Вплив моноксиду вуглецю та гіпертермії на синтез ейкозаноїдів та гормонів, що регулюють загибель клітин в легеневій тканині

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив моноксиду вуглецю та гіпертермії на синтез ейкозаноїдів та гормонів, що регулюють загибель клітин в легеневій тканині

бронхоальвеолярний клітина альвеолярний макрофаг

До цього часу була проведена велика кількість досліджень, предметом яких було вивчення систем, що беруть участь в регуляції клітинної загибелі, а також умов, які ведуть до її розвитку (Virchow R. 1977; Lockshin R.A. 1997). Клітинна смерть не розглядається більше як катастрофічне руйнування клітинної цілісності - а як кінцева точка цілого ряду каскадів метаболічних процесів, що протікають як всередині клітини, так і в організмі в цілому. Одна з систем, яка бере участь в регуляції клітинної загибелі, є система ейкозаноїдів (Vane J.R 1971, Гомазков О.А. 1987). Цікаві клінічні та експериментальні спостереження, які пов'язані з ініціацією генних механізмів апоптозу та розвитком клітинної смерті в різних тканинах після впливу моноксиду вуглецю, викликають необхідність у більш широкому розгляді ролі цієї моделі в процесі клітинної смерті (Piantaqdosi C.A. 1997, Щуковський В.В. та ін. 1996). Особливий інтерес сьогодні привертає питання, присвячене визначенню ролі і місця моноксиду вуглецю (СО) та системи ейкозаноїдів в процесі регуляції клітинної загибелі в легеневій тканині, що висвітлене недостатньо. Питання про вплив гіпоксії і гіпертермії та їх сумісної дії як чинників, що викликають клітинну смерть, на рівень синтезу ейкозаноїдів, стан нейрогуморальної системи та на клітинну цілісність, залишається мало вивченим, незважаючи на те, що цій проблемі також приділяється увага (Савченкова Л.В. 1995; Wyllie A.H.1993; Аветисян А.М. із співавт. 1987).

У представленій роботі проведено вивчення біосинтезу ейкозаноїдів в умовах перегрівання, дії моноксиду вуглецю, а також за умови їх сумісного впливу, що дозволило виявити невідомі досі взаємовідносини між рівнями синтезу простагландинів різних груп, циклічних нуклеотидів та ступенем клітинної загибелі в легеневій тканині щурів. Окрім цього дане дослідження дало відповідь на питання, яким чином ендокринна система реагує на умови, що призводять до розвитку клітинної загибелі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Подана робота виконана в межах конкурсної держбюджетної теми МОЗ України та планової держбюджетної тематики Луганського державного медичного університету - "Вплив екологічно небезпечних факторів на організм в умовах промислового регіону та розробка методів корекції метаболізму й інтенсивної терапії" № державної реєстрації 01.9.10.033409.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було визначення вмісту простагландинів, циклічних нуклеотидів та гормонів, що беруть участь в регуляції клітинної загибелі в легеневій тканині, яка виникає під впливом гіпертермії, моноксиду вуглецю, та їх сумісній дії.

Для реалізації мети було вирішено такі завдання:

Розроблено експериментальну модель, що викликає загибель клітин бронхоальвеолярного дерева in vivo в умовах впливу гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісної дії.

Встановлено особливості біосинтезу простагландинів Е2 і F2a із ендогенних попередників та циклічних нуклеотидів в тканинах нирок (корі і медулі) в умовах гіпертермії, а також концентрацію цих сполук в легеневій тканині (в правій і лівій легені) у тварин при гіпертермії, гіпоксії та їх сумісному впливі.

Досліджено ступінь руйнування епітелію бронхоальвеолярного дерева, шляхом визначення індексу дегенерації віюватого епітелію (ІДВЕ) в експериментальних умовах і виявлено стан клітинних ультраструктур в тканинах легень, нирок і печінки щурів лінії Wistar в умовах гіпертермії, для підтвердження розвитку клітинної загибелі.

Визначено стан внутріклітинних ферментативних систем альвеолярних макрофагів легень щурів при гіпертермії, гіпоксії і їх спільному впливі як однієї із характеристик клітинної загибелі.

Визначено вміст адренокортикотропного гормону (АКТГ), метенкефаліну, паратиреоїдного гормону (ПТГ), кальцитоніну, альдостерону, активності реніну плазми (АРП) у інтактних тварин та тварин під впливом гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісному впливі.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено експериментальну модель стимульованої клітинної загибелі, котра розвивалася в легеневій тканині під впливом гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісній дії. Вперше здійснено комплексне дослідження і проведено порівняльний аналіз дії гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх спільного впливу (як чинників, що викликають клітинну смерть) на зональну ниркову (коркову та медулярну) і легеневу (права і ліва легеня) концентрацію простаноїдів (простагландини Е2 і F2a) та циклічних нуклеотидів (ц-АМФ і ц-ГМФ). Вперше показана різниця між тканинними концентраціями простагландинів та циклічних нуклеотидів у правій та лівій легені під впливом підвищеної температури, моноксиду вуглецю та їх взаємодії. Вперше показано вплив досліджуваних факторів на деякі ланки ендокринної системи, які відповідають за адаптацію до умов температурного та гіпоксичного стресу, та зв'язок цих процесів із вмістом іонів Na⁺ і Ca²⁺ в нирковій тканині і плазмі крові в експериментальних тварин. Визначені концентрації мет-енкефаліну, АКТГ, ПТГ, кальцитоніну, альдостерону, АРП, що дозволило запропонувати схему адаптаційно-компенсаторних механізмів, що виникають під час розвитку клітинної загибелі в умовах розробленої нами експериментальної моделі.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені зміни ІДВЕ, порушення біосинтезу простагландинів та вмісту циклічних нуклеотидів в легеневій і нирковій тканинах, в умовах дії гіпертермії та моноксиду вуглецю, можуть служити допоміжними показниками для визначення ступеня розвитку в них клітинної загибелі.

