Вплив He-Ne лазера на прояв адаптивних кількісних ознак і біоелектричні властивості клітинних ядер у інбредних ліній і гібридів Drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru/

ХАРКІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ім. В. Н. Каразіна

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив He-Ne лазера на прояв адаптивних кількісних ознак і біоелектричні властивості клітинних ядер у інбредних ліній і гібридів Drosophila melanogaster

03.00.15 - генетика

Аленіна Світлана Борисівна

Харків - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано в науково-дослідному інституті біології

Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна

Міністерства освіти і науки України

Науковий керівник -

доктор біологічних наук, професор,

заслужений діяч науки і техніки України

Шахбазов Валерій Гайович,

Харківський національний університет ім. В. Н. Каразіна, завідувач кафедрою генетики та цитології

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, Бондаренко Юрій Васильович,

Інститут птахівництва УААН, головний науковий співробітник відділу генетики та селекції птахів; кандидат біологічних наук Шаламова Оксана Олексіївна, Інститут шовківництва УААН, завідуюча лабораторією селекції шовковичного шовкопряда.

Провідна установа:

Київський національний університет ім. Тараса Шевченка.

Захист відбудеться 25 жовтня 2000 р. о 14 годині на засіданні

спеціалізованої вченої ради К 64.051.18 при Харківському національному університеті ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, м. Свободи 4, ауд. ІІІ-15.

З дисертацією можна ознайомитись у Центральній науковій бібліотеці Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України за адресою: 61077, м. Харків, м. Свободи 4.

Автореферат розісланий 25 вересня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Некрасова А. В.

АНОТАЦІЯ

гетерозис лазерний репродукція

Аленіна С. Б. Вплив He-Ne лазера на прояв адаптивних кількісних ознак і біоелектричні властивості клітинних ядер у інбредних ліній і гібридів Drosophila melanogaster. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.15 - генетика. - Харківський національний університет ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України, Харків, 2000.

Дисертація присвячена проблемам гетерозису і мінливості адаптивних ознак у Drosophila melanogaster в умовах впливу низькоінтенсивного лазерного випромінювання. Ефекти опромінення He-Ne лазером досліджені на організменному і субклітинному рівнях. Вивчено роль генотипічної й експозиційної компонент у детермінації кількісних ознак, пов'язаних із репродукцією та адаптацією. Встановлено, що опромінення на ранніх етапах онтогенезу приводить до змін вищевказаних ознак, а ступінь виразності ефекту гетерозису залежить від режиму впливу. Підтверджено взаємозв'язок між адаптивними ознаками і біоелектричними властивостями клітинних ядер. Основні результати роботи мають теоретичну цінність і повинні враховуватися при дослідженні можливостей використання низькоінтенсивного лазерного випромінювання в селекційній практиці та медицині.

Ключові слова: гетерозис, Drosophila melanogaster, кількісні ознаки, адаптивні ознаки, біоелектричні властивості клітинних ядер, дисперсійний аналіз.

АННОТАЦИЯ

Аленина С. Б. Влияние He-Ne лазера на проявление адаптивных количественных признаков и биоэлектрические свойства клеточных ядер у инбредных линий и гибридов Drosophila melanogaster. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. - Харьковский национальный университет им. В. Н. Каразина Министерства образования и науки Украины, Харьков, 2000.

Диссертация посвящена проблемам гетерозиса и изменчивости адаптивных признаков у Drosophila melanogaster в условиях воздействия низкоинтенсивного лазерного излучения.

Материалом служили инбредные линии дикого типа различного географического происхождения, а также их реципрокные гибриды. Воздействию подвергали синхронизированные кладки яиц. Источником излучения служил He-Ne лазер типа ЛГН-111. Плотность мощности была равна 10 мВт/см2, экспозиции составили 1, 5, 10, 20 и 30 минут.

Проявления эффекта гетерозиса в норме и после воздействия исследовали по изменению таких признаков как репродуктивная способность по числу куколочных пупариумов, выход имаго и длительность развития до стадии куколки и стадии имаго. Для дополнительной характеристики линий была исследована их яйценоскость в первые 8 часов откладки яиц. Возможное влияние лазерного излучения на мутационный процесс оценивали по частоте возникновения в кладках инбредных линий доминантных летальных мутаций. Показателем эффекта воздействия лазера на клеточном уровне служили изменения электрокинетических свойств клеточных ядер в слюнных железах личинок дрозофилы, исследованные методом внутриклеточного микроэлектрофореза.

В отсутствие лазерного облучения исследованные в работе линии были контрастными по ряду признаков. Были также обнаружены различия в степени выраженности исследованных признаков между линиями и их реципрокными гибридами. Гибридные особи развивались быстрее, чем исходные линии. При этом ускоренное развитие сопровождалось повышением репродуктивной способности по числу куколочных пупариумов. Перечисленные различия следует отнести к проявлениям эффекта гетерозиса по адаптивно важным признакам.

Исследование на субклеточном уровне показали, что в норме исследованные гибриды обладают значительно более высоким уровнем биоэлектрической активности клеточных ядер.

Облучение лазером в исследованных в работе режимах не не вызывало повышение частоты поздних доминантных леталей. В то же время, низкоинтенсивное лазерное излучение оказалось способным вызывать эффект последействия, модифицируя адаптивно важные признаки у развившихся из облученных яиц особей.

Облучение лазером изменяло также степень выраженности эффекта гетерозиса. Для большинства признаков превосходство гибридов над линиями было максимальным при экспозициях свыше 10 минут. При этом гетерозис по выходу имаго наблюдался только после воздействия лазером.

Обнаружение после облучения He-Ne лазером пролонгированного эффекта по ряду признаков на протяжении всего онтогенеза позволяет предположить, что в реализации этого эффекта задействован генетический аппарат клеток развивающегося организма.

