Регенерація печінки у щурів: молекулярно-біологічні процеси, їх регуляція та часова шкала

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна Академія Наук України

Інститут молекулярної біології і генетики

03.00.03 - Молекулярна біологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

Регенерація печінки у щурів: молекулярно-біологічні процеси, їх регуляція та часова шкала

Оболенська Марія Юріївна

Київ 1999



Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі молекулярних механізмів біосинтезу білка Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (зав. відділом - доктор біологічних наук О.М. Платонов), в Інституті геронтології АМН України і в Альберт-Людвіг Університеті (Фрайбург, Німеччина).

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Соломко Олександр Петрович, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, зав. відділом біохімічної генетики;

доктор медичних наук, професор Бикоріз Анатолій Йосипович Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, зав. відділом біології пухлинної клітини;

доктор біологічних наук, професор Стойка Ростислав Степанович, Інститут біохімії ім. акад. О.В. Палладіна НАН України, Львівдиректор відділення регуляторних систем клітини.

Провідна установа: Інститут біоорганічної хімії і нафтохімії НАН України, Київ

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м. Київ-143, вул. Заболотного 150.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Л.Л. Лукаш



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми

Регенерація печінки - складний компенсаторний процес відновлення маси і функції органу внаслідок необоротного ушкодження або механічного видалення частини його паренхіми. Цей процес стоїть в одному ряду з такими біологічними явищами як ріст, розвиток, диференціювання, апоптоз. Розшифрування молекулярних механізмів, які зумовлюють ці процеси, залишається актуальною проблемою сучасної біології. Передумови для вирішення таких задач створені досягненнями в різних галузях біології, зокрема, в царині експресії геному і процесів диференціювання, взаємодії між клітинами різної природи та між системами організму тощо.

Регенеруюча печінка гризунів вважається класичною моделлю для вивчення загальних закономірностей і тканино-специфічних особливостей відновлювальних процесів. Постулюється, що регенераційний процес в печінці має такі складові: реакція на ушкодження; біохімічна адаптація органу до функціонального навантаження, що зросло; перехід клітин із проліферативно неактивного стану до клітинного поділу і реакції, які зумовлюють зміну старого фенотипу; власне проліферація клітин; реакції, які зумовлюють перехід від клітинного поділу до стану "спокою". В інтегральному процесі регенерації печінки приймають участь всі клітини органу. Регуляція клітино-специфічних функцій та поділу клітин одного типу, а також взаємодія між клітинами різних типів здійснюється за допомогою сигнальних молекул, зокрема тих, що виробляються клітинами печінки. Процеси, що відбуваються в регенеруючій печінці, координуються також з потребами цілісного організму. Все це зумовлює складну ієрархію регуляторних процесів на різних рівнях організації - субклітинному, клітинному, органному та організменному, і забезпечує чітку часову та просторову організацію процесу.

Кінцева мета у вивченні регенераційного процесу полягає у розшифруванні ключових механізмів кожної складової процесу і засобів їх координації як між собою, так і з вимогами організму, що змінюються. Ці знання повинні розширити уявлення про принципи функціонування живого і можуть бути використані для формального описання відновлювального процесу, що стало би суттєвим етапом у його пізнанні.

Зараз зібраний великий матеріал про біохімічні процеси, які відбуваються в печінці та в організмі під час відновлення печінки, існують різні гіпотези відносно природи процесу, однак кінцевої мети ще не досягнуто. Відсутня загальна схема процесу, в якій би враховувався його розвиток в часі і в просторі різнорідного за своїм клітинним складом органу. Як і раніше актуальними залишаються питання про природу регуляторних факторів, що запускають регенерацію, координують діяльність всіх клітин протягом відновлювального процесу і завершують його. Здобутки сучасної молекулярної біології дають можливість звертатися до цих питань і вирішувати їх як на новому теоретичному, так і на методичному рівні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота відповідає основному плану фундаментальних досліджень, які проводилися у відділі молекулярних механізмів біосинтезу білка ІМБіГ НАН України (зав. відділом доктор біологічних наук О.М. Платонов) (бюджетні теми: №01.86.0069116 - "Характеристика цитоплазматичних білкових факторів, які активують ядерний геном на ранніх стадіях регенерації печінки"; №01.9100034 - "Вивчення генів, експресія яких залежить від клітинного циклу гепатоцитів"; №0195U005358 - "Послідовність експресії протоонкогенів і тканино-специфічних генів у клітинному циклі гепатоцитів". Частина робота виконувалася в Інституті геронтології АМН України та в Інституті клітинної і молекулярної біології Альберт-Людвіг Університету (Фрайбург, Німеччина) за проектом SFB154 від Німецького наукового товариства.

Мета і задачі дослідження

Мета роботи полягає у з'ясуванні деяких молекулярних механізмів, які забезпечують перехід високоспеціалізованих і неактивних у проліферативному відношенні клітин печінки до проліферації та координацію їх клітино-специфічної і проліферативної активності протягом відновлювального процесу, зумовленого частковою гепатектомією (ЧГЕ). Основну увагу планувалося приділити вивченню експресії геному і деяких його генів, що кодують специфічні та неспецифічні для паренхімних і непаренхімних клітин печінки регуляторні фактори. Для досягення поставленої мети вирішувались такі задачі:

1. Ввести орієнтири для створення часової шкали регенерації печінки як динамічного процесу;

2. Дослідити деякі особливості експресії геному і регуляторних факторів протягом переходу печінки від "спокою" до проліферації, оскільки цей період є критичним для подальшого відновлення органу;

3. Дослідити, як протягом відновлювального процесу регулюються характерні для гепатоцитів властивості, а саме здатність знешкоджувати чужерідні речовини і синтезувати клітино-специфічні білки.

Для оцінки цих властивостей обрано експресію відповідних генів, які кодують цитохром Р4502Е1, білок першої фази дезінтоксикації, і клітино-специфічний транскрипційний фактор - ядерний фактор гепатоцитів 1 (ЯФГ-1);

4. Дослідити клітино-специфічну і проліферативну активність непаренхімних клітин печінки на прикладі синтезу, зокрема, фактора некрозу пухлин і ДНК;

5. Провести порівняльне дослідження експресії клітино-специфічних (ЯФГ-1) і клітино-неспецифічних (c-Fos, c-Myc) транскрипційних факторів в печінці у щурів після ЧГЕ і лапаротомії (ЛАП) з тим, щоб визначити роль цих факторів у проходженні гепатоцитами клітинного циклу та у відповіді гепатоцитів на травму;

6. З'ясувати як впливають події посттранскрипційного рівня на регуляцію експресії геному та окремих генів у регенеруючій печінці, зокрема, шляхом дослідження синтезу і внутрішньоклітинного розподілу новоствореної РНК, відносного вмісту індивідуальних транскриптів у фракціях ядерної і цитоплазматичної РНК, а також шляхом визначення ензиматичної активності системи 2',5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L, яка регулює вміст РНК в клітині;

7. Зважаючи на важливу роль окису азоту як універсального біорегулятора, визначити його продукцію різними клітинами регенеруючої печінки і можливу роль у відновленні маси і функції органу.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше запропоновано використовувати показники синтезу ДНК у клітинах печінки різного типу як орієнтири для створення часової шкали регенераційного процесу.

