Дослідження експресії муцинових генів в кон'юнктиві ока людини

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

Гут Ірина Йосифівна

УДК 577.218 577.21617.711

Дослідження експресії муцинових генів в кон'юнктиві ока людини

03.00.03 - молекулярна біологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2000

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрах офтальмології Львівського державного медичного університету ім. Данила Галицького, та Брістольського Університету, Велика Британія.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор СЕМЕНОВА Галина Савівна Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор МАЛЮТА Станіслав Станіславович Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м. Київ, зав. відділу молекулярної генетики;

кандидат біологічних наук ДРОБОТ Людмила Борисівна Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, Відділення регуляторних систем клітини, зав. відділу клітинної диференціації

Провідна установа: Київський національний університет ім. Тараса Шевченка, м. Київ

Захист відбудеться 21 березня 2000 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої Вченої Ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. академіка Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України

Автореферат розіслано 20 лютого 2000 року

Вчений секретар спеціалізованої Вченої Ради доктор біологічних наук Л.Л. Лукаш

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

муцини кон'юктива око гени

Актуальність теми. Мукозна оболонка (мукоза) ссавців є захисним бар'єром, який оберігає епітеліальні клітини дихального, шлунково-кишкового та репродуктивного трактів від шкідливих впливів зовнішнього середовища. Мукоза продукується спеціалізованими епітеліальними клітинами і є в'язким віскозним секретом, до складу якого входять вода, неорганічні сполуки, імуноглобуліни, антимікробні речовини, білки і мукополісахариди (Gendler, 1995).

Одним із складових компонентів мукози є муцини, які утворюють гетерогенну групу високомолекулярних (>200 кДа) глікопротеїнів. На даний час відкрито дев'ять типів муцинових генів (MUC1, MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7 і MUC8) і очікується відкриття нових (Watanabe, Van Klinben, 1998). Ґрунтуючись на структурних особливостях, а також клітинній локалізації, епітеліальні муцини поділяють на дві групи: трансмембранні і секреторні .

Аналіз нуклеотидних і амінокислотних послідовностей вказує на відсутність гомології між різними типами муцинових генів. В той же час, було виявлено спільні особливості в організації білкового компоненту муцинів, а саме, наявність тандемних повторів і численних центрів для О- і N-глікозилювання (Guyonnet-Duperat et al., 1995, Gum et al., 1990). Схематичну структуру трансмембранного (MUC1) та секреторного (MUC2) муцинів представлено на рис. 2. Біохімічний аналіз муцинів, виділених з різних тканин показав, що до їх складу входить велика кількість (до 75 % від загальної ваги) вуглеводів (Gum, 1992).

На сьогоднішній день інтенсивно вивчаються закономірності експресії муцинових генів в нормі і при патологічних станах. Для досліджень у вказаному напрямку були використані такі методичні підходи як аналіз експресії РНК (Нозерн-блотинг), білків (Вестерн-блотинг), гібридизація in situ і полімеразна ланцюгова реакція. Це дозволило провести детальний аналіз експресії трансмембранного (MUC1) і секреторних муцинів (MUC2-8) в різних епітеліальних тканинах. Видозмінений характер експресії муцинових генів було виявлено при різних патологічних станах, включаючи запальні процеси викликані бактеріальною та вірусною інфекцією (Jany et al., 1997, Adier et al., 1995), системні захворювання, злоякісні новоутворення (Lalani, 1991) і бронхіальну астму (Rose, 1992).

В роботах останніх років було показано, що ряд ендогенних та екзогенних факторів, зокрема ростові фактори, гормони, хімічні препарати і патогенні мікроорганізми можуть впливати на експресію муцинових генів в епітеліальних тканинах (Parry, 1992, Guzman et al., 1995, An et al., 1994, Gollub et al., 1995). Механізми контролю експресії муцинових генів є досить складними і можуть регулюватись на різних рівнях, включаючи транскрипцію, сплайсинг мРНК і трансляцію (Dohrman et al., 1994, Kovaric et al., 1998).

