Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

УДК:57.043:57.085.2:577.152.2

Шаніна Ірина Василівна

ГІПОТЕРМІЧНЕ ЗБЕРІГАННЯ ІЗОЛЬОВАНИХ ГЕПАТОЦИТІВ

ТА ПЕЧІНКИ ЩУРІВ У РОЗЧИНАХ РІЗНОГО СКЛАДУ

03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Харків - 2000



Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії Наук України.

Науковий керівник:

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник КРАВЧЕНКО ЛІДІЯ ПЕТРІВНА, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН

України, старший науковий співробітник відділу кріобіохімії.

Офіційні опоненти:

Доктор біологічних наук, професор ЖЕГУНОВ ГЕНАДІЙ ФЕДОРОВИЧ, зав. кафедрою медичної біології Харківського Державного медичного університету МОЗ України.

Доктор біологічних наук, професор КАЛІМАН ПАВЛО АВСЕНТІЙОВИЧ, зав. кафедрою біохімії Харківського Національного

університету ім. В.Н. Каразіна.

Провідна установа:

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Киів. Захист відбудеться “_19_” вересня 2000 р. о 13 год. 30 хв. на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, 61015, м. Харків 15, вул. Переяслівська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України,

61015, м. Харків 15, вул. Переяслівська, 23. Автореферат розісланий _17 _серпня_2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої Ради,

доктор медичних наук, професор А.М. ГОЛЬЦЕВ



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність. На теперешній час консервування органів (нирка, печінка, серце та інші) при 0-4°С є найпоширенішим методом їх зберігання для подальшого клінічного застосування [Padbury R.T., 1994; Southard J.H., 1995; Porte R., 1998]. Удосконалення методів холодового зберігання органів розвивалося шляхом підбору складу перфузійних та консервуючих розчинів [Collins G.M., 1969; Шумаков В.И., 1983; Southard J.H., 1989; Schilling M., 1993; Churchil T., 1995] з метою максимального подовження терміну їх безпечного консервування. Сольовий розчин внутрішньоклітинного типу Євро-Колінз дозволив зберігати печінку в умовах гіпотермії протягом 6-8 годин [Liu T., 1990; Wahlberg J., 1995], але вже у перші години зберігання органу спостерігаються морфологічні [Голомяко І.В., 1995; Горідько Т.М., 1995] та метаболічні [Деев В.А., 1995; Шагидулин Ю.М., 1995] порушення. Запропонований дослідниками США розчин Університету Вісконсин (UW) [Southard J.H., 1989], основними компонентами якого є глюконат натрію або лактобіонат калію, на сьогоднішній день дозволив досягти найбільших термінів холодового консервування печінки собак (24-48 годин) в експерименті [Jamieson N., 1988; van der Hoven J., 1998] та клінічній трансплантології (20 годин) [Todo S., 1988; Porte R., 1998]. Однак клінічні дослідження свідчать, що оптимальним часом гіпотермічного консервування печінки в розчині UW, після якого результат трансплантації виявляється позитивним, є 10-13 годин [Padbury R., 1994; Nuno J., 1995; Porte R., 1998]. Тому на цей час продовжується пошук нових розчинів та ефективних добавок для поліпшення холодового зберігання печінки [Churchell T., 1996; Lemasters J., 1997; Changani K., 1999; Rodriguez J., 1999], також як і вивчення причин пошкодження гепатоцитів в умовах тривалої гіпотермії [Serrar H., 1997; Olinga P., 1998; van der Hoven J., 1998; Vreugdenhil P., 1999; Toshchakov V., 1999]. Адекватними моделями для досягнення зазначеної мети в експериментальній біології є ізольовані гепатоцити та ціла печінка тварин. Ізольовані клітини печінки також є об'єктом дослідження кріобіологів, які розробляють ефективні методи їх консервування для подальшого клінічного застосування при лікуванні різноманітних форм печінкової недостатності [Federici A., 1995; Raper S., 1996].

Є перспективним більш детальне вивчення ефективності сахарозомістких розчинів для гіпотермічного консервування ізольованих гепатоцитів та печінки, оскільки дані розчини сприяли більшому збереженню ізольованих клітин печінки в умовах 4°С у порівнянні з натрій- та каліймісткими середовищами [Кравченко Л.П., 1993].

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіохімії в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: № 8, “Дослідження спрямованості метаболічних процесів, регулюючих детоксикаційні властивості нативних та кріоконсервованих гепатоцитів”, № ДР 01944005304 (дисертантом особисто були досліджені процеси перекисного окислення ліпідів в ізольованих клітинах печінки, а також вплив ряду метаболічно активних препаратів на збереження гепатоцитів в умовах тривалого гіпотермічного зберігання в сахарозомісткому середовищі), № 87 “Вивчення механізму біологічної дії кріоконсервованих препаратів ембріональної печінки на метаболізм гепатоцитів в умовах функціональної недостатності печінки”, № ДР 0100U004048 (автор самостійно досліджував зміну дихальної активності та рівня АТФ в ізольованих клітинах печінки, а також зміну активностей амінотрансфераз у перфузаті печінки після тривалого гіпотермічного зберігання в різних консервуючих розчинах).

Мета і задачі дослідження. Метою роботи була порівняльна оцінка ефективності сахарозомісткого та інших консервуючих розчинів (Маршал, UW, Дюльбекко) при гіпотермічному зберіганні ізольованих гепатоцитів та цілої печінки щурів.

Задачі роботи: 1) вивчення морфологічних особливостей ізольованих клітин печінки при гіпотермічному зберіганні у розчинах різного складу, а також дослідження впливу ряду метаболічно активних речовин (силібор, аспірин, метионін, глютатіон, алопурінол, дексаметазон) на їх збереження в умовах гіпотермії; 2) вивчення енергетичного стану та інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів в ізольованих гепатоцитах та печінці щурів при холодовому зберіганні в середовищах різного складу; 3) дослідження виходу маркерних ферментів (амінотрансфераз) у перфузат після гіпотермічного зберігання ізольованої печінки у розчинах різного складу.

