Вплив зміненої сили тяжіння на цитоскелет рослинних клітин з верхівковим ростом

26

Размещено на http://www.allbest.ru/

26

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут клітинної біології та генетичної інженерії

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив зміненої сили тяжіння на цитоскелет рослинних клітин з верхівковим ростом

03.00.22 - Клітинна біологія

Шевченко Галина Валеріївна

УДК: 531.5:576.311.348

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті ботаніки ім. М. Г. Холодного НАН України. Частину експериментів було проведено в Інституті ботаніки при університеті Франца Вільгельма м. Бонн, Німеччина.

Науковий керівник доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України

Кордюм Єлизавета Львівна Інститут ботаніки НАН України, заступник директора

Офіційні опоненти - доктор біологічних наук, професор Демків Орест Теодорович Інститут екології Карпат НАН України, завідуючий відділу екоморфогенезу рослин

кандидат біологічних наук Сорочинський Борис Володимирович Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, завідуючий лабораторії клітинної радіобіології

Провідна установа - Інститут молекулярної біології та генетики НАН України

Захист відбудеться 21 вересня 2000 року о 14:00 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.202.01 при Інституті клітинної біології та генетичної інженерії НАН України за адресою: 03143, Київ, вул. Академіка Заболотного, 148,

тел/факс: /380 44/ 266 71 04

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, вул. Академіка Заболотного, 148

Автореферат розісланий 21 серпня 2000 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Л.В. Тарасенко

Анотація

іон кальцій цитоскелет рослинний клітина

Шевченко Г.В. Вплив зміненої сили тяжіння на цитоскелет рослинних клітин з верхівковим ростом. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - клітинна біологія. - Інститут клітинної біології та генетичної інженерії НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено дослідженню впливу зміненої сили тяжіння на стан цитоскелету і внутрішньоклітинний розподіл іонів кальцію у кореневих волосках B.vulgaris. На основі закономірностей розташування елементів цитоскелету на послідовних стадіях формування кореневих волосків, встановлено, що на всіх етапах їх розвитку актинові філаменти забезпечують транспорт везикул Гольджі в точку росту. Злиття везикул з плазматичною мембраною регулюється актиновим цитоскелетом, причому його активність модулюється іонами кальцію. Спрямованість росту кореневих волосків визначає орієнтація потоку іонів кальцію через апікальну мембрану. Кореневі волоски мають стійкі внутрішні механізми підтримання напрямку росту, які забезпечуються узгодженою взаємодією цитоскелету та іонів кальцію. Запропоновано схему росту волосків в умовах кліностатування, в основу якої покладено механізм зміщення точки росту. Результати дослідження є внеском у розуміння сигнальних шляхів гравісприйняття у рослин.

Ключові слова: цитоскелет, актин, тубулін, мікрофіламенти, мікротрубочки, іони кальцію, гравічутливість, змінена сила тяжіння, кореневі волоски.

Шевченко Г.В. Влияние измененной силы тяжести на цитоскелет растительных клеток с верхушечным ростом. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - клеточная биология. - Институт клеточной биологии и генетической инженерии НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена вопросам влияния клиностатирования на состояние структур цитоскелета и распределение ионов кальция в корневых волосках B. vulgaris. Выявление топографии микротрубочек и микрофиламентов на последовательных этапах развития корневых волосков показало, что на всех стадиях, начиная с клеток протодермы, актиновые филаменты опосредуют транспорт везикул Гольджи к плазматической мембране в точку роста. Слияние везикул с плазматической мембраной регулируется микрофиламентами совместно с ассоциированными белками (миозины, аннексины, спектрин-подобный белок), активность которых модулируется ионами кальция. Предполагается, что на стадии трихобласта микрофиламенты способствуют попаданию на апикальную мембрану везикул, содержимое которых включает ферменты, способные частично нарушать соединения между полисахаридными фибриллами клеточной стенки и таким образом придавать ей пластичность, которая необходима для растяжения при инициации. На стадии волоскового выступа микрофиламенты способствуют активным процессам рециклизации мембраны, во время которых на апикальную мембрану доставляются белки каналов ионов кальция, которые являются интегральными белками плазматической мембраны. Встраивание белков и активация каналов приводит к повышению уровня кальция в верхушечной части волоска, что способствует образованию апикально-базального градиента данных ионов. Градиент кальция локализует процесы екзоцитоза в определенном месте апикальной мембраны, чем и способствует наростанию ее поверхности, и тем самым обеспечивает удлинение волоска в определенном направлении. Предполагается, что ориентация полярного потока ионов кальция через апикальную мембрану определяет направленность роста корневых волосков. Поскольку на стадии инициации градиент кальция отсутствует, это означает, что рост корневых волосков еще не определился. Поэтому данная стадия является чувствительной к воздействию внешних факторов, в частности, к дезориентации относительно направления вектора тяжести, что приводит к изменению угла наклона волоскового выступа до 40-60⁰. На последующих ростовых стадиях волосков в условиях клиностатирования происходит восстановление ориентации их верхушечной части снова до 85-95⁰. Мы предполагаем, что возобновление угла роста волосков связано с увеличением концентрации кальция в апексе, которая при клиностатировании происходит за счет активации механочувствительных каналов. Повышение [Са²⁺] ведет к запуску сигнальных реакций в результате чего активируются факторы, способные вызвать перестройки актинового цитоскелета или образование сети филаментов de novo. Одним из таких факторов может быть экспрессия генов профилина, белка, регулирующего полимеризацию актина. Результатом перестроек актинового цитоскелета является формирование транспортной сети микрофиламентов в новой точке апикальной мембраны, что в свою очередь, обеспечивает экзоцитоз в новом месте и приводит к образованию новой точки роста. Постепенное смещение точки роста на последовательных ростовых стадиях волосков ведет к восстановлению роста, на который корневые волоски детерминированы при нормальных условиях. Корневые волоски имеют внутренние сложные механизмы поддержания направления роста, в которых задействованы цитоскелет и ионы кальция. Предложена схема роста корневых волосков в условиях измененной силы тяжести.