Внутрішня поверхня повік і передня поверхня очного яблука покрита напівпрозорою мукозною мембраною. Відомо, що мукозна оболонка ока виконує ряд важливих функцій в підтримці гомеостазу зорового аналізатора, а саме: а) підтримує гомеостаз в передньому відрізку ока; б) є бар'єром, який захищає епітелій очного яблука від шкідливих впливів зовнішнього середовища, включаючи хімічні і фізичні подразники, збудники вірусних і бактеріальних інфекцій; в) є адекватним оптичним середовищем, що забезпечує проникнення світлового проміння до фоторецепторних клітин сітківки (Дубовская, 1984, Kanski, 1995).

Біохімічні і гістохімічні дослідження останніх років вказують на те, що основним компонентом мукози є муцини, які продукуються в епітеліальному шарі кон'юнктиви ока (Dilly, 1996). Існує ряд патологічних станів, які спричиняють структурні і функціональні зміни в мукозній оболонці кон'юнктиви ока людини.

Варто зазначити, що на сьогодні з епітеліальних тканин ока ні один з відомих муцинів не був очищений, а гени муцинів не були клоновані. Не було також проведено детального аналізу експресії муцинових генів в епітеліальних покривах ока здорової людини і при патологічних процесах. Все сказане свідчить про актуальність обраної проблеми і необхідність подальших досліджень у цій галузі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота "Дослідження експресії муцинових генів в кон'юнктиві ока людини" виконувалась за планом наукової роботи кафедри офтальмології Львівського державного медичного університету в співробітництві з Брістольським Університетом (Велика Британія).

Мета дослідження. Основною метою роботи було дослідження експресії генів трансмембранного (MUC1) та секреторних (MUC2, MUC3, MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6, MUC7 і MUC8) муцинів в кон'юнктиві ока людини методом гібридизації in situ.

Завдання дослідження. Відповідно до поставленої мети було сформульовано такі завдання:

1) провести аналіз нуклеотидних і амінокислотних послідовностей відомих муцинових генів з метою підбору специфічних проб для гібридизації in situ;

2) отримати радіоактивно-мічені олігонуклеотидні проби та перевірити ефективність їх гібридизації в тканинах, які експресують муцинові гени у великій кількості;

3) дослідити експресію трансмембранного (MUC1) та секреторних (MUC2-8) муцинових генів в епітеліальному шарі кон'юнктиви ока людини.

Наукова новизна та практичне значення одержаних результатів. Вперше показано, що в кон'юнктиві ока людини експресуються три типи муцинових генів, а саме: MUC1, MUC4 і MUC5AC. Поєднання методу гібридизації in situ з гістохімічним аналізом дозволило вивчити експресію даних генів на клітинному рівні. Експресія мРНК трансмембранного муцину (MUC1) була виявлена в клітинах сквамозного епітелію кон'юнктиви і має плямистий характер місцезнаходження. На відміну від MUC1, мРНК секреторного муцину MUC4 експресується в усіх шарах епітелію, її експресія є гомогенною і збігається з локалізацією Гоблетових клітин. Цікаво зазначити, що мРНК MUC5AC виявляється тільки в базальному шарі епітелію кон'юнктиви з чітко вираженим плямистим характером локалізації. Отримані дані є базою для вивчення змін в експресії муцинових генів при патологічних станах ока, включаючи запальні процеси, аутоімунні захворювання, деструктивні зміни спричинені хімічними та фізичними травмами, регенеративні процеси та злоякісні новоутворення. Дана робота відкриває також перспективи для пошуку і впровадження в практику препаратів, які можуть регулювати експресію муцинів в кон'юнктиві ока людини при патологічних станах.

