Закономірності деградації хроматину тимоцитів за променевого ураження щурів

Захист дисертації відбудеться "22" червня 1999р. о 12 год на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26. 001. 24 Київського університету ім. Тараса Шевченка за адресою: 252127, м. Київ, проспект Глушкова 2, корпус 12 (біофак), ауд. 215.

Поштова адреса: 252033. Київ-33, вул. Володимирська, 64, спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету: Володимирська, 58.

Автореферат розісланий "18" травня 1999 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, професор О.В. Брайон.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Дія численних екстремальних факторів, включаючи іонізуючу радіацію на організм, викликає ряд імунодефіцитних та аутоімунних станів. Основними проявами імунодефіциту є зміна кількісного і субпопуляційного складу імунокомпетентних клітин, зниження проліферативної активності лімфоцитів, їх міграційних властивостей. Центральне місце у функціонуванні імунної системи належить лімфоцитам, яким характерна висока радіочутливість (Ярилин, 1988; Дмитренко, 1997).

Дослідження впливу іонізуючої радіації на імунну систему, вивчення типових змін і особливостей структурних, метаболічних та функціональних порушень в лімфоцитах продовжує бути однією із основних проблем сучасної радіобіології. Згідно сучасних уявлень, загибель лімфоїдних клітин при променевому ураженні пов'язане з безпосереднім пошкодженням мембран і структурної цілісності хроматину (Волянский, 1994; Бурлакова, 1992). Відомо, що хроматин в лімфоїдних і гемопоетичних тканинах опромінених тварин розщеплюється на кратні нуклеосомам фрагменти, що утворюють на електрофореграмах характерну картину "драбини" (Brown, 1993). Подальше вивчення механізмів міжнуклеосомної деградації хроматину показали, що цей процес ініціюється ендогенними нуклеазами і має місце у багатьох випадках програмованої клітинної загибелі (Ярилин, 1996; Цудзевич 1997).

Аналіз проблеми загибелі лімфоцитів показує, що у пізнанні молекулярних основ процесу деградації ДНК, механізмів його регуляції досягнутий певний прогрес (Уманский, 1996; Хансон, 1997). Дискусійними залишаються питання ініціації та регуляції пускових механізмів фрагментації хроматину лімфоцитів після дії на тварин низьких доз іонізуючої радіації, немає вичерпної картини стану компенсаторних, захисно-відновних і патологічних реакцій у відмираючих клітинах.

Не викликає сумніву, що комплексні дослідження молекулярних механізмів розвитку загибелі клітин приведуть до поглибленого розуміння природи багатьох важливих захворювань людини, що пов'язані зі змінами показників імунної системи і відкриють нові перспективи ефективного впливу на імунодефіцитні стани в умовах дії іонізуючої радіації.

Отже, проблема, якій присвячена робота, є актуальною і являє собою значний теоретичний і практичний інтерес.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною тематичного плану науково-дослідних робіт кафедри біохімії, що виконується на замовлення Кабінету Міністрів України від 1995 до 2000 р., № держреєстрації 0197 U 003173 "Біохімічні механізми розвитку променевого ураження після дії іонізуючої радіації".

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи є дослідження механізму розвитку і регуляції деградації структури хроматину, динаміки неспецифічних стресорних реакцій в тимоцитах тварин, що зазнали опромінення, та вивчення особливостей впливу на ці процеси радіомодулятора-нікотинаміду.

У відповідності з метою були поставлені такі завдання:

1. Дослідити вплив різних доз іонізуючої радіації на деградацію хроматину тимоцитів щурів. Виявити умови прояву цитогенетичного ефекту, тобто, дозу іонізуючої радіації та найменший час стабільного формування дискретних зон хроматину за типом "драбини".

2. Дослідити механізм деградації хроматину та стан репараційної системи ДНК тимоцитів щурів при одноразовому рентгенівському опроміненні та дії хронічного випромінювання низької інтенсивності.

3. Дослідити протеолітичну активність тимоцитів при впливі іонізуючої радіації.

4. Дослідити вплив тотального одноразового рентгенівського випромінювання на стан процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в тимоцитах. 5. Вивчити модифікуючу дію нікотинаміду на деградацію ДНК тимоцитів опромінених щурів.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше показано, що деградація хроматину в тимоцитах щурів з формуванням дискретних ДНК-фрагментів за типом "драбини" розпочинається через 3 години після одноразового рентгенівського опромінення в дозі 1 Гр. Тривале хронічне зовнішнє та внутрішнє опромінення з загальним радіаційним навантаженням 25 сГр викликає подібну картину деградації хроматину. Виявлені закономірності утворення однониткових та двониткових розривів ДНК, які відбуваються в хроматині тимоцитів після дії на щурів іонізуючої радіації в дозі 1 Гр, їх зв'язок з роботою репараційної системи клітини.