Ключевые слова: цитоскелет, актин, тубулин, микрофиламенты, микротрубочки, ионы кальция, гравичувствительность, измененная сила тяжести, корневые волоски.

Shevchenko G.V. Influence of altered gravity on the cytoskeleton of tip-growing plant cells. - Manuscript.

Thesis for a candidate degree by speciality 03.00.22 - cell biology. - Institute of Cell Biology and Genetic Engineering, National Academy od Sciences of Ukraine, Kiev, 2000.

The research is aimed to investigate the impact, caused by altered gravity (clinorotation) on both the cytoskeleton arrangement and calcium concentration in B. vulgaris root hairs. Localization of microtubuli and microfilaments on the different stages of root hairs development showed that actin filaments form tracks for transport of Golgi vesicles into the growth site. Transport of vesicles and their fusion with the plasma membrane is promoted by the microfilaments and other actin-binding proteins (myosins, annexins, spectrin-like protein) activity of which is modulated by calcium. It is suggested that orientation of polar calcium flux establishes the precise orientation of root hairs growth. To our mind root hairs posess inner strong mechanisms for maintaining precise growth direction. Interraction between calcium ions and microfilaments is an important part of these mechanisms. The scheme of root hairs growth in altered gravity is proposed, where main attention is given to the shift of growth site. Results of the research is a contribution into the understanding of gravisensing pathways.

Key words: cytoskeleton, actin, tubulin, microfilaments, microtubuli, calcium ions, gravisensing, altered gravity, root hairs.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Україна, як космічна держава, активно впроваджує власну наукову програму розвитку космічної біології. Дослідницька робота в галузі освоєння космічного простору потребує створення контрольованих екологічних систем життєзабезпечення, головним компонентом яких є рослини. У зв'язку з цим актуальності набуває вивчення впливу зміни сили тяжіння на рослинні організми, особливо на їх елементарну складову - клітину. Концепції гравічутливості, які існують сьогодні, не висвітлюють всіх деталей процесу гравісприйняття і не розкривають механізмів передачі гравітаційного стимулу у рослинах. Дослідження стану органел в умовах зміненої сили тяжіння і цитоскелету, який є одним із компонентів системи сприйняття гравітації, поповнюють знання і розширюють уявлення про роль цього клітинного компоненту в механізмах розвитку і адаптації рослин до зміни величини і напрямку дії вектора гравітації. Визначення сигнальних шляхів за участю елементів цитоскелету поглиблює можливості вивчення захисних реакцій рослин і також сприяє розвитку фундаментальних досліджень у галузі клітинної і молекулярної біології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження впливу зміненої сили тяжіння на рослинну клітину і формулювання концепції гравічутливості рослин є головним завданням проектів по темі № 242 "Біологія клітини в умовах мікрогравітації" та № 305 "Обгрунтування пропозицій щодо дослідження впливу мікрогравітації на ріст і розвиток організмів", які затверджені Національним космічним агенством України і виконуються у відділі клітинної біології та анатомії Інституту ботаніки ім. М. Г. Холодного НАНУ.

Мета і задачі дослідження. Метою дисертаційної роботи було з'ясування ролі елементів цитоскелету в гравічутливості кореневих волосків Beta vulgaris. Для досягнення мети в умовах стаціонарного контролю та повільного кліностатування передбачалося:

візуалізувати мікрофіламенти та мікротрубочки на послідовних стадіях

диференціації кореневих волосків, починаючи з клітин протодерми;

дослідити дію інгібіторів елементів цитоскелету на розвиток кореневих

волосків;

виявити внутрішньоклітинний розподіл іонів кальцію у кореневих волосках;

вивчити вплив модифікацій сили тяжіння на верхівковий та плагіотропний ріст кореневих волосків.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше доведена роль цитоскелету та іонів кальцію у плагіотропному рості кореневих волосків; досліджена роль цитоскелету в гістогенезі епідермісу B. vulgaris та встановлений вплив зміни сили тяжіння на процес утворення кореневих волосків; вивчена природа гравічутливості кореневих волосків. Дістали подальший розвиток уявлення про роль цитоскелету та іонів кальцію у верхівковому рості рослинних клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані можуть використовуватися для дослідницьких робіт у галузі визначення молекулярних механізмів гравічутливості рослинних клітин з верхівковим ростом та сигнальних шляхів гравісприйняття.

Особистий внесок здобувача. Результати і ідеї, викладені у дисертації, належать особисто автору.