Виявлені зміни в життєвому циклі клітин (життя клітини - загибель клітини) в умовах впливу гіпертермії, гіпоксії та їх поєднання дають підставу припустити, що при розвитку гіперпроліферативних процесів, в основі яких лежить пригнічення процесів програмованої клітинної загибелі, можливе і доцільне застосування фокальної гіпертермії, як чинника, що стимулює клітинну загибель.

Результати дослідження взаємозв'язку синтезу простаноїдів, циклічних нуклеотидів та гормонів з регуляцією електролітного балансу в нормі і в експериментальних умовах, включені в учбову програму кафедри медичної хімії Луганського Державного медичного університету з тем: «Водно-сольовий обмін і його регуляція» і «Гормони, гормоноподібні речовини та їх посередники».

Особистий внесок здобувача. Внесок автора при виконанні дисертаційної роботи полягає насамперед у самостійному виконанні огляду літератури, участі у виконанні експерименту, статистичній обробці отриманих аналізів та інтерпретації отриманих даних, а також у формулюванні висновків роботи. Статті, що опубліковані в співавторстві в "Украинском биохимическом журнале" і в "Проблемах екологічної та медичної генетики і клінічної імунології", містять одержані здобувачем результати, в яких відображені методики експериментального дослідження з визначення вмісту простагландинів, морфологічні дослідження.

Апробація результатів дисертації. Матеріали результатів дисертації доповідалися на XV з'їзді Українського фізіологічного товариства (м. Донецьк 1998 р.); на IV міжнародному конгресі молодих вчених і студентів - медиків (Польща 1998 р.); на міжкафедральному засіданні працівників кафедри медичної хімії і науково-дослідного центру Луганського державного медичного університету.

Публікації. За результатами даної роботи опубліковано 6 наукових статей в трьох фахових виданнях, з них дві в єдиному авторстві, та 2 доповіді - в матеріалах двох наукових конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 159 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 3 розділів власних досліджень, заключного обговорення одержаних результатів та висновків. Список використаної вітчизняної та іноземної літератури включає 32 вітчизняних та 323 зарубіжних джерела. Робота ілюстрована 12-ма таблицями, 6-ма діаграмами, 3-ма рисунками, 4-ма мікрофотографіями.

Об'єкти та методи дослідження. Досліди поставлені на 220 щурах-самцях 3 місячного віку масою 200-250 гр. Тварини були поділені на 3 експериментальні групи та одну групу контролю. Для проведення експерименту було застосовано термотоксикологічну камеру (Можаєв Г.О. 1988 (АС 1452526)). У першій експериментальній групі тварин піддавали дії гіпертермії (+43 - +45°C) протягом 1 год., в другій - дії моноксиду вуглецю (СО) в концентрації 2000-2500 мг/м³ протягом 10 хв., в третій - спільному впливу гіпертермії та СО. У кожній групі визначалися рівні ендогенного біосинтезу простагландинів (ПГ) Е2, F2а та циклічних нуклеотидів в гомогенатах легеневої тканини (правої та лівої легені окремо) (Oliw 1980). Були визначені концентрації АКТГ, мет-енкефаліну, ПТГ, кальцитоніну, альдостерону в сироватці та активність реніну плазми (АРП). Був вирахуваний індекс дегенерації віюватого епітелію (ІДВЕ), поставлені реакції для виявлення стану активності альвеолярних макрофагів (АМ) (НСТ-тест, фагоцитарне число, фагоцитарний індекс, кількість живих АМ).

Кількісне визначення всіх метаболітів проводилося методом радіоімунного аналізу після їх попередньої екстракції та концентрації. Дослідження виконані за допомогою стандартних комерційних наборів у повній відповідності з доданими до них інструкціями. Були використані набори таких фірм: АКТГ, ПТГ, АРП фірми "CIS Biointernational" (Франція), альдостерону - фірми "Sorin Biomedica" (Італія), кальцитоніну - фірми "Byk-Sangtec Diagnostica" (Франция), мет-енкефаліну - фірми "Instar Corporation" (США), ПГF2а - фірми "Institute of isotopes" (Угорщина), ПГЕ2 - фірми "Advanced Magnetics Inc." (Великобританія), цАМФ і цГМФ - фірми "Chemapol" (Чехословакія). Підрахунок радіоактивності проводили на лічильниках "Бета-1" и "Гамма-1". У першій експериментальній та контрольних групах у тварин додатково визначали рівень іонів Са²⁺ та Na⁺ в корковому та мозковому шарі нирок і в плазмі крові. Також було виконано електронно-мікроскопічне дослідження тканини нирок, легень та печінки для визначення ознак, характерних для розвитку клітинної загибелі. Кількісне визначення білка проводили за методом Lowry (1951). Вимірювання електролітів в тканині та сироватці крові проводились за допомогою атомно-адсорбційного спектрофотометру С-115-М1.