Створено бактерійний вектор для продукції рекомбінантного N-MUC4 (N-кінцевий домен MUC4, що містить тандемні повтори), експресія якого є найбільш вираженою в кон'юнктиві ока. Отримано клони бактерій BL21 (DE3) pLysS, що експресують N-кінцевий домен MUC4 у великій кількості (з одного літра індукованих бактерій можна отримати біля 3 мг рекомбінантного білка).

Розроблено методику афінної очистки N-MUC4 на Talon Сефарозі, що дозволяє очистити His-tag/N-MUC4 практично до гомогенного стану. Наявність високоочищених препаратів рекомбінантного N-MUC4 дозволило розпочати роботу по отриманню специфічних моноклональних антитіл, проводити дослідження по вивченню біохімічних властивостей тандемних повторів даного муцину, а також ініціювати роботу по його кристалізації з наступним з'ясуванням трьохмірної організації методом рентгеноструктурного аналізу.

Апробація роботи. Основні положення дисертації доповідались на конференціях Офтальмологічного товариства Великої Британії (1996, 1997), Міжнародній конференції "Lorn Cancer Meeting" (Lorn, Australia, 1998), а також: на засіданнях кафедри офтальмології і Вченої ради Львівського державного медичного університету та відділу Офтальмології Брістольського Університету.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 3 статті у фахових наукових журналах, а також 3 тези конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, експериментальної частини, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел літератури. Дисертацію викладено на 104 сторінках стандартного машинопису, містить 24 рисунки і 5 таблиць. Список використаної літератури охоплює 93 найменувань.

Особистий внесок здобувача. Робота Гут І. Й. є особистим завершеним дослідженням. Методологічна основа наукової роботи відповідає меті та завданням дослідження. Автор самостійно провела пошук літератури за даною тематикою, здійснила експериментальні дослідження, описала отримані результати і сформулювала висновки експериментальної роботи.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ. МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНННЯ

Зразки кон'юнктиви повіки і перехідної складки ока були отримані від вісімнадцяти пацієнтів під час хірургічних втручань з приводу ентропіону, ектропіону і птозу. Зразки тканин шлунку, товстої і тонкої кишки, підщелепної слинної залози, бронхів і раку молочної залози були використані як позитивний контроль при вивчені експресії муцинових генів.

За допомогою комп'ютерного аналізу банків даних Swissprot і ЕМВО та програм для порівняння білкових і ДНКових послідовностей (Bestflt і Fasta) було відібрано 9 специфічних олігонуклеотидних послідовностей (довжиною 48 нуклеотидів кожна), що відповідають тандемним повторам дев'яти муцинових генів.

Олігонуклеотидні проби синтезували у відділі Біохімії Брістольського Університету на ДНК-синтезаторі фірми "АВІ". Очистку синтезованих олігонуклеотидів проводили за допомогою хроматографії високого тиску у зворотній фазі на хроматографі фірми "Beckman". Для мічення олігонуклеотидних проб використовували З'-дезоксинуклеотидтрансферазу ("Boehringer") і [(-³⁵S)]ATP, ("Amersham"). Мічені олігонуклеотиди очищали від вільного [(-³⁵S)]ATP за допомогою гель-фільтрації на колонках фірми "Stratagene". Ефективність включення радіоактивної мітки в олігонуклеотидні проби визначали за допомогою багатоканального лічильника фірми "Beckman". Гібридизацію in situ отриманих зрізів кон'юнктиви ока і контрольних тканин з міченими пробами проводили за методом описаним в роботі (Wilkinson, 1994). Даний метод включав такі етапи: прегібридизацію, гібридизацію і виявлення радіоактивного сигналу. Для вивчення гібридизаційного сигналу на клітинному рівні використовували срібну емульсію фірми "Кодак". Наявність радіоактивно-активованих срібних гранул у зразках аналізували за допомогою світлового мікроскопу фірми "Zeiss" в темному і освітленому полях зору. Специфічність гібридизаційного сигналу було підтверджено аналізом тканин, в яких експресію муцинових генів було показано в попередніх дослідженнях, а саме: шлунок, товста і тонка кишка, підщелепна слинна залоза, бронхи, трахея і рак молочної залози.

