1. Вперше виявлено і вивчено кристалічні білки, що продукуються новими штамами B. thuringiensis з оригінальної української колекції, які відібрані за наявністю у них подвійної специфічності до комах двох рядів (Lepidoptera - лускокрилі та Coleoptera - жорсткокрилі), досліджено спектр їх плазмідних ДНК, визначено специфічність генів кристалічних білків окремих штамів B. t.

2. Сконструйовано 2 оригінальні пари праймерів для ПЛР: одна - високоспецифічна до консервативної групи генів кристалічних білків класів Cry3, друга - вироджена, що має специфічність до більш широкого кола генів типу Cry1, Cry3 і Cry5, що визначають токсичність відповідно до лускокрилих, жорсткокрилих та комбіновану - до лускокрилих і жорсткокрилих одночасно.

3. Вперше ампліфіковано фрагменти генів, що відповідають за синтез кристалічних білків в досліджуваних штамах B. t., клоновано одержані продукти ПЛР і секвеновано 5' - і 3'-кінці цих продуктів, ідентифіковано гени кристалічних білків які гомологічні генам Cry1Ba2, Cry1Bc та групі генів Cry1A.

Практичне значення роботи. Результати дослідження інсектицидних кристалічних білків і генів, що їх кодують, можуть бути використані при створенні біоінсектицидних препаратів на основі цих штамів.

Фрагменти генів кристалічних білків, що одержано за допомогою cконструйованих вироджених праймерів ПЛР, можуть бути використані як зонди для пошуку Cry генів у геномах різних штамів B. t. з метою їх клонування та застосування для створення системи біологічного контролю комах-шкідників.

штам інсектицидний білок ген

Особистий внесок автора полягає у безпосередній участі у виконанні всього обсягу експериментальної частини дисертації, обробці літературних даних, аналізі та інтерпретації отриманих результатів.

Апробація роботи відбулася на міжнародній конференції "Молекулярная генетика и биотехнология”, м. Мінськ, 6-8 квітня 1998 р. та на спільному науковому семінарі відділу регуляторних механізмів клітини і відділу молекулярної генетики ІМБіГ НАНУ 1 березня 1999 р. За матеріалами дисертації опубліковано 3 статті.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, огляду літератури, експеріментальної частини (методи, результати дослідження та їх обговорювання) і висновків. Роботу викладено на 115 сторінках машинописного тексту, ілюстровано 23 рисунками і 4 таблицями. Список цитованої літератури охоплює 245 джерел.

Матеріали і методи

Мікроорганізми, які були використані у дослідженні. E. coli HB101, E. coli XL1, A. tumefaciens C58 i A. tumefaciens 1058, B. t.820, B. t.949, B. t.834, B. t.836, B. t.014, B. t.021, B. t.076, B. t.85 i B. t.888.

Плазміди, які були використані у дослідженні: pUC18, pBR322, pAp2034, pBlueScript SKII, pTiC58, pTi1058, F' фактор E. coli та плазміди досліджуваних штамів B. t.

Об'єктом дослідження були 9 нових штамів B. t., що були виділені на території України (Кримська філія грунтової мікробіології Інститута сільськогосподарської мікробіології ААН України, м. Чернігів). В основу відбору штамів було покладено подвійну специфічність, яку виявляли дані штами у біологічних експериментах по відношенню до лускокрилих і жорсткокрилих та відсутність продукції їми -екзотоксину.

Методи. Для продукції кристалічних білків культури B. t. вирощували в середовищах С2, АП, КС, LB, NSM, GYS, GYCS, GYN, SP за умов аерації при 30°С до закінчення спороутворення (як правило, 4 доби).

Наявність кристалів, що продукували досліджувані штами B. t., контролювалася за допомогою мікроскопії їх спорових культур при х 450 збільшенні на люмінісцентному мікроскопі ЛМ фазово-контрастним методом.

Інсектицидні кристалічні білки, що продукували досліджувані штами, аналізували в 10% ПААГ-SDS в трис-гліциновому буфері (Laemmlі U. K., 1970), попередньо розчинивши їх кип'ятінням протягом 10 хв. у буфері такого складу: 0,125 M трис-HCl (pH 6,8), 5% SDS, 5% бета-меркаптоетанол, 10% цукроза, 0,005% бромфеноловий блакитний (Lecadet M. et al., 1992).

Молекулярну масу білків визначали за допомогою калібрувальних графіків залежності логарифма молекулярної маси маркерних білків (набори HWM і LWM фірми Pharmacia) від їх відносної рухливості в 10% ПААГ-SDS.

