Кальцій-залежні механізми оогенезу мишей в нормі та при дії антиоваріальних антитіл

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

інститут фiзiологiї iм. О.О. Богомольця

УДК 576.8.097.5, 591.465.1, 615.27

Автоpефеpат

дисеpтації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Кальцій-залежні механізми оогенезу мишей в нормі та при дії антиоваріальних антитіл

03.00.13. - Фiзiологiя людини і тварин

Блашків Тарас Вірославович

Київ 2000

Загальна характеристика роботи

Фізіологічна функція яєчника ссавців складається з ендокринної функції та генеративної (утворення статевих клітин). Оогенез - багатофакторний процес мітотичного і мейотичного поділу статевої клітини від оогонію до яйцеклітини. Перший поділ ооцита починається ще в зародку. Відновлення мейозу ооцитом, який призупинений з моменту народження і до статевої зрілості, є абсолютно необхідним для нормального запліднення і подальшого розвитку плода. Регулювання розвитку ооцитів ссавців і процес відновлення мейозу вивчено недостатньо. Роль гормонів і ростових факторів, які керують цими процесами, складна, особливо беручи до уваги вплив фолікулярного оточення ооцита. У більшості видів, які вивчаються в наш час, точки контролю мітотичного і мейотичного циклів клітини визначені за фактом зростання рівня внутріклітинного кальцію (Busa, Nucitelli, 1985; Swann, Whitaker, 1986; Kline, 1988; Steinhardt, 1990; Whitaker, Patel, 1990). Більшість робіт було проведено на ооцитах, яйцях та ембріонах безхребетних або нижчих хребетних. Проте область досліджень швидко розширюється, включаючи ооцити ссавців, де роль кальцію в мейозі визнається надзвичайно важливою.

Актуальність теми. В літературі є дані про роль кальцію в дозріванні ооцита. Встановлено, що відбувається вхід Са²⁺ в яйцеклітину при заплідненні, а також Са²⁺ є необхідним для звільнення від другого арешту метафази яєць ссавців (мишей (Cuthbertson et al., 1981; Kline, Kline, 1992), хом'яків (Miyazaki, 1990), корів (Collas et al., 1993)). Тоді як роль позаклітинного кальцію та кальцієвих каналів у звільненні першого арешту метафази, тобто у відновленні мейозу ооцитами ссавців точно не встановлено (Homa et al., 1993, 1995).

Відомо, що при цілому ряді порушень в жіночій репродуктивній системі присутній аутоімунний компонент, пов'язаний з появою в сироватцi кровi антиоваріальних антитіл (запальний процес при неспецифічних ураженнях органів репродуктивної системи (Niauru, 1995), розвиток передчасної недостатності яєчників (Wheatcroft et al., 1994), при пошкодження тканин яєчника жінок після повторних пункцій фолікулів з метою екстракорпорального запліднення (Hovav et al., 1994), в безплiдних жiнок (Crha et al., 1995)). Механізм дії цих антитіл вивчений недостатньо.

Для моделювання дії аутоантитіл в експеpименті викоpистовують ксеногенні антитіла, які за своєю пpиpодою не відpізняються від аутоантитіл (Letteres, 1970; Krishnan et al., 1996). Показано, що антиоваpіальні антитіла (антиоваpіальна цитотоксична сиpоватка) дозозалежно впливають на моpфостpуктуpу яєчників самок щуpів та їх естpальний цикл (Зеленська Т. М., 1965, 1967; Спасокукоцький Ю. А., 1977) Досліджено вплив антиоваріальних антитіл на моpфологічні (Вербицкий М.Ш., Гоцуляк Я.Н., 1997; Гоцуляк Я.М., Янчій Р.І., 1999) та електрофізіологічні (Гоцуляк Я.М. і співавт., 1991) особливості ооцитів мишей. Але участь кальцієвих каналів в дії антиоваріальних антитіл на ооцити не встановлено. Тому дослідження процесу відновлення мейозу ооцитами миші на різних стадіях естрального циклу в нормі та при дії антиоваріальних антитіл є актуальним як для встановлення механізмів реініціації гонадотропінами мейозу ооцитами ссавців in vivo, так і для вивчення нових сторін ефекту дії антиоваріальних антитіл на статеві залози тварин (яєчники).

Метою дослідження було вивчення участі кальцій-залежних механізмів у відновленні мейозу ооцитами мишей на різних стадіях естрального циклу в нормі та при дії антиоваріальних антитіл, що вимагало виконання таких завдань: Размещено на http://www.allbest.ru/

- Дослідити здатність ооцитів до відновлення мейозу при їх неферментативному виділенні з фолікулів в залежності від розмірів фолікулів та самих ооцитів, а також від стадії естрального циклу миші.

- Вивчити вплив кальцію в різних його концентраціях в культуральному середовищі на відновлення мейозу ооцитами миші на стадіях проеструс та еструс І естрального циклу.

- Встановити роль кальцієвих каналів (за допомогою блокатора Са-каналів верапаміла) у відновленні мейозу ооцитами кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів та ооцитами без кумулюсних клітин на різних стадіях естрального циклу миші.

- Оцінити вплив великих доз антиоваріальної цитотоксичної сироватки (АОЦС) та виділених з неї антитіл (г-АОЦС) при застосуванні їх in vivo на морфофункціональні особливості фолікулів та ооцитів мишей.

- Оцінити вплив великих доз АОЦС, г-АОЦС, та виділеної з АОЦС небілкової термостабільної фракції (АОЦС_т) при застосуванні їх in vitro на відновлення мейозу ооцитами. Размещено на http://www.allbest.ru/

- Дослідити вплив низької концентрації кальцію в культуральному середовищі на відновлення мейозу ооцитами на стадіях проеструс та еструс І естрального циклу миші при дії г-АОЦС in vitro.