Об'єкт дослідження - тривале гіпотермічне зберігання ізольованих гепатоцитів та печінки щурів у розчинах різного складу.

Предмет дослідження - морфологічний та метаболічний стан ізольованих гепатоцитів та печінки щурів в умовах тривалого гіпотермічного (0-4°С) зберігання в середовищах різного складу.

Методи дослідження. Дослідження морфологічних особливостей ізольованих клітин печінки та впливу ряду метаболічно активних речовин визначалось з використанням світлового мікроскопа за ступенем виключення трипанового синього, зміною об'єму клітин та можливістю формування везикул на плазматичній мембрані гепатоцитів.

Дослідження інтенсивності процесів перекисного окислення ліпідів проводилось за накопиченням первинних (дієнові кон'югати) та вторинних (малоновий диальдегід) продуктів ПОЛ, зміною активності ферменту протиокислювальної системи (глютатіонредуктаза) в ізольованих гепатоцитах та печінці.

Вивчення дихальної активності ізольованих гепатоцитів проводили полярографічним методом, вміст АТФ в ізольованих клітинах та печінці визначали люциферин-люциферазним методом.

Дослідження солюбілізації маркерних ферментів проводили за виходом аспартатамінотрасферази (АсАТ) та аланінамінотранферази (АлАТ) у перфузат після гіпотермічного зберігання органу в середовищах різного складу.

Наукова новизна одержаних результатів. На основі порівняльного вивчення збереження, енергетичного стану та процесів перекисного окислення ліпідів в ізольованих гепатоцитах та печінці щурів за період тривалого холодового зберігання в сахарозомісткому середовищі (патент України), розчинах UW та Маршал вперше було доведено, що сахарозомісткий розчин (СМР) є більш ефективним порівняно із зазначеними розчинами. Показано, що сахарозомісткий розчин забезпечує збереження життєздатності, об'єму, енергетичного стану та процесів перекисного окислення ліпідів ізольованих гепатоцитів протягом 48 годин в умовах гіпотермії. Вперше показано, що в умовах гіпотермічного зберігання цілої печінки щурів у СМР досягається найменший вихід амінотрансфераз у перфузат при холодовій реперфузії органу у порівнянні з розчинами Маршал та UW. Дістала подальший розвиток концепція про те, що консервуючі розчини, які містять непроникаючі в клітину компоненти (сахароза, альбумін), сприяють ефективному холодовому зберіганню ізольованих клітин та цілої печінки. Встановлено, що у складі ізольованої печінки гепатоцити є більш чутливими до пошкоджуючих факторів в умовах холодової ішемії. Вперше показано, що в умовах пригнічення набухання ізольованих клітин та органу первинним є порушення енергозабезпечення клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані дані про енергетичний стан та процеси перекисного окислення ліпідів гепатоцитів сприяють з'ясуванню механізмів пошкодження ізольованих клітин печінки та цілого органу в умовах холодової гіпоксії. Одержані в роботі дані можуть бути використані при удосконаленні консервуючих розчинів для гіпотермічного зберігання ізольованих гепатоцитів та цілої печінки шляхом застосування непроникаючих у клітину компонентів. Сахарозомісткий розчин з додаванням силібора може знайти широке застосування для тривалого (96 годин) гіпотермічного зберігання ізольованих ядромістких клітин. Одержані результати дозволяють рекомендувати удосконалене сахарозомістке середовище [Кравченко Л.П., 1998] для гіпотермічного зберігання цілої печінки в експериментальних умовах, а також як основу для розробки методу гіпотермічного зберігання цілої печінки людини.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проведено аналіз даних літератури за темою дослідження, визначено мету та задачі роботи, а також шляхи їх вирішення. Автором особисто одержано експериментальні дані та проведено їх статистичну обробку, а також зроблено попередні висновки. Автором разом з науковим керівником були інтерпретовані результати та зроблені остаточні висновки.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на першому з'їзді Українського товариства кріобіології та кріомедицини (м. Харків, 1995р.), на ІІ-й конференції Парнаса (м. Гданськ, Польща, 1998р.), на конференціях молодих вчених в ІПКіК НАНУ (м. Харків, 1999, 2000 рр.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 статей, 7 тез доповідей, одержано 1 патент України.

Обсяг та структура роботи. Дисертація викладена на 147 сторінках друкованого тексту, складається із введення, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, глави власних спостережень та їх обговорення, висновків та переліку літературних посилань (259 джерел), містить 4 таблиці, 30 рисунків.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури

У першому розділі досліджень представлено докладний аналіз літератури за темою дисертації. Приділяється особлива увага дослідженням умов гіпотермічного зберігання клітин та органів; метаболічних змін, що відбуваються у період зберігання ізольованих гепатоцитів та цілої печінки; причин їх пошкодження та можливих шляхів запобігання.

У другому розділу описані матеріали та основні методи досліджень.

Матеріали та методи дослідження

Експерименти проводили на статевозрілих безпородних щурах вагою 200-300 г. Об'єктом дослідження були ізольовані гепатоцити та ціла печінка щурів. Ізольовані клітини печінки виділяли неферментативним методом [Кравченко Л.П., 1997]. Життєздатність одержаної суспензії визначали через забарвлення клітин вітальним красителем трипановим синім [Seglen P.O., 1976]. Концентрацію клітин у суспензії визначали за стандартною методикою з підрахунком у камері Горяєва [Неменова Ю.М., 1972].