Для ампліфікації N-кінцевого фрагмента кДНК MUC4, з метою подальшого клонування в бактерійний експресуючий вектор, було використано полімеразну ланцюгову реакцію. Ефективність ампліфікації ДНК MUC4 перевіряли електрофорезом в агарозному гелі. Для створення бактерійного експресуючого вектора pET-15b/N-MUC4, ампліфіковану і плазмідну ДНК розщеплювали рестриктазами Ndel і BamHl фірм "Gibco BRL" і "New England Biolabs". Очистку фрагментів ДНК з агарозного гелю здійснювали за допомогою набору для екстракції ДНК фірми "Qiagen". Реакцію лігування проводили з використанням ДНК лігази фірми "Gibco BRL". Компетентні бактерійні клітини штамів XLl-Blue фірми "Stratagene" і BL21 (DE3) pLysS фірми "Novagene" були використані для трансформації продуктами лігування. Очистку плазмідної ДНК з бактерій проводили за допомогою набору "Qiaex" фірми "Qiagen". Присутність фрагменту кДНК MUC4 в плазмідній ДНК виявляли рестрикційним аналізом і електрофорезом в 1 % агарозному гелі.

Експресію рекомбінантного N-MUC4 в бактеріях лінії 21 (DE3) pLysS, трансформованих плазмідою pET-15b/MUC4, індукували ізопропіл--Д-тіогалактозидом. Наявність рекомбінантного N-MUC4 в лізатах індукованих і неіндукованих бактеріальних клітин перевіряли електрофорезом в поліакриламідному гелі і методом імуноблотингу. Очистку рекомбінантного His-tag/N-MUC4 з лізатів індукованих бактерій проводили за допомогою афінної хроматографії на колонці, упакованій носієм "Talon" фірми "Novagen". Рекомбінантний білок елюювали з колонки буфером, до складу якого входило 0,2 М імідазолу. Кількісний і якісний аналіз очищеного N-MUC4 проводили спектрофотометрично і електрофорезом в поліакриламідному гелі.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Аналіз муцинових генів і підбір проб для гібридизації in situ. Специфіка організації муцинових генів стала основним критерієм підбору олігонуклеотидних проб для гібридизації in situ. У таблиці 1 наведено підсумок детального аналізу тандемних повторів дев'яти відомих муцинів, який базувався на використанні білкового банку даних Swissprot і програм для вивчення гомології на білковому і ДНКовому рівнях (Bestfit і Fasta). Відібрані олігонуклеотидні послідовності були проаналізовані в геномному банку даних для перевірки їх специфічності і ступеня виродженості.

Таблиця 1 - Характеристика тандемних повторів трансмембранного (MUC1) і секреторних (MUC2-MUC8) муцинів

Синтез, очистка і радіоактивне мічення олігонуклеотидних проб. Дев'ять олігонуклеотидних проб, що відповідають тандемним повторам відповідних муцинових генів, були синтезовані на ДНК синтезаторі і очищені до гомогенного стану за допомогою хроматографії у зворотній фазі. Варто зазначити, що даний етап був необхідним для того, щоб позбутися олігонуклеотидів синтез яких не був завершеним, оскільки наявність вкорочених олігонуклеотидів в гібридизаційній суміші може призвести до появи неспецифічного зв'язування і отримання недостовірних результатів. Мічення олігонуклеотидних проб проводили з використанням [(-³⁵S)]ATP і дезоксинуклеотидтрансферази. Мічені олігонуклеотиди відділяли від [(-³⁵S)]ATP, що не включився, гель-фільтрацією. В кінцевому результаті, нами були отримані і використані для досліджень мічені проби з високою питомою активністю: від 1,4 до 3,7 х 10⁸ імп/хв^-1/ мкг^-1.