Первинний цифровий матеріал експериментальних досліджень був оброблений традиційними методами варіаційної статистики. Для оцінки вірогідності отриманих результатів був використаний критерій Стьюдента. Результати розцінювались як статистично достовірні при p<0,05.

Результати дослідження та їх обговорення. Під час дії екстремальних факторів в клітині виникає геномна та гомеостазна нестабільність, яка призводить до виникнення адаптаційно-компенсаторних процесів в клітині або до декомпенсації, проявом якої є розвиток клітинної загибелі (Кунах 1995, Соловьян 1990). Було розроблено експериментальну модель клітинної загибелі, під час розвитку якої в ній відбуваються зміни в будові та структурі внутрішньоклітинних органел. Для підтвердження розвитку загибелі клітин було застосовано електронну мікроскопію.

Електронно-мікроскопічне дослідження легень показало, що альвеолоцити збільшені в розмірі, каріолема збережена, однак простір між внутрішньою і зовнішньою мембраною розширений. Спостерігається велика кількість юних мітохондрій, вони округлої форми, дещо збільшені в розмірі, але практично без матриксу. Старі мітохондрії характеризуються порушенням будови крист, аж до їх повного зникнення, матрикс світлий, спостерігається брунькування молодих мітохондрій. Гладкий та шорсткий ендоплазматичний ретикулум розширені.

На напівтонкому зрізі бронхіоли видно, що клітини слизової оболонки та міжклітинна мембрана набряклі і погано визначаються. Цитоплазма набрякла, але зберігає свою структуру. Ядра лімфоцитів, котрі були у полі зору, зберігали свою будову, проте ядерний хроматин конденсований по периферії ядра. Є ядра з початковими ознаками сегментації. В цитоплазмі спостерігається велика кількість вакуолей з більш оптично щільним вмістом. Мітохондрії збільшені.

Для підтвердження розвитку генералізації процесу клітинної загибелі були проведені електронно-мікроскопічні дослідження нирок та печінки. Встановлено, що під впливом гіпертермії більшість клітин коркового шару нирок була без деструкції цитоплазматичних органел. У ряді клітинних ядер був виявлений пікноз хроматину, а також набряк каріолеми. Мітохондрії - зі стертим малюнком крист. Вміст вакуолей і лізосом зменшений. У проксимальних відділах ниркових канальців нефрону було виявлено руйнування окремих клітин. Клітини, що оточують зруйновані, залишаються візуально цілими, хоча в їх ядрах хроматин знаходиться в конденсованому стані. Даний процес візуально нагадує поєднання двох видів клітинної смерті - некрозу та апоптозу. Останній відрізняється від проявів некрозу тим, що при масовій загибелі клітин відбувається руйнування ядер та органел клітин, при цьому в навколоклітинний простір викидається велика кількість лізосомальних ферментів, цитокінів, внаслідок чого навколишні клітини гинуть.

Дослідження гепатоцитів щурів показали, що плазмолема клітин змінена. Ядра мають овальну форму з рівними краями. Хроматин знаходився переважно в дифузному стані, але спостерігалися ядра з крайовою конденсацією ядерного хроматину, центральним фрагментарним його розрідженням і каріопікнозом. Мітохондрії зберігали свої розміри і форму, проте малюнок крист був помірно стертий. Відмічалося відбруньковування молодих мітохондрій, але без їх подальшого відшнуровування. Цитоплазма зберігала свою структуру, трохи збільшилися кількість і об'єм вакуолей. Ендоплазматичний ретикулум, як гладкий, так і шорсткий, був добре виражений, але дещо розширений.

Морфологічні зміни в епітелії бронхіального дерева, які виникали після впливу гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісної дії, було проаналізовано за допомогою визначення ІДВЕ трахеї, правого та лівого головного бронхів щурів. Так, при гіпертермії в цитологічному дослідженні мазків-відбитків в препаратах збільшувалася кількість слизу. Зростало число нейтрофілів. Клітинні елементи розташовувалися групами у вигляді скупчень і перебували в початковій стадії дегенерації. ІДВЕ достовірно зріс в трахеї в 1,6, правому бронху в 1,8, а в лівому - в 1,2 рази. У групі тварин, у яких моделювався вплив на органи дихання моноксиду вуглецю, при цитологічному дослідженні бронхіального вмісту в мазках-відбитках виявлялася в невеликій кількості слиз, малозмінені лейкоцити, АМ і клітини циліндричного епітелію. Оксид вуглецю достовірно підвищував ІДВЕ в трахеї в 1,4 рази в правому бронху в -- 1,2 рази. Зростання ІДВЕ в лівому бронху практично не відбувалося.