Уровень показателя ЭОЯ% у был оценен у инбредных и гибридных личинок в начале и в конце третьего личиночного возраста. На ранних этапах онтогенеза биоэлектрическая активность клеточных ядер у гибридных и инбредных личинок была существенно ниже, чем на более поздних. Генетически обусловленные различия по цитобиофизическим характеристикам между особями Drosophila melanogaster не обнаруживались на этапе онтогенеза, характеризующемся более низким уровнем функциональной активности ядер, но были хорошо заметны в относительно позднем возрасте.

В ответ на воздействие лазерного излучения наблюдались изменения уровня электроотрицательности ядер у инбредных и гибридных личинок. Лазерное излучение нарушало естественную динамику изменений биоэлектрических свойств клеточных ядер у личинок. В конце третьего личиночного возраста для особей всех генотипов обнаружена общая реакция на облучение с экспозициями в 1 и 5 минут. С увеличением времени облучения в интервале от 10 до 30 минут изменения значений показателя приобретали различное для линий и гибридов направление.

С помощью дисперсионного анализа была изучена роль генотипической и экспозиционной компонент в детерминации количественных признаков, связанных с репродукцией и адаптацией. Сила влияния внешнего фактора, воздействию которого организм подвергся на ранних стадиях своего развития, уменьшалась по мере протекания онтогенеза. В то же время, варьирование исследованных признаков по фактору «генотип» по мере прохождения стадий онтогенеза значительно не изменялось.

Основные результаты работы имеют теоретическую ценность и должны учитываться при исследовании возможностей применения низкоинтенсивного лазерного излучения в селекционной практике и медицине.

Ключевые слова: гетерозис, Drosophila melanogaster, количественные признаки, адаптивные признаки, биоэлектрические свойства клеточных ядер, дисперсионный анализ.

ANNOTATION

Alenina S. B. Effects of He-Ne laser irradiation on adaptive quantitative features expression and bioelectrical properties of cell nuclei in inbred lines and hybrids of Drosophila melanogaster. - Manuscript.

Thesis for a Candidate's of Biological Sciences degree by speciality 03.00.15 - genetics. -Kharkiv National University named after B. N. Karasin, Ministry of Education and Science of Ukraine, Kharkiv, 2000.

Dissertation is devoted to the problems of heterosis and variability of adaptive traits in Drosophila melanogaster under conditions of low energy laser irradiation influence. Effects of He-Ne laser radiation treatment were investigated on the organism and subcellular levels. Role of genotype and exposition components in determination of quantitative traits connected to adaptation and reproduction was studied. It was found that He-Ne laser radiation treatment on the early stages of ontogenesis results in changes of mentioned traits. Manifestation degree of heterosis effect depended also on treatment procedure. Correlation between adaptive traits and bioelectrical properties of cell nuclei was confirmed. The results of work are of theoretical value and should be taken into consideration for investigations to find out low energy laser irradiationapplications for selection practice and medicine.

Key words: heterosis, Drosophila melanogaster, quantitative traits, adaptive traits, bioelectrical properties of cell, dispersion analysis.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Гетерозис має безсумнівно важливе економічне значення для сільського господарства. Але підвищення ефективності використання цього феномену на практиці неможливе без більш детального розгляду механізмів формування та реалізації гібридної сили в онтогенезі. Адже за думкою провідних вітчизняних та зарубіжних вчених (Шахбазов В. Г., 1974; Бердишев Г. Д., 1984; Конарев В. Г. 1991; Струнников В. А., 1994; Спрэг Дж. Ф., 1987; Джинкс Дж. Л., 1987), загальна теорія, що пояснювала б перевагу гібридних форм над інбредними, усе ще не сформульована.

Дослідження, у яких розглянуто реакцію генетично різних форм на вплив зовнішніх фізичних чинників різної природи (Шахбазов та ін., 1990; Григорьева Н. Н., 1992; Чепель Л. М., 1992; Шкорбатов Ю. Г., 1992) показали доцільність та перспективність даного напрямку у вивченні природи гетерозису. А розвиток останнім часом лазерної техніки, який привів до активного використання оптичних квантових генераторів у сільському господарстві (Бляндур О. В. та ін., 1987; Бурилков В. К., Крочик Г. М., 1989; Лахно В. И. та ін., 1998) та медицині (Гамалея Н. Ф., 1981; Кошелев та ін., 1980; Илларионов В. Е., 1992; Козлов В. И. та ін., 1993), відкриває нові шляхи у пошуку чинників, що можуть сприяти генетично обумовленому підвищенню життєздатності організмів і дає новий матеріал для теоретичного вивчення проблеми гетерозису.

У свою чергу, найбільш раціональне застосування лазерного випромінювання низької інтенсивності для потреб сільського господарства та медицини неможливе без знання основних закономірностей і характеру змін, що виникають у прояві кількісних ознак після дії вказаного чинника. Особливу актуальність дослідженням у даному напрямку надає той факт, що механізми дії лазерного випромінювання до кінця все ще не з'ясовані, хоча існує багато гіпотез з цього питання (Кару Т. Й., 1989; Гамалея та ін., 1988; Зубкова С. М., 1995; Васильев М. В., 1997). До того ж на сьогоднішній день дуже мало досліджені віддалені наслідки впливу лазерного випромінювання на біологічні об'єкти (Самойлов Н. Г., 1998).

Таким чином, на даний момент вивчення на модельних об'єктах ефектів, які реалізуються під час розвитку особин, що підпали під дію лазерного випромінювання на ранніх стадіях онтогенезу є актуальним. Використання класичного генетичного модельного об'єкта - плодової мушки дрозофіли - дозволяє вивчити роль генотипу в реакції на лазерне опромінення та проконтролювати можливу післядію даного впливу.