Дослідження експресії муцинових генів в кон'юнктиві ока людини. За допомогою методу гібридизації in situ. було вивчено експресію трансмембранного (MUC1) та секреторних (MUC2, MUC3. MUC4, MUC5AC, MUC5B, MUC6. MUC7 і MUC8) муцинових генів в кон'юнктиві ока людини. Результати даного аналізу показали, що в кон'юнктивальному епітелії експресуються три типи муцинових генів, а саме: MUC1, MUC4 і MUC5AC (таблиця 2).

Таблиця 2 - Експресія муцинових генів в кон'юнктиві ока людини. Рівень експресії: (+++) - високий, (++) -середній, (+) - слабкий, (-) не виявляється

а) аналіз експресії трансмембранного MUC1 в кон'юнктиві ока. На сьогодні відомий лише один тип трансмембранного муцину MUC1, експресію якого було виявлено в епітеліальних тканинах майже всіх органів людини, за виключенням яєчників. Високий рівень експресії гіпоглікозильованої форми MUC1 було показано в пухлинах епітеліального походження, включаючи рак молочної залози, шлунку і товстої кишки.

При аналізі зразків кон'юнктиви ока людини методом гібридизації in situ, було виявлено специфічний гібридизаційний сигнал з міченою MUC1 пробою. Варто зазначити, що в порівнянні з раком молочної залози (позитивний контроль), експресія мРНК MUC1 в кон'юнтиві ока є значно слабшою. Найбільш інтенсивний гібридизаційний сигнал виявлено в сквамозних клітинах кон'юнктивального епітелію, що прилягають до базальної мембрани. Важливо також зазначити, що локалізація мРНК MUC1 має досить виражений плямистий характер. Поєднання гістохімічного аналізу і методу гібридизації in situ показало, що локалізація мРНК MUC1 не збігається з місцезнаходженням Гоблетових клітин, які відповідають за секрецію основних компонентів мукозної оболонки, включаючи муцини. Мікроскопічний аналіз гібридизованих зрізів показав, що мРНК MUC1 експресується в клітинах сквамозного епітелію.

Отримані результати вказують на те, що: а) мРНК MUC1 експресується в нижньому шарі кон'юнктиви ока людини; б) експресія MUC1 має плямистий характер локалізації; в) мРНК MUC1 експресується не в Гоблетових клітинах, а в сквамозному епітелії.

На підставі аналізу робіт із вивчення ролі MUC1 в інших епітеліальних тканинах можна зробити припущення, що даний муцин відіграє важливу роль в підтримці гомеостазу зорового аналізатора, а саме:

а) разом з секреторними муцинами бере активну участь в стабілізації сльозової плівки. Це можна пояснити специфікою структури MUC1, позаклітинний домен якого включає розгалужені вуглеводи, які можуть зв'язуватись з секреторними муцинами мукозного шару сльозової плівки;

б) відіграє роль "якоря", що дозволяє фіксувати мукозний шар кон'юнктиви на апікальній поверхні епітеліальних клітин. Трансмембранний і цитоплазматичний домени MUC1 утримують масивний позаклітинний домен на поверхні апікального епітелію;

в) розгалужена організація масивного позаклітинного домену є тим "глікопротеїновим скелетом", який підтримує просторову структуру мукозного шару кон'юнктиви;

г) бере участь в формуванні захисного бар'єру, який попереджує проникнення патогенних мікроорганізмів і чужорідних тіл у нижні шари кон'юнктиви.

б) характеристика експресії секреторних муцинів в кон'юнктиві ока людини. Метод гібридизації in situ дозволив виявити експресію тільки двох секреторних муцинів, а саме MUC4 і MUC5AC в епітеліальному шарі кон'юнктиви ока. Мічена MUC4 проба дала сильний гібридизаційний сигнал, який збігається з локалізацією кон'юнктивального епітелію (рис. 3).

