Бiохiмiчнi особливостi поверхневих лiпiдiв листя хвойних (Coniferae)

Размещено на http://www.allbest.ru

КИІВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

03.00.04 - Бохмя

Автореферат дисертацї на здобуття наукового ступеня

кандидата бологчних наук

Бiохiмiчнi особливостi поверхневих лiпiдiв листя хвойних (Coniferae)

Берзеніна Оксана Валерiiвна

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Дніпропетровському державному університеті

Міністерства освіти України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, Штеменко Наталія Іванівна,

завідувач кафедри біофізики та біохімії Дніпропетровського

державного університету.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Стародуб Микола Федорович,

завідувач відділу біохімії сенсорних та регуляторних систем Інституту

біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України.

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Оканенко

Олександр Аркадійович, старший науковий співробітник кафедри

фізіології та екології рослин, Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Провідна установа Чернівецький державний університет ім. Ю. Федьковича, кафедра біохімії та експериментальної екології, м. Чернівці.

Захист дисертації відбудеться 29 червня 2000 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.26.001.24 при Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м.Киів, проспект Глушкова, 2, корп. 12, біофак, ауд.215. Поштова адреса: Київ, 01033, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Київського національного універсітету імені Тараса Шевченка (м. Київ, вул. Володимиірська, 58)

Автореферат розісланий “29” травня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради, професор О.В. Брайон

Актуальнсть проблеми. Поверхнев лпди (ПЛ) листя рослин є позаклтинним гiдрофобним шаром, бохмчним барєром, який забезпечує пасивну стйксть рослинного органзму та є першою точкою контакту рослин з навколишнм середовищем. Вивчення бохмє ПЛ є напрямком який розкриває бохмчн основи стйкост рослинних органзмв. ПЛ є сумiшшю складних ефiрiв (воскiв), алканів, алканолів та iнших сполук з вуглеводним радикалом значноє довжини (С13- С36) (Blaker 1988, Bianchi 1987-1989, Prasad 1990, Gulz 1992, Maloney 1998).

Вважється, що найважливішими функцiями ПЛ є захист рослини вiд УФ-випромiнювання, проникнення гiдрофльних токсикантiв та патогенiв (Jenks 1995). Вивчення складноє гетерогенноє сумiші ПЛ потребує розробки нових пiдходiв з використанням сучасних спектральних та хроматографчних методiв. Цим можна пояснити невелику кiлькiсть вивченних видiв рослин та вiдсутнiсть узагальнюючих робт, присвячених закономiрнiстям формування епiкутикулярного гiдрофобного шару. Знання про механiзми бiосинтезу компонентiв ПЛ обмежен (Kollatukudy 1973-1987, Baker 1982) та носять дискусійний характер. В той же час, питання про функцiональне значення бiосинтезу близьких за структурою сполук, часто гомологiчних, є одним iз найбiльш нтригуючих проблем бiохiмiє (Судьина 1981). До найбiльш актуальних аспектв вивчення ПЛ вiдносяться питання родових та видоспецифiчних особливостей складу ПЛ, iснування закономiрностей формування ПЛ в процес розвитку хвоє, зв'язку складу ПЛ з газостiйкiстю та iншими видами стiйкостi рослин. Значна екологчна пластичнiсть хвойних та повязанний з нею широкий ареал єх розповсюдження робить цi рослини найбiльш зручним обєктом для вивчення бiохiмiчних основ барєрноє функцiє ПЛ, з одного боку, а їх здатнiсть створювати значну бiомасу в умовах непридатних для бiльшостi дерев робить хвойні цікавими як джерело лiпiдних компонентiв, що можуть використовуватись в практицi.

Оскiльки епiкутикулярний шар рослин є ункальним джерелом довголанцюгових молекул, як потребують вд організму значних енертичних витрат, повязанних з елонгацєю вуглеводневого ланцюга та секреторними механізмами, актуальною є також проблема препаративного видiлення та хiмiчноє модфкацє ПЛ з метою іх практичного використання.

Мета та основні завдання дослдження. Метою даноє роботи було:

- розробити методичн пдходи до вивчення поверхневих лiпiдiв рослин, як дають можливсть виявити бiохiмiчнi особливост формування поверхневих лiпiдiв листя хвойних та здйснити препаративне видiлення компонентiв;

виявити бiохiмiчнi особливост процесу формування поверхневих лiпiдiв хвоє та основнi бiосинтетичнi напрямки, якi активн в ПЛ хвоє.

вивчити динаміку накопичення ПЛ

Основними задачами роботи було:

1. Вивчити поверхнев лiпiди листя хвойних спектральними методами, методом газо-рдинноє хроматографє вуглеводнiв та метилових ефiрiв жирних кислот гiдролізатiв сумарноє фракцє, методом диференцйного термiчного аналзу та функцiонального аналзу.

2. Виявити родовi та видоспецифiчнi особливост процесiв бiосинтезу вуглеводнiв та жирних кислот в ПЛ хвоє.