Культуру B. t. для виділення ДНК вирощували в середовищі IM (0,75 % бактопептон, 1% глюкоза, 10мМ трис-HCl, рН 7,6) за умов аерації при 30°С протягом ночі. Для одержання сумарного препарату плазмідної ДНК вегетативні клітини B. t. відмивали в ТЕ-буфері, лізували обробкою лізоцимом (10 мг/мл) протягом 20 хв. при 37°С, після чого до лізатів додавали проназу (0,5 мг/мл) і продовжували інкубацію ще 30 хв. при 34°С у присутності 1% SDS. Далі виділення ДНК проводили лужним методом (Casse F. et al., 1979) з депротеїнізацією фенолом та хлороформом і осадженням етанолом. Плазміди B. t вивчали методом електрофорезу в 0,7% гелі агарози в ТАЕ-буфері (0,04 М трис-ацетат, 0,002 М EDTA).

Комп'ютерний аналіз нуклеотидних послідовностей відомих генів кристалічних білків та амінокислотних послідовностей цих білків з метою вибору праймерів для ПЛР проводили з використанням пакету програм PC/Gene.

Олігонуклеотиди, які використовували як праймери, були люб'язно синтезовані к. б. н.С.М. Кириленком за допомогою ДНК-синтезатора (модель "Gene Assembler,” Pharmacia Biotech.).

ПЛР суміш готували за стандартною методикою (Burke J. F., 1996). Ампліфікацію виконували на приладі "Gene ATAQ Controller” (Pharmacia Biotech.) за такою програмою: денатурація - 94°С - 3 хв., потім 40 циклів за таких умов: 94°С - 1 хв., 53°С - 1 хв., 72°С - 1 хв., останній етап 72°С - 5 хв. для праймерів Sn567-Asn1373. Для пари праймерів 5'Т-3'С програма відрізнялась температурою відпалення (44°С). Продукти ПЛР вивчали методом електрофорезу в 1,5% гелі агарози в ТАЕ-буфері.

Виділення продуктів ПЛР з гелю проводили за допомогою набору "Gene Clean" (Bio 101, Inc) відповідно до доданого протоколу. Вектори для клонування ПЛР фрагментів ДНК одержували розщепленням плазмідної ДНК pUC18 або рBluescript SKII рестрикційними ендонуклеазами EcoRV (або Eco32) та інкубацією з Taq полімеразою у присутності 2 mM dTTP 2 години при 70°С (Marchuk D, Drumm M. et al., 1990).

Компетентні клітини E. coli, одержували за методом А. Nishimura (1990). Обробку плазмідних ДНК рестриктазами, лігування, трансформацію E. coli, аналіз рекомбінантних клонів проводили за стандартними методами (Sambrook J. et al., 1988).

Первинну послідовність клонованих ПЛР фрагментів визначали за методом Сенгера (Sanger F. et al., 1977) із застосуванням флуорисцентних праймерів з використанням набору для секвенування "Cy5TM autocycle" (Pharmacia Biotech.) на автоматичному секвенаторі ALF express (Pharmacia LKB).

З метою аналізу ДНК методом гібридизації плазмідну ДНК B. t. (нативні плазміди або ДНК, оброблену рестриктазами), що була розділена в 0,7% гелі агарози, переносили на нейлонові фільтри (Sambrook J. et al., 1988). Зонди (відповідні фрагменти ДНК) мітили нерадіоактивною міткою (дігоксигеніном) з використанням набору "DIG Nucleic Acid Labeling Detection Kit" (Boeringer Mannheim) за рекомендацією виробника. Предгібридизацію, гібридизацію, відмивку фільтрів та детекцію проводили за тими ж рекомендаціями.

Результати і їх обговорення

Вивчення кристалічних білків досліджуваних штамів B. t.

Ефективність синтезу кристалічних білків штамів B. t. було перевірено на 9 середовищах з метою виявити найбільш придатні для цього середовища. З'ясувалося, що більшисть досліджуваних штамів B. t.: 949, 834, 820, 014, 85 і 888 з високою ефективністю продукують кристали на середовищі С2, а штам B. t.076 - на NSM. Штами B. t.021 і B. t.836 на жодному з перевірених середовищ не давали високого рівня продукції кристалічних білків.

Білковий склад кристалів, що продукуються досліджуваними штамами B. t., вивчали за допомогою електрофорезу в 10% ПААГ-SDS після їх солюбілізації як описано в розділі "Методи”. Електрофоретичні дослідження показали, що 5 штамів з 9 продукують кристалічні білки с молекулярною масою більше 130 кДа, а саме: штами B. t.820 і B. t.949 продукують кристалічні білки з молекулярною масою 164 кДа, штам B. t.834 - 144 кДа, штами B. t.85 і B. t.888 відрізняються тим, що продукують два високомолекулярних кристалічних білка - 146 кДа і 137 кДа, (Табл.1).