Апробація результатів дисертації. Результати дисертації обговорювалися на засіданнях відділу клітинної біології і анатомії Інституту ботаніки НАН України, на засіданнях групи клітинної біології Інституту ботаніки, м. Бонн (Німеччина) та були виголошені на наступних наукових з'їздах та конференціях: конференції молодих учених "Актуальные вопросы ботаники и экологии" (Харків, 1996), VI молодіжній конференції ботаніків у Санкт-Петербурзі, (1997), міжнародній конференції "Цитоскелет рослин" (Ялта, 1998), Всеукраїнській молодіжній науково-практичній конференції "Людина і космос" (Дніпропетровськ, 1999), IV з'їзді товариства фізіологів рослин Росії (Москва, 1999), 31-му та 32-му зібранні Міжнародного комітету з космічних досліджень (COSPAR) (Бірмінгем, 1996, Нагоя, 1998), 4-й конференції Міжнародного товариства біохімії і молекулярної біології (Едінбург, 1996), Європейському конгресі з питань молекулярної і клітинної біології (Брайтон, 1997), щорічних з'їздах федерацій європейських біохімічних товариств (FEBS) (Амстердам, 1997, Копенгаген, 1998), конгресі “Стрес і життя” (Будапешт, 1997), 17-му Міжнародному конгресі з питань біохімії і молекулярної біології (Сан Франциско, 1997), щорічному з'їзді федерацій європейських товариств з питань фізіології рослин (FESPP) (Варна, 1998), другій конференції Парнас (“Роль кальцію у сигнальних механізмах”) (Гданськ, 1998).

Публікації. Результати праці опубліковані у вигляді 4 статей у фахових реферованих журналах та 14 тез у матеріалах з'їздів і конференцій.

Структура дисертації. Дисертація викладена на 101 сторінці машинопису, включає 6 таблиць, 25 рисунків, які розміщені у чотирьох розділах додатків і безпосередньо у тексті. До складу дисертації входить вступ, три розділи (огляд літератури, експериментальна частина, аналіз і узагальнення результатів), висновки, додатки та список літератури, який містить 297 посилань.

2. Матеріали і методи

Об'єктом дослідження були паростки буряка Beta vulgaris L.. сортів бордо та носівська. Насіння розміщували на вологому фільтрувальному папері в скляних пробірках діаметром 1 -2 см і впродовж 4-х діб пророщували в темряві при кімнатній температурі. Для досліджень використовували паростки з довжиною коренів не більше 3-х сантиметрів. Кореневі волоски досліджували на стадії ініціації і на стадії активного росту (0,10 - 0, 35 мм завдовжки). Щільність волосків рахували на одиницю довжини кореня (1 мм) у зоні кореневих волосків.

Постановка модельних експериментів проводилася на кліностатах, які працювали в режимі повільного обертання з періодом два оберти на хвилину (Сытник и др., 1984, Kordyum, 1997).

Метод трансмісійної та скануючої електронної мікроскопії. Сегменти коренів промивали в 0,1 М фосфатному буфері і 2 години фіксували в глутаровому альдегіді (2,5% на фосфатному буфері, рН 6,9) при кімнатній температурі. Після промивання у фосфатному буфері (3 рази по 10 хвилин) проводили пост-фіксацію розчином OsO₄ (2% на фосфатному буфері). Зразки дегідратували за зростаючими концентраціями спиртів (Harris and Oparka, 1994). Для скануючої мікроскопії після дегідратації зразки висушували і досліджували у мікроскопі JSM 35 (Japan). Для електронної мікроскопії після дегідратації зразки насичували сумішшю ацетону і смоли епону у співвідношенні 1:1, 1:3, 3:1 по годині на кожний етап. Потім зразки заливали чистою смолою і полімеризували при 37⁰ впродовж доби і при 60⁰ впродовж двох наступних діб. Ультратонкі зрізи отримували на мікротомі "LKB-III", контрастували 15 хв в 0,5-2% розчині уранілацетату і досліджували на електронному мікроскопі "JEM-1200".

Імунофлуоресцентна мікроскопія. Сегменти коренів (1-1,5 см) промивали в стабілізуючому буфері (СБ) (50 мM PIPES, 5 мM MgSO₄, 5 мM EGTA, pH 6.9) і фіксували в 3,7% формальдегіді 1 годину при кімнатній температурі. Зразки дегідратували, після чого заливали в розчинний у спирті віск, який є композицією з дістеарату поліетиленгліколю 400 та 1-гексадеканолу (Balushka et al., 1992). Поздовжні і поперечні зрізи (7 мкм товщиною) отримували на мікротомі. Покращення проникності зрізів для антитіл досягалось шляхом видалення парафіну проведенням їх по спадаючим концентраціям спиртів. Зрізи для світлової мікроскопії робили в області меристеми, постмітотичної перехідної зони і зони диференційованих клітин (1 -5 мм від верхівки кореня). Трихобласти рахували на одиницю (0,2 мм) поверхні поперечного зрізу кореня.

Візуалізація мікрофіламентів. Після проведення в спиртах, зрізи для виявлення актинових філаментів 30 хвилин промивали в СБ і впродовж години інкубували з первинними антитілами проти актину (клон ICN Biomedicals, USA), (розведення 1:200 на фосфатному буфері рН 7,3 (РВS) (0,14 М NaCl, 2,7 мM KCl, 6,5 мM Na₂ HPO₄ x 2H₂ O, 1,5 мM KH₂ PO₄, 3,0 мM NaN₃). Потім проводили інкубацію зі вторинними антитілами (Sigma F 9006), міченими флуоресцинізотіоціанатом (FITC) (Sigma, USA) (розведення 1:20 в РВS) при кімнатній температурі одну годину (Balushka et.al., 1997).