3. Запропонувати схему напрямків бiосинтезу компонентiв поверхневих лiпiдiв, активних в процесi розвитку хвої рослин.

4. Розробити метод отримання вищих жирних кислот з листового опаду хвойних.

Наукова новизна, теоретична та практична цінність роботи. Розроблено методичний пдхд, який включає дослдження сумарноє фракцє ПЛ листя рослин спектральними та хроматографічними методами, методом функцiонального та диференцйного термiчного аналiзу, газо-рдинноє хроматографє метилових ефiрiв жирних кислот гiдролізатiв сумарноє фракцє. Розроблений пiдхiд дозволив встановити родов та видоспецифічнi особливостi процесу бiосинтезу основних компонентiв поверхневих лiпiдiв, активних в процес розвитку хвоє рослин. Розроблено метод одержання вищих жирних кислот з опаду листя на основ отриманих даних про динамку накопичення жирних кислот в ПЛ хвойних.

Результати проведених дослджень дозволяють глибше зрозумти звязки мж хiмiчним складом поверхневих лiпiдiв листя рослин рзного вку та формуванням гiдрофобного бiохiмiчного барєру, здатного захистити фотоcинтетичний апарат вд зовншнього впливу. Зроблен спостереження та висновки значно розширюють уявлення про механзми функцiонування рзних бiоcинтетичних процесiв в ПЛ листя рослин.

Звязок роботи з науковими програмами, планами, темами. Ця робота є частиною дослджень, як проводяться кафедрою бiофзики та бiохiмiє Днпропетровського держунверстету за темою: “Дослдження механзмiв змнност лiпiдiв рослин та розробка бiохiмiчних основ отримання речовин лiпiдноє природи з рослинноє сировини”, як входять в координацйний план №15 Мносвiти Украєни.

Особистий внесок здобувача. В процес виконання дисертацйноє роботи автором вивчено та проаналзовано наукову лтературу за темою дослдження. Дисертантом розроблено програму проведення експериментiв та пдбрані методи ршення поставлених задач. Дослiдження складу поверхневих лiпiдiв хвоє частково проводились в спвпрац з спвробтниками НДI бiологє ДДУ, кафедри бiофзики та бiохiмiї ДДУ та кафедри неорганчноє хмє УДХТУ, якi є спвавторами наукових праць здобувача. Обговорення та аналз результатiв дослджень проведен з науковим керiвником.

Апробаця роботи. Матерали дисертацє доповдались на XIII мжнародному конгрес захисту рослин (Гаага, Ндерланди, 1995), Мжнародній конференцє “Стйкий розвиток: забруднення навколишнього середовища та екологічна безпека” (Днпропетровськ, 1995), ІV мжнародному симпозум “Реакцє рослинного метаболзму на атмосферне забруднення та глобальн змни” (Ндерланди, 1997), VII Украєнському бохмчному зєзді (Києв, 1997), Мжнародноє конференцє з екотоксикологє (Анталя, Туреччина, 1998).

Публкацї. Основн положення роботи опублкован в 10 наукових роботах, з яких 6 статей.

Структура та обєм роботи. Дисертаця складається з вступу, огляду лтератури, експериментальноє частини, результатiв обговорення, висновкiв та списку лтератури, який включає 174 найменування. Робота викладена на 133 сторнках друкованого тексту та включає 18 рисункiв, 19 таблиць.

Матерали та методи дослджень.

Обєктами дослджень були окрем дерева 6 видiв: Picea abies L. Karst., Picea pungens Engelm., Pinus pallasiana D. Don., Pinus sylvestris L., Pinus nigra Arnold., Larix sibirica Ledeb., як зростають на територє Ботанчного саду Днпропетровського держунверситету. Вдбр хвоє проводився в перод активноє вегетацє протягом 3-х рокв (1994-1997). Вивчалась хвоя рзного вiку (першого, другого та третього років), яку збирали з середнього ярусу пвденно-схдного боку крони. Експерименти проводились в 3 - 4 бiологічних повторах.

Спектри поглинання в УФ-област знмали в гексанових розчинах на спектрометр Speсord M-40 (Німеччина) в 0.2; 0.5 або 1-сантиметрових кюветах, концентраця розчинiв 0.013-0.3%. Інфрачервон спектри вивчали на спектрометрі Speсord UR-20 у виглядi суспензє речовин в вазеліновому масл на оптичному скл з бромду кальцю .

Вуглеводні аналiзували в екстрактах псля випаровування алквоти на газо-рдинному хроматограф "Сhrom-5"(ЧССР) з полум'яно-онзацiйним детектором. Використовували скляну спіральну колонку розмром 2.5м х 0.4 см, заповнену 5% SP- 2100 на Chromaton N-Super 80-100 меш. Температура детектора та введення проби 2500 С, температура термостата програмувалась вiд 1500 до 2500 С з швидкстью 50С/хв. Швидксть газу-нося (геля) 40 мл/хв. Ідентифкацiю проводили порвнянням з часом утримання маркера - н-доктриоконтанолу.