Найбільш інформативних результатів від вивчення поставлених питань слід чекати при проведенні досліджень не тільки на організменному рівні організації живого, але й на рівні клітин і субклітинних структур, зокрема клітинних ядер, особливе значення надаючи дослідам на живих нативних клітинах.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота була виконана в рамках наукової тематики відділу генетики науково-дослідного інституту біології Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України в межах теми “Вивчити генетичні та епігенетичні основи життєздатності та стійкості організмів, розробити методи визначення та підвищення цих властивостей для медицини і селекції” за № держреєстрації 0198 U 005753.

Мета і задачі дослідження. Поглиблення уявлень про природу гетерозису та вивчення реактивності різних генотипів в умовах дії низькоінтенсивного лазерного випромінювання, а також виявлення можливих віддалених наслідків впливу вказаного зовнішнього фактора. Експериментальна перевірка на модельному об'єкті (Drosophila melanogaster) можливості дією лазерного випромінювання підвищувати рівень адаптивних кількісних ознак та біоелектричних властивостей клітинних ядер, а також змінювати ступень виразності ефекту гетерозису.

Виходячи з загальної мети роботи, були поставлені наступні задачі:

дослідити зміни рівня плодючості і життєздатності ліній і гібридів дрозофіли у зв'язку з ефектом гетерозису і впливом лазерного опромінення;

вивчити особливості розвитку інбредних ліній і гібридів дрозофіли в стандартних умовах і при зовнішньому впливі;

виявити, як довго в онтогенезі може зберігатися ефект від опромінення об'єкта на ранніх стадіях розвитку;

проаналізувати можливість впливу лазерного випромінювання на мутаційний процес;

дослідити фотобіологічну реакцію інбредних і гібридних організмів на субклітинному рівні по зміні електрокінетичних властивостей нативних клітинних ядер.

Наукова новизна отриманих результатів.

У ході дисертаційної роботи на модельному об'єкті (Drosophila melanogaster) вперше показана можливість змінювати важливі кількісні ознаки за допомогою лазерного опромінювання на ранніх стадіях онтогенезу.

Отримані нові наукові дані про різницю в реакції на дію опромінення лазером інбредних ліній і гетерозисних міжлінійних гібридів дрозофіли.

Уперше встановлено вплив лазерного опромінення яєць дрозофіли на біоелектричні властивості клітинних ядер на подальших стадіях розвитку.

Експериментально доведено, що зміни біоелектричних властивостей клітинних ядер внаслідок лазерного опромінення у ліній і гібридів дрозофіли були різними.

На підставі одержаних в роботі нових експериментальних даних виявлено зв'язок змін біоелектричних властивостей клітинних ядер з виявом фенотипових ознак, пов'язаних з репродукцією та адаптацією в умовах дії лазерного випромінювання.

Уперше знайдено стимулюючі та пригнічуючі експозиції впливу He-Ne лазера на розвиток дрозофіли.

Уперше проведено статистично обгрунтоване співставлення впливу генетичних факторів і лазерного опромінення на детермінацію різних фенотипових ознак дрозофіли.

Практичне значення отриманих результатів. Отримані результати мають теоретичну цінність для розуміння природи гетерозису і механізмів взаємодії лазерного випромінювання з живими об'єктами. Розроблений підхід може знайти застосування при теоретичному та експериментальному дослідженні можливостей практичного використання низькоінтенсивного лазерного випромінювання в селекційній практиці і медицині.

Результати проведених досліджень використовуються у подальшій науковій роботі відділу генетики НДІ біології та кафедри генетики та цитології Харківського національного університету ім. В. Н. Каразіна.

Особистий внесок здобувача. Дисертаційна робота виконана здобувачем повністю самостійно. Аналіз отриманих даних проводився разом із керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень, включені в дисертацію, були повідомлені на VI і VII Республіканських науково-практичних конференціях “Застосування лазерів у медицині і біології” (Харків, 1996, 1997) , на першому міжнародному конгресі “Лазер і здоров'я” (Кіпр, 1997) , на конференції молодих учених Харківського державного університету (Харків, 1995), на V з'їзді українського ентомологічного товариства (Харків, 1998) і на міжнародній конференції “Лазер і здоров'я“ (Харків, 1999).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 10 друкарських робіт: із них - 4 статті в наукових журналах і 6 тез.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з вступу і розділів: огляд літератури, об'єкти і методи досліджень, результати власних досліджень і їх обговорення, заключення і висновки та перелік цитованої літератури із 260 джерел. Обсяг дисертації 124 сторінки. Дисертація містить у собі 18 рисунків і один додаток із 23 таблиць.

МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

Матеріалом служили інбредні лінії Drosophila melanogaster дикого типу Домодєдовська - 32 (Д-32) і Swedish (Sw), що розрізнялися за показниками життєздатності і, а також реципрокні гібриди, отримані від схрещування цих ліній (тривалість інбридингу у вихідних форм становила 45 - 76 поколінь (перший етап досліджень) і 105 - 115 поколінь (другий етап)).

Впливу лазерного випромінювання піддавали синхронізовані кладки інбредних і гібридних яєць. Джерелом випромінювання служив He-Ne лазер типу ЛГН-111 (л=0,633 мкм, щільність потужності в зоні опромінення - 10 мВт/см2).

Показниками ефекту гетерозису (в нормальних умовах і після впливу лазера) були швидкість розвитку до стадії імаго (ШР), репродуктивна здатність по числу лялечних пупаріумів (РЗ) і вихід імаго (ВІ).

Плодючість і життєздатність визначали, підраховуючи число потомків однієї пари особин на стадії лялечки (РЗ), і імаго (ВІ)., порівнюючи у першому варіанті плодючість гібридів і вихідних ліній і життєздатність зазначених форм на передімагінальних стадіях розвитку - у другому. У лінійних самиць додатково оцінювали яйценоскість по числу відкладених протягом 8 годин яєць у тесті на домінантну летальність.