- Оцінити роль кальцієвих каналів (за допомогою специфічних блокаторів: амілорида як блокатора Т-типу, та верапаміла як блокатора L-типу) у відновленні мейозу ооцитами миші на стадіях діеструс та еструс І при застосуванні г-АОЦС in vitro.

Наукова новизна. Вперше встановлено, що після двох годин культивування в середовищі без кальцію відновлення мейозу ооцитами миші на стадії проеструс естрального циклу було повністю пригніченим. Тоді як на стадії еструс І блокування відновлення мейозу ооцитами в безкальцієвому середовищі було неповним. Вперше виявлено, що верапаміл пригнічував відновлення мейозу ооцитами кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів, які були виділені з “великих” фолікулів яєчників мишей на стадії проеструс та на стадії еструс І. Це вказує на те, що Са²⁺ канали кумулюсних клітин та ооцита проявляють активність саме в цей період, і що це має вирішальне значення для набуття ооцитом здатності до відновлення мейозу. Вперше показано, що великі дози антиоваріальної цитотоксичної сироватки та антиоваріальних антитіл, при одноразовому внутрівенному мишам, викликали дозозалежне зменшення кількості ооцитів, які виділяли з одного яєчника, а також пригнічення відновлення мейозу ооцитами in vitro. Вперше встановлено, що вплив великих доз термостабільної фракції антиоваріальної цитотоксичної сироватки виразився в збільшенні кількості ооцитів, які відновлювали мейоз після 2 та 20 годин культивування. Культивування в середовищі з 0,4 ммоль/л СаCl₂ та великими дозами антиоваріальних антитіл, (протягом 2 та 20 годин) зменшувало гальмівну дію антиоваріальних антитіл на відновлення мейозу in vitro ооцити мишей на стадії еструс І естрального циклу. Вперше одержано дані, про участь кальцієвих каналів L-і Т-типу у відновленні мейозу ооцитами, а також що більшою є роль L-типу, ніж T-типу, кальцієвих каналів у впливові антиоваріальних антитіл на відновлення мейозу in vitro ооцитами миші на стадії еструс І естрального циклу. Размещено на http://www.allbest.ru/

Теоретичне i практичне значення роботи. Отримані результати розкрили участь кальцій-залежних механiзмів у відновленні мейозу ооцитами ссавців, що має фундаментальне значення для розуміння процесів оогенезу - нормального розвитку, дозрівання і активацiї яйцеклiтини. Через встановлення ролі кальцію в дiї антиоваріальних антитіл на відновлення мейозу in vitro ооцитами відбувся поступ у розумінні механізмів розвитку безпліддя імунного походження. Встановлення нових аспектів дії специфічних речовин таких як антиоваріальна цитотоксична сироватка та її фракції (термостабільна та гамма-глобулінова) на здатність ооцитів відновлювати мейоз in vitro має практичне значення для розробки нових методик по регулюванню репродуктивної функції ссавців. Запропоновані та обгрунтовані в дисертації експериментальні моделі для вивчення спонтанного та індукованого відновлення мейозу ооцитами в подальшому можуть бути використані для фундаментальних досліджень впливу факторів, які є важливими для росту і розвитку ooцита, а також для прикладних досліджень і розробок допоміжних репродуктивних технологій у медицині і тваринництві. Отримані результати були використані при читанні курсу нормальної фізіології на кафедрі медичного інституту УАНМ та на кафедрі фізичної та біомедичної техніки КПІ.

Особистий внесок здобувача. Автором самостійно здійснено науковий пошук та обгрунтування напрямку досліджень. Запропоновано моделі для вивчення спонтанного та індукованого відновлення мейозу ооцитами, а також розроблено технологічні параметри систем культивування для адекватного дослідження росту та розвитку ооцитів ссавців in vitro. Самостійно проведені всі експериментальні дослідження, статистична обробка одержаних результатів, аналіз результатів, сформульовано основні висновки роботи, підготовлено до публікації матеріали стосовно основних положень експериментальних досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні положення й результати дисертації доповідалися: на Мiжнаpодному симпозiумі по iмунологiї pепpодукцiї (Київ, Україна; 22-25 жовтня 1996 р.), на симпозіумі з міжнародною участю “Бесплодие: вспомогательные репродуктивные технологии 2000” (Київ, Україна; 27-28 травня 1999 р.), на міжнародній конференції “Механизмы функционирования висцеральных систем”, присвяченій 150-літтю з дня народження академіка І.П.Павлова (Санкт-Петербург, Россия; 23-25 сентября 1999 г.), на ІІІ Міжнародному конгресі патофізіологів (Одеса, Україна, 28-31 травня 2000 р.).

Публікації. Матеріали дисертаційного дослідження викладено в 3 статтях у наукових фахових виданнях, 1 статті в збірнику наукових праць, та 3 тезах доповідей на конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота представлена в одному томі, викладена на 150 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, розділу описання матеріалів і методів дослідження, розділу результатів власних експериментальних досліджень, розділу аналізу і узагальнення результатів дослідження, висновків, списку використаних джерел, додатка. В тексті приведено 18 таблиць та 14 рисунків. Список літератури на 31 сторінці містить 31 джерело українською та російською мовами і 206 іноземних джерела.