При сумісному впливі гіпоксії і гіпертермії цитологічне дослідження виявило велику кількість слизу. Клітинні елементи, в основному лейкоцити, АМ, лімфоцити і клітини бронхіального епітелію, розташовувалися великими групами у вигляді скупчень і нашарувань, що утруднювало їх транслокацію та кооперацію. Дегенеративні зміни клітинного складу були більш вираженими. Знижувалася функціональна здатність віюватого епітелію. Вирішено було порівняти ступінь впливу факторів експерименту на здатність до виживання, як АМ, так і віюватого епітелію трахеобронхіального дерева, з метою порівняння експериментальних умов, які викликають максимальний рівень клітинної загибелі. У зв'язку з цим нами був введений коефіцієнт клітинної загибелі, в котрому враховувалась кількість живих клітин серед загального числа клітин (N=100) і який визначали за формулою:

100 - загальна кількість клітин, що підраховувалась

Nи - кількість живих клітин після впливу пошкоджуючого фактора

Nк - кількість живих клітин в контрольній групі.

- віднімання визначає кількість мертвих клітин в загальній групі клітин

Даний коефіцієнт показує в скільки разів кількість загиблих клітин після дії пошкоджуючого фактора переважає над кількістю загиблих клітин в контрольній групі (Рис.1).

Для оцінки взаємозв'язку розвитку клітинної загибелі з функціональним станом клітин було проведено дослідження функціональної активності АМ, тому що вона знаходиться в прямій залежності від цілісності внутріклітинних структур і клітини в цілому. Дослідження функціонального стану АМ допомогло оцінити ступінь ушкоджень клітин, в залежності від виду подразника, котрий викликав розвиток клітинної загибелі. Після впливу гіпертермії, функціональний стан АМ значно змінився. Фагоцитарне число поменшало в 1,63 рази, фагоцитарний індекс зменшився в 3,93 рази, НСТ-тест виріс в 3,14 рази, тетразолієва активність виросла в 1,59 рази, а кількість життєздатних АМ знизилася в 1,58 рази. СО вплинув менш виражено, ніж перегрівання на стан АМ.

Рис. 1. Коефіцієнти клітинної загибелі альвеолярних макрофагів та віюватого епітелію трахеобронхіального дерева при дії гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісному впливі

Під впливом гіпоксії функціональний стан АМ змінився таким чином: фагоцитарне число знизилося в 1,23 рази, фагоцитарний індекс АМ поменшав в 1,63 рази, НСТ-тест виріс в 1,84 рази, тетразолієва активність збільшилася в 1,86 рази, кількість життєздатних АМ практично не відрізнялась від групи контролю.

На особливу увагу заслуговують результати досліджень місцевих захисних механізмів органів дихання при сумісному впливі на них моноокису вуглецю і високої температури навколишнього середовища. Стан функціональної активності АМ у тварин цієї групи характеризувався значним зниженням фагоцитарного числа і фагоцитарного індексу в 2,15 і 4,49 разів відповідно. Число НСТ позитивних АМ зросло в 3,16 раз, а їх тетразолієва активність виросла в 1,45 рази, кількість життєздатних АМ зменшилась в 1,51 рази. Це може вказувати на глибокий зрив компенсаторних механізмів функціональної адаптації, який приводить до підвищення кліренсу клітинної загибелі, як за рахунок некрозу, так і за рахунок активації програмованої клітинної загибелі (Sodja C. 1998). Таким чином, спільний вплив моноксиду вуглецю і гіпертермії, виявляє найбільш виражену дію на активність АМ, різко пригнічуючи її. Виходячи з отриманих даних можна припустити, що в легеневій тканині за умови впливу гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісної дії відбувалося різке пригнічення функціональної активності АМ. Агентом, який викликав найменші прояви клітинної загибелі, виявився моноксид вуглецю, а найбільший вплив був характерний для сумісної дії гіпертермії та моноксиду вуглецю.

Поряд з вивченням морфофункціональних змін в віюватому епітелії бронхів, трахеї та АМ, проводилось також визначення концентрацій простагландинів Е2 та F2a в правій та лівій легені, так як гіпертермія є фактором, котрий може впливати на біосинтез гормонів і гормоноподібних речовин (Knapp H.R. 1994). В умовах гіпертермії змінюються процеси синтезу і катаболізму біологічних активних речовин, змінюються властивості їх рецепторів, модулюється їх біологічна активність (Prado W.A. 1997). В умовах гіпертермії ми вивчали рівень синтезу ейкозаноїдів і циклічних нуклеотидів в легеневій тканині і в тканині коркового і мозкового шару нирки щура. У даному дослідженні проводилася порівняльна характеристика можливостей синтезу ейкозаноїдів тканинами легень і нирок як двох можливих метаболічних протилежностей, тому що відомо, що в нирках відбувається основний синтез простагландинів, а легені виступають метаболічним фільтром, в якому відбувається їх дезактивація (Nally J.E. 1996). Але при цьому в легенях існує і базальний рівень синтезу простагландинів. Наявність активного синтезу лейкотрієнів в легенях вже встановлена (Birks E.K. 1997, Hammarstrom S. 1985).

