca2+ channels in inhibitory synaptic transmission at the culture of rat hippocampal neurons. - Manuscript.

Thesis for PhD degree by specialty 03.00.13. - human and animal physiology. - Bogomoletz institute of Physiology NASc of Ukraine. Kiev - 1999.

The dissertation is devoted to investigation of electrophysical and pharmacological properties evoked inhibitory postsynaptic currents of developing rat hippocampal neurons in vitro and the participation of different voltage-activated Ca2+ channels in inhibitory synaptic transmission. The obtained results indicated that enlargement of cultivating term caused an increase of the average amplitude of evoked inhibitory postsynaptic currents and their amplitudes variations, whereas deviation of the average current amplitudes didn`t change. It was shown, that inhibitory transmission in hippocampal neurons in vitro was mediated mainly by HVA Ca2+ currents. On the base of diffrent sensitivity to specific Ca2+ channel blockers it was indicated that L-type Са2+ current (blocked by 10М nifedipine) not involved in sinaptic transmission, whereas -CTx-GVIA (N-type) and -Aga-IVA (P-\Q-type) -sensitive components, sensitive to high concentrations nifedipine component and insensitive to this organic blockers component of Ca2+ current participated in triggering inhibitory neurotransmitter release in hippocampal neurons.

Key words: inhibitory synaptic transmission, voltage-activated Ca2+ channels, GABAA receptors, hippocamp.

Размещено на Allbest.ru