На підставі даних про синтез РНК і розподіл новоствореної РНК в клітинних структурах гепатоцитів, а також даних про експресію геному та індивідуальних генів вперше виділено два принципово різних процеси протягом переходу печінки із стану "спокою" до стану проліферативної активності. Для першого процесу характерні миттєві компенсаторні реакції: активація загального синтезу РНК у гепатоцитах і синтезу в ядрах і мітохондріях, підвищення вмісту досліджених індивідуальних мРНК. Вміст клітино-специфічних РНК ЯФГ-1 та Р4502Е1 зростає більшою мірою, ніж вміст РНК, які кодують клітино-неспецифічні транскрипційні фактори c-Myc та c-Fos. Другий процес характеризує зміну фенотипу клітин печінки і проявляється тимчасовим зниженням синтезу РНК, затримкою новоствореної РНК в ядрі і відповідно меншим надходженням її в цитоплазму. Вперше продемонстровано зниження і підвищення активності системи 2',5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L відповідно в ядерній і цитоплазматичній фракціях. Вказана система відповідає за розщеплення вибраних молекул РНК. Вперше виявлено підвищення активності інтерферону /, специфічного індуктора системи 2',5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L.

Вперше виявлено підвищення експресії фактора некрозу пухлин протягом перехідного періоду, що свідчить про активацію клітино-специфічних функцій клітин Купфера або "осілих" макрофагів печінки. Продемонстровано зростаючу сприйнятливість клітин печінки до цього фактору внаслідок підвищення експресії обох рецепторів. Вперше з'ясовано, що в період, коли в регенеруючій печінці одночасно відбуваються синтез ДНК в гепатоцитах і тканино-специфічна відповідь на травму, підвищена експресія транскрипційних факторів c-Fos i ЯФГ-1 пов'язана з відповіддю на травму. Вперше показано, що в регенеруючій печінці зміни експресії фактору c-Мyc корелюють з фазами клітинного циклу і пов'язані з проліферативною відповіддю з боку гепатоцитів.

У цілісній тканині регенеруючої печінки та в популяціях гепатоцитів, "осілих" макрофагів і ендотеліальних клітин із синусоїдів печінки вперше визначено синтез окису азоту. Виявлено, що синтез окису азоту позитивно корелює із G1- та G2-періодами клітинного циклу відповідних клітин і негативно - з S-фазою клітинного циклу тих же клітин.

На підставі аналізу літературних даних і результатів нашої роботи вперше висловлено декілька припущень відносно ролі специфічної і проліферативної активності паренхімних і непаренхімних клітин печінки протягом відновлювального процесу. Синусоїдальні клітини печінки, які є клітинами мезенхімного походження, протягом перехідного періоду і клітинного циклу гепатоцитів інтенсивно продукують сигнальні молекули і за їх допомогою регулюють перехід до проліферації і власне проліферацію гепатоцитів. З початком клітинного циклу синусоїдальних клітин їх паракринна активність знижується. Проліферативна активність клітин печінки одного типу поєднується з специфічною активністю клітин печінки іншого типу. Для кожного типу клітин печінки існують клітино-специфічні мітогени, деякі з яких одночасно діють як клітино-специфічні інгібітори проліферації для інших клітин регенеруючої печінки.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Теоретичне значення одержаних результатів полягає у тому, що вони розширюють уяву про молекулярні механізми відновлювальних процесів. Вони, зокрема, свідчать про необхідність активної зміни "старого" фенотипу під час переходу високо-диференційованих клітин до проліферації, про характер взаємодії клітин мезенхімного і епітеліального походження, а також про взаємодію регуляторних систем таких як окис азоту та 2'5'-оліго(А)аденілати з цитокінами. Отримані результати дають уяву про природу транкскрипційних факторів, які зумовлюють відповідь печінки на травму і проходження клітинного циклу, про подвійну функцію, принаймні, деяких регуляторів проліферації, які діють як клітино-специфічні активатори і клітино-специфічні інгібітори проліферації.

Практичне значення одержаних результатів полягає у їх використанні при плануванні дослідницької роботи в галузях, пов'язаних із вивченням проліферації та диференціювання печінки. Крім того, отримані результати можуть бути корисними при розробці стратегії лікування багатьох захворювань печінки або наслідків хірургічного втручання, наприклад, для стимулювання відновлювальних процесів у хворих на гепатит або для гальмування злоякісного росту, для контролю за ростом трансплантованої печінки тощо.

Особистий вклад здобувача. Більшість результатів, які викладено в дисертації, одержані пошукачем самостійно. Частину експериментальних досліджень було проведено в співробітництві з Герасимовою Т.Б., Білич К.І., Новіковою Л.В., Сазоновою Л.Я., Ваніним А.Ф., Мордвінцевим П.І. і Шульце-Шпекінг А. Усі досліди планувались пошукачем, проводились і обговорювались під її безпосереднім керівництвом. Підготовка матеріалів до друку і написання текстів наукових повідомлень здійснювалась виключно пошукачем. Матеріали опубліковано в спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на:

IV всесоюзному біохімічному з'їзді (Львів, 1979);

IV всесоюзному симпозіумі "Молекулярні механізми генетичних процесів" (Москва, 1979);

VII всесоюзному симпозіумі "Структура і функції клітинного ядра" (Харків, 1980);

V всесоюзному симпозіумі "Міжмолекулярні взаємодії і конформації молекул" (Алма-Ата, 1980);

IV симпозіумі СРСР-ФРН "Структура і транскрипція геному" (Єреван, 1981);

Українському біохімічному з"їзді (Дніпропетровськ, 1982);

XII всесоюзній конференції з електронної спектроскопії (Суми, 1982); республіканській конференції "Ядерні білки і експресія геному" (Канів, 1983);

VI всесоюзній конференції "Питання регенерації і клітинного розмноження" (Москва, 1985);

V всесоюзному біохімічному з'їзді (Київ, 1986); школі "Сучасні проблеми регенерації" (Йошкар-Ола, 1986);

IX всесоюзному симпозіумі "Структура і функції клітинного ядра" (Черноголовка, 1987);

V українському біохімічному з'їзді (Івано-Франківськ, 1987);

Школі-конференції "Структура і функція біополімерів" (Львів, 1989);