Візуалізація мікротрубочок. Скельця із зразками, приготовленими для виявлення тубуліну, вміщували в 1% розчин тритону Х-100, потім промивали в СБ буфері і одну годину інкубували з первинними антитілами проти тубуліну (Amersham International, U.K.), розведеними 1:200 в РВS. Як і в попередьому випадку, одну годину проводили інкубацію зі вторинними антитілами, міченими флуоресцинізотіоціанатом (Balushka et.al., 1996в). Після фарбування зрізи промивали в РВS і переносили у суміш гліцерину (80%) і фосфатного буфера (рН 8,0), (20%,). Препарати досліджували під флуоресцентним мікроскопом Axiovert 405M (Zeiss,Germany) з фільтрами (450-490 нм і 520 нм). Для фотографування застосовували плівку Kodak T-Max, 400ASA.

Застосування інгібіторів цитоскелету. Цитохалазин D. Паростки інкубували в розчині цитохалазину D (Sigma, USA) (2.5 мкг/мл^-1) впродовж 6-ти годин (Balushka et al., 1997с). Потім проводили стандартну процедуру фіксації і заключення матеріалу, як описано раніше. 1 мг латрункуліна В (Calbiochem, USA) розчиняли в 250 мкл DMSO (базовий розчин). У дослідах використовували 0,1мкМ розчин. Таксол. Базовий розчин (20 мМ) таксолу (Paclitaxel, Calbiochem, USA) приготовляли в 100 % DMSO. Для інкубації паростків впродовж 6 год використовували робочий розчин 20 мкМ. За контрольний розчин використовували розчин DMSO (Balushka et.al., 1992, 1996 б).

Виявлення іонів кальцію методом кальцієвих барвників. Концентрацію іонів кальцію у цитоплазмі кореневих волосків вимірювали за допомогою флуоресцентного індикатора INDO-1/АМ (Sigma Chemical Co.,) (Buch and Jones, 1987, Grynkiewicz et.al., 1985), який попередньо розчиняли в DMSO (1мМ). Для експериментів використовували INDO -1 в концентрації 50 мкМ в 10мМ НЕРЕS-буфері, рН 6,5-7,0 (Кордюм и Даневич, 1996). Паростки інкубували в розчині впродовж години при кімнатній температурі. В експериментах з присутністю позаклітинного кальцію в середовище додавали 0,01М СаCl₂. Інтенсивність флуоресценції в кореневих волосках вимірювали на люмінесцентному мікроскопі ЛЮМАМ И-З з об'єктивом 20 + і фотометричною насадкою ФМЕЛ-1А (збудження 360 нм, емісія 480 нм для вільного і 400 нм для зв'язанного кальцію). Виміри проводили на кореневих волосках довжиною від 380 до 500 мкм. Інтенсивність флуоресценції вимірювали з інтервалом 20с впродовж 40 хв після інкубації. Концентрацію кальцію вираховували за формулою Буша і Джоунса (Buch and Jones, 1987): [Са²⁺] = K_d R₁ [(R-R_min)/(R_max-R)], де R₁ - відношення інтенсивності флуоресценції вільного від Са²⁺ розчину до насиченого Са²⁺ в 480 нм; R_min - відношення інтенсивності флуоресценції в двох довжинах хвиль у розчині, вільному від Са²⁺; R_max - відношення інтенсивності флуоресценції в двох довжинах хвиль у розчині, насиченому Са²⁺; R - відношення інтенсивності флуоресценції в двох довжинах хвиль у досліджуваному матеріалі (R=I₄₀₀/I₄₈₀); K_d - константа комплексу Са²⁺ + INDO-1, яка становить 250 нм (Grynkiewicz, 1985). При калібровці сигналу для отримання максимальної флуоресценції використовували 10 мМ СаCl₂, мінімальну флуоресценцію реєстрували із додаванням 4 мМ ЕGТА. Результати обробляли за допомогою комп'ютерної програми BIO для виявлення абсолютного вмісту елементу в рослинній клітині.

Статистична обробка результатів. Експерименти проводили в 3-х кратній повторності, в кожній з яких досліджували щонайменше 14 коренів. Цифрові результати подані у вигляді: середнє (х) середнє квадратичне відхилення (Sx). Похибка визначення концентрації іонів кальцію, кількості клітин на поперечний зріз кореня і щільності волосків не перевищувала 20%.

3. Результати досліджень та їх обговорення

На підставі порівняльних досліджень організації цитоскелету в процесі диференціації трихобластів та росту кореневих волосків Beta vulgaris в умовах стаціонарного контролю та кліностатування були виявлені закономірності розташування мікротрубочок і мікрофіламентів у гістогенезі епідермісу та був встановлений вплив зміненої сили тяжіння на здатність ризодерми формувати кореневі волоски. У розвитку кореневих волосків виділено три основні стадії, а саме: 1) підготовка трихобласта до утворення виступу волоска, 2) утворення виступу волоска (ініціація) і 3) активний ріст волоска. На основі досліджень топографії цитоскелету та внутрішньоклітинного розподілу іонів кальцію при дії зміненої сили тяжіння і експериментів з інгібіторами елементів цитоскелету і кальцієвих каналів вперше доведена визначальна роль актинового цитоскелету та іонів кальцію в реалізації плагіотропного росту кореневих волосків.