Основний зміст

Матеріали та методи досліджень. В дослідах використовували самок білих безпородних мишей віком 8 тижнів, масою 20 г. Всі тварини утримувались в однакових умовах і досліджувались в певний проміжок часу доби і сезон року. Для експериментів вибирали самок: на стадії діеструс - відсаджених від самців; на стадії проеструс; на стадії еструс (І); на стадії еструс (ІІ). Стадії проеструса та еструса (І і ІІ), індукували присутністю самця в клітці, розділеній перегородкою (Манк М., 1990). Стадії естрального циклу самок мишей контролювали за допомогою вагінальних мазків. Забір яєчників здійснювали під ефірним наркозом. Під мікроскопом МБС-9 фолікули механічно звільняли від сполучно-тканинної основи кортикальної речовини. Скляними трубочками їх попередньо розподіляли на групи за розмірами і переносили в тепле (37 ⁰С) середовище. Після проколу фолікула голкою виділяли: ооцити, оточені кумулюсом (кумулюсно-ооцитарні клітинні комплекси - КОКК) та ооцити без кумулюсу (О). Загальне число КОКК, які виділяли з обох яєчників однієї миші, становило 40. (О) - отримували з КОКК. Всі ооцити знаходилися на стадії “зародкового пухирця” (ЗП+), яку встановлювали за наявністю чітко сформованої ядерної оболонки. Звільнення (ЗП+) - ооцитів від фолікулярних клітин здійснювали механічно. Розміри фолікулів та ооцитів (з прозорою оболонкою) встановлювали за допомогою окулярного мікрометра. КОКК та О культивували в камерах, що вміщували 0,45 мл культурального середовища DМЕ (D5405, Sigma) з 15 ммоль HEPES, з концентрацією Са²⁺ (1,71 ммоль/л), в термостаті при 37⁰С, в стерильному боксі. Напередодні кожної експериментальної серії, всі КОКК та О від 5-10 мишей розміщували разом до розподілу в окремі камери, по 40 ооцитів, які слугували як експериментальний та контрольний матеріал. Всі контрольні та тестовані ооцити культивувалися в однакових умовах. Антиоваріальну цитотоксичну сироватку (АОЦС) одержували шляхом трифазової імунізації кроликів антигеном (сольовими екстрактами тканин яєчника білих безпородних мишей) в зростаючих дозах (Спасокукоцький Ю.А. і співавт., 1963). Титр антитіл в цитотоксичних сироватках визначали за реакцією зв'язування комплементу. Отримано чотири антиоваріальні цитотоксичні сироватки. Титр одержаної шляхом їх змішування сироватки становив: 1:320. Термостабільну фракцію (АОЦС_т) одержували з АОЦС прогріванням останньої при 76⁰ С, протягом 20 хвилин. Антиоваріальні антитіла (г-АОЦС - сумарна гамма-глобулінова фракція) отримували з АОЦС шляхом висолювання (Фримель Г., 1987). Для дослідження впливу АОЦС та г-АОЦС на морфофункціональні особливості фолікулів та ооцитів in vivo речовини вводились внутрівенно (в хвостову вену) мишей на стадії діеструсу. Для дослідження впливу АОЦС та г-АОЦС на відновлення мейозу ооцитами in vitro речовини додавалися в середовище культивування. Для встановлення специфічного і неспецифічного впливу АОЦС та г-АОЦС було використано нативну кролячу сироватку інтактних тварин, та нормальні (неспецифічні) гама-глобуліни. Нативну кролячу сироватку (НКС) одержували від інтактних кролів. Фракції НКС (НКС_т та г-НКС) отримували за тією ж методикою, що і аналогічні фракції АОЦС.

Було також використано: культуральні середовища DМЕ DULBECCO'S MODIFIED EAGLE'S MEDIUM)(D5405, FOB Sigma), MEM(JOKLIK MODIFIED) (0518, FOB Sigma); 1М розчин СаCl₂2Н₂О, з якого при додаванні в розрахованих кількостях до безкальцієвого середовища М0518, отримували 0,1; 0,2; 0,31; 0,4; 0,8; 1,71ммоль/л СаСl₂. Подібно отримували середовище з 3,0; 5,0; 10,0 та 20,0 ммоль/л СаСl₂. Для приготування середовищ використовували деіонізовану воду; амілорид (Sigma) - блокатор Са-каналів Т-типу, який додавали під-час приготування культурального середовища, отримуючи 0,30 ммоль/л та 0,50 ммоль/л; верапаміл (Sigma) - блокатор Са-каналів L-типу, який додавали підчас приготування культурального середовища), отримуючи 0,02 ммоль/л, 0,12 ммоль/л, 0,24 ммоль/л; препарати цільної АОЦС, та г-АОЦС при застосуванні in vivo. Попередньо нами було встановлено дозу-ефект як для АОЦС (0,001 мл цільної сироватки) так і для г-АОЦС (0,002 мг/мл циркулюючої крові миші). Потім було підібрано “великі дози” препаратів. Ними для білих безпородних статевозрілих мишей віком 8 тижнів вагою 20 грамів стали: 0,1 мл та 0,01 мл при титрі сироватки 1:320 (“великі дози АОЦС”) та 0,2 мг на мл циркулюючої крові миші та 0,02 мг (“великі дози г-АОЦС”); препарати цільної АОЦС, АОЦС_т і г-АОЦС при застосуванні in vitro. Попередньо нами було встановлено “дозу-ефект”: 0,005 мл - для цільної АОЦС, 0,05 мл - для АОЦС_т та 0,005 мг г-АОЦС. Потім підібрано “великі дози”: 0,01 мл та 0,1 мл - для цільної АОЦС, 0,1 мл та 0,25 мл - для АОЦС_т, 0,02 мг та 0,2 мг - для г-АОЦС; препарати НКС, НКС_т і г-НКС (при застосуванні in vitro, як контрольні) у таких же дозах, що і для АОЦС, АОЦС_т, г-АОЦС. А саме: 0,01 мл та 0,1 мл - для цільної НКС; 0,1 мл та 0,25 мл - для НКС_т; 0,02 мг та 0,2 мг - для г-НКС.