Гiдроліз сумарних ПЛ, реекстракцiя та виявлення двох лiпiдних фракцiй - неацильних речовин та жирних кислот - проводили за Кейтсом (1975).

Cинтез нтрозометилсечовини, виготовлення розчину дазометану та метилювання жирних кислот проводили за Физер (1971). Газо-рдинну хроматографю жирних кислот проводили за методами Руденко (1971) та Шаршуновоє (1980). Розділення жирних кислот проводили у вигляд єх метилових ефрiв. Хроматографічне роздлення сумiш метилових ефiрiв жирних кислот проводили двома методами:1) розділення на неполярних силконових еластомерах типу SP-2100 та в режим, описаному вище для вуглеводнiв; 2) роздлення на полярних носях на скляних колонках 2,5 х 0,4 см, заповнених 15% Reoplex 400 на Chromaton N-Super 0,125-0,160 меш або 10% ПЕГС на Chromosorb P 80-100 меш при ізотермчному режим при температур термостату 2000С та температур камери випаровування 2500С. Ідентифкацiю вищих жирних кислот виконували за допомогою стандартних сумiшей метилових ефiрiв жирних кислот та окремих жирних кислот виробництва фрми Serva Feinbiochemica Heidelberg.

Диференцiйний термчний аналiз (ДТА) зразкiв проводили на дериватографі системи Паулк-Паулк-Ердей (Paulik 1987) марки Q-1500 D (МОМ) в динамчному режим в умовах звичайного теплообмну в интервал температур 10-5000С, з швидкстю нагрвання 100/хв., еталон - Al2O3, при мас зразкiв 0,1г та реєстрацiєю кривих диференцiйного термiчного аналiзу з максимальною чутливстю.

Присутнсть оксосполук (альдегидiв та кетонiв) перевряли за реакцiєю з 2,4-динтрофенлгдразином псля розчинення сумарних ПЛ в етанол (Органікум 1979). Статистичне опрацювання результатів експериментів проводили за Лакіним (1980)

Основн результати дослдження.

Обгрунтування рацiональност обраних методiв дослдження. На основ огляду методiв екстракцiї, був вибраний методичний підхід, приводиться обгрунтування вибору розчинника та умов екстракцiє, яка призводить до вичерпноє екстракцiє ПЛ та в той же час не впливає на внутршньоклтинн лiпiди, приводиться також критичний аналiз методу тонкошаровоє хроматографє та УФ-спектроскопє, які не дозволяють виявити родовi та видоспецифчнi особливостi. В той же час показана нформативнсть ІЧ-спектроскопє для вивчення ПЛ рослин. Складнi ефiри, жирн кислоти та iншi сполуки, якi мiстять карбонiльну групу та знаходяться в склад ПЛ, проявляються в ІЧ-спектр у виглядi характеристичних смуг карбонiльного поглинання в област 1705 - 1750 см-1.

Використана нами модифікацiя ПЛ за Кейтсом дозволила провести повний аналiз жирнокислотного складу фракцiє лiпiдiв та вперше показати наявнсть значноє клькст жирних кислот з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю в ПЛ хвоє. Нами вперше показано можливсть використання методу диференцiйного термiчного аналiзу для визначення онтогенетичних та видоспецифічних закономрностей формування ПЛ листя рослин за показниками ендотермічних переходів ПЛ.

Родов та видоспецифчнi особливостi поверхневих лiпiдiв хвої першого року. Склад карбонiльних сполук ПЛ листя хвойних є родоспецифічним, про що свдчать рзні спввдношення смуг поглинання карбонiльних сполук (табл.1). Особливо сильно вдрзняється за цим показником P. abies.

Вуглеводні ПЛ хвоє представлен непарними та парними алканами вiд С17 до С34 (табл. 2). Превалюючим компонентом у всіх хвойних є С29-алкан.

Для того, щоб бльш яскраво показати видоспецифiчнiсть вуглеводнiв, було обрано три пiдходи:

Оцнка ступеню гетерогенност вуглеводнiв ПЛ хвоє. Значущими вважали тльк компоненти, кльксть яких перевищувала 1%, кожен такий компонент приймали за 1. Для роду Picea цей показник складає 3-6, для Pinus - 10-11, а для Larix - 14. Ступнь гетерогенност може

Таблиця 2

Склад вуглеводнів поверхневих ліпідів листя хвойних (%), вік хвої 1 рік.

бути оцінена також внеском превалюючого компоненту: для Picea 75-88%, Pinus - 18-48%, Larix - 19,24%; Узагальнюючи цi два показника, можна казати, що три роди вивчених хвойних вдрзняються за гетерогеннстю вуглеводнiв ПЛ. При цьому, враховуючи, що роди Pinus та Picea вивчен в умовах однакового фзіологчного вiку, можна сказати, що гетерогеннсть вуглеводнiв хвойних є видоспецифiчною ознакою та рд Picea характеризується меньшою гетерогеннстю, ніж рд Pinus.

Спввдношення парних та непарних компонентiв.