Швидкість розвитку до стадії імаго визначали, виміряючи інтервал у годинах між початком відкладки яєць і виходом імаго у поколінні потомків.

Фертильність ліній визначали по частоті незапліднених яєць у кладках. Частоту домінантних летальних мутацій оцінювали, шляхом вирахування відсотка яєць, що не розвинулися через вісім годин від початку кладки, від загального числа запліднених яєць, при цьому світлі матові яйця класифікували як ранні леталі, темні - як пізні леталі.

Електрокінетичні властивості клітинних ядер визначали методом внутрішньоклітинного мікроелектрофорезу, розробленим на кафедрі генетики і цитології Харківського національного університету (Шахбазов та ін., 1990; Страшнюк В. Ю, 1992). У відпрепарованих слинних залозах личинок дрозофіли різного віку підраховували відсоток електронегативних ядер, що зміщувалися в електричному полі. Сила струму в камері для мікроелектрофорезу складала 0,7 мА, напруга - 7 В/см2.

ОСНОВНІ РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Генетично обумовлені розходження у ступеню виразності адаптивних ознак у дрозофіли, що виявляються в умовах дії лазерного випромінювання.

Лінії, використані в роботі як вихідний матеріал, були контрастними по ряду ознак. Лінію Sw можна вважати більш сильною порівняно з лінією Д 32 за показниками, пов'язаними з репродукцією і життєздатністю на різних етапах онтогенезу, тому що в контрольних умовах особини даного генотипу характеризувалися більшою репродуктивною здатністю (РЗ) і виходом імаго (ВІ), (розходження статистично достовірні, p < 0,01).

Гібриди в контрольному варіанті переважали вихідні лінії за величиною РЗ, але не відрізнялися від вихідних ліній за життєздатністю, оскільки ВІ кожного гібрида достовірно не відрізнявся від рівня ВІ відповідної материнської форми. Вплив лазерного випромінювання на стадії яйця змінював ступінь виразності досліджуваних ознак.

Як видно з рис.1 і 2, більш слабку лінію лазерне випромінювання стимулює, збільшуючи РЗ (відмінності від контролю достовірні при експозиціях у 1, 10 і 20 хвилин) і ВІ (статистично достовірно при 1, 5 і 20 хвилинах опромінення).

Сильна лінія, навпаки, зазнає на собі гнітючої дії лазерних променів. При всіх досліджуваних режимах впливу достовірно зменшується вихід імаго (p<0,05), а при всіх експозиціях, крім 10-хвилинної, спостерігається пригнічення репродуктивної здатності.

Встановлено, що ні в контролі, ні в умовах опромінення не порушується співвідношення кількості самиць і самців, як у ліній, так і у гібридів, що говорить про відсутність розходжень по життєздатності інбредних і гібридних самиць і самців за вказаних умов.

Стимуляція плодючості і життєздатності дією лазера, виявлена також і у гібрида F1(Д-32xSw). Показники РЗ і ВІ поліпшуються при експозиціях 10 і 30 хвилин (відмінності від контролю достовірні, p<0,05).

Дія лазерного випромінювання змінювала також ступінь прояву гетерозисного ефекту. Максимальний гетерозис спостерігався після 10 - 30 хвилинного впливу. При зазначених експозиціях гібрид F1(Д- 32xSw) перевершував кращу лінію на 22,4 - 53,0% (p < 0,05) (у контролі перевага становила 13,3%) . Гібрид F1(SwxД-32) після опромінення з експозиціями 20 і 30 хвилин демонстрував перевагу над лініями у 46,4% і 52,9% (у контролі 32,5%).

По виходу імаго перевага гібридів над відповідними їм материнськими інбредними лініями спостерігається тільки після дії лазерного випромінювання (рис. 2). При опроміненні з експозицією у 30 хвилин обидва гібриди перевершують материнські форми за життєздатністю (F1(Д-32xSw) - на 49,9%, а F1(SwxД-32) - на 33,9% при p<0,01 ), у той час як у контролі така перевага відсутня.

Таким чином, отримані дані дозволяють припустити, що за допомогою лазера можлива компенсація несприятливих особливостей організму, викликаних інбредною депресією, і посилення процесів, що приводять до прояву гетерозису.

Вивчення фертильності інбредних особин і частоти появи домінантних леталей у кладках ліній показало, що в контрольних умовах лінії достовірно не розрізняються за кількістю відкладених яєць і ембріональною життєздатністю, однак за частотою появи незапліднених яєць у кладках лінія Sw значно перевершує лінію Д 32, що свідчить про більш низку фертильності першої, можливо, обумовлену фізіологічними особливостями самиць даної лінії. Зіставляючи ці дані з рівнем виходу імаго і репродуктивної здатності по числу лялечкових пупаріумів, різницю між лініями по РЗ і ВІ можна пояснити різницею у життєздатності особин Sw і Д 32, що виявляється на більш пізніх етапах розвитку.

Лазерне випромінювання істотно не впливало на яйценосність самок і частоту домінантних леталей і незапліднених яєць у кладках досліджуваних ліній. Таким чином, мутагенний ефект від впливу низькоінтенсивного лазерного випромінювання виявлений не був.

Використані лінії були контрастними і по тривалості передімагінальних стадій онтогенезу. Дані про швидкість розвитку ліній і гібридів представлені на рисунку 3. У першій серії експерименту особини лінії Д-32 обох статей розвивалися у середньому на 6,9% швидше (p < 0,01), ніж особини лінії Sw.

Більш швидкий розвиток самиць порівняно із самцями спостерігався у лінії, що розвивалася швидше, і в обох гібридів. Статистично достовірні розходження швидкості розвитку між самицями і самцями лінії Sw були відсутні.