Фальк-симпозіумі "Білки в регуляції генів печінки" (Базель, Швейцарія, 1989);

Всесоюзній нараді "Актуальні питання клітинної біології" (Ленінград, 1989);

Всесоюзній школі-семінарі "Молекулярна біологія і медицина" (Ленінград, 1990);

Всесоюзному симпозіумі "Молекулярна і клітинна онкобіологія" (Львів, 1990); VI, VII i VIII міжнародних симпозіумах "Клітини синусоїдів печінки" (Антверпен, Бельгія, 1992; Кіото, Японія, 1994; Бордо, Франція, 1996);

Нараді німецького товариства дослідників печінки (Берлін, Німеччина, 1993);

Міжнародному симпозіумі "Регуляція експресії генів печінки в нормі і патології (Колд-Спрінг-Харбор, 1993);

Симпозіумі американського товариства дослідників печінки "Регенерація печінки" (Аерлі, США, 1993);

Фальк-симпозіумі "Цитокіни і печінка" (Фрайбург, Німеччина, 1994), Фальк-симпозіумі і конгресі "Хвороби печінки і клініка" (Базель, Швейцарія, 1995);

Фальк-симпозіумі "Сигналізація в печінці" (Фрайбург, Німеччина, 1997);

Фальк-симпозіумі "Нормальний і злоякісний ріст" (Халле, Німеччина, 1998).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 55 робіт, які включають розділ у монографії, 26 статей, із них 6 одноосібних і 20 в співавторстві, 7 - в зарубіжних виданнях, і 28 тез доповідей наукових конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на 290 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, об'єктів і методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, підсумків і висновків. Список літератури включає 380 найменувань. Дисертація проілюстрована 17 таблицями і 57 рисунками.

ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для роботи використовували самців білих щурів лінії Wistar віком 4-5 місяців вагою 200-300 г. Регенерацію печінки моделювали за допомогою операції видалення лівої латеральної та серединної часток печінки [Higgins, Anderson, 1931], реакцію печінки на травму - за допомогою лапаротомії. Основним об'єктом дослідження була печінка інтактних і оперованих щурів у різні строки після операцій.

ДНК-синтетичну активність в клітинах регенеруючої печінки визначали за допомогою 3Н-тимідіну, який вводили внутрішньовенно за 1 год до декапітації. Виділення ДНК проводили за методом Цанєва і Маркова [1969]. Показники проліферативної активності клітин Купфера і ендотеліальних клітин синусоїдів визначали за відносним вмістом клітин з подвоєною кількістю ДНК у популяції відповідних ізольованих клітин. Суспензію ізольованих клітин обробляли розчином РНКази з наступним фарбуванням ДНК пропідіуміодидом. Відносний вміст клітин з різною кількістю ДНК визначали на приладі для сортування клітин з використанням програми CELLFIT і моделі SOBR.

Дослідження внутрішньоклітинного синтезу і розподілу новоутвореної РНК в гепатоцитах проводили методом електрономікроскопічної авторадіографії. У нижчезазначені терміни щурам вводили внутрішньочеревинно 3Н-оротову кислоту. Обробку печінки і підготовку зрізів проводили стандартним методом у модифікації Герасимової і Білич [1986]. Використана методика дає розмір зерен срібла менший за найменшу досліджену органелу клітини - мітохондрію, що дозволяє ототожнювати зерна срібла з новоутвореною РНК, яка належить цим і іншим структурам клітини. Кількість зерен срібла над різними компартментами (ядро, ядерце, мітохондрії, ендоплазматичний ретикулум) гепатоцитів визначали за допомогою електронного мікроскопу JEM-IOOB методом прямого влучення [Подымов, Кортуков, 1981].

Кінетичну складність ядерної РНК визначали в реакції гібридизації між зникаючими кількостями радіоактивно мічених фракцій клітинної ДНК і надлишком ядерної РНК. Фракції ДНК, в яких послідовності повторюються близько 105, 103 і 1-10 разів, розділяли за швидкістю реасоціації і виділяли за допомогою хроматографії на оксиапатиті. ДНК мітили в реакції нік-трансляції з 32Р-дЦТФ згідно [Rigby, 1977]. Для виключення реасоціації ДНК під час гібридизації реакцію здійснювали у присутності 80% формаміду. Ступінь гібридизації визначали як частку радіоактивної ДНК, яка входить до складу гібридних молекул. Гібриди відокремлювали від одноланцюгової нуклеїнової кислоти хроматографією на оксиапатиті.

Відносний вміст індивідульних РНК визначали в складі ядерної і полі(А)+ цитоплазматичної РНК за методом Northern-гібридизації та в складі тотальної РНК за методом зворотньої транскрипції - ланцюгової полімеразної реакції. Ядерну і цитоплазматичну фракції клітин печінки розділяли центрифугуванням тканинного гомогенату в розчині 0,25 М сахарози - 2,5% лимонної кислоти при 600 g. Тотальну, ядерну і цитоплазматичну РНК виділяли гуанідінізотіоціанатним методом [Cathalа et al., 1983]. Полі(А)+ цитоплазматичну РНК отримували шляхом фракціонування цитоплазматичної РНК на колонці з оліго(дТ)целюлозою. кДНК-зонди мітили в реакції нік-трансляції або в реакції з розсіяною затравкою згідно до інструкції виробника відповідних реактивів (Amersham, Англія). Гібридизацію проводили на фільтрах Hybond N+ стандартною технікою Dot- i Blot-гібридізації у модифікації Патер та інш. [1991]. Ступінь гібридизації кДНК з РНК кількісно оцінювали за допомогою денситометрії радіоавтографів. В кожний із моментів дослідження визначався вміст індивідуальних транскриптів в РНК фракцій у %% стосовно до вмісту відповідних транскриптів в РНК із інтакної печінки, а також вміст індивідуальних транскриптів у перерахунку на ДНК з врахуванням змін, які стосуються вмісту відповідної фракції РНК в тканині протягом операційного періоду [Atryzek, Fausto, 1978].