Обрунтовансть такого пiдходу до оцнки отриманих даних пояснюється тим, що цi компоненти, згідно даних літератури, cинтезуються рзними механзмами. Синтез парних та непарних компонентiв в ПЛ двох родiв Picea та Pinus проходить з рзною нтенсивнстю (табл.3), при цьому за клькстю непарних компонентiв рд Picea переважає рд Pinus майже в 1,5 рази. Видова специфічнсть за цим показником практично вдсутня, що особливо характерно в випадку ПЛ хвоє представникв роду Pinus.

Високомолекулярнсть компонентiв За молекулярною вагою вуглеводнiв ПЛ серед вивчених рослин вдзначається Pinus sylvestris, в ПЛ хвої якого знайдено значну кiльксть С30 - С31 алканiв. В той же час в двох нших представниках цього ж роду значноє кiлькост високомолекулярних компонентiв не знайдено. Таким чином, видоспецифiчнiсть вуглеводнiв ПЛ хвоє може бути продемонстрована з використанням такого підходу.

Для складу жирних кислот ПЛ хвоє характерна: насиченсть та значна кiлькiсть жирних кислот з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю (табл. 4).

Таблиця 4

Склад жирних кислот поверхневих ліпідів листя хвойних рослин %,

вік хвої 1 рік

Вивчен представники хвойних мають значн мжродов вдмнност за спввдношенням жирних кислот, якi входять до складу ПЛ. Так, для роду Picea характерна значна кiлькiсть жирних кислот з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю (21-34%), для Pinus - С22-жирноє кислоти (29, 36, 48%), а для Larix - тльк С22-жирноє кислоти (бiльш 90%). Якщо роди Picea та Pinus близьк за складом жирних кислот, то Larix суттєво вдрзняється можливо внаслдок ншого життєвого циклу та впливу фзиологчного вiку листя на склад ПЛ.

На основі отриманих даних та даних літератури можна припустити, що жирн кислоти з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю снуюють в ПЛ у вльному стан. Надзвичайно сильне поглинання в област 1725 см-1 ПЛ P. abies з цєє точки зору можна пояснити поглинанням валентного звязку карбонiлу гептадекановоє (С17), пентадекановоє (С15) та нонадекановоє (С19) жирних кислот в неетерифкованому стан.

Сумарн поверхневi лiпiди хвоє в процес розвитку листя. На пдстав отриманих даних очевидно, що навть для одного роду Pinus склад вуглеводнiв та жирних кислот в ПЛ однорчноє хвоє вдрзняється за молекулярною вагою. Так, для P. sylvestris характерна наявнiсть бiльш високомолекулярних жирних кислот з кiлькiстю атомiв вуглецю бльше С20 - 52% та вуглеводнiв з номером виходу вище десяти 74%, в порвнянні з ПЛ P. pallasiana 34% та 45% вдповдно.

В основі робочої гпотези було припущення, що динамка формування компонентiв ПЛ цих двох видiв вдрзняється, таким чином, снують значн вдмнност в склад ПЛ видiв Pinus sylvestris та Pinus pallasiana в процес розвитку хвоє. Дійсно нами показано, що в процес розвитку змнюється спввдношення смуг на користь смуги 1735 см-1 в ІЧ-спектрах ПЛ.

Таблиця 5.

Результати термогравіметричних дослджень поверхневих лпдв хвоє Р. sylvestris L. та P. pallasiana D.Don рзного вку.

Для P.sylvestris - вида, який характеризується бiльш високомолекулярними компонентами, ця особливсть виражена бiльш суттєво. Цi спостереження свдчать про активний cинтез або розклад карбонiлвмсних сполук (жирн кислоти в вільному стан та складнi ефiри) в процес розвитку хвоє. Для додаткового пдтвердження цєє гпотези ми застосували метод ДТА, чутливий до молекулярно-динамічних характеристик сполук та єх сумiшей. Виходячи з отриманих результатiв (табл. 5), можна констатувати наявнiсть двох низькотемпературних близько розташованих ендотермчних ефектiв (I та II).

Перший - широкий, без мнмуму в нтервал 20-500 С, а другий - гострий з чтким мнмумом в нтервал 45-800 С. Обидва ендотермчних ефекти проходять без втрати маси, що свідчить про наявнiсть фазових переходiв при цих температурах.

Базуючись на даних подібних дослджень (Reinhardt 1994) та теорє термографє (Берг 1969), можна вднести ефект I до плавлення аморфноє фази ПЛ, а II - до плавлення кристалічноє фази ПЛ.

При подальшому пiдвищен температури спостергається серя ендотермчних ефектiв з втратою маси.