У легенях нами досліджувався базальний рівень біосинтезу ПГЕ2 і ПГF2а і їх вторинних посередників ц-АМФ і ц-ГМФ. Проведення дослідження в правій і лівій легені було обумовлене їх деякими морфофункціональними відмінностями. Так, навіть у контрольній групі, рівень синтезу ПГЕ2 між правою і лівою легенею достовірно відрізнявся. Його вміст в правій легені перевищував такий в лівій в 1,5 разів. У дослідній групі під впливом гіпертермії синтез ПГЕ2 різко зростав (Рис.2). Концентрація ПГF2а в контрольній групі достовірно не відрізнялася між правою і лівою легенею, але все ж його ендогенний синтез був більш інтенсивним в правій легені. У дослідній групі, після перегріву концентрація ПГF2а зросла в правій і лівій легені (Рис.2).

Співвідношення концентрацій ц-ГМФ в правій і лівій легені було різним. У правій його вміст перевищував такий в лівій в 1,4 рази. Після перегрівання концентрація ц-ГМФ зростала більш ніж в 3 рази, як в правій так і лівій легені (Рис. 2).

Базальний рівень ендогенного синтезу ц-АМФ в правій легені, також перевищував рівень базального біосинтезу в лівій (Рис 2).

При визначенні вмісту ПГЕ2, ПГF2а та ц-АМФ і ц-ГМФ в тканинах кори і медули нирки щура було встановлено, що в контрольній групі концентрація ПГЕ2 в корковому та медулярному шарі нирок відрізнялись в 960 разів, причому основний вміст ПГЕ2 був зареєстрований в медулярному шарі нирок. У досліджуваній групі вміст ПГЕ2 зріс в корі в 8,8 раз, в медулі нирок - в 1,33 рази - порівняно з контрольною групою. Подібним чином змінювалась і концентрація ПГF2а. В контрольній групі вміст ПГF2а в мозковій речовині був у 57 разів більшим, ніж в корі нирки. При перегріві вміст ПГF2а в корі зріс в 1,65 рази, в медулі - 1,9 разів.

Рис.2- вміст простагландинів Е2, F2а та циклічних нуклеотидів в легенях при дії гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісному впливі

Концентрація вторинних посередників, циклічних нуклеотидів, (ц-АМФ і ц-ГМФ), що пов'язані з реалізацією сигналів через систему простагландинів Е2 і F2а, змінювались іншим чином. Аналіз експериментальних даних показав, що в нирковій тканині в контрольній групі вміст ц-АМФ в медулі перевищував такий в кірковій речовині в 3 рази. Після перегріву його концентрація зросла таким чином: у корі - 15,6 рази, в медулі - 2,6 рази. При дослідженні вмісту ц-ГМФ, який є вторинним посередником дії ПГF2а, встановлено, що в контрольній групі він в корі складав 0,15 пмоль\мг білку, що в 6,4 рази менше, ніж в мізковій речовині. У групі експериментальних тварин концентрація ц-ГМФ зростала, як в корі, так і в медулі нирки.

Зміни у співвідношенні концентрацій циклічних нуклеотидів(ц-АМФ/ц-ГМФ), як в легеневій так і в нирковій тканині, може свідчити про функціональну мобілізацію органу і запуск програми клітинної смерті, або через некроз, або ж через реалізацію програмованої клітинної смерті. (Van Rijn J. 1996).

В умовах тканинної гіпоксії, що розвивається у тварин в атмосфері з підвищеною концентрацією СО, після експозиції в камері вміст ПГЕ2 виріс в правій і лівій легені в 2,7 і 1,9 рази відповідно (Рис.2). Концентрація ПГF2а в легенях в процесі експерименту також зростала: в правій легені - в 2,6 разів, а в лівій - в 1,2 разів (Рис.2). Вплив СО викликав зниження рівня ц-АМФ в правій легені порівняно з контролем в 1,8 рази, а в лівій зниження було більш глибоким - в 3,1 рази. Динаміка змін рівня ц-ГМФ практично не відрізнялася від такої при перегріві. Його концентрація в правій легені виросла в 4,2 рази, а в лівій - в 1,7 рази (Рис. 2).

Для перевірки припущення про сумарний вплив гіпоксії і гіпертермії на досліджувані процеси ми провели порівняльний аналіз ендогенного біосинтезу простагландинів і їх посередників при сумісній дії цих агентів та роздільних впливів на них гіпертермії і моноокису вуглецю. Сумісна дія СО і гіпертермії моделювалося при поєднанні двох вищевказаних умов. У експериментальній групі ендогенний біосинтез простагландинів суттєво змінювався. У правій легені синтез простагландину Е2 зріс в 2,5 а в лівій в 2,9 рази, при цьому ж впливі синтез простагландину F2a в правій легені виріс в 3,5, а в лівій в 2,9 рази (Рис. 2). Вміст циклічних нуклеотидів після проведення експерименту змінювався інакше. Концентрація ц-АМФ різко зросла: в правій легені - в 4, а в лівій - в 10 разів. Динаміка змін циклічного гуанозинмонофосфату була такою ж, як при перегріванні і впливі СО, але його рівень в правій легені значно зріс (в 9 разів) порівняно з контролем, а в лівій - в 16 разів (Рис. 2). Отримані дані підтверджують наше припущення про те, що фактор гіпертермії і СО реалізують свої ефекти через схожі механізми, одним з яких є активація ендогенного біосинтезу простагландинів і системи циклічних нуклеотидів. Особливу увагу привертає система циклічного гуанозинмонофосфату, оскільки його реакція на умови експерименту була найбільш вираженою.