Ізольовану печінку щурів одержували після її перфузії in situ охолодженим консервуючим розчином через V.Porta. Після цього печінку виймали з тіла тварин та переносили у скляні бюкси, наповнені відповідним розчином (4°С).

Гіпотермічне зберігання проводили при температурі 4°С. Відбір зразків та їх біохімічний аналіз проводили після 24-, 48-, 72- та 96 годин гіпотермічного зберігання. У роботі досліджували вплив таких розчинів:

1. Сахарозомісткий розчин (СМР) - ізотонічний розчин сахарози, збалансований сольовими компонентами + 1% БСА [Кравченко Л.П., 1993].

2. Сахарозомісткий розчин (СМР) з додаванням фармакологічного препарату (силібор) в концентрації 1 мг/мл.

3. Середовище Дюльбекко [Barnes D., 1980].

4. Середовище Дюльбекко з додаванням силібора в концентрації 1 мг/мл.

5. Розчин Університету Вісконсин - UW (без рафінози) [Mitchell S., 1996].

6. Розчин UW з додаванням силібора в концентрації 1 мг/мл.

7. Розчин Маршал (гіпертонічний цитрат) [Ross H., 1976].

Дихальну активність ізольованих гепатоцитів вимірювали полярографічно в комірці місткістю 1 мл при 37°С за допомогою закритого платинового електрода Кларка на полярографі LP-7E.

Вміст АТФ у безбілковому кислотному екстракті визначали за допомогою люциферин-люциферазного методу [Атауллаханов Ф.И., 1981] на біохемілюмінометрі БХЛ-06.

Вміст дієнових кон'югатів (ДК) в ізольованих гепатоцитах та тканині печінки щурів визначали за методом [Орехович В.Н., 1977].

Вміст малонового диальдегіда (МДА) в ізольованих гепатоцитах та тканині печінки в різних реакціях (початкова, спонтанна, аскорбат- та НАДФН-індукована) визначали за методом [Kunimoto M., 1981].

Активність цитоплазматичного ферменту глютатіонредуктази (ГР) визначали в надосадовій рідині за зменшенням вмісту НАДФН в досліджуваній пробі [Вилкова В.А., 1982].

Активності амінотрансфераз (АсАТ та АлАТ) в перфузаті визначали згідно з уніфікованим методом за Рейтманом та Френкелем [Меньшиков В.В., 1973].

Дослідження об'єму та форми гепатоцитів проводилось з використанням світлового мікроскопу Jenaval (Carlzeiss, Jena, GDR) через відеокамеру, з'єднаного з комп'ютером IBM-PC. Морфометрична обробка здійснювалася за допомогою програми, яка дозволяє розрахувати периметр та площу проекції клітин. Проекцією клітин вважався еліпс. Об'єм життєздатних клітин розраховувався за формулою-V=4/3r3, радіус-R=s/ без урахування везикул.

Одержані результати оброблялися статистично за методом Стьюдента-Фішера у випадку параметричного розподілу даних, за методом Манна-Уітні у випадку непараметричного розподілу на комп'ютері IBM-PC, використовуючи пакет програм “ORIGIN”.



Результати та їх обговорення

Зміна життєздатності, об'єму та форми ізольованих гепатоцитів на етапах гіпотермічного зберігання у розчинах різного складу. У період тривалого консервування ізольованих гепатоцитів за умов 4°С істотне значення у збереженні життєздатності, форми та об'єму клітин має склад консервуючого розчину (рис. 1, 2). Гіпотермічне зберігання клітин печінки у розчинах Дюльбекко та Маршал призводить до зниження життєздатності до 52±4.7 - 65±5.9% через 24 години, до 7.0±0.5 та 33±2.5% через 48 годин зберігання, відповідно (рис. 1). У той же час холодове зберігання ізольованих гепатоцитів у розчині Дюльбекко викликає збільшення об'єму клітин (рис. 2). Через 48 годин спостерігається зниження об'єму цитоплазматичного матрикса гепатоцитів до контрольного рівня (середовище Дюльбекко) та нижче (розчин Маршал) (рис. 2). Це відбувається паралельно до формування везикул на поверхні плазматичної мембрани гепатоцитів. Подальше гіпотермічне зберігання (72 години) клітин печінки у розчинах Дюльбекко та Маршал призводить до збільшення розміру везикул. Дані літератури [Stefanovich P., 1995; Zahrebelski G., 1995; Wang S., 1996; Kuo J., 1997] вказують на те, що поява на поверхні плазматичної мембрани клітин так званих “блебсів” при різних впливах пов'язана з модифікацією білків цитоскелету та супроводжується зниженням рівня АТФ, порушенням мембранної проникності та набуханням клітин, що в подальшому призводить до їх загибелі [Herman B., 1990; Zahrebelski G., 1995].

Рис. 1. Життєздатність ізольованих гепатоцитів у різних розчинах (4*С). 1 - СМР; 2 - UW; 3 - Маршал; 4 - Дюльбекко. М*m, n=7-12.

Рис. 2. Об'єм гепатоцитів при зберіганні в різних розчинах (4*С); 1 - контроль, 2 - 24-, 3 - 48-, 4 - 72 години зберігання; М*m, n=7-12 (* - р<0.01 відносно до контролю; ** - р<0.01 відносно до періоду 24 годин у відповідному розчині).

Дещо інша картина спостерігається при гіпотермічному зберіганні ізольованих гепатоцитів у середовищах, що містять такі непроникаючі у клітину компоненти як сахароза, альбумін (СМР) та лактобіонат (UW). Холодове зберігання ізольованих клітин в СМР не призводить до зміни їх об'єму протягом усього періоду (рис. 2). Збереження гепатоцитів на кінець консервуючого періоду (72 години) складає більше ніж 60 % (рис. 1). При гіпотермічному зберіганні ізольованих гепатоцитів у розчині UW після 48 годин спостерігається збільшення об'єму клітин. Життєздатність при цьому залишається на рівні, більшому за 50%. На кінець періоду консервування (72 години) в даному розчині життєздатність клітин печінки знижується до 25±3%. Протягом усього періоду зберігання гепатоцитів у розчинах СМР та UW не спостерігається формування везикул на плазматичній мембрані життєздатних клітин.