З точки зору бiохiмiчних особливостей ПЛ найбiльш цкав ефекти I-II. Параметри цих ефектiв свідчать, що: 1) ПЛ листя двох вивчених рослин вдрзняються за структурно-динамчними характеристиками; для P. sylvestris характерн термiчн нтервали та максимуми переходiв при значно вищих температурах, ніж для P. pallasiana, що пдтверджується нашими попереднми даними; 2) для вивчених рослин характерн вдмнност в закономрностях формування ПЛ: якщо для P. pallasiana характерно пiдвищення молекулярноє маси компонентiв ПЛ хвоє з вком, то в P. sylvestris умовно “важк” компоненти cинтезуються ще в молодоє хвоє; 3) мжвидов вдмнност в ПЛ характерн як для аморфноє, так і для кристалічноє фази ПЛ.

Таким чином, види рослин суттєво вдрзняються один вд одного за молекулярно-динамчними характеристиками сполук, що утворюють захисний шар.

За шкалою газостйкост (Илькун 1978) цi рослини вднесен до рзних груп: P. sylvestris - до нестйких (V группа), а P.pallasiana - вдносно стйких (III группа). Вдносна стйксть другого виду може бути пояснена можливстю фазового переходу при фзологічних температурах. Наявнiсть низькотермiчного фазового переходу в ПЛ хвоє відмічена нами вперше та його фзіологчне значення ранше не обговорювалось.

Мнливість складу вуглеводнiв поверхневих лiпiдiв хвоє в процес є розвитку. Застосовуючи показник гетерогенност, який був описаний вище, спостергали, як вн змнюється в Picea з віком: P. рungens - 3, 7, 10; P. abies - 7, 9,10; в Pinus: P. pallasiana - 10,13,15; P. sylvestris - 11,14,14; P. nigra - 10, 11, 12, для першого, другого та третього років, відповідно.

Отриман результати пдтверджують ранше висловлене припущення про те, що ступнь гетерогенност вуглеводнiв ПЛ хвоє зростає в процес її розвитку. Якщо для роду Picea зростання гетерогенност вуглеводнiв ПЛ хвої з вком проходить дуже нтенсивно та вмст превалюючого компоненту змнюється вдвч протягом року, то для роду Pinus зафіксований процес змни гетерогенност незначний (майже вс вуглеводнев компоненти cинтезуються вже в перший рк), але вн практично не стосується С29-алкану, тому що нонакозан залишається самим значним компонентом на всх вивчених стадях розвитку хвоє.

Спiввiдношення парних та непарних компонентiв зазнає значних змiн в процесi розвитку хвоє обох представникв хвойних. Найбiльш характерним це є для роду Pinus, де суттєво зростає частка непарних компонентiв та падає частка парних. Змiни гетерогенност також трапляються внаслдок зростання частки С17, С19, С31-алканiв. Для роду Picea є характерним незначна змiна спiввiдношення парн/непарн вуглеводн. Процес формування вуглеводнiв в розвитку хвоє проходить по-рзному: в род Picea спочатку cинтезується набр вуглеводнiв, де превалюють (до 90%) непарн алкани та цей спектр поповнюється парними вуглеводнями; в роду Pinus парн вуглеводн знаходяться в значних кiлькостях (бiльше 50%) в молодому лист, а в процесi росту листя єх кiлькiсть зменьшується практично втрич. Тобто, крм рзноє видоспецифiчноє динамки формування спектру вуглеводнiв, слд вдмiтити, що найбiльш активним процес змiнення вуглеводного спектру є для молодого листя; починаючи з 2 року практично сформовано “дорослий” спектр, який має родов та видоспецифчн вдмнност (приблизно однакову гетерогеннсть 11-13 та ступнь превалювання непарних компонентiв).

Для 4-х представникв хвойних динамка формування умовно високомолекулярних компонентв (ВМК - вуглеводн з радикалом вище С29) ПЛ хвоє майже схожа: низький вмiст на 1 роц та високий на 2 та 3 роках розвитку. Ункальним в цьому план є Pinus sylvestris, ПЛ якої вмщують значну кiлькiсть ВМК на протязі всього вивченого пероду розвитку хвоє.

Мiнливість складу жирних кислот поверхневих лiпiдiв хвойних в процесi розвитку хвоє. Для усіх вивчених видiв хвойних знайден загальн закономрност змiни жирнокислотного складу сумарних ПЛ:

а) Значне збльшення частки бегеновоє кислоти. Якщо для роду Pinus кiлькiсть цєє жирноє кислоти була суттєвою в лiпiдах хвоє першого року та єє вмiст з вком збльшувався вдвічи, то для роду Picea це збльшення досягало десятикратних величин. Ранше нами було показано, що збльшення нтенсивност бiосинтезу бегеновоє кислоти є характерним для вкових змiн ПЛ нших рослин (Батюкова 1997).

б) Збереження високого вмiсту жирних кислот з парною кiлькiстю атомiв вуглецю. В процесi росту в ПЛ хвоє збергається високий вмiст жирних кислот з парною кiлькiстю атомiв вуглецю без врахування бегеновоє кислоти. Збльшення молекулярноє маси компонентiв може бути поясненням зсуву фазових переходiв ДТА-кривих в область бiльш високих температур в ПЛ листя старшого вiку.