Мікроскопічний аналіз гібридизованих зрізів в світлому і темному полях зору виявив наявність радіоактивно-активованих гранул срібла в усіх шарах епітелію кон'юнктиви, які відповідали місцезнаходженню міченої проби а, відповідно, і мРНК MUC4. На відміну від MUC1, експресія мРНК MUC4 має гомогенний характер локалізації по всій товщині кон'юнктивального епітелію. Імуногістохімічний аналіз гібридизованих зрізів показав, що гібридизаційний сигнал виявляється в Гоблетових клітинах, які локалізуються епітеліальному шарі кон'юнктиви ока.

Експресія мРНК MUC5AC виявляється тільки в базальному шарі кон'юнктивального епітелію. В порівнянні з MUC4, експресія мРНК MUC5AC має виражений плямистий характер місцезнаходження. Отримані результати свідчать про те, що MUC4 і MUC5AC експресуються в різних популяціях кон'юнктивального епітелію. За допомогою гістохімічного аналізу було показано, що Гоблетові секреторні клітини не містять мРНК MUC5AC. Варто також зазначити, що інтенсивність MUC5AC гібридизаційного сигналу була набагато слабшою порівняно з сигналом, отриманим при гібридизації з MUC4 міченою пробою.

Тканини раку молочної залози, бронхів і товстої кишки людини мали високий рівень експресії мРНК MUC1, MUC4 і MUC5AC і були використані як позитивний контроль методу гібридизації in situ.

Підсумовуючи отримані результати з вивчення експресії секреторних муцинів в коню'нктиві ока, можна зробити такі висновки: а) в епітелії кон'юнктиви ока людини експресуються тільки два секреторні муцини - MUC4 і MUC5AC; б) MUC4 експресується в усіх шарах епітелію кон'юнктиви ока людини, тоді як MUC5AC - тільки в базальному шарі; в) експресія мРНК MUC4 характеризується гомогенним характером локалізації, а мРНК MUC5AC вираженим плямистим; г) рівень експресії MUC4 є набагато вищим порівняно з мРНК MUC5AC.

Отримані результати є основою для вивчення змін в експресії муцинів при патологічних станах, включаючи кон'юнктивіти вірусного і бактерійного походження, регенеративні процеси після хімічних та фізичних травм, злоякісні новоутворення, а також симптом "сухого ока".

Експресія і очистка рекомбінантного MUC4. Зважаючи на те, що експресія MUC4 є найбільш вираженою в кон'юнктиві ока людини і те, що біохімічні властивості і функція даного муцину є слабо вивченими, було вирішено експресувати рекомбінантний N-кінцевий домен MUC4, який кодує тандемні повтори.

На сьогодні існує ряд систем експресії, які дозволяють продукувати рекомбінантні білки у великій кількості. В експериментальній практиці найчастіше використовуються системи експресії в бактеріях, клітинах комах (бакуловірусна система) та клітинах ссавців.

Для отримання рекомбінантного N-MUC4 ми вибрали бактерійну систему експресії рЕТ, розроблену Стадіером (Studier 1986) і Розенбергом (Rosenberg 1987). В даній системі експресія рекомбінантного білка знаходиться під контролем сильного промотора Т7 РНК полімерази. В свою чергу, транскрипцію даного гена, яка контролюється Lac UV5 промотором, індукують ІПТГ. Іншою важливою характеристикою цієї системи є низький рівень транскрипційної активності, а, відповідно, і експресії рекомбінантного білка в неіндукованих бактеріях. Важливо зазначити, що ряд векторів системи рЕТ (рЕТ-15, рЕТ-22, рЕТ-23) дозволяють експресувати рекомбінантний білок в поєднанні з His-tag епітопом. Наявність даного епітопу дає можливість очистити рекомбінантний білок за допомогою афінної хроматографії.