Штами B. t.85, 888, 949 і 820 в ряді експериментів в ПААГ-SDS демонстрували інтенсивну смугу, що відповідає поліпептиду з молекулярною масою 76,5 кДа.

Таблиця 1. Молекулярна маса кристалічних білків досліджуваних штамів B. thuringiensis

Це явище може бути зумовлено як можливістю розщеплення нативних білків протеазами, що локалізовані на поверхні кристалів, так і тим, що в залежності від умов вирощування можуть утилізуватись різні сайти ініціації трансляції. Штами B. t.014, 021 і 836 продукують кристалічні білки з молекулярною масою 76,5 кДа, а B. t.076 - два кристалічні білки 96,5 кДа і 77,0 кДа (Табл.1). Крім високомолекулярних білків, штами B. t.820, B. t.949, B. t.014, B. t.85, B. t.888 продукують також низькомолекулярні білки (приблизно 18 кДа) (Табл.1).

Крім великої кількості, що характерна для кристалічних (до 30% сухої ваги) білків B. t., яка виявляється у ПААГ електрофорезі спорових препаратів досліджуваних штамів за інтенсивністю поліпептидних смуг, що відповідають кристалічним білкам, було одержано ще один доказ того, що описані білки є кристалічними. Було проведено дослідження динаміки синтезу кристалічних білків вивчених штамів, бо, як відомо, продукція кристалічних білків B. t. відбувається переважно під час спороутворення. Вивчення динаміки синтезу високомолекулярних кристалічних білків штамів B. t.820, B. t.949, B. t.834, B. t.014 методом електрофорезу в 10% ПААГ-SDS показало, що у вегетативній (6-годиний) культурі вивчених B. t. штамів високомолекулярні кристалічні білкі відсутні, тоді як вже через 24 години спостерігалося накопичення цих білків; а через 3 доби було виявлено гіперпродукцію досліджуваних білків, звичайну для даних B. t. штамів, якщо їх вирощувати на середовищі С2.

Таким чином, більшисть досліджуваних B. t. штамів синтезують високомолекулярні кристалічні білки 137 кДа - 164 кДа, які, як правило, є типовими представниками B. t. токсинів, що специфічні до Lepidoptera. Штами B. t.014, B. t.021 і B. t.836 продукують білки, що за молекулярною масою подібні до B. t. токсинів, що специфічні до Coleoptera. До складу кристалів, що продукує штам B. t.076, входять досить оригинальні білки, що робить перспективним їх подальше вивчення.

Визначення плазмідного складу ряду нових штамів B. t. Відомо, що відмінною рисою B. t. є наявність в них складного комплексу екстрахромосомних елементів (від 1,7 Мда до 180 Мда), відомішою функцією яких є те, що, в основному, на високомолекулярних плазмідах локалізовано Cry гени, що забезпечують продукцію -ендотоксинів. Оскільки подальшою метою дослідження було пошук Cry генів, важливо було одержати препарати ДНК досліджуваних штамів B. t., що містили б ДНК всіх плазмід, які представляють геном даних штамів. Зважаючи на залежність між складом середовища для культивування B. t. і тим, які плазмідні ДНК переважно виділяються, було підібрано середовище (див. розділ "Методи"), що забезпечувало стабільну відтворюванність виділення високомолекулярних плазмід.

Вивчення препаратів сумарної ДНК методом електрофорезу в 0,7% агарозному гелі показало, що всі вивчені штами B. t. містять складний комплекс екстрахромосомних елементів, як високомолекулярних (більш ніж 30 Мда), так і низькомолекулярних (менш ніж 30 Мда). Штами B. t.820 і B. t.949 мають дуже схожий набір високомолекулярних плазмід: 2 плазміди на рівні приблизно 120 Мда і три дуже близькі плазмідні смуги, що демонструють рухливість приблизно на рівні 63 Мда. Штам B. t.834 відрізняється від інших тим, що не містить низькомолекулярних плазмід, а містить дві пари високомолекулярних плазмід. Всі штами містять декілька плазмід з молекулярною масою вище 63 Мда (F'фактор E coli). Найбільші високомолекулярні плазміди менш рухливі, ніж ДНК pTi C58 A. tumefaciens, яка була використана як маркер, тобто мають молекулярну масу більш 120 Мда. Найбільші плазміди присутні в препаратах сумарної ДНК штамів B. t.014 і B. t.076 - більше 120 Мда, а штами B. t.85 і B. t.888 схожі за плазмідний набором. Таким чином, отримані препарати плазмідної ДНК вивчених штамів B. t. містили достатньо складний набір високомолекулярних плазмід і могли бути використаними в ПЛР як матриці для пошуку Cry генів.