в) Зниження вмiсту жирних кислот з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю. Ця закономрнсть також бiльш характерна для роду Picea, нж для роду Pinus. Нами було висунуте припущення про снування жирних кислот з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю в вльному стан в ПЛ хвоє, що вдповдає результатам IЧ-спектроскопє та лтературним даним.

Про можливість препаративного видiлення жирних кислот з опаду листя хвойних. Нами був модифiкований метод гiдролзу лiпiдних екстрактiв рослин таким чином, що з опаду листя Pinus sylvestris ми отримали до 3,8% сумiш вищих жирних кислот. Були пдбран оптимальн умови обробки опаду листя: кипятння подрбненого опаду в водному луз та наступна екстракцiя. В залежност вiд використаного варіанту методу можна отримати рзну за складом сумiш жирних кислот.

Метод є простим в технчному виконанн, передбачає багаторазове використання розчинникв, що суттєво знижує собвартсть продукцiє та витрати на охорону оточуючого середовища. Сировина для виробництва С22 та С20 жирних кислот за цим методом є доступною та широко розповсюдженою. Можливе використання даного методу виробництва сумiш вищих жирних кислот з відходiв деревообробноє промисловост.

На перших стадях розвитку листя, за нашими даними, активн обидв системи, проте домінує ЕД-1, яка приводить до видоспецифчного спектру вуглеводнiв, жирних кислот з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю та зростанню високомолекулярност всєє фракцiє ПЛ. Це дозволяє нам стверджувати, що в процесi розвитку хвоє нтенсифкується робота системи ЕД-2. Можна вдмтити також деякi видоспецифчн компоненти, зокрема, превалювання С19:0 жирноє кислоти в вльному стан в Picea abies в лист 1 року.

Отриман нами дан розширюють та поглиблюють уявлення про механзми процесу формування компонентв ПЛ листя, який є активним на протязі вивченого пероду та проходить з утворенням нових компонентв, а також має родов та видоспецифчн особливост.

Висновки

1. Вивчення родових та видоспецифчних особливостей формування поверхневих лiпiдiв листя хвойних рослин повинно включати спектральн та газохроматографічнi дослдження сумарних поверхневих лiпiдiв, наступний гiдролз та дослдження фракцiє жирних кислот і метод диференцiйного термiчного аналiзу.

2. IЧ-спектроскопя нформує про активний синтез карбонiльних сполук в склад поверхневих лiпiдiв в процесi розвитку хвоє, як полягають в змiн спiввiдношення нтенсивностей смуг поглинання в област 1705-1710 см-1 та 1725-1740 см-1 в поверхневих лiпiдах листя хвойних рзного вiку.

3. Для активного формування компонентiв поверхневих лiпiдiв листя хвойних в процесi єх розвитку характерні змiни складу вуглеводнiв: пiдвищення ступеню гетерогенност, зростання частки С17, С19, С31-алканiв та частки високомолекулярних компонентiв. Тенденцiє змiни компонентного складу поверхневих лiпiдiв характерн для всх вивчених видiв хвойних, при цьому деякi родовi та видоспецифчнi особливостi стосуються накопичення окремих компонентів.

4. Суттєву частку (до 79%) в поверхневих лiпiдах листя хвойних складають жирн кислоти з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю, як знаходяться переважно в вльному стан. Загальною закономрнстю змiни складу поверхневих лiпiдiв в процесi розвитку хвої для всх вивчених видiв хвойних є рзке збльшення кiлькостi бегеновоє кислоти в єє ПЛ (Pinus - в 1,5 - 2 рази, Picea - в 10 разв), а також зниження кiлькостi жирних кислот з непарною кiлькiстю атомiв вуглецю.

5. Для поверхневих ліпідів листя хвойних характерні два низькотемпературних фазових переходи в областях 20-500С та 40-800С (без втрати маси), якi можна вднести до плавлення аморфноє та кристалчноє фази. Температура фазових переходів залежить вiд складу та динамки формування компонентiв поверхневих лiпiдiв хвоє.

6. Припусткова схема напрямкв біосинтезу окремих класiв та компонентiв поверхневих лiпiдiв листя хвойних, створена на основі отриманих даних, демонструє єх активацiю або нгібування на окремих етапах розвитку хвоє.

7. Екстракцiє ліпідів з опаду листя хвойних з наступною хiмiчною модифкацiєю екстракту дає можливість отримати до 3,8 % вищих жирних кислот та може бути рекомендована для практичного використання.

Список робіт, опублікованих за темою дисертацiї

1. Штеменко Н.I., Дукачова О.В., Заморуева Л.Ф. Особливостi складу поверхневих лiпiдiв хвойних // Укр. біохім. журн.-1997.-Т.69, №4.-С.61-65.

2. Батюкова О.В., Штеменко Н.I., Глушко В.В. Вищі жирн кислоти поверхневих тканин зерна кукурудзи// Бюлетень iнституту зернового господарства .-1997.-№5.-С.56-58.