3.1 Роль мікрофіламентів в утворенні кореневих волосків та вплив зміненої сили тяжіння на утворення кореневих волосків

Встановлено, що для ризодерми B. vulgaris характерне чергування волоскових (трихобласти) і безволоскових (атрихобласти) клітин. У ростових зонах кореня, починаючи з меристеми, трихобласти і атрихобласти знаходяться на різних етапах диференціації. До зони кореневих волосків у безволоскових клітинах диференціація закінчується, а волоскові клітини вступають у фазу активного росту і високої функціональної активності.

Як показали наші дослідження, в клітинах епідермісу B. vulgaris присутні всі форми актину, які описані для інших вищих рослин, а саме: філаментний і неполімеризований актин (Seagull et. al., 1987, Шевченко, 1999). Починаючи з пізньої меристеми у деякої частини трихобластів спостерігаються виразні ущільнення актинового цитоскелету в апікальній частині, тобто в місці появи майбутнього виступу волоска. При кліностатуванні кількість трихобластів з ущільненням з актинового цитоскелету в апікальній частині збільшується майже втричі, особливо на рівні зони розтягу (табл. 1). При дії цитохалазину як у стаціонарних умовах вирощування, так і в умовах кліностатування кількість таких трихобластів на одиницю довжини поверхні поперечного зрізу кореня незначна (табл. 1).

Таблиця 1 Кількість трихобластів з підвищеною щільністю актинового цитоскелету в апікальній частині (на 0,2 мм поверхні поперечного зрізу кореня) (n=54)

Також виявлено, що дія цитохалазину D призводила до зменшення кількості самих волосків на одиницю довжини кореня, аналогічним чином діяв і таксол (табл. 2). При застосуванні сильнодіючого дезорганізатора актинового цитоскелету - латрункуліну B - кореневі волоски не формувалися ні в контролі, ні в умовах кліностатування (див. табл. 2).

Таблиця 2 Вплив умов вирощування на щільність кореневих волосків (n=37)

Ми припускаємо, що перед ініціацією волоска в апікальній частині трихобласта відбувається інтенсивна полімеризація актину, яка веде до формування мікрофіламентів, необхідних для спрямованого руху везикул Гольджі до апікальної мембрани (Emons and Traas, 1986, Emons, 1987). Про утворення мікрофіламентів свідчить присутність у верхівці трихобласта профіліну, білка, здатного регулювати полімеризацію актину (Balushka et al., 1997b). Вважається, що сам рух везикул забезпечується взаємодією актину і міозину (McCurdy and Williamson, 1991). Везикули містять ферменти, які розщеплюють зв'язки між полісахаридними фібрилами (Peterson and Farquhar, 1996), що знижує жорсткість стінки трихобласта у верхівці і надає їй пластичності (Meekes, 1985, Miller et al., 1997), необхідної для розтягу при утворенні волоскового виступу. Те, що саме сітка філаментного актину сприяє формуванню виступу волоска, беспосередньо доводять наші експерименти з латрункуліном (Spector et al., 1989), який повністю руйнує філаментний актин і тим самим припиняє транспорт везикул Гольджі у район апікальної мембрани трихобласта, в результаті чого кореневі волоски не формуються зовсім. Результати таблиці 2 показують, що застосування цитохалазину, який запобігає полімеризації мікрофіламентів слабше, ніж латрункулін, знижує кількість кореневих волосків на одиницю довжини кореня.

Таким чином, збільшення кількості трихобластів з підвищеною щільністю актину в апікальній частині при кліностатуванні свідчить про те, що в умовах зміненої сили тяжіння здатність ризодерми утворювати кореневі волоски посилюється, що підтверджується результатами вимірювання кількості волосків на одиницю довжини кореня (табл. 2). Відомо, що посилене формування кореневих волосків є неспецифічною реакцією і спостерігається при дії багатьох інших чинників, зокрема, засоленості, зміни рН середовища (Cormack, 1944) та впливу азот-фіксуючих бактерій (Hofer, 1988, Miller et al., 1997).

Нами вперше виявлено, що до збільшення кількості кореневих волосків призводить дія зміненої сили тяжіння. За деякими припущеннями, формування кореневих волосків регулюється перехресною взаємодією гормональних шляхів (Masucci and Schiefelbein, 1996), яка може бути чутливою до зміненої гравітації (Aarrouf et al., 1999).

3.2 Роль цитоскелету та іонів кальцію у верхівковому рості

На стадії ініціації волоска як в умовах стаціонарного контролю, так і кліностатування відмічалося щільне розташування актину на більшій частині купола волоска. Ні на стадії ініціації, ні на термінальній стадії росту не знайдено різниці у концентрації іонів кальцію між основою і верхівкою волосків. Апікально-базальний градієнт у розподілі кальцію (Hermann and Felle, 1995, Miller et al., 1997) виявлявся тільки під час активного росту клітин (табл. 3). В умовах кліностатування градієнт кальцію зберігався, проте його показники у верхівках волосків значно збільшувалися (табл. 3).

На нашу думку, присутність актину у куполі волоска доводить вирішальну роль актинового цитоскелету в становленні полярності клітини. Слід зазначити: з результатів багатьох досліджень випливає, що цитоплазма виступу волоска позбавлена чіткого розділення на зони (Miller et. al., 1997).