Так, вивчені розчини за ефективністю збереження проникності плазматичної мембрани, об'єму та форми (формування везикул на плазматичній мембрані) ізольованих гепатоцитів при тривалому гіпотермічному зберіганні розподілились таким чином: СМР®UW®Маршал®Дюльбекко.

Вплив силібора на збереження ізольованих гепатоцитів в умовах 4°С у різних середовищах. Додавання силібора у СМР та інші середовища (Дюльбекко, UW) сприяло збереженню життєздатності суспензії ізольованих клітин за період гіпотермічного консервування (рис. 3). Більш того, присутність силібора в розчині Дюльбекко перешкоджала утворенню великих везикул на поверхні плазматичної мембрани протягом 48 годин зберігання. Додавання силібора у розчин UW попереджало збільшення об'єму клітин, яке відбувалося при холодовому зберіганні гепатоцитів без препарату. Як випливає з літературних джерел [Венгеровский А.И., 1988; Гордиенко А.Д.; 1990, Rauen U., 1997, 1998], механізм дії гепатопротектора силібора на мембранні структури клітин є набагато складнішим і не обмежується його антиоксидантними властивостями. Тому додавання силібора в усі досліджувані розчини значно знижує пошкоджуючу дію гіпотермії, що сприяє пролонгуванню термінів холодового зберігання гепатоцитів.

Рис. 3. Вплив силібора на життєздатність ізольованих гепатоцитів при зберіганні (4*С) у різних розчинах: 1 - СМР+силібор, 2 - СМР, 3 - UW+силібор, 4 - UW, 5 - Дюльбекко+силібор, 6 - Дюльбекко; М*m, n=5-10.

Енергетичний стан ізольованих гепатоцитів при тривалому гіпотермічному зберіганні. Контрольний рівень дихальної активності свіжовиділених гепатоцитів (V_енд=20.0±1.1, V_сук=25.6±0.7, V_р=41.6±4.8 нмоль О2/хв/106 клітин) та вміст АТФ (19±2.3 нмоль/10⁶ клітин) свідчать про те, що мітохондрії у складі свіжовиділених гепатоцитів характеризуються інтактністю електронтранспортного ланцюга та здатні утилізувати субстрати окислення. В умовах гіпотермічного зберігання ізольованих гепатоцитів у розчині Дюльбекко через 24 години спостерігається зниження рівня ендогенного та відокремленого дихання, а також вмісту АТФ відносно до контрольних значень (рис. 4, табл. 1) Коефіцієнт стимуляції дихання сукцинатом на даний період зберігання складає 2.12, що значно вище припустимого рівня та вказує на порушення проникності плазматичної мембрани гепатоцитів. При гіпотермічному зберіганні ізольованих клітин печінки в розчинах СМР та UW ендогенне дихання та вміст АТФ достовірно не змінюються протягом 48 годин (рис. 4, табл. 1).

Рис. 4. Зміна рівня АТФ (% від контролю) суспензії ізольованих гепатоцитів при зберіганні (4*С): 1 - контроль, 2 - 24-; 3 - 48-; 4 - 72 години зберігання. М*m, n=5-6. (* - p<0.01 відносно до контролю).

Зниження ендогенного дихання та рівня АТФ спостерігається через 72 години зберігання гепатоцитів у зазначених консервуючих розчинах. За даними “сукцинатного тесту” порушення проникності плазматичної мембрани виявляється через 48 годин зберігання клітин печінки в розчині UW і через 72 години у СМР (табл. 1). Дослідження енергетичного стану ізольованих гепатоцитів в період тривалого гіпотермічного зберігання у середовищах різного складу вказують на те, що при їх консервуванні у розчинах СМР та UW, в умовах пригнічення осмотичного набухання клітин досягається збереження енергетичних параметрів протягом 48 годин на відміну від середовища Дюльбекко.

Стан процесів перекисного окислення ліпідів у період зберігання ізольованих гепатоцитів при 4°С. При тривалому гіпотермічному зберіганні (48 годин) ізольованих гепатоцитів у СМР та СМР+силібор не спостерігається збільшення вмісту дієнових кон'югатів (ДК), малонового диальдегіда (МДА), а також зниження активності глютатіонредуктази (ГР) (табл. 2).

Таблиця 1 - Дихальна активність гепатоцитів у період холодового зберігання в середовищах різного складу (нмоль O₂ /хв/10 ⁶ клітин; М±m, n=5-6).

Розчини	Досліджувані параметри	Термін зберігання (4°С)
		24 години	48 годин	72 години
Дюль-бекко	Ендогенне дихання	15.71.0 µ	11.00.5* ·	9.90.5* ·
	Дихання після додання сукцинату	33.32.4 µ	36.24.7 µ	46.85.7 *
	Дихання після додання відокремлювача ДНФ	23.51.5 *	12.81.4 *	9.62.0 *
	Vсук/Vенд	2.1	3.3	4.7
	Vр/Vенд	1.5	1.2	0.9
	Ендогенне дихання	16.81.4	16.50.3	14.10.8 *
СМР	Дихання після додання сукцинату	23.11.4	23.83.5	27.21.3
	Дихання після додання відокремлювача ДНФ	28.62.1 µ	25.93.8 µ	17.61.2 *
	Vсук/Vенд	1.4	1.4	1.9
	Vр/Vенд	1.7	1.6	1.2
UW	Ендогенне дихання	18.21.5	17.80.6	13.40.8 *
	Дихання після додання сукцинату	20.41.6	34.93.8 µ	32.03.2 µ
	Дихання після додання відокремлювача ДНФ	33.52.8	24.93.7 µ	14.41.0 *
	Vсук/Vенд	1.1	2.0	2.5
	Vр/Vенд	1.8	1.4	1.1

Примітки: 1. µ - р<0.05 відносно до контрольного рівня;

2. * - р<0.01 відносно до контрольного рівня;

3. · - р<0.01 відносно до Vенд. гепатоцитів у СМР и UW на

відповідному етапі зберігання.