3. Штеменко Н.I., Батюкова О.В., Штеменко О.В., Дрик Т.В. Спектральна та термогравіметрична характеристика поверхневих ліпідів хвої різного віку // Укр. бiохiм. журн.- 1999.- Т.71, №3.-С.119-121

4. Штеменко Н.I., Дрик Т.В., Мартинова В.В., Батюкова О.В. Дослiдження оксосполук поверхневих лiпiдiв хвойних// Укр. бiохiм. журн.- 1999.- Т.71, №4.- С.113-115

5. Дрик Т. В., Штеменко Н.І., Паталах І.І., Батюкова О.В. Склад жирних кислот поверхневих ліпідів деяких рослин// Вісник ДДУ.Біологія. Екологія.-1999. -С.58-62.

6. Shtemenko N.I., Zamorueva L.F., Duckachova O.V., Vinnichenko A.N. Investigation of surface layer of plant leaves// Матеріали Першої міжнародн. Науково-практичної конфер. “Стійкий розвиток: забруднення навколишнього середовища та екологічна безпека” Дніпропетровськ, ДДУ - 1999.-С.114-116

7. Shtemenko N.I., Batukova O.V., Dryk T.V. Responses of coniferous to air pollution // Abstr.of The Fourth International Symposium on ”Responses of Plant Metabolism to Air Pollution and Global Change”.-The Netherland.-1997.-P.124.

8. Shtemenko N.I., Dukachova O.V., Zamorueva L.F. Waxes in plant protection // Abstr. of XIII International Plant Protection Congress.- The Hague (The Netherlands.- 1995.-1309

9. Батюкова О.В., Штеменко Н.I. Особливостi бiосинтезу поверхневих лiпiдiв хвойних // Тези доповiдей. VII Украiнського бiохiмiчного з iзду.- Киiв.-1997.-C.82

10. Shtemenko N.I., Batukova O.V., Dryk T.V., Patalakh I.I. Some physical-chemical properties of leaf cuticular lipids // Abstr. of International Conference on Ecotoxicology & Environmental Safety “Secotox 98”.-Antalya (Turkey).-1998.-P.93.

Анотації

Berzenina O.V. Biochemical speciality surface lipids of Coniferae leaves. The manuscript.

The thesis for competition of scientific degree of candidate of biological sciences on a speciality 03.00.04 - biochemistry - Taras Shevchenko Kyiv National University, Kyiv, 2000.

Тhe disertation is dedicated to study of surface lipids of Coniferous plants leaves in the process of the needle development. The methodical approach for study surface lipids has been worked out. The informativity of IR-spectroscopy is shown. The data which to confirm the active synthesis of carbonylcontaining compounds surface lipids in the process of the needle development have been obtained. The trends of change of compounds in content of surface lipids were shown for all species of studied needle plants. Meanwhile the generic and specific peculiarities have been observed. The dinamic changes in the carbohydrate fraction concerning the elevation of heterogenity level were found. The increase of both C17, C19, C39-alkanes and the part of highmolecular components were noticed. The fraction of fatty acids contained high level of odd-carbon fatty acids. During the process of the needle development the high increase of behenic acid content was observed, besides the level of even-carbon acids content decreased. These data obtained shown general tend regularity in changes of fatty acid fraction of surface lipids for all studied species. Using the method of differential thermal analysis (DTA) the presence of two phases transitions without mass loss has been shown. There transitions could be classified as surface lipids melting points of amorphous and crystalline phases respectively. The possible way of biosynthesis some components of surface lipids has been shown in the present work. The method of purification of considerable amount of fatty acids with long chain from modified extract of deciduous needle on the base of obtained results has been proposed. This method could be recommended for practical use.

Key words: Coniferous, surface lipids, GL-chromatography, fatty acids, carbohydrates, behenic acid

Берзенина О.В. Біохімічні особливості поверхневих ліпідів листя хвойних рослин (Coniferae). Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2000.

Дисертацию присвячено вивченню складу поверхневих ліпідів листя хвойних рослин в процесі розвитку хвої. Розроблено методичний підхід до вивчення поверхневих ліпідів. Показано інформативність інфрачервоної спектроскопії, отримані дані підтвержують активний синтез карбонільних сполук в складі поверхневих ліпідів в процесі розвитку хвої. Доведено, що тенденції зміни компонентного складу поверхневих ліпідів характерні для всіх вивчених видів хвойних, але при цьому відмічаються деякі родові та видоспецифічні особливості. Для вуглеводневої фракції в процесі розвитку притаманні: підвищення ступеню гетерогенності, зростання частки С17, С19, С31-алканів та частки висомолекулярних компонентів. Показано, що для фракції жирних кислот має суттєвий вміст жирних кислот з непарною кількістю атомів вуглецю. В ході розвитку хвої спостерігалось різке збільшення кількості бегенової кислоти, а також зниження вмісту жирних кислот з парною кількістю атомів вуглецю, що є загальною закономірністю зміни складу поверхневих ліпідів для всіх вивчених видів хвойних. Методом диференцiйного термiчного аналiзу показано наявнiсть низькотемпературних фазових переходiв (без втрати маси) в поверхневих лiпiдах листя хвойних, якi можна вднести до плавлення аморфноє та кристалчноє фази. В роботі дано можливу схему напрямкв синтезу окремих класiв та компонентiв поверхневих лiпiдiв листя в рзних видах хвойних. На основі отриманих результатів розроблено метод екстракцiє ліпідів опаду листя хвойних з наступною хiмiчною модифкацiєю екстракту, при якй досягається видiлення суттєвих клькостей вищих жирних кислот та який може бути рекомендований для практичного використання.