Зворотню транскрипцію тотальної РНК і ланцюгову полімеразну реакцію отриманої к ДНК здйснювали згідно з протоколом фірми Pharmacia (Швеція). Для підвищення чутливості ланцюгової полімеризації 5'-праймери мітили (-32Р)дАТФ в Т4-полінуклеотидкіназній реакції згідно до протоколу фірми - виробника реактивів. Цикл полімеризації складався із денатурації 1 хв при 94С, віджигу 1 хв при специфічнй температурі для кожної пари праймерів і власне полімеризації 1 хв. при 72С. Початкова денатурація і завершальна полімеризація тривали відповідно 5 і 25 хв. Реакційну суміш піддавали електрофорезу в 5% поліакріламідному гелі за неденатуруючих умов. Радіоактивність характерних смуг на радіоавтографах визначали за методом Черенкова. Активність 2',5'-оліго(А) синтетази визначали в ядерній і цитоплазматичній фракції S15 за кількістю міченого АМФ, який включається в олігоаденілати в присутності ензиму [Smekens-Etienne et al.,1983]. Ядра виділяли в розчині 0,32 М сахарози в присутності інгібіторів протеіназ і очищали центрифугуванням через 1,5 М сахарозу [Bush et al., 1967]. Ензим із ядерної і цитоплазматичної фракції S15 афінно зв'язували з надлишком кополімера, який фіксували на папері Whatman 3ММ. Продукти реакції олігомеризації розділяли за допомогою тонкошарової хроматографії на поліетіленіміноцелюлозі і кількісно визначали за їх радіоактивністю у сцинтиляційному лічильнику.

Вміст РНКази L визначали методом ковалентного зв'язування її специфічного активатора 2-5А4-3'-(32Р)фЦ [Bisbal et al., 1989]. Реакцію зв'язування олігоаденілату здійснювали в двох варіантах - з клітинним екстрактом печінки з наступним електрофорезом і з Western-блотом клітинного екстракту. У кожний з моментів дослідження кількість зв'язаного олігоаденілату визначали денситометрією електрофореграм і по відношенню до кількості олігоаденілату, зв'язаного з ензимом інтактної печінки, видаленої під час ЧГЕ у тієї ж тварини. Активність інтерферону / в екстракті тканини печінки визначали за його здатністю пригнічувати цитопатогенну дію вірусу везикулярного стоматиту в культурі клітин [Ho, Enders, 1959].Рівень синтезу окису азоту в печінці визначали методом електронного парамагнітного резонасу [Vanin et al., 1984]. Метод базується на здатності диетилтіокарбамату (ДЕТК), який вводиться за 30 хв до декапітації, зв'язуватися з ендогенним негемовим залізом з утворенням "пастки" для окису азоту. При взаємодії ендогенного окису азоту з "пасткою" утворюється мононітрозильний комплекс заліза з ДЕТК, який і дає специфічний ЕПР-сигнал. Спектри ЕПР визначали на радіоспектрометрі ЕПР Varian E9. NO-синтетичну активність гепатоцитів, клітин Купфера і ендотеліальних клітин синусоїдів визначали за кількістю нітритів, які накопичуються протягом однієї доби у культуральній рідині відповідних ізольованих клітин [Griess et al., 1982].

Гепатоцити ізолювали колагеназним методом [Tran-Thi et al., 1985], а клітини Купфера і ендотеліальні клітини синусоїдів - проназно-колагеназним методом з їх подальшим розділенням в елютріаторі [Eyhorn et al., 1988]. Ізольовані клітини ідентифікували за структурою, здатністю поглинати частинки латексу (1,16µ), притаманну клітинам Купфера, наявністю характерного для ендотеліальних клітин синусоїдів поверхневого антигену, що взаємодіє з антитілами RECA [Duijvestijn et al., 1992] і за специфічною для клітин Купфера реакцією на хлорацетатестеразу [Shlayer et al., 1988]. Ізольовані клітини культивували на пластикових планшетах згідно [Tran-Thi et al., 1985; Eyhorn et al., 1988].

Дані досліджень оброблено статистично з використанням -критерію Стьюдента, а дані електрономікроскопічної авторадіографії - за методом одно- і двофакторного дисперсійнного аналізу [Плохинский, 1975].

ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНА ЧАСТИНА

Часова характеристика регенераційного процесу

Показники ДНК-синтетичної активності клітин регенеруючої печінки вивчали з метою використання їх як часових орієнтирів процесу відновлення органу. Відносна легкість визначення цих показників, різноманітність існуючих методів, універсальність прояву проліферативної активності з боку клітин усіх типів зумовлюють цей вибір.

Інтенсивність синтезу ДНК в печінці інтактних щурів є незначною (0,66 х 104 імп х хв-1 х мг-1 ДНК), але через 18 год. після ЧГЕ питома радіоактивність ДНК зростає більше, ніж в 100 разів і тримається на цьому рівні біля 10 год., що відповідає тривалості S-фази. Через 38 і 50 год після ЧГЕ виявлено додаткові підйоми біосинтезу ДНК. Якщо згідно з даними Bucher et al. [1964], перший підйом повністю зумовлений синтезом ДНК в гепатоцитах, то другий пов'язаний з активністю епітелію жовчних протоків і перисинусоїдальних зірчастих клітин [Tanaka et al., 1990; Michalopoulos, 1997], а також з активністю певної фракції гепатоцитів, які повторно вдаються до проліферації.

Проліферативна активність клітин Купфера виявляється менш синхронною, ніж у гепатоцитів, оскільки за даними FACS-аналізу клітини знаходяться в фазах S - G2 протягом 37-62 год.

Відповідна фаза в ендотеліальних клітин синусоїдів припадає на проміжок часу між 72 і 120 год. після ЧГЕ

Враховуючи зазначені і раніше відомі показники проліферативної активності клітин регенеруючої печінки, проміжок часу від початку G1-фази клітинного циклу гепатоцитів (близько 3-4 год. після ЧГЕ) [Lu et al., 1992] до, принаймні, 6-ої доби після операції можна розглядати як клітинні цикли гепатоцитів, епітелія жовчних протоків, перисинусоїдальних зірчастих клітин, клітин Купфера і ендотеліальних клітин синусоїдів, що відбуваються в названій послідовності.

Більш докладними орієнтирами є показники окремих фаз клітинного циклу різних клітин.

Проміжок часу від операції до початку першого клітинного циклу гепатоцитів виділяється як перехідний, і для його періодизації використані чисельні показники експресії геному і окремих генів.

Експресія геному і деякі механізми її регуляції протягом перехідного періоду регенераційного процесу

Синтез і внутрішньоклітинний розподіл новоутвореної РНК

У гепатоцитах печінки щурів після ЧГЕ і ЛАП методом електроно-мікроскопічної авторадіографії оцінювали синтез і внутрішньоклітинний розподіл новоутвореної РНК за середньою чисельністю зерен срібла над різними компартментами одиночної клітини і за відносною кількістю клітин, в яких зерна виявляються над відповідними структурами.

3Н-оротову кислоту (3Н-ОК) вводили на короткий (за 15 хв до забору зразків) і більш тривалий (введення в момент операції) час. У першому випадку показники характеризують інтенсивність процесів, а в другому - кількість і розподіл новоутвореної РНК внаслідок процесів, що відбуваються з РНК протягом експозиції з ізотопом.

3Н-ОК вводили за 15хв до забору зразків печінки.

t0 i ti - час забору зразків у інтактних і оперованих щурів.