Ідентифікація генів, що кодують кристалічні білки в досліджуваних штамах B. t. за допомогою полімеразної ланцюгової реакції

Оскільки гени, які кодують кристалічні білки з різною специфічністю до комах-шкідників, становлять багаточисельну родину, окремі представники якої мають різний ступінь гомології, то конструювання ПЛР праймерів, які були б специфічні до певних генів, стало окремим етапом дослідження нових штамів.

Виходячи з першочергового інтересу до генів типу Cry3, тобто специфічних до жорсткокрилих, було проведено аналіз нуклеотидних послідовностей відомих генів такого типу. Як ПЛР праймери було обрано послідовності двох ділянок ДНК з 100% гомологією, що характерні для генів з високим ступенем гомології таких як Cry3А, Cry3В і Cry3D (Табл.2). Як матриці в ПЛР з цими праймерами (Sn567 - Asn1373) були використані сумарні препарати ДНК досліджуваних штамів B. t., але жоден з використаних штамів не давав ПЛР продукт очікуваного розміру (836 нп.), хоча всі штами, що продукують високомолекулярні білки (більше 130 кДа) та штам B. t.014, демонструють в ПЛР тільки один продукт.

ПЛР продукт штаму B. t.014, одержаний з праймерами Sn567 - Asn1373, було клоновано, після чого частково визначено нуклеотидну послідовність цього фрагменту. Цей фрагмент, як з'ясувалося, не має гомології з відомими Cry генами.

Таблиця 2. Праймери, що було використано в ПЛР.

Для конструювання другої пари праймерів було застосовано інший підхід - пошук амінокислотної гомології серед кристалічних білків, токсичних до жорсткокрилих. Цей аналіз виявив тільки дві ділянки в амінокислотних послідовностях таких білків, які демонстрували високий ступінь гомології. Повернення до відповідної нуклеотидної послідовності цих генів показало, що у більшості випадків відсутність гомології припадає на третій нуклеотид кодону.

Праймерами для ПЛР стали послідовності цих ділянок ДНК з заміною негомологічних нуклеотидів на інозин. Тобто були сконструйовані вироджені праймери 5'T - 3'C (Табл.2). Використання в ПЛР виродженої пари праймерів (5'T - 3'C) і сумарних плазмідних ДНК як матриці показало, що продукти ПЛР очікуваних розмірів (приблизно 1000 нп) були одержані для штамів B. t.820, B. t.949, B. t.834, B. t.014, B. t.85, B. t.888 ). Продукти ПЛР не вдалося одержати для B. t.836, B. t.021 і B. t.076.

Для того, щоб з'ясувати, що являють собою одержані ПЛР продукти, ампліфіковані фрагменти ДНК штамів B. t.949, B. t.834 і B. t.85 було клоновано в плазміді Blue Script SK II. Після клонування було проведено визначення первинної послідовності 5' - і 3' - кінців цих ампліфікованих фрагментів

Порівняння нуклеотидних послідовностей цих фрагментів з нуклеотидними послідовностями відомих Cry генів B. t. показало, що з B. t.834 клоновано фрагмент ДНК, який дійсно є фрагментом гена, що відповідає за синтез кристалічного білка і демонструє високу гомологію з геном Cry1Вс (Z46442, неопубліковані дані, BishopA. H., 1994). Продукт ПЛР, одержаний з ДНК B. t.949, є ампліфікованим фрагментом Cry гена, що має у визначеному районі 100% гомологію з генами Cry1Ва1 (Х06711, Brizzard B. L., 1988), Cry1Ва2 (Х95704, Soetaert P., 1996). Послідовність ПЛР продукту штаму B. t.85, який продукує два кристалічні білки з близькою молекулярною масою, демонструє гомологію з висококонсервативною ділянкою групи генів типу Cry1А, а саме: Cry1Ab (X13233, Haider, 1988), Cry1Ab1 (M13898, Wabiko H. K., 1986), які кодують кристалічні білки, що токсичні для представників Lepidopterа. Не виключено, що для штамів, які продукують різні кристалічні білки, ПЛР продукти, що одержано з виродженими праймерами, містять суміш фрагментів, ампліфікованих з різних Cry генів. Цей факт підтверджено для штаму B. t.85 за допомогою гібридизації за Саузерном. Таким чином, праймери для ПЛР, які створені на основі амінокислотної гомології кристалічних білків, що токсичні для жорсткокрилих, дозволили ампліфікувати фрагменти ДНК генів, що кодують білки з іншим типом токсичності. Цей факт знайшов своє пояснення після подальшого аналізу тих ділянок ДНК генів типу Cry3, з яких вибрано вироджені праймери. Завдяки своїй виродженості, сконструйовані праймери мають високий ступінь гомології з генами типу Cry1, Cry3 та нового типу Cry5, що кодують білки з молекулярною масою 81 кДа і демонструють специфічність до Lepidoptera i Coleoptera, тобто сконструйовані вироджені праймери є універсальними для пошуку та ідентифікації цих трьох типів Cry генів.