Ключові слова: Coniferous, поверхневі ліпіди, ГР-хроматографія, жирні кислоти, вуглеводні, бегенова кислота

Берзенина О.В. Биохимические особенности поверхностных липидов листьев хвойных (Coniferae). Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04. - биохимия - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2000.

Диссертация посвящена изучению состава поверхностных липидов листьев хвойных растений в процессе развития хвои. Разработан методический подход включающий спектральные и газохроматографические исследования суммарных поверхностных липидов, последующий гидролиз и изучение фракции жирных кислот, Разработанный подход позволил установить родо- и видоспецифические особенности процессов биосинтеза основных компонентов поверхностных липидов, активных в процессе онтогенеза листа. Результаты проведенных исследований позволяют более глубоко понять причинно-следственные связи между химическим составом поверхностных липидов листьев растений различного возраста и их защитной функцией. Сделанные наблюдения и выводы значительно расширяют представления о механизмах функционирования различных биосинтетических процессов в эпидермальных тканях растений. Показана информативность инфракрасной спектроскопии: полученные данные подтверждают активный синтез карбонилсодержащих соединений в поверхностных липидах заключающиеся в изменении соотношения интенсивностей полос поглощения в области 1705-1710 см-1 и 1725-1740 см-1 в поверхностных липидах в процессе развития хвои. В тоже время дан критический анализ метода тонкослойной хроматографии и УФ-спектроскопии, не позволяющих выявить родо- и видоспецифические особенности состава поверхностных липидов. Доказано, что тенденции изменения компонентного состава поверхностных липидов характерны для всех изученных видов хвойных. Но при этом отмечаются некоторые родовые и видоспецифические особенности.

Углеводороды хвойных представлены в основном нечетными алканами и четными алканами от С19 до С34. Превалирующим компонентом у всех хвойных является С29-алкан. В целом, для углеводородной фракции характерны следующие динамические изменения: повышение степени гетерогенности, возрастание доли С17, С19, С31-алканов и доли высокомолекулярных компонентов. Но если для рода Picea увеличение гетерогенности углеводородов поверхностных липидов хвои с возрастом происходит очень интенсивно и содержание превалирующего компонента меняется почти вдвое в течение года, то для рода Pinus зафиксированный процесс изменения гетерогенности менее выражен (почти все углеводородные компоненты синтезируются уже в первый год) и он практически не затрагивает С29-алкан, так как нонакозан остается самым значительным компонентом на всех изученных стадиях онтогенеза.

Показано, что фракция жирных кислот имеет существенное содержание жирных кислот с нечетным количеством атомов углерода. Можно предположить, что жирные кислоты с нечетным количеством атомов углерода существуют в ПЛ в свободном виде. Необычно сильное поглощение в области 1725 см-1 ПЛ P. abies с этой точки зрения можно объяснить поглощением валентной связи карбонила гептадекановой (С17), пентадекановой (С15) и нонадекановой (С19) жирных кислот в неэтерифицированном виде.

В ходе развития хвои наблюдалось резкое возрастание содержания бегеновой кислоты, а также снижение количества жирных кислот с нечетным количеством атомов углерода, что является общей закономерностью изменения состава жирнокислотной фракции поверхностных липидов всех изученных видов растений. С помощью метода дифференциального термического анализа, который чувствителен к молекулярно-динамическим характеристикам соединений и их смесей показано наличие двух фазовых переходов (без потери массы) в поверхностных липидах листьев хвойных в областях 20-500С и 40-800С, которые можно отнести к плавлению аморфной и кристаллической фазы поверхностных липидов. По шкале газоустойчивости эти растения отнесены к разным группам: Pinus sylvestris - к нестойким (V группа), а Pinus pallasiana - относительно устойчивым (III группа). Относительная устойчивость второго вида может быть объяснена возможностью фазового перехода при физиологически значимых температурах. Наличие низкотемпературного фазового перехода в хвойных обнаружено нами впервые и его физиологическое значение ранее не обсуждалось. В работе приводится возможная схема путей биосинтеза отдельных классов компонентов поверхностных липидов хвои обсуждается их активация или ингибирование в процессе онтогенетического развития листа. На основе полученных данных разработан метод выделения значительных количеств высших жирных кислот из модифицированного экстракта опада хвои, который может быть рекомендован для практического применения. ліпід лист карбонільний кислота

Ключевые слова: Coniferous, поверхностные липиды, ГЖ-хроматография, жирные кислоты, углеводороды, бегеновая кислота.

Размещено на Allbest.ru