Показники достовірності сили впливу за [Плохинский, 1970]:

Н: Ф=7>Ф0,999=5,4;

Яд.: Ф=10,5>Ф0,999=7,5;

М: Ф = 11,5>Ф0,999 = 5,6;

ЭР: Ф = 4,5>Ф0,95 = 2,7

Через 15 хв після введення 3Н-ОК новоутворена РНК виявляється з різною частотою в окремих компартментах гепатоцитів випадкового зрізу. Всі гепатоцити інтактної печінки містять зерна срібла над без'ядерцевою частиною ядра, ядерцем і над ендоплазматичним ретикулумом і тільки біля 10% клітин - над мітохондріями. Через 30 хв після ЧГЕ стрімко зростає синтез РНК в ядрі і підвищується кількість новоутвореної РНК в ендоплазматичному ретикулумі. Значно зростає синтез РНК у мітохондріях окремо взятого гепатоцита і на порядок зростає кількість гепатоцитів, в яких виявляються зерна над мітохондріями. Мітохондрії з новоутвореною РНК розташовані у безпосередній близькості до ядра. В інтервалі 0,5-3,0 год після ЧГЕ зберігається підвищений рівень синтезу РНК у без'ядерцевій частині ядра і уповільнюється в ядерці і мітохондріях, причому значною мірою за рахунок зменшення частки гепатоцитів, які приймають в ньому участь. Після зменшення кількості новоутвореної РНК в ендоплазматичному ретикулумі відбуваєтсья її повільне зростання.

При більш тривалій присутності ізотопу в організмі теж виявляється двофазний характер змін - початкове підвищення вмісту РНК у зазначених відділах клітин, яке змінюється тимчасовою затримкою новоутвореної РНК в ядрі і відповідно меншим її надходженням до цитоплазми. Цей процес збігається з перебудовою апарату трансляції - з скороминучим зменшенням числа зв'язаних з ендоплазматичним ретикулумом рибосом. Наступне збільшення кількості рибосом та їх впорядкування було зафіксовано, починаючи з 3-ої години після ЧГЕ [Платонов и др., 1980]. Таким чином, згідно з нашими даними перехідний період включає фазу адаптивного посилення експресії ядерного і мітохондріального геномів і фазу заміни існуючої програми діяльності клітин на нову.

Кінетична складність ядерної РНК

Для загальної характеристики ядерної РНК був використаний метод гібридизації надлишку РНК із слідовими кількостями основних фракцій ДНК, які було розділено за частотою повторення послідовностей. Виявилося, що ядерна РНК із печінки через 3 год. після ЧГЕ гібридизується з меншою часткою унікальних послідовностей ДНК (частота повторення 1-10 разів), ніж ядерна РНК із печінки через 3 год після ЛАП (7,9% ДНК в гібридах проти 11,4% ). Звідси розраховано кінетичну складність РНК, яка передається довжиною (або масою) всіх різновидностей РНК, взятих по одній. Вона становить 3,0х108 та 4,8х108 нуклеотидів для ядерної РНК із печінки щурів відповідно після ЧГЕ і ЛАП. За характером змін отримані результати збігаються з даними гібридизації унікальних послідовностей ДНК з загальною клітинною, полі(А)-ядерною і новоутвореною РНК (фракція 63С) із регенеруючої печінки щурів [Grady et al., 1979; 1981; Прима и др., 1982], а також корелюють з вищенаведеними даними про синтез і внутрішньоклітинний розподіл новоутвореної РНК. Зниження кінетичної складності загальної РНК та її фракцій, затримка новоутвореної РНК в ядрі і зменшене її надходження до апарату трансляції, що перебудовується, свідчить про тимчасове часткове обмеження експресії геному і відповідно деяких функцій гепатоцитів, які, ймовірно, не є пріоритетними на цьому етапі регенераційного процесу. На подальших етапах кодуючі білок транскрипти не відрізняються за кінетичною складністю від транскриптів із печінки щурів після ЛАП, хоча дещо інші за якісним набором [Colbert et al., 1977; Krieg et al., 1979].

Послідовності ДНК із середньою і високою частотою повторення транскрибуються після ЧГЕ в більшій мірі, ніж після ЛАП (3,6% проти 2,6% через 3 год після кожної операції). Окрім відомих рибосомальних, транспортних і низькомолекулярних РНК транскрипти цих послідовностей ДНК остаточно не ідентифіковані. Деякі транскрипти послідовностей з високою частотою повторення входять до складу високомолекулярних РНК, як, наприклад, транскрипти В2 послідовностей в РНКР4502Е1 і РНК основного комплексу гістосумісності [Крамеров, 1989].

Дані, які було отримано за допомогою методів електроно-мікроскопічної авторадіографії і гібридизації ДНК-РНК, свідчать про те, що в перехідний період регенераційного процесу відбуваються зміни на різних рівнях експресії геному. Тому постає закономірне питання про механізми і наслідки цих змін.

Експресія транскрипційних факторів c-Fos, c-Myc, ЯФГ-1 і високоспеціалізованого білка Р4502Е1

Для розв'язання питання про молекулярні механізми виявлених змін дослідження здійснювали в декількох напрямках. Зокрема, вивчали експресію транскрипційних факторів c-Fos, c-Myc, ЯФГ-1 і високоспеціалізованого білка Р4502Е1. Гени c-fos i c-myc належать до генів миттєвої відповіді, а також до генів, які самі регулюють свою експресію, тобто знаходяться на найвищім щаблі ієрархії регуляторних білків. Транскрипційний фактор ЯФГ-1 регулює численні тканино-специфічні гени, зокрема, ген Р4502Е1. Експресія гену Р4502Е1 уособлює максимально спеціалізований фенотип печінки. При найменших ознаках дедиференціювання тканини експресія цього гену припиняється найпершою [Padgham et al., 1993].

Відносний вміст всіх досліджуваних індивідуальних РНК у складі полі(А)+ цитоплазматичної РНК змінюється під впливом ЧГЕ і ЛАП. За характером змін одночасно виявляються схожість і різниця між двома процесами. Частіше кількісно більш вираженими є зміни в регенеруючій печінці. Протягом перехідного періоду регенераційного процесу спостерігається миттєве (0-0,5 год після ЧГЕ) підвищення вмісту всіх досліджуваних транскриптів у складі полі(А)+ цитоплазматичної РНК і наступна реакція (0,5-3 год після ЧГЕ ), характерна для транскриптів кожного типу.

Етапність в експресії досліджуваних генів відповідає періодичності, яку спостерігали в синтезі і розподілі новоутвореної РНК. Підвищена експресія різних за характером дії транскрипційних факторів протягом миттєвої реакції розкриває механізм, що призводить до підвищення експресії геному (див. вище), зокрема самого транскрипційного фактору ЯФГ-1 [Flodby et al., 1993] і гену Р4502Е1 як одного з його мішеней.