Таблиця 2 -Зміна вмісту продуктів ПОЛ (нмоль/10 ⁶ клітин) та активності глютатіонредуктази (нмоль НАДФН/хв/10 ⁶ клітин) в ізольованих гепатоцитах у період гіпотермічного зберігання (М±m, n=5-6).

Розчини	Термін збері-гання, 4°С	Рівень МДА	ДК	ГР
		початковий	спонтан-ний	аскорбат-індук.	НАДФН-індук.
Контроль	30 хв.	0.240.03	0.290.03	1.070.12	4.000.45	0.270.04	5.631.14
СМР	24 год.	0.230.02	0.390.04	0.960.10	3.360.4	0.250.02	4.700.50
	48 год.	0.260.03	0.470.05	1.260.17	5.040.66	0.260.07	4.000.70
	72 год.	0.370.05	0.500.08	2.710.31	6.500.78	0.390.07	2.100.54
	96 год.	0.720.08	1.120.13	4.120.46	8.301.00	0.770.09	1.960.45
СМР+силібор	24 год.	0.260.03	0.370.05	0.490.05	0.980.10	0.240.03	4.030.34
	48 год.	0.330.03	0.370.04	0.750.12	1.500.29	0.240.03	4.260.69
	72 год.	0.400.05	0.400.05	1.370.15	3.020.33	0.290.02	2.040.22
	96 год.	0.490.05	0.650.08	2.760.32	4.350.51	0.440.03	2.010.31

Примітки: 1. - р0.05 відносно до контролю;

2. - р0.05 відносно до відповідного періоду зберігання у СМР.

По завершенні наступної доби зберігання (72 години) відбувається зниження активності глютатіонредуктази та збільшення вмісту МДА в індукованих (аскорбат- та НАДФН-) реакціях ПОЛ. Через 96 годин зберігання клітин печінки у СМР та СМР+силібор спостерігається збільшення вмісту ДК та МДА в усіх досліджуваних реакціях ПОЛ, який є значно нижчим у СМР+силібор. Ефективність сахарозомісткого середовища по відношенню до вивчених показників можна пояснити насамперед тим, що такі слабопроникаючі компоненти як сахароза (0.25 М) та альбумін запобігають набуханню клітин. Окрім того, альбумін є інгібітором фосфоліпазного процесу [Сороковой В.И., 1975], а наявність Са²⁺ (1.2 мМ) у даному середовищі пригнічує збільшення вмісту МДА. Поєднаний вплив зазначених компонентів даного розчину запобігає зміні мембран гепатоцитів під впливом процесів перекисного окислення ліпідів протягом 48 годин гіпотермічного зберігання.

Зміна рівня АТФ в тканині печінки у період зберігання при 0-4°С. При гіпотермічному зберіганні цілої печінки щурів в подібних експериментальних умовах спостерігається інша динаміка зміни метаболічних параметрів. В умовах холодового зберігання печінки щурів у середовищах різного складу (СМР, СМР+силібор, UW, Маршал) вже через 24 години відбувається зниження рівня АТФ у тканині - до 50-60 % від контролю (рис. 5). На кінець періоду консервування (72 години) печінки в усіх вивчених розчинах вміст АТФ залишався на рівні 25-15 %. Зниження вмісту АТФ у печінці може бути результатом порушення мітохондріальної функції гепатоцитів у складі органу, оскільки було показано зниження функції мітохондрій через 24 години зберігання печінки в розчинах Євро-Колінз [Lambote L., 1978], Маршал [Summut I., 1995] та UW [Kim J., 1992]. Згідно з пропозицією цих авторів, зниження функції мітохондрій пов'язане з розрізнюючою дією на процеси окислювального фосфорилювання вільних жирних кислот, збільшення яких у період холодового зберігання викликано активацією фосфоліпаз.

Стан процесів перекисного окислення ліпідів у тканині печінки в умовах зберігання органу при 0-4°С. При зберіганні печінки в розчині Маршал через 24 години спостерігається збільшення вмісту дієнових кон'югатів, через 72 години зберігання - МДА в початковій реакції ПОЛ (табл. 3).



Рис. 5. Вміст АТФ у тканині печінки в період зберігання (4*С) у різних консервуючих розчинах (% від контролю). 1 - контроль; 2 - 24-; 3 - 48-; 4 - 72 години зберігання; * - p<0.01, ** - p<0.05 відносно до контрольного рівня; (М*m, n=6-7)

Таблиця 3 - Зміна вмісту продуктів ПОЛ (нмоль/г тканини) та активності глютатіонредуктази (нмоль НАДФН/хв/г тканини) у тканині печінки в період гіпотермічного зберігання у розчинах різного складу (М±m, n=5-9).