Таким чином, на підставі отриманих результатів можна заключити, що спільний вплив СО і гіпертермії викликає більш значні зміни клітинних процесів в легеневій тканині. Сьогодні існують роботи, що підтверджують значний вплив СО на такі важливі метаболічні процеси, як синтез ферментів, наприклад цитозольної гуанілат-циклази (Jourd'heuil D. 1997; Марков Х.М. 1996), тощо. Клітинна загибель - процес багатогранний який здійснюється на різних рівнях клітинної організації і контролюється різноманітними регуляторними механізмами. Одним з таких факторів є і лейкотрієни (Krajcsi P. 1996) На сучасному етапі існують незаперечні докази впливу гормонів, зокрема глюкокортикоїдів (ГК), на розвиток програмованої клітинної загибелі в тимоцитах (Schwartsman R.A. 1994). В тимоцитах, які було оброблено ГК, була виявлена фрагментація клітинного ядра з остаточним розпадом ДНК під впливом ядерних ендонуклеаз (Wyllie A.H. 1980). Можливими механізмами, що викликають апоптоз під дією ГК є експресія кальмодуліну з подальшим зростанням концентрації внутрішньоклітинних іонів Са²⁺, активація протоонкогенів з подальшою зміною клітинного циклу, зниження продукції інтерлейкінів і інших цитокінів (Baughman G. 1997; Helmberg A. 1995). Проте роль і механізми дії інших гормонів досліджені недостатньо. Тому особливий інтерес викликає дослідження стану гормонів гіпофізу, нейрогормонів, гормонів, що регулюють рівень іонів Na⁺ і Са²⁺ в плазмі крові і нирках. Метою цих досліджень було визначити, яким чином ендокринна система реагує на умови, які ведуть до розвитку клітинної загибелі.

Іони Са²⁺ також регулюють не тільки процеси вивільнення гормонів, але і самі в комплексі з кальмодуліном виступають посередниками в реалізації гормональної відповіді (Теппермен Д. 1989). Крім того, вони є одним з факторів згортання крові, входять до складу кісткової тканини, є індукторами апоптозу (Nicotera P. 1986). Проте питання, яким чином умови що викликають розвиток клітинної смерті, впливають на баланс гормонів, що регулюють концентрацію іонів Са²⁺ в плазмі крові (ПТГ та кальцитоніну) залишається відкритим. У нашому експерименті в умовах гіпертермії концентрація ПТГ зростала в 1,6 рази при практично незмінній концентрації сироваткового кальцитоніну. Дане зростання концентрації ПТГ спостерігалося на фоні зростання концентрації Са²⁺ в плазмі крові на 10% і зниженням його вмісту в медулі нирок також на 10%. Найімовірніше, відбувається стимульована гіпертермією або ж її наслідками, такими як підвищення концентрації ГК (внаслідок викиду АКТГ) і катехоламінів, реакція, в процесі якої опосередковано (через гальмування всмоктування кальцію в кишечнику) і безпосередньо (через ?-рецептори паращитовидних клітин) відбувається стимуляція секреції ПТГ, внаслідок чого відбувається зростання плазмової концентрації іонів Са²⁺. (Теппермен Д. 1989).

Перегрівання організму є стресом, основними проявами якого є підвищення концентрацій ГК. Основну роль в процесі регуляції рівня ГК в крові виконує АКТГ. Функціональний стан наднирників може відбиватися через динаміку зміни концентрації в крові основного регулюючого фактора їх гормонів - АКТГ.

Рис.3. Концентрація гормонів в сироватці крові при впливі гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісній дії

В експерименті після перегріву концентрація АКТГ в сироватці крові виросла в 2,4 рази, що дозволяє сказати, що при даному впливі активність ГК, як в сироватці, так і в тканинах організму, буде підвищеною. Крім того, одним з вторинних ефектів АКТГ є регуляція секреції наднирниками мінералокортикоїдів (альдостерону). У випадку з перегріванням АКТГ відіграє, скоріш за все, роль пускового фактора секреції альдостерону. Але таке різке підвищення концентрації альдостерону (в 4 рази) важко пояснити тільки підйомом концентрації АКТГ. Його концентрація в крові контролюється і рядом інших факторів. До таких факторів відносяться рівень іонів Nа⁺ в плазмі крові, осмолярність плазми, рівень секреції реніну та вивільнення ангіотензину. Це припущення було підтверджене результатами дослідження інших факторів, що регулюють концентрацію альдостерону в крові. Була визначена активність реніну плазми, яка при гіпертермії зростала в 2,8 разів (Рис. 3).

Вміст реніну в крові та його активність залежить від ниркового кровотоку, від рівня біосинтезу цитокінів (ПГЕ2), від стану активності ферментних систем тих органів, в яких відбувається його секреція. Наслідком роботи системи ренін-ангіотензин-альдостерон (РАА) в нашому експерименті було підвищення концентрації сироваткового натрію на 20% від початкового рівня.