Тварини в дослідах використовувалися з розрахунку: 36 самок на один досліджуваний параметр при культивуванні in vitro; 0,3 мг білка/яєчник при імунізації кролів; 12 самок на одну дозу при введенні in vivo. Відновлення мейозу визначали по встановленню розчинення “зародкового пухирця” після терміну культивування. Підраховування ооцитів здійснювали в кінці терміну культивування, а кількість ооцитів із зародковим пухирцем (ЗП+) та розчиненим зародковим пухирцем (ЗП-) визначали, використовуючи інвертований мікроскоп. Вираховували відношення кількості ооцитів з (ЗП-) до початкової (загальної) кількості (ЗП+) ооцитів у процентах (% ЗП-). Специфічний (АОЦС/НКС) і неспецифічний (НКС/контроль) впливи на відновлення мейозу ооцитами мишей вираховували в (%). Для оцінки достовірності (р) різниці між групами показників використовувався t-критерій Стьюдента (Х.Шенк, 1972).

Основні результати дослідження та їх обговорення

Відновлення мейозу ооцитами, які виділяли з фолікулів різного розміру на різних стадіях естрального циклу миші. Отримані нами величини розмірів фолікулів (таблиця 1) дещо відрізняються від розмірів фолікулів миші за даними літератури. В роботі (Roy, Greenwald, 1996) приводиться класифікація фолікулів миші, яка враховує розмір діаметра фолікула, а також кількість шарів фолікулярних клітин всередині фолікула. Група фолікулів з діаметром 104-193 мкм зіставляється з виділеною нами групою “малі” фолікули; група фолікулів з діаметром 195-303 мкм відповідає “середнім” фолікулам; група фолікулів з діаметром >303 мкм - групі “великі” фолікули на всіх досліджуваних нами стадіях естрального циклу миші.

Таблиця 1. Розміри фолікулів миші на різних стадіях естрального циклу (мкм).

Примітка: фолікули таких розмірів становили (%) від загальної кількості фолікулів групи.

Отримані нами розміри ооцита (таблиця 2) не значно відрізняються від величин ооцитів миші за даними літератури. Так, в роботі (Eppig, O'Brien, 1996) приводяться дані, про те, що величини діаметру ооцитів становили від 41,00,3 до 76,00,3 мкм. Цей факт підтверджено також даними отриманими при вивченні здатності ооцитів миші до відновлення мейозу in vitro (Sato, Miyamoto, 1988; Hirao et al., 1993).

Таблиця 2. Розміри ооцитів миші на різних стадіях естрального циклу (мкм).

Примітка: (*) - p <0.01 - достовірність відмінностей розміру ооцита з “малого” (“великого”) фолікула на стадії еструс І по відношенню до розміру ооцита з такого ж фолікула на стадії діеструс.

Нами встановлено, що процент ооцитів на стадії “зародкового пухирця” (ЗП+) здатних здійснити перехід на наступну мейотичну стадію “розчиненого зародкового пухирця” (ЗП-) після 2 годин культивування становив 22,2±0,2% (р <0.01) з "малих" фолікулів з яєчника мишей в діеструсі та 28,1±0,2% (р <0.01) з "малих" фолікулів з яєчника мишей в еструсі І, а також - 32,4±0,3% (р <0.01) з "великих" фолікулів з яєчника мишей в діеструсі та 41,8±0,2% (р <0.01) з "великих" фолікулів з яєчника мишей в еструсі І. Після 14 годин культивування, відповідно, 82,6±0,3% (р <0.05) і 90,4±0,3% (p <0.05); та 94,8±0,3% (р <0.05) і 98,4±0,2 (p <0.05).

В роботах, проведених раніше іншими авторами, показано, що здатність ооцита закінчувати преімплантаційний розвиток залежить від розміру фолікула, в якому він розвивається (Eppig et al., 1994; Blondin, Sirard, 1995; Crozet et al., 1995). В наших експериментах здатність ооцита відновлювати мейоз in vitro залежала як від розміру фолікула та самого ооцита так і від стадії естрального циклу, на якій відбувалося вилучення яєчника миші. Ми вважаємо, що досліджувані нами фолікули з яєчника на двох стадіях естрального циклу мишей можуть служити експериментальними моделями для вивчення спонтанного та індукованого відновлення мейотичного дозрівання ооцитів. Тоді для першої моделі: вивільнення ооцитів з фолікулярного оточення на стадії діеструс передбачає припинення дії мейоз-пригнічуючих факторів, зокрема цАМФ (Homa, 1995), на ооцити і мейоз відновлюється спонтанно; для другої: встановлення стадії еструса І у самок мишей передбачає здійснення передовуляторного зростання концентрації ЛГ в фолікулярній рідині антральних фолікулів яєчника, що індукує відновлення мейозу ооцитами.