Як показав аналіз первинної послідовності фрагменту ПЛР з штаму B. t.949, геном цього штаму містить ген такий же як Cry 1Ва2. Для дослідження цей штам був відібраний за ознакою подвійної специфічності - до Lepidoptera і до Coleoptera. Відомо, що ген Cry 1Ва2 кодує кристалічний білок, що токсичний для комах двох рядів - Lepidoptera і до Coleoptera. Аналіз нуклеотидних послідовностей ампліфікованих фрагментів штамів B. t.834 і B. t.85 показав, що вони містять гени, специфічні до Lepidoptera. Три штами B. t.836, 021 і 076 містять Cry гени, які не взаємодіють з виродженими праймерами з даною специфічністю і потребують використання інших праймерів.

Вивчення гомології між Cry генами досліджуваних штамів за допомогою гібридизації. Продукти ПЛР, які було одержано з виродженими праймерами і клоновано, були використані для вивчення гомології між Cry генами досліджуваних штамів та для визначення локалізації цих цих генів в геномі B. t. Використання клонованого фрагменту Cry гена з штаму B. t.949 як гібридизаційної проби показало наявність гібридизації з однаковими за розміром HindIII-фрагментами (більше 5 тис. н. п.) ДНК штамів B. t.949, B. t.820 і B. t.85 (Рис 7). Клонований фрагмент штаму B. t.949 слабо гібридизується з трьома HindIII-фрагментами ДНК штаму B. t.834. З Cry генами інших досліджуваних B. t. штамів не спостерігалось скільки-небудь помітної гомології. Таким чином, геноми штамів B. t.949, B. t.820 і B. t.85 містять гени кристалічних білків з високим ступенем гомології до відомого гена Cry1Ва2, тобто їх інсектицидну активність до Lepidoptera і Coleoptera обумовлено присутністю саме цього гена.

Cry ген штаму B. t.834, який, як показав порівняльний аналіз нуклеотидних послідовностей, демонструє високий ступінь гомології з геном Cry1Вс, проявляє слабку гомологію по відношенню до гену Cry1Ва2 і розрізається HindIII на три фрагменти принаймні в районі гібридизації з ПЛР продуктом B. t.949, що має розмір приблизно 1000 н. п.

Гібридизація сумарних препаратів плазмідних ДНК з міченим фрагментом ДНК Cry гена B. t.949 дозволила визначити, що в геномах B. t.949 і B. t.820 цей ген локалізовано на однакових за молекулярною масою плазмідах (~63 МДа), локалізація Cry гену позначена стрілкою). Цей же фрагмент гібридизується з однією з плазмід B. t.85, локалізація Cry гена позначена стрілкою). Секвенування ПЛР продукту B. t.85 дозволило ідентифікувати присутність в його геномі гена типу Crу1А, тобто специфічного до Lepidoptera. Фрагмент ДНК цього гена гібридизується з іншою плазмідою (>63 МДа), локалізація Cry гену позначена стрілкою). Таким чином, B. t.85, який продукує два високомолекулярні кристалічні білки (146 кДа і 137 кДа), містить два гени різних класів (Cry1А і Cry1В), які локалізовано на різних плазмідах.

Фрагмент ДНК Cry гена B. t.834 гібридизується з високомолекулярною плазмідою цього ж штаму (приблизно 120 Мда), локалізація Cry гена позначена стрілкою).

Таким чином, проведене дослідження ряду нових штамів B. t. забезпечило базу для подальших біотехнологічних розробок. Воно дає змогу проводити широкий скринінг колекцій і нових ізолятів B. t. з використанням запропонованих праймерів, забезпечує зонди для визначення локалізації Cry генів трьох типів як на плазмідах, так і в рестрикційних фрагментах ДНК, дозволяючи клонувати ідентифіковані Cry гени з геному нових штамів B. t. і використовувати їх для створення системи біологічного контролю шкідників, наприклад, за допомогою переносу клонованих генів до геному бактерій фітосфери.

Висновки