Ендогенні опіоїди є тими нейропептидами, на які покладаються функції інтеграції і взаємодії між гуморальної і нервовою системами. Цілим рядом робіт встановлена роль екзогенних опіатів в розвитку і стимуляції апоптозу (Yin DL. 1997; Singhal PC._Ћ 1997). Але досліджень стану системи ендогенних опіоїдів в умовах стимуляції клітинної загибелі практично не проводилося. В дослідженнях, що проводилися в нашому центрі раніше, встановлена роль і вплив опіоїдів на синтез простагландинів і стан водно-сольового балансу в нирковій тканині. Вони виявляли антинатрійуретичну дію і гальмували вироблення простагландинів (Кузнецова Е.В. 1994; Комаревцева И.О.1992.

Зниження рівня мет-енкефаліну в умовах клітинної загибелі є компенсаторно-приспособлювальною реакцією, аналогічно синтезу БТШ, результатом якої повинно бути зниження проявів клітинної загибелі не тільки в самій клітині або їх культурі, але і в організмі в цілому. Враховуючи те, що у АКТГ і ендогенних опіатів є спільний попередник, то можна передбачити, що зниження їх концентрацій в плазмі крові зумовлене негативним зворотним зв'язком АКТГ з проопіомеланокортином або з його подальшими метаболітами (Shreiber V. 1994). При дії СО також було досліджено концентрації АКТГ, мет-енкефаліну, ПТГ, кальцитоніну, альдостерону, АРП, з метою визначення можливої ролі Сяк сигнальної молекули в процесах гуморальної регуляції клітинної загибелі.

Дія моноксиду вуглецю на стан ендокринної системи організму виявилася більш вираженою, ніж вплив гіпертермії. Після проведення експерименту спостерігалося зниження вмісту АКТГ в сироватці крові (в 2,2 рази) та концентрації мет-енкефаліну (в 1,3 рази) порівняно з контролем (Рис 3). Така реакція АКТГ на дію СО може бути пояснена зменшенням активності систем синтезу. Порушення цього процесу є початком розвитку в клітині процесів клітинної загибелі, при якому клітина втрачає своє основне функціональне призначення. Отримані дані свідчать про участь СО в системі передачі сигналу від клітинних рецепторів до генетичного апарату клітини. Подібний факт був встановлений при порівнянні з дією СО та NO на гіпофіз (Rivier C. 1998).

Вивчення впливу СО на концентрації основних гормонів, що регулюють концентрацію іонів кальцію в плазмі крові. (Рис. 3) показало, що мають місце порушення які є протилежними до тих, які були встановлені при дії гіпертермії. Концентрація ПТГ знизилася (в 3,5 рази) і практично еквівалентно зросла концентрація кальцитоніну (в 3,7 рази), що може скоріш за усе свідчити про зростання концентрації іонів Са²⁺ в плазмі, і даний ефект можна розглядати як компенсаторну реакцію організму на підвищення концентрації іонів Са²⁺.

Дія СО призводила до зміни показників РАА системи: концентрація альдостерону виросла в 13,6 разів ,а АРП - в 3,9 разів (Рис.4) в порівнянні з контролем. Отримані результати свідчать про те, що речовинами, які регулюють вміст компонентів РАА системи в плазмі крові виступає і СО. Ці дані збігаються з результатами з підвищення плазмової активності реніну після експозиції тварин в атмосфері СО і ПГЕ2 (Kramer BK.1998; Кузнецова Е.В. 1994). Оскільки його концентрація і в легенях, і нирках значно зросла, плазмова концентрація також буде високою, і він зможе реалізувати свої властивості як гормон, регулюючи активність РАА системи.

Поєднання дій гіпертермії та СО було моделлю, коли в умовах розвитку клітинної смерті (гіпертермія) до клітин доставлявся СО. Оцінюючи картину гормонального спектру, необхідно було враховувати можливість впливу цитокінів, NO, ейкозаноїдів на вміст гормонів в плазмі крові в умовах стимульованої клітинної загибелі, оскільки існують дані про можливу активацію індуцибельної NO-синтетази СО, з подальшим включенням в ланцюг тканинних процесів молекули NO (Chiarugi V.1998). Сам СО, крім того, є стимулятором індуцибельної циклооксигенази-2, що обумовлює посилення біосинтезу ПГЕ2 практично у всіх тканинах організму (Kostoglou-Athanassiou I. 1998). Також існують дані про активацію системи інтерлейкінів в умовах розвитку клітинної загибелі під впливом СО (Li WX. 1998).

Після проведення експерименту концентрація АКТГ знизилася в 1,6 разів, а вміст мет-енкефаліну в 2,4 рази порівняно з контролем (Рис.3). Дане зменшення концентрацій нейрогормонів може свідчити або про виснаження клітинних систем, що виділяють їх, або про те, що в клітинах розвинулися зміни, які є не сумісні з виконанням властивих для них функцій (Maines M.D. 1995). На користь цього припущення свідчить також порушення в системі регуляції кальцію, що виражаються в зникненні реципрокних взаємовідносин між двома гормонами, які регулюють концентрацію іонів кальцію в плазмі крові, що виражається в підвищенні концентрацій як ПТГ, так і кальцитоніну в бік зростання концентрації кальцитоніну (Рис.3).