Вплив різних концентрацій кальцію в середовищі на відновлення мейозу in vitro ооцитами миші на стадіях проеструс та еструс І естрального циклу. В літературі є суперечливі дані про участь Са²⁺ в розвитку статевих клітин в період їх дозрівання (Tsafriri, Bar-Ami, 1978; Leibfried, First, 1979; Paleos, Powers, 1981; Racowsky, 1986; De Felici et al., 1991; Kaufman, Homa, 1993). Проведеними нами дослідженнями встановлено, що культивування (ЗП+)-ооцитів мишей на стадії проеструс в середовищі без Са²⁺ повністю блокувало відновлення мейозу, тоді як після двох годин культивування у 57,51,4% (n=12) (ЗП+)-ооцитів мишей на стадії еструс І в безкальцієвому середовищі відбувалося відновлення мейозу. Мінімальна концентрація Са²⁺, при якій після двох годин культивування у 20,01,41% (ЗП+)-ооцитів мишей на стадії проеструс відбувалося розчинення ЗП становила 0,08 ммоль/л. Тоді як, за даними літератури, при культивуванні ооцитів свині, мінімальною концентрацією СаCl₂, необхідною для відновлення мейозу, була концентрація 0,026-0,053 ммоль/л (Bae, Channing, 1985). Зростання концентрації Са²⁺ від нульової до фізіологічної (1,71 ммоль/л), супроводжувалося зростанням здатності до відновлення мейозу ооцитами мишей на стадії проеструс, але не впливало таким чином на ооцити мишей на стадії еструс І. Зростання концентрації Са²⁺ в культуральному середовищі від 3 ммоль/л до 10 ммоль/л збільшувало кількість ооцитів, які відновлювали мейоз після 1 та 2 годин культивування, тоді як 20 ммоль/л концентрація Са²⁺ пригнічувала здатність до відновлення мейозу в ооцитів мишей на стадії проеструс. Доза 10 ммоль/л Са²⁺ пригнічувала в порівнянні з 5 ммоль/л відновлення мейозу ооцитами мишей на стадії еструс І. Доза 20 ммоль/л концентрація Са²⁺ пригнічувала здатність до відновлення мейозу в ооцитів мишей на стадії еструс І. Размещено на http://www.allbest.ru/

Недавні дослідження показують, що ЛГ на додаток до активації аденілатциклази підвищує метаболізм фосфоінозітиду і, відповідно, продукцію інозитолтрифосфату, а також подальше внутріклітинне звільнення Са²⁺ в фолікулярних клітинах свині (Mattioli et al., 1991). Встановлено (Saez et al., 1989), що кальцій як і інозитолтрифосфат може проходити через перехідні проміжки між ооцитом та кумулюсними клітинами і, таким чином, забезпечувати передачу Са²⁺ сигналу із фолікулярних клітин до ооцита, як це виявлено в фолікулах жаби (Sandberg, et al., 1992). Запліднення яйця миші викликає повторні Са²⁺ транзієнти, які можуть продовжуватися на протязі формування другого полярного тільця (Kline, Kline, 1992) і зупинятися при формуванні пронуклеоса (Kline, 1996). Оскільки забір яєчника миші ми здійснювали через 2 години після хвилі передовуляторного ендогенного зростання ЛГ, тоді можливо, що ЛГ-індукований Са²⁺-транзієнт проходить в ооцит і запускає вивільнення Са²⁺ внутріооцитарного, таким чином буде підтримуватися розчинення “зародкового пухирця” навіть за умови відсутності Са²⁺ в оточуючому середовищі. У випадку культивування ооцитів мишей на стадії проеструс описаний вище шлях поступання Са²⁺ не спрацьовував, не було передовуляторного зростання рівня ЛГ. Саме так, на нашу думку, процес відновлення мейозу ооцитами є залежним від присутності іонів Са²⁺ в експериментальному розчині. Размещено на http://www.allbest.ru/

Вплив різних концентрацій блокатора кальцієвих каналів верапамілу на відновлення мейозу ооцитами мишей на різних стадіях естрального циклу. Поки що в літературі немає чітких доказів переміщення Са²⁺ через клітини кумулюсу в ооцит ні по перехідні проміжки, ні по Са-каналах. До цього часу фукціонування Са-каналів як кумулюсних клітин, так і самого ооцита, а також їх прямий зв'язок з відновленням мейозу є предметом досліджень (Homa, 1995), тоді як при заплідненні роль Са-каналів ооцита, як стверджують, точно встановлено (Kline, 1996). Проте є дані стосовно впливу блокатора кальцієвих каналів верапамілу на культивовані ооцити ссавців. Використані нами дози верапамілу застосовувалися в (Powers, Paleos, 1982; Bae, Channing, 1985; Kaufman, Homa, 1993).

Згідно з нашими результатами, блокатор кальцієвих каналів L-типу верапаміл повністю пригнічував відновлення мейозу ооцитами без кумулюсних клітин миші на стадіях проеструс та еструс І, що вказує на функціонування в оолемі (ЗП+)-ооцитів миші Са-каналів, взаємодіючи з якими, верапаміл впливав на здатність ооцитів відновлювати мейоз. Верапаміл також пригнічував відновлення мейозу ооцитами кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів, які були виділені з “великих” фолікулів яєчників мишей на стадії проеструс та на стадії еструс І. Це свідчить, що Са-канали кумулюсних клітин проявляють активність саме в цей період, і що це може мати вирішальне значення для набуття ооцитом здатності до відновлення мейозу.

Відомо, що клітинна мембрана містить декілька типів каналів, по яких Са²⁺ рухається із внутріклітинного простору та із Са-депонуючих органел в гіалоплазму (Hosey, Lazdunski, 1988). Складна кінетика зв'язування блокатора з каналом відповідає мультиточковій моделі їх зв'язування (Striessnig et al., 1994). Наслідком такого зв'язування проявляється зниженням доступності канала для Са²⁺, і така “стабілізація” інактивації канала являється ключевим фактором в його блокуванні (Пидопличко В.И., Верхратский А.П., 1989; Dzhura et al., 1996; Williams et al., 1999; Amasheh S., Weber W., 1999; Reifarth et al., 1999; Weber et al., 2000).

Ми пояснюємо залежність дії блокатора Са-транспорту від дози та стадії естрального циклу тим, що густина функціонуючих Са-каналів мембрани кумулюсних клітин та оолеми ооцитів змінюється в процесі розвитку овуляції. Одержані дані можуть свідчити, що гонадотропіни (а саме ЛГ) запускають фосфоінозитидні перетворення в гранулярних клітинах з звільненням в них Са, який переходить в кумулюсні клітини по Са-каналах, і далі через Са-канали оолеми в ооцит, долаючи пригнічуючий вплив цАМФ, відбувається відновлення мейозу.