Стратегія клонування ДНК MUC4. Для клонування N-кінцевого фрагмента ДНК MUC4 в рЕТ-15Ь вектор, було використано полімеразну ланцюгову реакцію. Стратегію клонування представлено на рис. 4.

Реакцію ампліфікації N-кінцевого фрагмента ДНК MUC4 (1200 нуклеотидів), рестрикційне переварювання і лігування ампліфікованої ДНК і рЕТ-15Ь вектора проводили за стандартним методом, як описано в "Матеріалах і методах досліджень". Використання висококомпетентних клітин штаму XL-1 Blue для трансформації продуктами лігування (N-MUC4 ДНК і рЕТ-15Ь вектор) дозволило отримати велику кількість ампіцилін-резистентних колоній. Підрахунок кількості колоній, які виросли на чашках Петрі в присутності ампіциліну показав, що ефективність лігування N-MUC4 ДНК в рЕТ-15Ь вектор була достатньо високою. Для ідентифікації колоній, що містять рЕТ-15Ь вектор із MUC4 вставкою було проведено рестрикційний аналіз очищених плазмідних ДНК з використанням Ndel і ВаmH1 рестриктаз. Результати проведеного аналізу показали, що серед 12 відібраних ампіцилін-резистентних колоній, 9 містили рЕТ-15b плазмідну ДНК із N-MUC4 вставкою.

Експресія і афінна очистка рекомбінантного N-MUC4. На наступному етапі необхідно було перевірити рівень експресії рекомбінантного N-MUC4 в дванадцяти відібраних бактерійних клонах. Індукцію експресії здійснювали за допомогою ІПТГ. Білки лізатів бактерійних клітин до і після індукції розділяли в 10 % поліакриламідному гелі і фарбували за допомогою Кумасі голубого R-250. Аналіз отриманої електрофореграми показав наявність додаткової смуги з мол. масою близько 48 кДа тільки в лізатах індукованих бактерій, що були трансформовані рекомбінантним рЕТ-15b вектором з MUC4 вставкою. Імуноблотинг бактерійних лізатів із специфічними антитілами проти His-tag підтвердив наше припущення, про те що додаткова білкова смуга з молекулярною масою біля 48 кДа відповідає рекомбінантному His-tag/N-MUC4.

Подальший аналіз індукованих бактерійних лізатів показав, що рекомбінантний N-MUC4 експресується як детергент-розчинний (Тритон Х-100) білок. Ця властивість рекомбінантного N-MUC4 була важливим фактором для його подальшої очистки за допомогою афінної хроматографії.

Таким чином, нами було отримано 9 бактерійних клонів, які експресують рекомбінантний N-MUC4. Наявність на N-кінці MUC4 шести залишків гістидину забезпечила можливість очистки рекомбінантного білка за допомогою афінної хроматографії на Talon Сефарозі. Як видно з рис. 5, за допомогою лише одного етапу очистки на Талон Сефарозі було отримано препарат рекомбінантного N-MUC4 з чистотою більше ніж 95 %.

На основі аналізу проведених експериментів можна зробити такі висновки: а) бактерійна система експресії білків рЕТ-15b дозволяє наробляти детергент-розчинний N-MUC4 у міліграмових кількостях; б) за допомогою афінної хроматографії, His-tag/N-MUC4 можна очистити з лізатів бактерійних клітин практично до гомогенного стану.

Наявність рекомбінантного N-MUC4 дала можливість розпочати роботу з отримання специфічних моноклональних антитіл, а також вивченню його структури та біохімічних властивостей.

Висновки

1. На основі детального аналізу нуклеотидних та амінокислотних послідовностей дев'яти муцинових генів було підібрано специфічні олігонуклеотидні проби для проведення досліджень методом гібридизації in situ. Специфічність гібридизаційного сигналу з радіоактивними пробами перевірено на тканинах, в яких експресія муцинових генів була вивчена раніше.