Стан РАА системи і співвідношення між її компонентами також змінювалося. Концентрація альдостерону виросла в 9,2 разів, а АРП -- в 4,6 разів (Рис.3).

Базуючись на останніх даних літератури та даних, які було отримано в роботі, можна підсумувати, що моноксид вуглецю і простагландини виступають одночасно як тригери і внутрішньоклітинні месенджери в процесі запуску і розвитку клітинної загибелі, де СО і простагландини, залишаючись єдиною регуляторною системою, виконують різноспрямовані функції. Виконуючи функції внутрішньоклітинних месенджерів вони чинять і активуючий і інгібуючий вплив на генний апарат клітини, контролюючий розвиток клітинної загибелі. В цьому процесі можуть бути задіяні NO, СО, циклооксигеназа, гемоксигеназа, ПГЕ2 і ПГF2a, тому що в недавніх дослідженнях був виявлений вплив СО на активність циклооксигенази, в якому відбувалося підвищення її активності з подальшим підвищенням утворення простагландинів (Mancuso C. 1998; Satta M.A. 1998).

Висновки

Перегрівання організму (до 41-43?C), вплив моноксиду вуглецю та їх сумісна дія ведуть до загибелі клітин віюватого епітелію бронхів, ниркової, печінкової та легеневої тканин.

Під впливом моноксиду вуглецю, гіпертермії та їх сумісної дії відбувається зрушення метаболізму поліненасичених жирних кислот, що виражається в зростанні тканинної концентрації простагландинів Е2 та F2а в правій та лівій легені.

В умовах впливу гіпертермії, моноксиду вуглецю та їх сумісної дії в легеневій тканині відбувається різноспрямована зміна концентрацій циклічних нуклеотидів в бік зниження ц-АМФ та зростання ц-ГМФ.

Базальна та стимульована в умовах експерименту концентрації простагландинів та циклічних нуклеотидів в правій легені перевищують такі в лівій.

У гормональній відповіді організму при дії моноксиду вуглецю, гіпертермії та їх сумісній дії відбувається різнонаправлені зрушення ендокринних механізмів регуляції концентрації іонів кальцію плазми крові.

Підвищення активності ренін-ангіотензин-альдостеронової системи з розвитком синдрому гіпернатріємії вказують на порушення водно-сольового гомеостазу, що сприяє розвитку клітинної загибелі.

Дія моноксиду вуглецю та його поєднання з гіпертермією веде до зниження концентрації мет-енкефаліну, значного зменшення вмісту АКТГ в сироватці крові, що вказує на зрив адаптаційних механізмів в стресорних гормональних системах.

Дія моноксиду вуглецю та його сумісний вплив з гіпертермією викликають зростання плазмової концентрації ПТГ, кальцитоніну, іонів Са²⁺ та Na⁺, зниження плазмової концентрації мет-енкефаліну та АКТГ, зростання тканинної концентрації простагландинів, ц-ГМФ зниження тканинної концентрації ц-АМФ, що сприяє розвитку клітинної загибелі.

Список робіт

И. А. Комаревцева, А. А. Рощупкин, В. Н. Комаревцев, М. В. Панасенко, В. Н. Сенчий "Изменение метаболизма простаноидов при кистозном поражении почек" // Украинский биохимический журнал, 1997, № 5-6 , т. 69, С. 168-176.

И.А. Комаревцева, В.Н. Сенчий. Особенности эндогенного биосинтеза простагландинов Е₂ и F_2a тканями лёгких в условиях гипоксии и гипертермии // Украинский биохимический журнал.- 1998.- Т.70.-№ 5.- С.117-121

Сенчій В.М. Моноксид вуглецю - як один із можливих чинників в розвитку програмованої клітинної смерті // Український медичний альманах.- 1998.- №4.- С.110-113

Сенчий В. Н., Панасенко М. В., Комаревцева И. О. Роль перегрева, моноксида углерода, и простагландина Е2, в опосредовании апоптоза, и их влияние на стрессорно-адаптационную систему мет-энкефалин-АКТГ при экспериментальном индуцировании программируемой клеточной гибели // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології.- 1998.- Вип.3.- С.260-269

В.Н.Сенчий "Гипертермия как фактор развития программируемой клеточной гибели" Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології, 1998, Вип.2, С.265-273

В.Н.Сенчий И.О.Комаревцева "Состояние гипоталамо-гипофизарной, ренин-ангиотензин-альдостероновой систем и гормонов, регулирующих концентрацию ионов кальция в условиях клеточной гибели" // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології, 1999, Вип.21(1), С.210-219

В. М. Сенчій Особливості ендогенного біосинтезу ейкозаноїдів в тканинах легенів та нирок // Фізіологічний журнал.- 1998.- №3.- Т. 44.- С.12.

V.Senchiy I. Komarevtseva The role of carbon monoxide in the development of program cell death.. // 4^th International Medical Students Congress: Nov. 5-8, 1998, Katowice, Poland.

Размещено на Allbest.ru