Вплив антиоваріальних антитіл при застосуванні іn vivo на морфо-функціональні особливості фолікулів та ооцитів мишей. В наших дослідженнях одноразове внутрівенне введення великих доз АОЦС та г-АОЦС через 72 години викликало: дозозалежне зменшення кількості ооцитів які виділяли з одного яєчника а саме, кількість ооцитів в яєчнику після дії АОЦС в дозі 0,1 мл становила 4,50,9 шт/яєчник (p<0.01) та після дії 0,01 мл 9,60,5 шт/яєчник (p<0.01), при 15,620,21 шт/яєчник в контролі; після дії г-АОЦС в дозі 0,2 мг та 0,02 мг до 7,71,5 шт/яєчник (p<0.01) та 11,80,5 шт/яєчник (p<0.01), відповідно, при 15,620,21 шт/яєчник в контролі; відсутність в яєчнику фолікулів певного розміру, а також зміну розмірів самих фолікулів. Так, після дії АОЦС в дозі 0,1 мл реєстрували відсутність “середніх” та “великих” фолікулів (p<0.01), а також зменшення розмірів “малих” фолікулів (p<0.01) у порівнянні з контролем. Після дії 0,01 мл спостерігали відсутність “великих” фолікулів (p<0.01) та збільшення “середніх” фолікулів (p<0.05). Після дії 0,2 мг г-АОЦС реєстрували відсутність “малих” (p<0.01) та “середніх” фолікулів (p<0.01) , а також зменшення “великих” фолікулів (p<0.01). Після дії 0,02 мг - відсутність “малих” фолікулів (p<0.01), зменшення “середніх” (p<0.05), та “великих” фолікулів (p<0.01); зменшення розмірів ооцитів. Так, після дії АОЦС в дозі 0,1 мл та 0,01 мл реєструвалося зменшення розміру ооцита з “малого” фолікула (p<0.01) та (p<0.05), відповідно, по відношенню до контрольних; після дії г-АОЦС в дозах 0,2 мг та 0,02 мг реєструвалося зменшення розміру ооцита з “великого” фолікула (p<0.01); не відновлення мейозу ооцитами, а також дозозалежне зменшення ооцитів, які відновлювали мейоз in vitro. Так, після дії АОЦС в дозі 0,1 мл жоден ооцит не відновлював перший поділ мейозу після 2-ох годин культивування (p<0.01). Після дії 0,01 мл АОЦС %(ЗП-) знижувалося (p<0.01) в порівнянні з контрольними значеннями; після дії г-АОЦС в дозі 0,2 мг та 0,02 мг %(ЗП-) зменшувався (p<0.01).

Ми констатуємо пригнічуючий вплив великих доз АОЦС та АОАТ на події, пов'язані з фолікулогенезом (ендокринно регульованим процесом розвитку фолікулів), та гаметогенезом (паракринно регульованим процесом розвитку статевих клітин з гаплоїдним набором хромосом), що провело до не відновлення мейозу (перехід зі стадії ЗП+ на стадію ЗП- не відбувається) ооцитами, які несуть в зародковому пухирці диплоїдний набір хромосом, а отже, до відсутності власне яйцеклітини (ооцита другого порядку) і, неможливості здійснення вірогідного запліднення. Таким чином ми пояснюємо функціональну кастрацію тварин після введення великих доз АОЦС, а також можливу роль АОАТ у формуванні безпліддя самок імунного походження (при розвитку в організмі інтенсивного антитілоутворення до антигенів яєчника).

Вплив антиоваріальної цитотоксичной сироватки та її фракцій при застосуванні in vitro на відновлення мейозу ооцитами мишей. Нами показано, що АОЦС дозозалежно пригнічувала відновлення мейозу в ооцитів у порівнянні з дією НКС, а остання - порівняно з контролем. Так, після дії АОЦС в дозі 0,01 мл 10,02,5 % ооцитів відновлення мейозу після 2-ох годин культивування при 13,31,9 % при дії НКС: 0.01 мл НКС (p<0.01). Після дії 0,1 мл АОЦС та НКС %(ЗП-) становило відповідно 2,00,8 % та 12,50.8 % (p<0.01). Після дії АОЦС в дозі 0,01 мл 35.61.6 % ооцитів відновлення мейозу після 20 годин культивування при 77,52,1 % при дії НКС (p<0.01). Після дії АОЦС в дозі 0,1 мл %(ЗП-) становив 15,32,1 % при 82,41,8 % після дії НКС (p<0.01). Так, після дії АОЦС_т в дозі 0,1 мл 26,51,3 % ооцитів відновлення мейозу після 2-ох годин культивування при 22,42,1 % при дії НКС_т (p<0.01). Після дії 0,25 мл АОЦС_т %(ЗП-) становив 30,81,7 % при 24,52,1 % при дії 0.25 мл НКС_т (p<0.05). Після дії АОЦС_т в дозі 0,1 мл 96,32,4 % ооцитів відновлення мейозу після 20 годин культивування при 84,12,3 % при дії НКС_т (p<0.001). А після дії 0,25 мл АОЦС_т %(ЗП-) становило 99,80,19 % при 77,21,4 % при дії НКС_т (p<0.01). Після дії г-АОЦС в дозі 0,2 мг після 2 годин культивування %(ЗП-) зменшувався до 15,11,8 % при 20,32,1 % при дії г-НКС (p<0.10). Після 20 годин культивування відповідно 37,62,4 % і 75,32,7 % (p<0.01). Після 20 годин культивування при дії 0,02 мг - 42,42,3 % та 78,32,1 % відповідно (p<0.01). Вплив антиоваріальних антитіл (г-АОЦС), які складають певну частку термолабільної фракції АОЦС, також був переважно гальмівним, в прямій залежності від дози та терміну культивування.