В другій серії експерименту тенденція ліній до прояву контрастності знижувалася. По швидкості розвитку до стадії імаго самиці і самці Д-32 перевершували F1(SwxД-32) особин Sw у середньому на 1,8% (p<0,01).

При відсутності зовнішнього впливу в обох експериментальних серіях у гібридів спостерігався ефект гетерозису. Особини обох статей гібрида F1(SwxД-32) і самиці гібрида F1 (Д-32xSw) (ступінь інбридингу вихідних форм - 55-60 поколінь) розвивалися до стадії імаго на 2,9 - 7,9% швидше, ніж краща з інбредних ліній.

Опромінення лазером запліднених яєць змінював швидкість розвитку порівняно з контролем. Характер змін залежав від режиму опромінення, генотипу і статі особини, що розвивається.

Так, в експериментах першої серії розвиток самиць і самців Д-32 і F1(Д-32xSw) уповільнювався при експозиціях у 1, 5, 20 і 30 хвилин для інбредної лінії й у 1, 5 і 20 хвилин для гібрида. При десятихвилинному опроміненні достовірно повільніше розвивалися тільки самиці вищезгаданого гібрида. Опромінення протягом 10 і 30 хвилин приводило до більш швидкого розвитку самиць і самців, а протягом 20 хвилин - до прискореного розвитку самиць Sw. Реакція гібрида F1(SwxД-32) на дію лазера мала різноспрямований характер: експозиція в 1 хвилину уповільнювала розвиток особин даного генотипу, 5 і 10 - прискорювали його як у самиць так і у самців, а 30 хвилин опромінення прискорювали розвиток тільки самиць.

Експерименти другої серії підтверджують ефекти, описані вище. Незважаючи на більш швидкий розвиток особин, вихідні форми яких пройшли 105 - 110 поколінь інбридингу, напрямок реакції ліній і гібридів на лазерне випромінювання зберігався, в основному, незмінним. Однохвилинне опромінення достовірно уповільнювало в порівнянні з контролем розвиток самиць і самців Д-32 і F1(Д- 32xSw), а також самиць F1(SwxД-32) і не впливало на дану ознаку у особин лінії Sw. Для самців гібрида F1(SwxД-32), що розвинулися з оброблених протягом однієї хвилини яєць, відмінності від контролю не були достовірні, але, як і в експериментах першої серії, простежувалася стійка тенденція до збільшення тривалості передімагінальних стадій онтогенезу.

Тридцятихвилинна експозиція прискорювала розвиток особин Sw, уповільнювала розвиток самиць F1(SwxД-32) і достовірно не змінювала розвиток особин обох статей F1(Д-32xSw), самців F1(Sw x Д- 32) і самиць Д-32.

При зазначеній експозиції була достовірною перевага по швидкості розвитку у слабогетерозисних самців даного гібрида над кращою з батьківських ліній.

Зміни біоелектричних властивостей клітинних ядер гібридних і інбредних особин Drosophila melanogaster у зв'язку з ефектом гетерозису, онтогенезом і дією лазерного випромінювання.

Експеримент проводили у дві серії. Лінії, що були матеріалом, піддавалися тісному інбридингу протягом 45-50 поколінь у першій серії і протягом 110-115 поколінь - у другій. В першому випадку рівень біоелектричної активності клітинних ядер визначали у личинок кінця третього віку (за 2 години до формування пупаріуму). В другій серії експериментів досліджували показник ЕНЯ% інбредних та гібридних личинок дрозофіли не тільки наприкінці (за 2 години до формування пупаріуму), але й на початку (за 15 годин до формування пупаріуму) третього личинкового віку.

Порівняльний аналіз отриманих даних показав, що лінії Sw і Д-32, контрастні по ряду адаптивно важливих ознак, розрізнялися і за цитобіофізичними властивостями. Рівень показника електронегативності ядер (ЕНЯ%) лінії Sw був значно нижчим порівняно з лінією Д-32.

У експерименті, в ході якого схрещували особин, що пройшли 45-50 поколінь інбридингу, відмінності гібрида F1(Д-32xSw) від кращої по даній ознаці

лінії (Д-32) у середньому склали 38,8%, а той же гібрид, але отриманий від схрещування ліній після 110-115 поколінь інбридингу, відрізнявся від лінії Д-32 на 37,8%. Рівень гетерозисності другого гібрида дещо знизився. Особини F1(SwxД-32) відрізнялися від особин Д-32 на 44,2% у першому експерименті і на 25,8% у другому.

Отримані результати можуть свідчити про підвищену функціональну активність ядер гібридів, і добре узгоджуються з даними про зв'язок біоелектричних властивостей ядер з ефектом гетерозису.

Аналіз даних, отриманих в експериментах з лініями, що пройшли 110-115 поколінь інбридинга та їх реципрокними гібридами, підтвердив уявлення про те, що на ранніх етапах онтогенезу біоелектрична активність клітинних ядер личинок істотно нижча, ніж на більш пізніх. Ця закономірність властива не тільки лініям, але й гібридам, тому що на початку третього віку не виявлено достовірних розходжень за рівнем ЕНЯ% між гібридними й інбредними особинами.

На більш пізніх етапах онтогенезу біоелектрична активність ядер клітин значно зростає. При цьому спостерігається перевага гібридів над лініями, а також розходження між лініями, неоднаковими по адаптивних ознаках.

У даній роботі були досліджені біоелектричні властивості клітинних ядер інбредних і гібридних личинок дрозофіли, що розвинулися з опромінених He-Ne лазером яєць, на початку і наприкінці третього личинкового віку.

Діаграма залежності показника ЕНЯ% у личинок кінця третього віку від експозиції впливу лазерного випромінювання на інбредні і гібридні кладки яєць (вихідні лінії пройшли 45 - 50 поколінь інбридингу) розпадається на дві якісно різні ділянки - до 10 і після 10 хвилин впливу.