Таблиця 3 Вплив умов вирощування на розподіл іонів кальцію (нM) у кореневих волосках B.vulgaris, (n=100)

Ми припускаємо, що формуванню зональності клітини сприяє актиновий цитоскелет. А саме: в апексі виступу, за аналогією з функцією мікрофіламентів у клітинах тварин (Luna and Hitt, 1992, Bretscher, 1993), філаменти опосередковують транспорт облямованих везикул, у результаті чого забезпечується інтенсивна рециклізація (Ridge, 1995, Peterson and Farquhar, 1996) і перебудова плазматичної мембрани. Оскільки як у тварин, так і у рослин Ca²⁺ -канали є інтегральними білками плазматичної мембрани, очевидно, що їх вбудова в апікальну мембрану відбувається при рециклізації (Jones et. al., 1995). Активність вбудованих каналів веде до локалізованого входу іонів кальцію, тоді як різниця концентрації іонів кальцію між верхівкою і основою волоска визначає апікально-базальний Са ²⁺ - градієнт, що, в свою чергу, зумовлює полярність клітини (Miller et al., 1997). Вбудова каналів відбувається переважно на стадії ініціації волоска, що і пояснює появу градієнту кальцію вже після цієї стадії. Існування полярного потоку іонів Са²⁺ забезпечується за рахунок узгодженної роботи Са²⁺ -каналів різних типів і Са²⁺ -АТФаз (Trewavas, 1999). Як відомо, всі клітини з верхівковим ростом характеризуються власним градієнтом іонів кальцію, проте його показники відрізняються у різних видів рослин і типів клітин (Bibikova et al., 1997, Cai, et al., 1997).

Для волосків в стадії активного росту характерні довгі пучки мікрофіламентів, які зорієнтовані, в основному, паралельно до осі клітини і спрямовані до її апексу. В апікальній зоні волосків філаменти утворювали щільнішу сітку, ніж у субапікальній

Функція мікрофіламентів на цій стадії розвитку полягає в створенні руху цитоплазми і забезпеченні ростових процесів (Lloyd, et al., 1987, Heath, 1990а, Jackson and Heath, 1993, Cardenas et.al., 1998). Мікрофіламенти опосередковують рух екзоцитозних везикул у напрямку до апікальної мембрани. Із літератури відомо, що свою роль у верхівковому рості цитоскелет виконує тільки за наявності в середовищі іонів кальцію (Felle and Hepler, 1997, Bibikova et al., 1997, Jones et. al., 1995, Cai, et al., 1997, Malho et al., 1998, Sanders et al., 1999). Вважається, що спрямований потік іонів кальцію несе інформацію про вектор поляризації і задає просторову розмітку напрямку активності обмінних процесів і морфогенезу (Медведев, 1996). У кореневих волосках, як і в інших клітинах з верхівковим ростом (Miller et al., 1997), кальцій у верхівці активує багато Са²⁺-залежних цитоплазматичних факторів і білків (Berger et al., 1993, Li, et al., 1997), які потрібні для доставки і злиття везикул з апікальною плазматичною мембраною (Jones et. al., 1995). Крім того, іони кальцію впливають на утворення в апексі локусів мікрофіламентів, які регулюють процеси злиття (Li, et al., 1997). Таким чином, саме Са ²⁺- потік локалізує процеси екзоцитозу в певному місці апікальної мембрани, що сприяє наростанню її поверхні і, тим самим забезпечує ріст волоска в певному напрямку (Malho, 1995, Braun and Richter, 1999, Сhatterjee et al., 2000).

Ми припускаємо, що в процесі росту рух цитоплазми доставляє везикули Гольджі до верхівкової зони волоска, де щільні мікрофіламенти виступають у ролі буфера, який регулює поставку везикул саме в точку росту. Це підтверджують і результати інших авторів (Kropf et al., 1998, Miller et. al., 1999). Аналогічну функцію буфера, який регулює обмін між популяцією везикул і виходом її частини на апікальну мембрану, актинові філаменти виконують і в клітинах тварин, наприклад в секреторному епітелії (Yao and Forte, 1996). Короткі актинові філаменти у точці росту разом з іншими білками (анексини, спектриноподібний білок), активність яких забезпечується іонами кальцію, сприяють векторизації процесів злиття везикул з мембраною (Miller et. al., 1999). У везикулах, які потрапляють на апікальну мембрану, присутні попередники полісахаридів матриксу клітинної стінки (Ridge, 1995), які використовуються для її формування.

Згідно з нашими спостереженнями, змінена сила тяжіння не впливає на процеси верхівкового росту, оскільки не було помічено суттєвої різниці в розмірах волосків в умовах стаціонарного контролю і кліностатування.