Більш виражений приріст РНК, що кодують тканино-специфічні білки ЯФГ-1 і Р4502Е1, ніж РНК, які кодують клітино-неспецифічні білки c-Fos i c-Myc, протягом початкової реакції свідчить про її спрямованість на підтримку тканино-специфічних функцій печінки. Цілком ймовірно, що в регенеруючій печінці через 1 год після ЧГЕ реалізується здатність цитохрому Р4502Е1 каталізувати утворення кетонів [Koop, 1996], які можуть використовуватися у стрімко зростаючому глюконеогенезі [Taub, 1996]. Тимчасова активація експресії гену c-fos корелює з тимчасовою (біля 1 год після ЧГЕ) активністю транскрипційного фактору c-Fos/c-Jun [Taub, 1996].

Вищезазначені зміни вмісту полі(А)+ цитоплазматичних РНК c-fos, c-jun i ЯФГ-1 відбуваються на фоні незмінної їх концентрації в ядерній РНК. Це свідчить про суттєву роль посттранскрипційних подій в експресії цих генів на початковому етапі регенераційного процесу. Навпаки, одночасне підвищення вмісту ядерної і полі(А)+ цитоплазматичної РНК Р4502Е1 вказує на активацію транскрипції цього гену.

Активність системи 2'5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L

Стосовно механізму, що зумовлює протягом перехідного періоду тимчасове часткове обмеження експресії геному на рівні РНК, було висунуто припущення, що воно відбувається завдяки активації системи

2'5'-оліго(А)синтеза-РНКаза L. Дійсно, роздільне дослідження 2'5'-оліго(А)синтетазної активності ядерної і цитоплазматичної фракцій показало, відповідно, зменшення і підвищення ензиматичної активності і кількості тринуклеотидів, що синтезуються (табл. 1).

Примітка: 2'5'-оліго(А)синтетазну активність фракцій подано в мікроодиницях ензиматичної активності на 1 мг сумарного білка фракції.

Оскільки єдиною відомою мішенню для оліго(А)нуклеотидів є ензим РНКаза L [Floyd-Smith et al., 1981], то такі зміни повинні призводити до уповільнення розщеплення (або процесінгу) ядерної РНК і, навпаки, до прискореного розщеплення РНК в цитоплазмі і до дисоціації полісом внаслідок фрагментації їх мРНК [Тоотс и др., 1988] (для порівняння: вищезазначене зменшення кількості новоутвореної РНК в цитоплазмі і перерозподіл рибосом на ендоплазматичному ретикулумі). Збільшення концентрації РНКази L, що було визначено за кількістю специфічно зв'язаного радіоактивно міченого олігоаденілату, підтверджує ймовірність функціонування зазначеного механізму. Більше того, у гомогенаті печінки через 1-3 год. після ЧГЕ було виявлено специфічну для інтерферону / антивірусну активність. Інтерферон / відомий як єдиний індуктор системи 2'5'-оліго(А)синтези-РНКази L [Sen, Lengyel, 1992]. Отже, припущення щодо можливої участі системи

2'5'-оліго(А)синтетази-РНКази L в заміні фенотипу інтактної печінки на фенотип регенеруючої печінки на рівні РНК отримало суттєве підтвердження.

Фактор некрозу пухлин (ФНП-) як регулятор перепрограмування діяльності клітин печінки внаслідок ЧГЕ

Незважаючи на те, що багато чого відомо про відновлювальний процес в печінці, залишається нез'ясованим питання про природу пускових механізмів. Експресія специфічних для гепатоцитів мітогенів (фактора росту гепатоцитів, ФРГ; епідермального фактора росту, ЕФР; трансформуючого фактора росту, ТФР тощо) та їх рецепторів значно підвищується після ЧГЕ [Fausto et al., 1995; Michalopoulos, DeFrances, 1997]. Щоправда, таке підвищення спостерігається лише на початку першого клітинного циклу гепатоцитів (3-4 год. після ЧГЕ), і тому ці мітогени не можуть вважатися пусковими. У нашій роботі вперше було поставлено питання про пускову функцію продуктів клітин Купфера. Така ідея грунтувалася на загальному для еукаріотичних організмів положенні про регулюючу роль клітин мезенхімного походження в проліферації клітин епітеліального походження, на здатності активованих і пригнічених клітин Купфера відповідно прискорювати або гальмувати синтез ДНК в гепатоцитах регенеруючої печінки [Маянский и др., 1977], на промітогенних властивостях по відношенню до гепатоцитів основного цитокіну клітин Купфера - ФНП- [Beyer et al., 1990]. Вперше у печінці тварин, яким не вводили індуктори синтезу ФНП-, було виявлено експресію цього цитокіну з максимальним її проявом через 1 год. після ЧГЕ. Починаючи з 3-ої години після операції спостерігали також підвищену експресію РНК, що кодують обидва рецептори до ФНП-, РФНП1 і РФНП2. Це свідчить про підвищену сприйнятливість клітин печінки до дії ФНП-. Для більш точної оцінки кількості молекул ФНП-специфічних РНК у регенеруючій печінці реакцію зворотньої траскрипції проводили у присутності зовнішнього стандарту, тобто РНК, яку було отримано in vitro в реакції транскрипції модифікованої ділянки гену ФНП- в складі плазміди рSPT18. Кількість ФНП-специфічних молекул РНК в 1 мкг клітинної РНК становила (1,6 - 7,2) х 104 для печінки через 1 год. після ЧГЕ і (5,6 - 6,0) х 104 та (0,6 - 3,6) х 103 відповідно для печінки стимульованих ліпополісахаридом і інтактних щурів. Більш детальне дослідження експресії ФНП- та її ролі в процесі відновлення печінки підтвердило наш результат, а також довело, що ФНП- проявляє непряму мітогенну дію на гепатоцити [Yamada et al., 1996]. Ця дія опосередковується кіназами, транскрипційними факторами c-Fos/c-Jun, ядерним фактором В, а також передавачем сигналу та активатором транскрипції і інтерлейкіном-6 [Rai et al., 1996] і виявляється раніше за дію інших мітогенів, що впливають на гепатоцити. Крім промітогенної дії на гепатоцити, ФНП- гальмує синтез ДНК в ендотеліальних клітинах синусоїдів [Sato et al., 1986], індукує місцеву і системну відповідь з боку печінки на травму [Вaumann, Gauldie, 1994] та контролює інші біохімічні процеси.