В наших дослідах in vitro відбувалося пригнічення відновлення мейозу ооцитами при культивуванні в присутності великої дози АОЦС і г-АОЦС, що не суперечить (Спасокукоцкий Ю.А. і співавт., 1977; Гоцуляк Я.М., Янчій Р.І., 1999). Реєстровані зміни могли бути спричинені, на нашу думку, призупиненням або блокуванням г-АОЦС початкових етапів ядерного дозрівання (ЗП+)-ооцитів при переході на стадію (ЗП-), а також неповним цитоплазматичним дозріванням культивованих ЗП- ооцитів, не зважаючи на видиме завершення ядерного дозрівання. Стосовно АОЦС_т, слід відмітити, що отримане нами зростання досліджуваних показників в експериментах in vitro можна пояснити присутністю в досліджуваній сироватці термостабільних речовин типу мейоз-активуючих стеролів (МАС), які вже виділені з фолікулярної рідини людини, а також із зрілих бичачих тестикулів (Byskov et al., 1995а; Byskov et al., 1995b). З огляду на це, для пригнічення репродуктивної функції у наукових і практичних цілях можна рекомендувати термолабільну фракцію АОЦС (або г-АОЦС) у великих дозах, а для стимуляції розвитку яйцеклітин - АОЦС_т у великих дозах.

Вплив низької концентрації кальцію в середовищі культивування на відновлення мейозу ооцитами мишей при дії антиоваріальних антитіл. У літературі немає даних стосовно вивчення процесу відновлення мейозу ооцитами при дії антиоваріальних антитіл в середовищі із зниженою концентрацією Са²⁺. Одержані нами результати свідчать, що знижений вміст кальцію в середовищі послаблює гальмівний вплив г-АОЦС на відновлення мейозу ооцитами, більш значно - гальмівну дію неспецифічних сироваткових факторів (на стадії еструс І). На стадії проеструс за цих умов більш істотний гальмівний вплив мали специфічні фактори г-АОЦС. На нашу думку, вхід кальцію, який відбувся в ооцитах мишей на стадії еструс І, компенсував нестачу Са²⁺ за умов культивування і зменшував специфічний гальмівний вплив г-АОЦС на відновлення мейозу.

Вплив блокаторів кальцієвих каналів верапамілу та амілориду на відновлення мейозу ооцитами мишей при дії антиоваріальних антитіл in vitro. В літературі є дані про те, що існує ряд захворювань нервової системи, в патогенезі яких важливу роль відводять дії аутоантитіл (Greenberg, 1994; Appel et al., 1994; Waxman, 1995). Це такі захворювання як боковий аміотрофічний склероз (Mallea, Yoshino, 1994; Kimura et al., 1994; Smith et al., 1994), Ламберт-Етона міастенічний синдром (Goldstein et al., 1994; Lennon et al., 1995), інші види міастеній (Leger et al., 1993; Takamori, 1995). Аутоантитіла, що виявляються в сироватці крові таких хворих, проявляють свій вплив на мембранні канали: кальцієві (Kowalski et al., 1990; Motomura et al., 1994), калієві (Shillito et al., 1995), натрієві (Takigawa et al., 1995). Проте, немає даних стосовно впливу антиоваріальних антитіл на кальцієві канали оолеми ооцитів ссавців. Отримані нами результати подано в таблиці 3.

Таблиця 3. Кількість ооцитів, які відновлювали мейоз при культивуванні в середовищі з блокаторами кальцієвих каналів (верапамілом та амілоридом) при дії антиоваріальних антитіл (% Мm, n=12).

Примітка: р-достовірність відмінностей значення (%ЗП-) при дії г-АОЦС в порівнянні з г-НКС. Размещено на http://www.allbest.ru/

В наших дослідах in vitro відбувалося підсилення пригнічення відновлення мейозу ооцитами при культивуванні в присутності г-АОЦС та блокаторів кальцієвих каналів. Збереження дуже значного гальмування відновлення мейозу при впливові г-АОЦС і верапамілу навіть при довгостроковому культивуванні ооцитів мишей на стадії еструс І дозволяє також припустити, що в цьому випадку діючі гальмівні чинники блокують більшість механізмів відновлення мейозу. Це дає підстави рекомендувати сумісне використання вказаних чинників з метою призупинення відновлення мейозу навіть після активації ооцитів. Вплив амілориду у досліджуваних дозах проявлявся тільки на стадії еструс І, переважно у ранні строки культивування, а потенціюючий гальмівний ефект при додаванні г-АОЦС та г-НКС у цього блокатора був значно слабшим, ніж у верапамілу і виявлявся тільки при довгостроковому культивуванні. При сумісному впливові г-АОЦС або г-НКС з обома блокаторами (0,12 ммоль/л верапамілу та 0,50 ммоль/л амілориду) ми спостерігали, що ефект на відновлення мейозу ооцитами мишей на стадії діеструс не відрізнявся від впливу г-АОЦС або г-НКС з додаванням тільки верапамілу. На стадії еструс І спостерігали посилення гальмівного ефекту (переважно неспецифічних сироваткових факторів) після 2 год культивування та часткову редукцію гальмівного впливу специфічних сироваткових факторів після 20 годин культивування у порівнянні з впливом г-АОЦС або г-НКС з додаванням тільки верапамілу.

Оскільки блокування каналів Т-типу ооцитів мишей в еструсі І посилювало гальмівний ефект переважно неспецифічних сироваткових факторів, мабуть, функціонування цих каналів бере участь у механізмах відновлення мейозу при дії або впливові неспецифічних пригнічуючих факторів білкової природи. Проте, редукція специфічного гальмування відновлення мейозу г-АОЦС на фоні дії обох блокаторів при довгостроковому культивуванні без сумніву свідчить і про існування додаткових до описаних вище, механізмів відновлення мейозу.