3.3 Роль цитоскелету і іонів кальцію в плагіотропному рості

Відомо, що кореневим волоскам властивий плагіотропний ріст, який еволюційно сформувався в умовах земного тяжіння і характеризується орієнтацією ростової осі паралельно поверхні Землі. Нами встановлено, що як в умовах стаціонарного контролю, так і кліностатування орієнтація волосків, які знаходяться в стані активного росту, коливається в межах 85 - 95⁰ по відношенню до поздовжньої осі кореня. Кліностатування впливало на орієнтацію волосків лише на стадії ініціації і змінювало кут виступу волоска на 40-60⁰. Оскільки вважається, що спрямованість росту волоска формується з появою спрямованого потоку іонів кальцію через апікальну мембрану (див. вище), відсутність градієнту на стадії виступу свідчить про те, що напрямок росту клітини ще не визначився. Згідно наших припущень на цьому етапі зовнішні стимули можуть порівняно легко змінювати орієнтацію волосків, що і відбувається в експериментах зі зміненою силою тяжіння. Як згадувалося раніше, в умовах кліностатування після проходження стадії ініціації верхівка волосків знову починає рости під кутом 85 - 95⁰. Ми вважаємо, що зміні кута росту з 40 - 60⁰ на 85 - 95⁰ сприяє підвищена концентрація іонів кальцію в апексі (табл. 3), яка є результатом активації кальцієвих каналів або збільшення їх загальної кількості (Hermann & Felle, 1995, Felle and Hepler, 1997, Miller et. al., 1997). Проведені досліди зі специфічним інгібітором механочутливих каналів кальцію - іонами гадолінію - довели, що канали цього типу є важливою складовою у регуляції концентрації кальцію в кореневих волосках в умовах кліностатування (рис. 3, табл. 3).

Даний тип каналів розглядається як високоорганізований молекулярний рецептор механічного стресу (Morris, 1990). Слід додати, що впродовж останніх років цитоскелет і іони кальцію розглядаються як сигнальна система для різноманітних стимулів у різних типів клітин (Jones et. al., 1995, Bibikova et al., 1997, Braun and Wasteneys, 1998, Sanders et al., 1999, Franklin-Tong, 1999).

Ми вважаємо, що ці два елементи взаємодіють і у процесах гравічутливості кореневих волосків B. vulgaris. Оскільки в умовах кліностатування іони кальцію підвищуються до концентрації, яка достатня для забезпечення сигнальних реакцій, можна припустити, що підвищення рівня цитоплазматичного кальцію, як системи вторинного посередника, активує Ca²⁺ -залежні процеси в кореневих волосках, які спрямовані на пристосування до мінливості довкілля, і зміна концентрації вільного Ca²⁺ може бути сигналом для змін метаболізму і регуляції росту (Tretyn et al., 1991). У результаті проходження сигналу можуть активуватися фактори, які викликають перебудову актинового цитоскелету. До таких факторів належить експресія генів профіліну (Schmidt and Hall, 1998, Witsch et al., 1998, Franklin-Tong, 1999). Профілін регулює додаткову полімеризацію мікрофіламентів, у ході якої формуються транспортні треки для руху везикул у нову точку апікальної мембрани. Це призводить до локалізованого екзоцитозу і наростання мембрани саме в цій точці апексу (Miller et al., 1999), тоді як активація кальцієвих каналів забезпечує становлення нової осі полярності клітини. Згідно наших уявлень при кліностатуванні підвищена концентрація іонів кальцію через регулювання перебудов актинового цитоскелету призводить до зміщення точки росту волоска. В свою чергу, зміщення точки росту на послідовних етапах розвитку волоска веде до реорієнтації росту і повернення до напрямку, на який кореневі волоски детерміновані (рис. 1).

Таким чином, наші експерименти, проведені в умовах стаціонарного контролю і зміненої сили тяжіння з додаванням у середовище вирощування інгібіторів цитоскелету і кальцієвих каналів довели, що актиновий цитоскелет та іони кальцію визначають плагіотропність росту кореневих волосків B. vulgaris. На основі отриманих даних можна стверджувати, що кореневі волоски, як і деякі інші клітини з верхівковим ростом (Демків та ін., 1997), мають стійкі внутрішні механізми підтримання напрямку росту. Причому ініціація і ріст кореневих волосків регулюються різними механізмами.

II

Рис. 4. Механізм відновлення кута росту 85 - 95⁰ у кореневих волосках B. vulgaris під час проходження послідовних ростових стадій. 1,2, 3 - стадії росту в умовах стаціонарного контролю (І) і кліностатування (ІІ). F - філаментний актин, G - мономерний актин, C - канали кальцію, стрілка вказує на напрям входу іонів, P - профілін, V - везикули, стрілка - напрям росту, g - вектор гравітації.

3.4 Роль тубулінового цитоскелету у верхівковому і плагіотропному рості кореневих волосків

На основі того, що мікротрубочки відсутні у виступі волоска на стадії ініціації і у зрілих клітин не досягають верхівки, можна припустити, що тубуліновий цитоскелет не залучений до верхівкового росту. В наших експериментах кліностатування не змінювало орієнтації мікротрубочок ні в клітинах епідермісу, ні в самих кореневих волосках, що може слугувати доказом того, що мікротрубочки безпосередньо не задіяні і в механізмах гравічутливості цього типу клітин.

Проте той факт, що у кореневих волосках як на стадії трихобласта, так і на стадії активного росту волоска мікрофіламенти і мікротрубочки розміщені поздовжньо, не виключає синергічної взаємодії між двома системами цитоскелету. Це підтверджують досліди із застосуванням антитубулярних речовин, у присутності яких щільність волосків на одиницю довжини кореня зменшувалась (див. табл.2.), що вказує на те, що руйнування тубулінового цитоскелету порушує процес утворення кореневих волосків. Можна погодитись із тими дослідниками, які припускають, що на всіх стадіях розвитку кореневих волосків мікротрубочки відповідають за впорядковану організацію мікрофіламентів і можуть виступати в ролі каркасу для орієнтації останніх (Lloyd, et al., 1987, Heath and Kaminsky, 1989, Braun and Sievers, 1994, Ridge, 1995, Tominaga et.al., 1998). Цілком логічно, що руйнування мікротрубочок призводить до структурних змін сітки актинового цитоскелету, а, отже, до змін у процесах формування і росту волосків. В зв'язку з цим ми не виключаємо можливості, що шляхом взаємодії із мікрофіламентами, мікротрубочки беруть участь у гравічутливих реакціях кореневих волосків.