Вивчені характерні закономірності протікання реакцій ПОЛ і встановлено, що в опромінених тимоцитах реакції ПОЛ мають фазову залежність, що відповідає основним термінам деградації хроматину.

Досліджено протеолітичну активність тимоцитів щурів, що зазнали впливу іонізуючої радіації та модифікуючої дії нікотинаміду.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати щодо закономірностей механізму деградації хроматину тимоцитів опромінених тварин мають, перш за все, фундаментальне значення, оскільки дозволяють суттєво обгрунтувати розвиток післярадіаційних порушень в лімфоїдних клітинах на молекулярному рівні і лежать в основі розробки засобів цілеспрямованої їх корекції. Досліджено характер неспецифічних реакцій та зміни протеїназних активностей ферментів, що доповнюють відомі на сьогоднішній день принципи і етапи загибелі лімфоїдних клітин після дії іонізуючої радіації.

Тому на першому етапі роботи ми досліджували характер та основні закономірності деградації хроматину тимоцитів опромінених щурів при дії різних доз радіації, а також порівнювали дію одноразового рентгенівського опромінення на щурів з наслідком дії хронічного іонізуючого опромінення низької інтенсивності.

При використанні електрофорезу в агарозному гелі не вдається спостерігати чіткої картини фрагментації хроматину тимоцитів через 3 год після дії на тварин випромінювання в дозі 0.5 Гр, але відмічається його деградація. Через 1та 2 год після дії випромінювання в дозі 1 Гр було виявлено посилення деградації хроматину, але відсутні чітко сформовані дискретні області ДНК. Як видно з Рис. 1, поява набору ДНК-фрагментів відбувається через 3 год після дії на щурів іонізуючої радіації в дозі 1 Гр. Нуклеосомні фрагменти формують дискретні області за типом "драбини" відповідно до їх розміру. При цьому на електрофореграмі в агарозному гелі виявляються виразні смуги, що, як правило, відповідають фрагментам ДНК довжиною 200, 600 та 800 пар нуклеотидів (Матишевська, 1997).

При опроміненні в дозі 2 та 4 Гр спостерігається накопичення дискретних ДНК-фрагментів. Кількість фрагментів не збільшується з підвищенням дози. Збільшення дози до 8 Гр приводить до підвищення вмісту ДНК в термінальних зонах електрофореграми. Паралельно відбувається формування нових фрагментів ДНК, що мають більшу молекулярну масу.

При вивченні структурного стану хроматину тимоцитів хронічно опромінених щурів встановлено, що відбувається його фрагментація. Кількість фрагментів ДНК значно зростає та розподілені вони рівномірніше за спектром молекулярних мас (Рис. 2).

В результаті проведених досліджень встановлено, що дія хронічного іонізуючого випромінювання в дозі 25 сГр, як і одноразового рентгенівського опромінення, приводить до активації процесів фрагментації ДНК в тимоцитах з подібним характером.

Другим із підходів для визначення ступеня деградації хроматину в клітинах було дослідження виходу низько-молекулярних фрагментів ДНК - ПДН. Нами встановлено, що з підвищенням дози випромінювання спостерігається достовірне збільшення накопичення ПДН (Рис. 3).

В результаті накопичення ПДН, які мають різну молекулярну масу, відбувається формування дискретних областей на електрофореграмах. Факт їх появи дає змогу зробити висновок про активацію в клітині процесів, які вже не підлягають контролю з боку репараційної системи. Отримані нами дані та результати літератури (Солдатенков, 1989) дозволяють стверджувати, що в опромінених лімфоцитах деградація ДНК є ранньою подією і передує загибелі цих клітин.

Утворення розривів ДНК та їх репарація. Для аналізу фрагментації ДНК тимоцитів опромінених щурів ми вивчали динаміку структурних змін хроматину. Цілісність полімерної ДНК після опромінення порушується внаслідок утворення одно-ниткових та двониткових розривів. Як видно з Рис. 4, процес розщеплення структури ДНК має фазовий характер. Так, вже через 15 хв після опромінення відбувається збільшення кількості однониткових розривів, що на далі може визначати розвиток подій. Хоча більшість їх ліквідуються, деяка частина залишається нерепарованою і приводить до виникнення додаткових двониткових розривів, кількість яких через 120 хв. починає збільшуватись. Критичний рівень двониткових розривів, можливо, є сигналом в результаті якого відбувається активація систем деградації генетичного матеріалу (Bruant, 1984).