Для експозицій першої ділянки кривої виявлена загальна закономірність у реакції особин усіх генотипів, а саме: різке зниження рівня показника ЕНЯ% при однохвилинному опроміненні з наступним його зростанням при збільшенні експозиції до п'яти хвилин . Зі збільшенням часу опромінення в інтервалі від 10 до 30 хвилин зміни значень показника набували різного для ліній і гібридів напрямку.

На початку третього личинкового віку, що характеризується початково низьким рівнем біоелектричної активності клітинних ядер, картина змін ЕНЯ% дещо інша. Як і на більш пізньому етапі онтогенезу, при експозиції в одну хвилину спостерігалась подібність у реакції ліній і гібридів, однак у даному варіанті рівень ЕНЯ% не знижувався, а підвищувався, що може свідчити про здатність лазерного випромінювання порушувати природну онтогенетичну динаміку зміни цитобіофізичних характеристик.

Тридцятихвилинна експозиція викликає реакцію лише на більш пізніх етапах розвитку, оскільки на початку третього віку рівень ЕНЯ% у личинок, що розвинулися з опромінених яєць, достовірно не змінюється.

Порівнюючи біоелектричні властивості клітинних ядер гібридних і інбредних личинок кінця третього віку, можна судити про силу гетерозисного ефекту по даній ознаці в нормі і при впливі зовнішнього фізичного чинника.

Максимальна по величині перевага гібридів над кращою з батьківських ліній, що спостерігається в контролі, і свідчить про наявність у цих гібридів ефекту гетерозису. Після впливу відносно невеликих експозицій лазерного випромінювання (1 і 5 хвилин) ця різниця зникає. У той же час, при більш тривалому опроміненні (понад 10 хвилини) у гібридів виникає стійка тенденція до відновлення рівня ЕНЯ%, на що вказує наявність достовірної переваги по даній ознаці (р<0,05) над кращою з батьківських ліній у гібрида F1(Д-32xSw) після 10- і 30-хвилинного впливу, а у гібрида F1(SwxД-32) - після 20 хвилин опромінення.

Сила впливу експозиції лазерного випромінювання і генотипа на кількісні ознаки на різних стадіях онтогенезу дрозофіли.

Оцінка внеску генотипу й експозиції лазерного випромінювання у різноманітність кількісних ознак, пов'язаних з адаптацією була проведена за допомогою дисперсійного аналізу.

Кількісне зіставлення реактивності ліній і гібридів стало можливим після обчислення показника сили впливу (hE2) для чинника E (експозиції лазерного випромінювання) у кожному з генетичних варіантів у двох серіях експерименту. У перший ступінь інбридингу вихідних ліній склала 50 - 65 поколінь, у другий - 105 - 115 поколінь.

Результати обчислень доводять, що вплив експозиції опромінення на репродуктивну здатність, вихід імаго, тривалість передімагінальних стадій онтогенезу і біоелектричні властивості клітинних ядер високодостовірний.

Серед інбредних ліній найбільш реактивною по ознаках, пов'язаних із репродукцією і життєздатністю нащадків, а також по біоелектричних властивостях клітинних ядер, виявилася лінія Swedish. А серед гібридів більш високою чутливістю до зовнішнього впливу відрізнявся менш гетерозисний із них -- F1(Д-32xSw). При цьому варіювання рівня ЕНЯ%, репродуктивної здатності і виходу імаго по чиннику E серед особин F1(Д-32xSw) було значно вищим, ніж серед особин інших, використаних у роботі генотипів.

Показники hE2, обчислені для цього гібрида склали 59,8 ± 1,8% (ЕНЯ%), 41,4 ± 3,5% (ВІ) і 38,4 ± 3,7% (РЗ), що в 2 - 4 рази вище відповідних значень hE2 для найбільш стабільної лінії (Д-32).

В другій серії експерименту досліджували ЕНЯ% у личинок різного віку, а також швидкість розвитку до стадії лялечки і стадії імаго.

Достовірний вплив чинника E на рівень ЕНЯ% гібридних личинок спостерігається тільки наприкінці третього віку (2 години до формування пупаріуму).

Варіювання тривалості передімагінальних стадій онтогенезу (швидкості розвитку) має інший характер, ніж варіювання зазначених раніше ознак. Найбільшою мінливістю швидкості розвитку в результаті дії лазерного випромінювання відрізнялася лінія Д-32 і гібрид F1(SwxД-32). Показник сили статистичного впливу чинника E для даного гібрида склав 16,3±0,2%, перевищуючи значення hE2 для лінії Sw у 4 рази.

В другій серії експерименту більш мінливою по тривалості розвитку до стадії лялечки і стадії імаго виявилася лінія Sw.

Викладене вище доводить, що ефекти від опромінення на ранніх стадіях онтогенезу зберігаються при подальшому розвитку. А різниця у чутливості різних генотипових форм вказує на значну роль в реакції на дію даного чинника початкового стану об'єкта, обумовленого генотипом.

Було вивчене варіювання ознак по чиннику G (генотип) і оцінений показник hG2 у нормі і при кожному з режимів впливу. У контролі генотипова компонента у визначенні досліджуваних у даній роботі ознак, складає 23,2 - 58,5% у першій серії експерименту і 21,23 - 59,06% - у другий.

Опромінення лазером змінює природні розходження між генетично різними особинами. У першій серії експериментів експозиції від 1 до 10 хвилин зменшують генетично обумовлену різноманітність ознак, пов'язаних із репродукцією і життєздатністю, зводячи його до мінімуму при 5 і 10 хвилинному опроміненні. У той же час, при 20 і 30 хвилинному впливі роль генотипу у формуванні репродуктивної здатності та виходу імаго зростає в порівнянні з контролем.