Розчини	Термін зберігання	Рівень МДА	ДК	ГР
		початковий	спонтан-ний	аскорбат-индук.
Контроль	30 хв.	16.42.0	18.82.4	32.24.5 §	22.52.4	43.96.3
СМР	24 год.	18.61.3	19.52.0	34.95.0 §	20.71.2	414.6
	48 год.	18.41.7	20.20.7	30.33.4 §§	16.92.03	40.05.3
	72 год.	17.23.1	19.33.5	37.64.8 §§	19.71.5	25.33.5
СМР+силібор	24 год.	20.23.0	22.42.6	26.84.8	25.22.1	385.6
	48 год.	17.02.6	17.03.1	32.74.9	21.71.8	29.43.6
	72 год.	15.82.1	15.92.6	34.57.4	25.31.1	29.53.2
UW	24 год.	16.81.8	21.62.5	34.03.3 §	23.82.5	21.73.8
	48 год.	19.21.6	24.52.4	35.59.3 §§	18.31.2	23.34.3
	72 год.	19.22.4	21.42.9	31.02.0 §	18.60.7	23.11.4
Маршал	24 год.	20.42.3	21.42.2	35.57.4 §§	29.31.9	25.33.0
	48 год.	20.22.0	20.42.0	30.86.7	19.32.8	18.92.8
	72 год.	23.12.1	22.01.7	28.43.4	20.91.1	9.61.98 µ

Примітки: 1. - р0.05 відносно до контрольного рівня;

2. - р0.05 відносно до періоду зберігання в СМР;

3. µ - р0.05 відносно до відповідного значення в СМР, СМР+силібор та UW;

4. § - р0.01 відносно до початкового рівня ПОЛ;

5. §§ - р0.05 відносно до початкового рівня ПОЛ.

Паралельно до збільшення вмісту продуктів ПОЛ у тканині печінки відбувається зниження активності глютатіонредуктази через 24 години зберігання органу в розчині Маршал з наступним її зниженням під кінець періоду консервування (табл. 3). В умовах гіпотермічного зберігання печінки у розчинах СМР, СМР+силібор та UW не спостерігається збільшення вмісту дієнових кон'югатів та МДА в усіх реакціях ПОЛ (початкова, спонтанна, аскорбат-індукована) протягом усього періоду консервування. Причому на всіх етапах зберігання у розчинах СМР та UW додаткова індукція ПОЛ аскорбатом викликала збільшення накопичення МДА, як і в контрольних зразках. Це може вказувати на збереження систем регуляції процесів ПОЛ. Однак у даних умовах зберігання органу ферментативна антиокислювальна система печінки виявилася більш чутливою до впливу гіпотермії: зниження активності глютатіонредуктази відбувається після 24 годин зберігання у розчині UW та через 72 години у СМР (табл. 3).

Одержані дані дозволяють зробити висновок, що в умовах тривалого зберігання печінки при 0-4°С у консервуючих розчинах СМР, СМР+силібор та UW можливе запобігання активації процесів перекисного окислення ліпідів. Це пояснюється наявністю в розчині UW відновленого глютатіону (виявляє захисну дію від пошкодження перекисями ліпідів), а у СМР - альбуміна та Са²⁺ (1.2 мМ).

Активність цитозольних амінотрансфераз у перфузаті печінки після гіпотермічного зберігання. При дослідженні активностей амінотрансфераз (АсАТ та АлАТ) у перфузаті після короткострокової холодової реперфузії печінки, яка слідує за гіпотермічним зберіганням органу було показано, що в усіх вивчених розчинах із збільшенням часу зберігання відбувається підвищення активності зазначених ферментів (рис. 6). Активність АлАТ у перфузаті печінки є достовірно нижчою при холодовому зберіганні органу у СМР та СМР+силібор, ніж у розчинах UW та Маршал на всіх періодах консервування (рис. 6). При зберіганні органу у розчині UW активність АлАТ є достовірно нижчою, ніж у розчині Маршал після 24-, 48- та 72-ох годин. Активність АсАТ в перфузаті печінки після кожного періоду гіпотермічного зберігання змінювалась подібним чином. Ці дані відображають процеси пошкодження мембранних структур органу, що відбуваються в період тривалого холодового зберігання. Вони також дозволяють зробити висновок, що перерозподілення зазначених ферментів після періоду тривалого гіпотермічного консервування органу істотно залежить від консервуючого розчину, які за ефективністю розподілились у такому порядку: СМР=СМР+силібор®UW®Маршал.

Рис. 6. Зміна активності АлАТ в перфузаті печінки в період зберігання (4°С) у різних розчинах. 1 - 3-, 2 - 24-, 3 - 48-, 4 - 72 години. Об'єм перфузата 15 мл. М±m, n=5-6 (* - p<0.01 відносно до контролю; ** - p<0.01 відносно до відповідного періоду зберігання печінки у СМР та СМР+силібор; · - відносно до відповідного періоду зберігання клітин у розчині UW)



ВИСНОВКИ

У дисертації представлено експериментальне узагальнення та нове вирішення наукової проблеми, що стосується змін деяких морфологічних параметрів, енергетичного стану та процесів перекисного окислення ліпідів ізольованих гепатоцитів та цілої печінки щурів в умовах тривалого гіпотермічного зберігання у розчинах різного складу. Одержані в роботі дані свідчать про те, що подальше вивчення та застосуванння сахарозомістких розчинів для гіпотермічного зберігання ізольованих гепатоцитів та цілої печінки є більш перспективним.

Збереження життєздатності, об'єму та вірогідність утворення везикул на плазматичній мембрані ізольованих гепатоцитів щурів, а також енергетичного стану та процесів перекисного окислення ліпідів в ізольованих клітинах та цілій печінці в умовах гіпотермічного зберігання істотно залежить від складу консервуючого розчину. Необхідною є наявність у консервуючому середовищі непроникаючих у клітину компонентів (лактобіонат, сахароза, альбумін) для пригнічення набухання.

Застосування консервуючих розчинів СМР та UW для тривалого гіпотермічного консервування ізольованих гепатоцитів дозволяє зберегти ендогенне дихання та рівень АТФ незмінними протягом 48 годин на відміну від сольового середовища Дюльбекко.