У відповідь на дію випромінювання відбувається активація функціонування репараційних систем, які мають значний, але певний резерв. (Рябченко, 1982, Shall, 1982). Це приводить до того, що приблизно через 2 год кількість однониткових розривів зменшується. Індекс репарації збільшується порівняно з першим дослідженим терміном. Та в інтервалі до 60 хв позаплановий синтез ДНК підвищений стосовно інтактних тварин (Рис. 5). опромінення деградація хроматин тимоцит

З приведених вище даних деградації і репарації можна зробити висновок про те, що на першому етапі (120 хв) в результаті дії іонізуючої радіації відбувається накопичення двониткових розривів ДНК. А збільшення кількості однониткових розривів ДНК приводить до зменшення синтетичного потенціалу клітини.

Хронічно опромінені тварини мали інший розподіл досліджених показників. Так, при аналізі одно - та двониткових розривів ДНК їх кількість відповідає закінченню першої фази деградації генетичного матеріалу. Але індекс репарації перевищує норму, що може свідчити про потенційну життєздатність клітин. Приймаючи до уваги раніше отримані дані за допомогою електрофорезу: більшу, у порівнянні з одноразовим рентгенівським опроміненням, кількість дискретних зон деградації хроматину, їх рівномірне розподілення за спектром молекулярних мас, зникнення зазначених особливостей через 2-3 тижні після опромінення тварин можна зробити висновок, що ці клітини знаходяться у стані адаптації.

Результати порівняння дії одноразового рентгенівського та хронічного випромінювання свідчать про те, що зменшення індексу репарації не пов'язано зі зменшенням ресурсу клітини, а є наслідком дії програми адаптації більш складної за ієрархією біологічної системи.

Механізм розвитку фрагментації хроматину тимоцитів опромінених щурів. Експериментальним шляхом було встановлено, що Са2+, Mg2+-залежна ендонуклеаза здійснює розриви ниток ДНК, що знаходяться між нуклеосомами (Cohen, 1984). Внаслідок цього з'являються розриви, які несуть 3'-ОН кінці (Белецкий, 1987), накопичуються ПДН. Тому частина нашої роботи була направлена на вивчення ферментативної деградації ДНК та визначення природи нуклеаз, що відповідають за цю деградацію в тимоцитах опромінених щурів. Через 30 хв після дії радіації в тимоцитах починає збільшуватись Са2+, Mg2+-залежне накопичення ПДН, що через 120 хв набуває максимального значення (при цьому воно збільшується в п'ять разів у порівнянні з контролем). Репараційні системи вже не справляються з новою хвилею утворення ферментативних розривів, і через 180 хв спостерігалась впорядкована деградація ДНК. Далі відбувається елімінація клітин з деградованим хроматином.

Нами було досліджено і Mg2+-залежне накопичення ПДН, оскільки Mg2+-залежна нуклеаза відома як фермент, що також деградує нативну ДНК (Никонова, 1982). Як видно з Рис. 6, через 120 хв. Mg2+ - залежне накопичення ПДН збільшується у два рази, але у порівнянні з активністю Са 2+, Mg2+-залежної ендонуклеази можна зробити висновок про незначний вклад цього ферменту у формування ефекту.

Таким чином, можна зазначити, що в умовах нашого експерименту 120 хв після дії опромінення можна вважати незворотним терміном процесу пошкодження клітин. Са2+, Mg2+-залежна ендонуклеаза -ініціює процес ферментативного розпаду хроматину, і її ферментативна активність визначає фрагментацію генетичного матеріалу. Сигналом для збільшення активності ферменту може бути збільшення нерепарованих двониткових розривів.

ІІ. Стан ПОЛ тимоцитів при дії рентгенівського опромінення. В тимоцитах після опромінення швидко прискорюються вільнорадикальні реакції перекисного окислення, що супроводжуються розщепленням складних органічних сполук, дисипитацією їх енергетичного потенціалу і утворенням токсичних продуктів ліпоперекисної природи (Кудряшов, 1961; Серкіз, 1990; Кудряшов, 1992). Тому наступним етапом наших досліджень було вивчення динаміки спонтанного, ферментативного та неферментативного окислення в тимоцитах опромінених щурів.