Швидкість розвитку при експозиціях у 1 - 20 хвилин залежить від генотипу в меншій мірі, ніж за нормальних умов, а при 30-хвилинному впливі роль генотипу в його варіюванні зростає.

Такі ж зміни у варіюванні швидкості розвитку по чиннику G виявлені для однохвилинної експозиції і в другій серії експерименту. У варіанті з 30-хвилинною експозицією показник hG2 залишається зниженим у порівнянні з контролем.

У експериментах, проведених у даній роботі, вплив мав місце на ранніх стадіях онтогенезу (вік яєць, що опромінювалися, - 1-1,5 години), а оцінку зазначених раніше ознак проводили пізніше. Біоелектричні властивості клітинних ядер у слинних залозах досліджували на 5 - 4 добу від початку розвитку, тривалість передімагінальних стадій онтогенезу, вихід імаго і репродуктивну здатність по числу лялечних пупаріумів - на 9 - 14 добу. У зв'язку з цим виникає питання, чи змінюється сила впливу лазерного випромінювання на результативну ознаку в міру віддалення від моменту впливу

Первинні дані, отримані для різних генотипів, були зведені у загальні дисперсійні комплекси, виходячи з яких обчислювали показники сили статистичного впливу (hE2) чинника E (експозиції лазерного випромінювання), що характеризують мінливість ознаки в цілому. Одночасно з цим була проведена оцінка генотипової компоненти у варіюванні перерахованих вище ознак (hG2). Результати представлені на рисунку 6.

З отриманих даних випливає, що сила впливу зовнішнього чинника, дії якого організм піддався на ранніх стадіях свого розвитку, зменшується в міру протікання онтогенезу. Значення hE2 було максимальним для біоелектричних властивостей клітинних ядер (показник виміряється на найбільш ранній після опромінення лазером стадії розвитку) і мінімальним для виходу імаго (визначається на стадії, найбільш віддаленій від моменту дії вказаного чинника).

У той же час, варіювання досліджуваних ознак по чиннику G (генотип) у міру проходження стадій онтогенезу значно не змінювалося. Таким чином, як випливає з отриманих даних, сила впливу зовнішнього чинника (на відміну від сили впливу генотипу) знижується при переході до чергової стадії розвитку, але в рамках першого етапу онтогенезу, найменш віддаленого від моменту впливу, може підвищуватися, що, можливо, пов'язано зі змінами генної активності, обумовленими реалізацією генетичної програми розвитку.

ОБГОВОРЕННЯ.

Отримані у роботі дані про зміни адаптивно важливих ознак у ліній і гібридів Drosophila melanogaster в наслідок дії випромінювання He-Ne лазера на ранніх етапах онтогенезу дають можливість, по-перше, проаналізувати ще не вивчені аспекти прояву ефекту гетерозису, і, по-друге, по-новому оцінити проблему взаємодії низькоінтенсивного лазерного випромінювання з біологічними об'єктами. Виявлена за нормальних умов перевага гібридів над лініями за репродуктивною здатністю, що супроводжується прискоренням розвитку і підвищенням рівня електронегативності клітинних ядер, добре узгоджується з даними про складний вплив ефекту гетерозису на адаптивні ознаки і онтогенез дрозофіли (Некрасова А. В., Шахбазов В. Г., 1981), а також ще раз підтверджує наявність взаємозв'язку між біоелектричними властивостями клітинних ядер і проявами ефекту гетерозису (Страшнюк В. Ю., Шахбазов В. Г., 1988).

Важливим результатом даної роботи є виявлення ефекту післядії внаслідок опромінення лазером яєць дрозофіли, оскільки активізація структурних генів є обов'язковою умовою для виникнення пролонгованого ефекту фотостимуляції (Самойлов Н. Г., 2000).

Отримані в представленій дисертаційній роботі дані про зміни біоелектричних властивостей клітинних ядер у личинок різного віку, що розвилися з опромінених He-Ne лазером яєць, також дозволяють припустити наявність змін в активності генетичного апарата клітин у зв'язку з дією лазера. При цьому слід враховувати, що існує декілька рівней регуляції генної активності.

Згідно Nagl W. (1985), конформація хроматину є результатом організації геному плюс електростатичне оточення. Локальні зміни конформації хроматину під час розвитку проходять згідно термодинамічним, електродинамічним і квантово-механічним законам, і залежать від положення клітини всередені різних фізичних і хімічних градієнтів. Зміни структури хроматину дозволяють пізніше включити в дію тонкі механізми регуляції генної активності, що реалізуються ферментами і регуляторними білками. Крім того, очевидно, існує системний рівень регуляції генетичних функцій клітинного ядра, обумовлений його інтегральними властивостями. На системному рівні біоелектричні властивості клітинних ядер можуть відігравати важливу роль у неспецифічній регуляції функціональної активності ядерного геному (Шахбазов В. Г., Шкорбатов Ю. Г., 1986).

За даними різних авторів, лазерне випромінювання здатне викликати зміни у функціональному стані клітин. Показана здатність цього чинника підвищувати рівень біосинтетичних процесів (Кару Т. Й., 1989), викликати дисоціацію хроматину на білки і ДНК (Крепак О. М. та ін., 1984) та ініціювати структурні перебудови клітинних мембран (Зубкова С. М., 1995). Достатньо імовірно, що такі зміни на рівні макромолекул і клітинних структур можуть викликати ввімкнення вказаних вище рівней регуляції генної активності у відповідь на опромінення лазером. Надалі, неспецифічна реакція клітин на лазерний вплив, що виявляється по змінам інтегральних властивостей клітинних ядер, може приводити до змін генної активності і, як наслідок, до різниці в проявах фенотипових ознак. Оскільки розглянутий нами різновид впливу викликає зміни не тільки на рівні інтегральних ядерних властивостей, але й на організменному рівні, отримані дані дозволяють по-новому поглянути на можливі механізми взаємодії лазерного випромінювання з живими об'єктами, а також можуть служити ще одним підтвердженням установленого раніше (Шахбазов В. Г. та ін., 1986) взаємозв'язку адаптивних ознак з біоелектричними властивостями клітинних ядер.