Висновки

З використанням різних концентрацій Са²⁺, блокаторів кальцієвих каналів (верапаміла та амілорида), а також антиоваріальних антитіл в середовищі культивування досліджено участь кальцій-залежних механізмів в процесі відновлення ооцитами миші мейозу, який є абсолютно необхідним для нормального запліднення і подальшого розвитку плода, а також чинником жіночого безпліддя аутоімунного походження, і який досі був недостатньо вивченим.

Показано, що здатність ооцитів до відновлення мейозу in vitro при їх неферментативному виділенні з яєчника миші на різних стадіях естрального циклу, залежить як від розмірів фолікула та самого ооцита, так і від стадії естрального циклу миші. Найбільший процент ооцитів, які вступали в мейоз in vitro, характерний для “великих” фолікулів на стадії еструс І.

Встановлено, що процес відновлення мейозу ооцитом залежить від фази естрального циклу і є кальцій-залежним. Культивування ооцитів мишей на стадії проеструс в середовищі без Са²⁺ повністю блокувало відновлення мейозу, тоді як в ооцитах мишей на стадії еструс за цих умов блокування відновлення мейозу було неповним.

Встановлено участь кальцієвих каналів (за допомогою блокатора L-типу Са-каналів верапаміла) у відновленні мейозу in vitro ооцитами кумулюсно-ооцитарних клітинних комплексів та ооцитами без кумулюсних клітин на стадіях проеструс та еструс І естрального циклу миші.

Показано, що антиоваріальні антитіла при їх застосуванні in vivo, викликали дозозалежне зменшення кількості ооцитів, які виділяли з одного яєчника миші та пригнічення відновлення мейозу ооцитами in vitro.

При порівняльному вивченні дії АОЦС, НКС, г-АОЦС, г-НКС, АОЦС_т, НКС_т in vitro встановлено, що вплив цільної АОЦС на процес відновлення мейозу ооцитами є сумарним ефектом кількох різноспрямовано діючих чинників: 1) специфічних гальмівних термолабільних, в тому числі антиоваріальних антитіл; 2) специфічних мейоз-активуючих термостабільних; 3) неспецифічних гальмівних термолабільних (включаючи нормальні антитіла).

Показано, що знижений вміст кальцію в культуральному середовищі послаблює гальмівний вплив антиоваріальних антитіл на відновлення мейозу ооцитами і є більш виражений на стадії еструс І.

Встановлено, що в присутності блокаторів кальцієвих каналів L- та Т-типу (верапаміла та амілорида, відповідно) відбувалося підсилення пригнічуючої дії антиоваріальних антитіл на відновлення мейозу ооцитами. Цей ефект був більш виражений на стадії еструс І.

Отримані результати свідчать, що на оолемі ооцитів миші функціонують кальцієві канали L- і Т-типу, активність яких залежить від стадії естрального циклу і пов'язана з механізмами відновлення мейозу ооцитами. На стадії діеструс при відновленні мейозу функціонують переважно канали L-типу, на стадії еструс І - канали Т-типу. Кальцієві канали залучаються в механізм пригнічуючої дії антиоваріальних антитіл на відновлення ооцитами мейозу.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації

1. Алексєєва І.М., Вознесенська Т.Ю., Блашків Т.В., Янчій Р.І. Відновлення in vitro мейотичного дозрівання та формування першого полярного тільця ооцитами мишей на різних стадіях естрального циклу//Фізіол. журн.-- 1999. -- Т. 45, №5. -- С. 55-59.

2. Янчій Р.І., Блашків Т.В., Вознесенська Т.Ю. Вплив кальцію на відновлення першого поділу мейозу та на формування першого полярного тільця in vitro ооцитами мишей на стадіях проеструс та еструс//Експериментальна та клінічна фізіологія та біохімія. -- 1999, №2. --С. 21-25.

3. Янчій Р.І., Блашків Т.В., Вознесенська Т.Ю., Портниченко А.Г., Сандуляк В.Н., Бідзіля Ю.П. Вплив верапамілу на відновлення мейозу та формування першого полярного тільця ооцитами мишей in vitro//Фізіол. журн.-- 2000.-- Т. 46, №1.-- С. 52-57.

4. Алексєєва І.М., Янчій Р.І., Блашків Т.В., Портниченко А.Г., Бідзіля Ю.П. Вплив кумулюсних клітин на відновлення першого поділу мейозу ооцитами мишей in vitro // Сб. научных трудов симпозиума с междунаролным участием 27-28 мая 1999. - К.: 1999. - С. 233-238.

5. Gotsuiyak Y.M., Blashkiv T.V., Yanchiy R.I., Voznesenska T.Y. Influence of specific antibodies on process of oocyte maturation in vivo and iv vitro // Тези. доп. Міжнародний симпозіум по імунології репродукції (Київ, 22-25 жовтня 1996). -- К., 1996. -- С.16.

6. Блашкив Т.В., Алексеева И.Н., Янчий Р.И. Влияние кальция на in vitro созревание ооцитов мышей // Сб. матер. международной конференции “Механизмы функционирования висцеральных систем”, посвященной 150-летию со дня рождения академика И. П. Павлова (Санкт-Петербург, Россия; 23-25 сентября, 1999). -- СПб., 1999. -- С.49-50.

7. Блашків Т.В., Алексєєва І.М., Янчій Р.І., Портниченко А.Г., Вознесенська Т.Ю., Блашків В.С. Морфометричні зміни фолікулів та ооцитів миші після внутрівенної ін'єкції великих доз антиоваріальної цитотоксичної сироватки та антиоваріальних антитіл //ІІІ Міжнародний конгрес патофізіологів, 28-31 травня 2000). -- Одеса, 2000. - С. 34.

Размещено на http://www.allbest.ru/