Молекулярно-біологічні процеси та часова характеристика перехідного періоду. молекулярний некроз печінка щур

На підставі даних, отриманих в нашій роботі та в роботах інших дослідників, пропонується розрізняти дві фази у перехідному періоді регенераційного процесу - фазу первинної компенсаторної реакції (0-0,5 год. після ЧГЕ) і фазу перепрограмування діяльності клітин (0,5-3,0 год. після ЧГЕ). Протягом першої фази використовуються переважно існуючі до операції ресурси органу, зокрема, енергетичні та білки, активність яких модифікується [Taub, 1996]. Зміни мембранного потенціалу, іонних потоків, внутрішньоклітинного рН і окислювально-відновлювального потенціалу до значної міри обумовлюють біохімічні процеси протягом першої фази [Koch et al., 1990]. Під час другої фази експресія генів залежить від білкового синтезу de novo і регулюється такими сигнальними молекулами, як цитокіни, гормони тощо [Koch et al., 1990]. Одночасно з активацією експресії одних генів (ЯФГ-1, Р4502Е1, ФНП-, РФНП1, РФНП2 тощо) відбувається тимчасове обмеження експресії інших. Останнє вважається проявом активної заміни існуючого фенотипу, а система 2'5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L - її ймовірним чинником на рівні РНК.

Клітинний цикл гепатоцитів і реакція гострої фази

Однією із складових регенераційного процесу є реакція гострої фази з боку печінки. Ця високо-специфічна системна реакція печінки на травму будь-яким чинником і будь-якої локалізації полягає в секреції специфічних білків, які гальмують руйнівні і активують загоювальні процеси в місці ушкодження. На часовій шкалі регенераційного процесу реакція гострої фази збігається з першим клітинним циклом гепатоцитів, а максимальний її прояв - з максимальною ДНК-синтетичною активністю [Sobczak et al., 1989]. Само по собі це суміщення вказує на надзвичайну спроможність гепатоцитів поєднувати тканино-специфічні та проліферативні функції і в той же час викликає питання, як ці функції регулюються. Для відповіді на це питання проведено порівняльне дослідження експресії генів c-fos, c-myc, ЯФГ-1 і Р4502Е1 у зазначеному проміжку часу після ЧГЕ і ЛАП. В останньому випадку відповідь печінки на травму, спричинену розтином черевної порожнини, постає як самостійна реакція. Виявлено, що після ЧГЕ і після ЛАП в печінці зростає вміст досліджених транскриптів, які знаходяться в складі полі(А)+ цитоплазматичної РНК. Однак, на відміну від подій на початку регенераційного процесу, приріст кількості тканино-специфічних транскриптів ЯФГ-1 і Р4502Е1 майже дорівнює приросту після ЛАП, хоча після ЧГЕ функціонує тільки 1/3 печінки, а потреба в білках гострої фази після ЧГЕ видається не меншою, а більшою. Схожі зміни спостерігаються з транскриптами гену c-fos. Кількісно і за часом прояву вони суттєво не відрізняються після обох операцій. На цій підставі експресія протоонкогену c-fos в інтервалі 15-30 год після ЧГЕ вважається необхідною в першу чергу для відповіді печінки на травму. Цей висновок відповідає тому, що його було зроблено на підставі досліджень in vitro [Karin et al., 1997], і спростовує розповсюджену думку про виключну роль протоонкогену c-fos в клітинному циклі. Протилежний до вищенаведеного характер змін спостерігається з полі(А)+ цитоплазматичними транскриптами гену c-myc. Приріст їх вмісту майже в три рази перевищує той, що виявляється після ЛАП, і вміст транскриптів змінюється синхронно з фазами клітинного циклу. Такий результат in vivo отримано вперше. Він підтверджує дані, що їх було отримано in vitro, і передбачає регуляторну роль фактору c-Myc у проходженні клітинного циклу [Seth et al., 1993].

Окис азоту (NO) - ймовірний найпростіший внутрішньо-клітинний і міжклітинний регулятор регенераційного процесу

Велику увагу при дослідженні факторів, які регулюють відновлювальний процес в печінці, привертає окис азоту. Це найпростіша короткоживуча й, очевидно, еволюційно давня сполука, яка взаємодіє зі своїми мішенями без участі ензимів. Деякі реакції окису азоту можуть бути зворотними, що є суттєвою вимогою для функціонування регуляторного фактора. Мішенями для окису азоту виступають тіоли білків, атоми/іони заліза та інших перехідних металів, молекули кисню та супероксид, тирозиновий радикал, тощо [Marletta et al., 1988]. Окис азоту може бути як внутрішньоклітинним регулятором, так і фактором міжклітинного спілкування.

За допомогою діючої in vivo "пастки" для NO було вперше визначено кількість окису азоту, що утворюється протягом 30 хв в різні періоди регенераційного процесу. З'ясовано, що синтез окису азоту змінюється після ЧГЕ. Максимальне зростання спостерігається через 1 і 6 год, а також в інтервалі 25-36 год після ЧГЕ. Другий і третій періоди зростання збігаються з G1- i G2-періодами першого клітинного циклу гепатоцитів. Їх розділяє період мінімальної продукції NO, що припадає на S-фазу гепатоцитів.

Для з'ясування того, які клітини регенеруючої печінки продукують окис азоту було проведено дослідження з ізольованими в різні часи після ЧГЕ гепатоцитами, клітинами Купфера і ендотеліальними клітинами синусоїдів. Виявилося, що кількість синтезованого окису азоту у згаданих клітинах зменшується в порядку їх наведення, причому в усіх клітинах синтез відбувається протягом G1- і G2-фаз і спадає протягом S-фази клітинного циклу. Поки що невідомо, які з можливих мішеней окису азоту задіяні в регуляції клітинного циклу. Досить вирогідно, що NO згідно зі своєю властивістю взаємодіяти з ключовим ензимом синтезу ДНК - рибонуклеотидредуктазою [Moncada et al., 1991], пригнічує її активність протягом G1- і G2-фаз і "дозволяє" відбуватися синтезу ДНК за умов, коли синтез самого NO відсутній. Зміни активності або концентрації багатьох сполук в регенеруючій печінці можна пояснити періодичною дією NO. Зокрема, зменшення концентрації комплексно зв'язаного негемового заліза в ядрах клітин регенеруючої печінки (19,0 2 мг% проти 27 2 мг% в інтактному органі) може бути наслідком специфічної дії NO і суттєвим для клітинного циклу.

Координація функцій клітин печінки за допомогою сигнальних молекул

Нами був проведений аналіз власних і літературних даних з метою встановити, як змінюється набір сигнальних молекул протягом відновлювального процесу і як ці зміни пов'язані з молекулярно-біологічними процесами, що відбуваються в регенеруючій печінці. Найбільша різноманітність сигнальних молекул виявляється на ранніх етапах процесу - до початку і протягом першого клітинного циклу гепатоцитів.

Експресія сигнальних молекул в часовій шкалі регенераційного процесу.

Примітка:

Час після ЧГЕ (год)

Максимальна експресія сигнальних молекул.