ВИСНОВКИ

1. Внаслідок проведених досліджень на модельному об'єкті Drosophila melanogaster уперше виявлені віддалені наслідки від опромінення He-Ne лазером, які позначаються на прояві адаптивно важливих кількісних ознак у імаго та біоелектричних властивостях клітинних ядер у личинок.

2. Експериментально показано, що у контрольних умовах досліджені в роботі гібриди дрозофіли переважали вихідні лінії за репродуктивною здатністю, швидкістю розвитку до стадії імаго та рівнем електронегативності клітинних ядер, що слід віднести за рахунок ефекту гетерозису.

3. Уперше експериментально доведено, що опромінення яєць дрозофіли He-Ne лазером з експозициями від 1 до 30 хвилин при щільності потужності в зоні опромінення 10 мВт/см2 приводить до змін ряда кількісних адаптивно важливих ознак протягом всього онтогенезу особин, що розвинулися з опромінених яєць.

4. Отримані нові наукові дані про різницю в реакції на дію He-Ne лазера між інбредними лініями та гетерозисними міжлінійними гібридами дрозофіли, яка зберігається протягом різних стадій онтогенезу.

5. Встановлено, що в залежності від вихідного рівня даної ознаки, напрямок і ступінь її змін під впливом опромінення низькоінтенсивним лазером у ліній і гібридів були різними.

6. Показано, що найбільш значна різниця у реактивності особин різних генотипів спостерігалась при експозиціях вищих за 10 хвилин.

7. На підставі нових експериментальних даних доведена можливість змінювати ступінь виразності гетерозисного ефекту дією He-Ne лазера та виявлені режими дії, що сприяють прояву гетерозису у дрозофіли. При опроміненні яєць дрозофіли He-Ne лазером з експозиціями вищими за 10 хвилин перевага гібридів над інбредними лініями була максимальною.

8. Показано, що опромінення He-Ne лазером у досліджених в роботі режимах не приводить до підвищення частоти домінантних летальних мутацій у вихідних інбредних ліній.

9. Поряд зі змінами внаслідок опромінення лазером ознак, пов'язаних з репродукцією і адаптацією, у імаго виявлені зміни біоелектричних властивостей клітинних ядер у личинок. Це дає підстави вважати, що саме енергетичний стан ядерного геному і є причиною змін виразності інших фенотипових ознак після опромінення.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Аленина С. Б., Шахбазов В. Г. Различия в биоэлектрических свойствах клеточных ядер инбредных линий и гетерозисных гибридов Drosophila melanogaster в норме и при облучении гелий-неоновым лазером // Известия харьковского энтомологического общества. - 1997. - Т. 5, вып. 1. - С. 115 - 118.

2. Аленина С. Б., Шахбазов В. Г. Влияние лазерного излучения на репродуктивные свойства и жизнеспособность линий и гибридов Drosophila melanogaster. // Фотобиология и фотомедицина. - 1998. - № 1. - С.81-85.

3. Аленина С. Б. Реакция на облучение He-Ne лазером генетически различных инбредных линий Drosophila melanogaster // Известия харьковского энтомологического общества. - 1998. - Т. 6, вып. 1. - С. 149 - 154.

4. Шахбазов В. Г., Аленіна С. Б., Горенська О. В., Саміло С. М., Страшнюк В. Ю. Прояви ефекта гетерозиса у Drosophila melanogaster по біоелектричним властивостям клітинних ядер // Известия харьковского энтомологического общества. - 1999. - Т. 7, вып. 1. - С. 149 - 154.

5. Аленина С. Б., Шахбазов В. Г. Влияние лазерного излучения на развитие личинок и онтогенетические изменения биоэлектрических свойств клеточных ядер дрозофилы.// Матер. XII междунар. науч.-практ. конф. “Применение лазеров в медицине и биологии” (20 - 23 апр. 1999 г, Харьков) - 1999 - С. 14.

6. Шахбазов В. Г., Аленіна С. Б., Горенська О. В., Саміло С. М., Страшнюк В. Ю. Прояви ефекта гетерозиса у Drosophila melanogaster по біоелектричним властивостям клітинних ядер // V з'їзд Українського ентомологічного товариства (7 - 11 вересня 1998 р., м. Харків). Тези доповідей. - 1998, Ніжин. - С. 183.

7. Аленина С. Б., Коробов А. М., Шахбазов В. Г. Влияние He-Ne лазера на развитие модельного объекта - Drosophila melanogaster.// The 1st Intern. Congr. “Laser and Health” 97 (11 - 16 ноября 1997, Limassol, Cyprus) - 1997. - C. 6.

8. Аленина С. Б., Шахбазов В. Г. Влияние излучения гелий-неонового лазера на развитие дрозофилы.// Матер. VIII междунар. науч.-практ. конф. “Применение лазеров в медицине и биологии” (1 - 5 апр. 1997 г, Харьков) - 1997 - С. 119.

9. Аленина С. Б., Шахбазов В. Г. Влияние гелий-неонового лазера на мутагенную активность и электрокинетические свойства клеточных ядер дрозофилы.// Материалы VI республиканской науч.-практ. конф. “Применение лазеров в медицине и биологии” (8 - 13 апреля 1996 г, Харьков) - 1996 - С. 6.

10. Аленина С.Б. Роль интегральных свойств ядерного геному и активации стрессовых генов в неспецифической устойчивости организмов.// Матер. науч. конф. молодых ученых биологического факультета и научно-исследова-тельского института биологии. - Харьков, 1996. - С. 3 - 4.

Размещено на Allbest.ru

...