При гіпотермічному зберіганні ізольованих клітин печінки у СМР не спостерігається активація процесів перекисного окислення ліпідів протягом 48 годин. Протягом 72 годин зберігання гепатоцитів у даному консервуючому розчині кількість клітин з незмінним об'ємом та поверхнею плазматичної мембрани залишається на рівні, більшому за 60 %.

Введення силібора в усі досліджувані розчини сприяє збереженню життєздатності ізольованих гепатоцитів у період гіпотермічного консервування. Силібор також пригнічує процеси перекисного окислення ліпідів у сахарозомісткому розчині.

В умовах холодового зберігання ізольованої печінки в розчинах СМР, Маршал та UW спостерігається достовірне зниження рівня АТФ через 24 години.

При гіпотермічному зберіганні печінки в розчині Маршал відбувається збільшення вмісту дієнових кон'югатів через 24 години, МДА - через 72 години, що не спостерігається при холодовому консервуванні печінки у розчинах СМР, СМР+силібор та UW.

Солюбілізація цитоплазматичних ферментів (АсАТ та АлАТ) у перфузат при короткостроковій холодовій реперфузії печінки, яка слідує за гіпотермічним зберіганням органу в різних консервуючих середовищах, збільшується у такій послідовності: СМР=СМР+силібор®UW®Маршал.



ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Kravchenko L., Andrienko A., Belous A., Shanina I. Long-term storage of isolated liver cells at hypothermia // Cryo-Letters. - 1994. - V. 15, № 3. - P. 135-145.

Кравченко Л.П., Белоус А.М., Шанина И.В. Влияние гипотермии на некоторые биохимические показатели изолированных гепатоцитов // Укр. биохим. журн. - 1994. - Т. 66, № 4. - С. 108-113.

Кравченко Л.П., Шанина И.В., Белоус А.М. Эффективность силибора при гипотермическом хранении изолированных гепатоцитов // Проблемы криобиологии. - 1996. - № 3. - С. 41-44.

Shanina I., Kravchenko L. Metabolic properties of isolated rat hepatocytes after long-term storage at 4°C // Проблемы криобиологии. - 1997. - - № 4. - С. 66-68.

Кравченко Л.П., Белоус А.М., Шанина И.В. Длительное холодовое хранение печени в системе in vivo и in vitro // Проблемы криобиологии. - 1998. - -№ 3. - С. 39-41.

Shanina I., Kravchenko L., Sampson V. Efficiency of the sucrose-containing solution on the cold prеservation of whole liver // Cryo-Letters. - 1998. - V. 19, № 4. - P. 231-236.

Кравченко Л.П., Білоус А.М., Шаніна І.В. Спосіб консервування печінки тварин // Патент України № 236223Л А 01 №1/02. - 2.08.98. - Бюл. № 4.

Belous A., Kravchenko L, Sukach A., Zemlyanskikh N., Shanina I. Semenchenko O. Investigation of the properties of rat hepatocytes following temperature-osmotic exposure // International meeting University of Leuven. - Leuven, Belgium. - 1994. - P. 24.

Fuller B., Kravchenko L, Cheethan K., Shanina I. Using the sucrose solution for cold storage of isolated hepatocytes in culture // 31st Annual Meeting of Society for Cryobiology. - Kioto, Japan, 1994. - P. 198.

Кравченко Л.П., Шанина И.В., Белоус А.М. Эффективность сахарозо-содержащих растворов при холодовом хранении (0°С) целой печени крыс // 1-й зїзд трансплантологів України "Сучасні проблеми клінічної та експериментальної трансплантології". - 1995. - С. 109-110.

Шанина И.В., Кравченко Л.П., Белоус А.М Исследование влияния ряда фармакологических препаратов на сохранность изолированных гепатоцитов в условиях 4°С // 1-й з"їзд Українського товариства кріобіології і кріомедицини. Тези доповiдей. - Харків. - 1995. - С. 279-281.

Kravchenko L., Shanina I. Effect of sucrose-containing solution in rat liver preservation model in vivo // 6th International conference on tissue banking, -Edinburg, Scotland.- 1997. - P. 30.

Shanina I., Kravchenko L. The state of antioxidant system of isolated hepatocytes under conditions of hypothermic storage // 35th Annual Meeting of Society for Cryobiology. - Pensylvania, USA. - 1998. - P. 156.

Shanina I., Sukach A., Kravchenko L. Action of silibor and calcium on survival of hepatocytes during hypothermic storage // The 2nd Parnas Conference. - Gdansk, Poland. - 1998. - № 12.

ізольовані гепатоцити гіпотермічне зберігання



АННОТАЦИЯ

Шанина И.В. “Гипотермическое хранение изолированных гепатоцитов и печени крыс в средах различного состава”. Рукопись. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19 - криобиология и криомедицина. Институт проблем криобиологии и криомедицины Национальной Академии Наук Украины. Харьков, 2000.

Диссертация посвящена вопросу длительного холодового (0-4°С) хранения изолированных клеток печени и целой печени крыс. В работе показано, что сохранение жизнеспособности, энергетического состояния и процессов перекисного окисления липидов в изолированных гепатоцитах и печени в условиях гипотермического хранения зависит от состава консервирующего раствора. Наличие в среде непроникающих в клетку компонентов, таких как лактобионат, сахароза и альбумин является необходимым для подавления набухания клеток. Гипотермическое хранение изолированных гепатоцитов в солевом растворе Дюльбекко в течение 24 часов вызывает увеличение объема клеток. Это сопровождается формированием везикул на плазматической мембране гепатоцитов, что не происходит в условиях хранения гепатоцитов в растворах UW и сахарозосодержащем (ССР). В период 72 часов хранения изолированных гепатоцитов в ССР сохранность клеток с неизменным объемом и поверхностью плазматической мембраны остается на уровне более 60 %. Показано, что при холодовом хранении изолированных гепатоцитов в ССР и UW уровень эндогенного дыхания и содержание АТФ достоверно не изменяются в течение 48 часов в отличие от солевой среды Дюльбекко. Установлено, что в течение гипотермического хранения изолированных клеток печени в ССР не отмечается увеличения содержания диеновых конъюгатов и малонового диальдегида, а также снижения активности фермента противоокислительной системы клеток печени - глютатионредуктазы в течение 48 часов. Добавление гепатопротектора силибора во все изученные растворы способствует сохранению жизнеспособности изолированных гепатоцитов. Введение силибора в ССР подавляет процессы перекисного окисления липидов. Эти данные позволяют утверждать, что сахарозосодержащий раствор (патент Украины) является более эффективным для длительного гипотермического хранения изолированных гепатоцитов, чем растворы UW и Маршал.