Висновки

На основі дослідження стану цитоскелету та внутрішньоклітинного розподілу іонів кальцію при дії зміненої сили тяжіння і експериментів з інгібіторами елементів цитоскелету і кальцієвих каналів вперше висвітлена визначальна роль актинового цитоскелету та іонів кальцію в реалізації плагіотропного росту кореневих волосків.

Встановлено, що для ризодерми Beta vulgaris характерне чергування волоскових (трихобласти) і безволоскових (атрихобласти) клітин, які в різних ростових зонах кореня відрізняються за формою, розміром і ступенем диференціації. Виділено три стадії розвитку кореневих волосків: 1) підготовка трихобласта до утворення волоскового виступу, 2) формування виступу (ініціація) і 3) активний ріст волоска.

Ініціації кореневого волоска передує формування ущільненої сітки актинового цитоскелету у верхівковій частині трихобласта, яка забезпечує утворення виступу волоска. В умовах кліностатування здатність ризодерми утворювати кореневі волоски посилюється.

Кореневі волоски, які активно ростуть, характеризуються підвищеною щільністю мікрофіламентів у зоні верхівки і апікально-базальним градієнтом іонів кальцію, який виникає після появи волоскового виступу. Актиновий цитоскелет при наявності іонів кальцію опосередковує процеси верхівкового росту.

Під час кліностатування градієнт іонів кальцію зберігається, проте його показники у верхівках волосків значно збільшуються в результаті активації механочутливих кальцієвих каналів на апікальній мембрані.

Тубуліновий цитоскелет бере опосередковану участь у процесах верхівкового росту і гравічутливості кореневих волосків.

Кореневі волоски є зручною моделлю для вивчення гравічутливості рослин і можуть бути рекомендовані для досліджень у галузі космічної клітинної біології та фізіології рослин.

Список опублікованих праць

Шевченко Г.В. Актиновий цитоскелет кореневих волосків Beta vulgaris L// Український ботанічний журнал. - 1999. - Т. 56, №2. - С. 80-84.

Shevchenko G.V. Patterns of cortical microtubules in epidermis of Beta vulgaris roots under clinorotation//Advances in Space Research. - 1999. - V.24., №6. - P.739-742.

Shevchenko G.V. Microtubules in outer cortex cells of Beta vulgaris L.. roots under clinorotation//Cell Biology International.- 1997.- V.21. - P. 893-894.

Шевченко Г.В. Особенности актинового цитоскелета клеток корневой меристемы Beta vulgaris L. на разных стадиях митоза//Цитология и генетика. - 2000. - Т. 34, №3. - С.10-14.

Шевченко Г.В. Цитоскелет рослинних клітин з верхівковим ростом в умовах зміни сили тяжіння//Актуальные вопросы современной ботаники и экологии. Тезисы докладов конференции молодых ученых и специалистов. - Харьков. - 1996. - С. 110.

Shevchenko G.V. Cytoskeletal components of Beta vulgaris root hairs in altered gravity fields// Adv. in Space Res. - 1998. - V.21, №8/9. - P. 1167.

Shevchenko G.V. Changes of calcium level under altered gravity may influence the cytoskeleton of plant cells//Biochemical Society Transaction. - 1997. - V.25. - P. 5775.

Shevchenko G.V. Actin microfilaments arrangement in tip-growing plant cells can be influenced by altered gravity// European Congress for Molecular Cell Biology, Abstract, Brighton, UK. - 1997. - P. 23.

Шевченко Г. В. Растительная клетка в условиях изменения силы тяжести//Тезисы VI молодежной конференции ботаников в Санкт-Петербурге, 12-16 мая. - 1997. - С. 70.

Shevchenko G.V. Role of Ca²⁺ in gravity perception of plant cells//Annual FEBS Meeting, Amsterdam. - 1997. - 1p.

E.L. Kordyum, G.V. Shevchenko Mechanisms of plant cell adaptation to microgravity// “Stress of Life” Congress, Hungary, Abstract .-1997.-P. 74.

Shevchenko G.V. Signal transduction in tip-growing plant cells//25th FEBS Meeting, Copenhagen, Abstract book. - 1998. - P. 75.

Shevchenko G.V. Tip-growing plant cells may respond to altered gravity//32^nd Scientific Assembly of COSPAR, Abstracts, Nagoya, Japan. - 1998. - P. 387.

Shevchenko G.V. Cytoskeleton of rhisodermis cells of Beta vulgaris roots//Bulgarian Journal of Plant Physiology.- 1998.- P. 17.

Shevchenko G.V. Possible role of calcium in graviperception of tip-growing plant cells//Abstracts, Parnas Conference. - 1998. - 1 P.

Шевченко Г.В., Котенко Т.Б. Уявлення про вплив факторів космічного польоту на рослинну клітину//Матеріали Всеукраїнської молодіжної конференції "Людина і космос" Дніпропетровськ. - 1999. - C. 207.

Шевченко Г.В. Цитоскелет клеток эпидермиса Beta vulgaris и Lepidium sativum// Тезисы IV съезда общества физиологов растений России. - 1999. - Т. 1. - С. 141.

Размещено на Allbest.ru