Скорочення: геп - гепатоцити,

КлК - клітини Купфера,

ЕКлС - ендотеліальні клітини синусоїдів,

Ткс - тромбоксан,

ПГ - простагландин

Курсивом виділені дані, отримані в нашій роботі.

Чисельні сигнальні молекули продукуються непаренхімними клітинами і згідно зі своїми властивостями регулюють різноманітні біохімічні процеси. Ранній глікогеноліз, звуження судин, активація кров'яних бляшок корелюють з активністю тромбоксану А2; наступне розширення судин, підвищення рівня циклічного АМФ, продукція й дія епідермального фактора росту - з дією простагландіну Е2; миттєва реакція на травму - з дією ФНП- та інтерлейкіну 1 (ІЛ-1), тощо. Основними мітогенами для гепатоцитів є ФНП- фактор росту гепатоцитів та епідермальний фактор росту, комітогеном - простагландин Е2 [Michalopoulos, DeFrances, 1997]. Під час проліферації гепатоцитів деякі сигнальні молекули (ФНП-, простагландин Е2, ІЛ-1) пригнічують проліферацію непаренхімних клітин [Hortelano et al., 1995; Holloway et al., 1997]. Аналогічна ситуація спостерігається з іншими клітинами печінки. Проліферація клітин Купфера та ендотеліальних клітин синусоїдів співпадає з тимчасовою активністю їх специфічних промітогенів, трансформуючого фактора росту [Holloway et al., 1997] і фактора росту ендотелію судин, відповідно [Yamane et al., 1994], які продукуються перисинусоїдальними зірчастими клітинами і гепатоцитами. Одночасно з активацією синтезу ДНК в клітинах Купфера трансформуючий фактор росту пригнічує синтез ДНК в гепатоцитах та ендотеліальних клітинах синусоїдів [Holloway et al., 1997; Fausto et al., 1995]. Крім того, він активує синтез NO в клітинах Купфера і, таким чином, сприяє зниженню їх клітино-специфічної активності [Stadler et al., 1995].

Таким чином, протягом регенераційного процесу клітино-специфічна активність одних клітин необхідна для забезпечення проліферативної активності інших. В межах клітин одного типу проліферативна активність супроводжується зниженням їх клітино-специфічної активності. Поряд з універсальними для всіх клітин регуляторами проліферації (цикліни, окис азоту тощо) в печінці функціонують клітино-специфічні активатори та інгібітори. Їх взаєморегуляція в значній мірі зумовлює перебіг регенераційного процесу в печінці щурів.

Звичайно, ця праця не дає відповіді на всі питання, що стоять перед дослідником відновлювальних процесів у високодиференційованих тканинах, однак, дає нові уявлення про часову шкалу регенерації та про молекулярно-біологічні процеси на кожному із її етапів, дозволяє запропонувати концепцію про взаємодію клітин різних типів і принципи зміни програм діяльності клітин і, нарешті, вказує на необхідність проведення подальших досліджень.



ВИСНОВКИ

1. Дослідження параметрів клітинного циклу, експресії геному та активності деяких регуляторних факторів в печінці щурів після ЧГЕ дозволили запропонувати: часову шкалу процесу; гіпотезу, що пояснює механізм переходу високодиференційованих і неактивних в проліферативному відношенні клітин печінки до проліферації; положення про провідну роль непаренхімних клітин у переході гепатоцитів до проліферації; концепцію про співвідношення проліферативної і клітино-специфічної активності клітин печінки протягом відновлювального процесу.

2. Встановлено, що в регенеруючій печінці щурів гепатоцити, клітини Купфера та ендотеліальні клітини синусоїдів вступають у клітинний цикл в порядку їх наведення. Запропоновано використовувати параметри клітинних циклів клітин різних типів як часові орієнтири регенераційного процесу, а період між операцією і початком клітинного циклу гепатоцитів розглядати як перехідний від проліферативно неактивного до проліферативно активного стану тканини.

3. Запропоновано розрізняти два етапи у перехідному періоді регенераційного процесу: етап первинної компенсаторної реакції (0-0,5год після ЧГЕ) та етап перепрограмування діяльності клітин (0,5-3 год після ЧГЕ). Для першого характерні підвищення синтезу тотальної РНК і її фракцій, прискорення переходу новоутвореної РНК з ядра в цитоплазму, підвищення експресії тканино-специфічних (ЯФГ-1,

Р4502Е1) і неспецифічних білків (c-myc, c-fos). Для другого етапу характерні зниження синтезу і надходження новоутвореної РНК в цитоплазму, зменшення різноманітності ядерної РНК і затримка її в ядрі.

4. Вперше виявлено активацію системи 2'5'-оліго(А)синтетаза-РНКаза L та її специфічного індуктора інтерферону / протягом перехідного періоду регенераційного процесу. Запропоновано гіпотезу, за якою активне вибіркове видалення "старих" РНК, зокрема за допомогою вищезазначеної системи, вважається необхідним етапом для переходу викодиференційованої тканини від стану спокою до проліферації.

5. Вперше у регенеруючій печінці визначено експресію генів, які кодують фактор некрозу пухлин і його два рецептори, та виявлено значне підвищення їх експресії протягом перехідного періоду регенерації;

6. Обґрунтовано положення про провідну роль непаренхімних клітин печінки в запуску регенераційного процесу, що забезпечується активацією їх клітино-специфічних функцій протягом перехідного періоду і першого клітинного циклу гепатоцитів.

7. Вперше визначений синтез окису азоту і його інтенсивність у регенеруючій печінці щурів. Кількість NO, яке продукують гепатоцити, клітини Купфера та ендотеліальні клітини синусоїдів, зменшується в порядку наведення цих клітин. Синтез NO відбувається протягом G1- і G2-фаз і спадає в S-фазі клітинного циклу.

8. Вперше на моделі регенеруючої печінки in vivo продемонстровано взаємозв'язок між екпресією гену c-myc і фазами клітинного циклу гепатоцитів. Рівень експресії гену c-myc підвищений протягом G1- і G2-фаз і знижений в S-фазі клітинного циклу .

9. Вперше з'ясовано, що експресія генів с-fos, ЯФГ-1 і Р4502Е1 в проміжку часу, коли одночасно відбуваються проліферація гепатоцитів і відповідь печінки на травму, пов'язана з відповіддю печінки на травму.

10. Виходячи з даних, отриманих у цій роботі, запропоновано концепцію про синергізм клітино-специфічної активності одних клітин печінки і проліферативної активності інших. Показана подвійна функція сигнальних молекул, які регулюють проліферацію клітин в регенеруючій печінці, - деякі з них (простагландін Е2, ФНП-, ТФР-) можуть одночасно виконувати роль клітино-специфічних активаторів і клітино-специфічних інгібіторів проліферації.

...