В работе установлено, что в системе изолированной печени гепатоциты являются более чувствительными к повреждающему фактору в условиях холодовой гипоксии. Показано, что при гипотермическом хранении изолированной печени в четырех консервирующих растворах (ССР, ССР с добавлением силибора, UW, Маршал) к 24 часам хранения отмечается достоверное снижение уровня АТФ. Получены результаты о том, что в условиях холодового хранения печени в растворе Маршал наблюдается увеличение содержания диеновых конъюгатов после 24 часов, малонового диальдегида после 72 часов хранения. При консервации печени в ССР и UW увеличение наконления продуктов перекисного окасления липидов не происходит. Ферментативная противоокислительная система гепатоцитов в составе целого органа является более чувствительной к воздействям, индуцированным гипотермией. Хранение изолированной печени крыс в растворах UW и Маршал вызывает снижение активности глютатионредуктазы после 24 часов хранения, в ССР - после 72 часов. В работе было показано, что солюбилизация ферментов АсАТ и АлАТ в перфузат печени после краткосрочной холодовой реперфузии, следуемой за гипотермическим хранением органа увеличивается в ряду используемых консервирующих растворов: ССР=ССР+силибор®UW®Маршал. Данные, полученные в работе позволяют утверждать что ССР является не менее эффективным раствором для гипотермического хранения изолированной печени по сравнению с раствором UW. Независимо от состава консервирующего раствора максимальным сроком гипотермического хранения изолированной печени крыс методом безперфузионного хранения является 24 часа. Это связано с резким снижение уровня АТФ к данному периоду консервации.

Полученные данные об энергетическом состоянии и процессах перекисного окисления липидов клеток печени способствуют выяснению механизмов повреждения изолированных гепатоцитов и целого органа в условиях холодовой гипоксии. Полученные результаты позволяют рекомендовать ССР для гипотермического хранения изолированных гепатоцитов и печени в экспериментальных условиях. Данная консервирующая среда может являться основой для разработки более эффективных сред для гипотермического хранения печени и других органов с целью экспериментального и клинического использования.

Ключевые слова: гипотермическое хранение, изолированные гепатоциты, изолированная печень, консервирующие растворы, жизнеспособность, везикулы, дыхательная активность, уровень АТФ, перекисное окисление липидов, активность АлАТ и АсАТ.

Шаніна І.В. “Гіпотермічне зберігання ізольованих гепатоцитів та печінки щурів у розчинах різного складу”. Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія і кріомедицина. Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної Академії наук України, Харків, 2000.

Дисертація присвячена питанню тривалого холодового (0-4°С) зберігання ізольованих гепатоцитів та цілої печінки. Показано, що збереження морфологічних та метаболічних параметрів ізольованих гепатоцитів та печінки в умовах гіпотермічного зберігання залежить від складу консервуючого розчину. Встановлено, що сахарозомісткий розчин забезпечує збереження життєздатності об'єму, енергетичного стану та процесів перекисного окислення ліпідів ізольованих гепатоцитів протягом 48 годин. Вперше показано, що в умовах гіпотермічного зберігання цілої печінки щурів у СМР досягається найменший вихід амінотрансфераз у перфузат при холодовій реперфузії органу у порівнянні з розчинами Маршал та UW. Встановлено, що в системі ізольованої печінки гепатоцити є більш чутливими до пошкоджуючих факторів в умовах холодової ішемії. Показано, що в умовах пригнічення набухання ізольованих клітин та органу первинним є порушення енергозабезпечення клітин.

Ключові слова: гіпотермічне зберігання, ізольовані гепатоцити, ізольована печінка, консервуючі розчини, життєздатність, везикули, дихальна активність, рівень АТФ, перекисне окислення ліпідів, активність АлАТ та АсАТ.

Shanina Irina V. “Hypothermic storage of rat isolated hepatocytes and liver under different solution composition ”. Manuscript. Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences on the speciality 03.00.19 - cryobiology and cryomedicine. Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, 2000.

Thesis is devoted to the problem of long term cold (0-4°C) storage of isolated hepatocytes and whole liver. It has been shown that the maintenance of morphological and metabolic parameters of isolated hepatocytes and liver under hypothermic storage depends on the composition of the preservation solution. It has been established that sucrose-based solution provides the integrity of viability, volume, energetic state and lipid peroxidation processes of isolated hepatocytes within 48 hrs of hypothermic storage. First it has been demonstrated that under hypothermic storage of rat whole liver in sucrose-based solution the least aminotransferase output into perfusate during organ cold reperfusion in comparison with Marshall's and UW solutions is achieved. It has been established that the hepatocytes are more susceptible to damaging factors under cold ischemia in the system of isolated liver. It has been shown that under oedema suppression of isolated hepatocytes and organ the disturbance of cell energetic providing is an initial one.

Key words: hypothermic storage, isolated hepatocytes, isolated liver, preservation solutions, viability, vesicles, respiration activity, ATP level, lipid peroxidation, activity ALT and AST.

Размещено на http://www.allbest.ru/

...