2. Вперше показано, що в кон'юнктиві ока людини експресуються три типи муцинових генів, а саме: MUC1, MUC4 і MUC5AC. Експресію трансмембранного муцину MUC1 виявлено у всіх шарах сквамозного епітелію кон'юнктиви. Секреторний муцин MUC4 експресується в усіх шарах епітелію кон'юнктиви і ця експресія має гомогенний характер локалізації. мРНК MUC5AC виявляється лише в базальному шарі кон'юнктивального епітелію і має виражений плямистий характер розповсюдження. Отримані результати є базовими для вивчення змін в експресії муцинових генів при патологічних станах ока, включаючи запальні процеси (кон'юнктивіти), аутоімунні захворювання (синдром Стівенса Джонсона, Cicatrical pemphigoid), деструктивні зміни (хімічні та фізичні травми), регенеративні процеси та злоякісний ріст.

3. Створено бактерійний вектор для експресії фрагмента MUC4, що містить тандемні повтори. Отримано клони трансформованих бактерій, в яких рекомбінантний білок експресується в міліграмових кількостях.

4. Розроблено методику афінної очистки N-кінцевого фрагмента MUC4 на Talon Сефарозі, що дозволяє отримати велику кількість рекомбінантного білка.

5. Наявність рекомбінантного N-MUC4 дозволила розпочати роботу з отримання специфічних моноклональних антитіл, а також вивченню біохімічних властивостей даного муцину.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Ellingham R.B., Myerscough N., Gout I.I., Berry M., Corfield A. Soluble mucins in human aqueous tears / / Biochemical Society Transactions. -1997.- 25. N 3.- P.12-16.

2. Гут I.Й., Елінгем P., Істі Д., Семенова Г.С. Вивчення експресії секреторних муцинів у кон'юнктиві ока людини // Биополимеры и клетка.-1998.- 14. N 1.- C. 29-38.

3. Gout I. I. Structure and function of epithelial mucins. Review // Биополимеры и клетка.-1998.- 14. N 5.- C.410-419.

4. Gout I. I., Ellingham R. B., Berry M. Biochemical properties of mucins in the human conjunctiva // South Western Ophthalmological Society Meeting. Bristol, United Kingdom, June 1996.- P.72.

5. Gout I.I., Ellingham R.B., Easty D. In situ hybridisation for MUC genes in human conjunctiva // South Western Ophthalmological Society Meeting. Bristol, United Kingdom, June 1997.- P.132.

6. Gout I.I. Expression of transmembrane mucin MUC1 in human conjunctiva // Lorn Cancer Meeting. Lorn, Australia, February 1998.- P.147.

АНОТАЦІЇ

Гут І. Й. Дослідження експресії муцинових генів в кон'юнктиві ока людини. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2000.

Захищається робота, в якій наведено результати досліджень із вивчення експресії муцинових генів в кон'юнктиві ока людини методом гібридизації in situ. Вперше показано, що серед дев'яти відомих на сьогодні муцинових генів, в епітелії кон'юнктиви експресуються трансмембранний MUC1 та секреторні (MUC4 і MUC5AC) муцини. Експресію відповідних генів було досліджено на клітинному рівні поєднанням методів гібридизації in situ, гістохімії та мікроскопії в темному і освітленому полях зору. Створено бактерійну систему експресії, яка дозволяє продукувати рекомбінантний N-кінцевий фрагмент MUC4 (N-MUC4) у великих кількостях. Поряд з тим, розроблено методику очистки рекомбінантного N-MUC4 за допомогою афінної хроматографії. Отримані результати є базою для вивчення змін в експресії муцинових генів при патологічних станах ока, а також проведення дослідженнь з вивчення біохімічних властивостей секреторного муцину MUC4.

Ключові слова: епітелій, кон'юнктива ока, експресія, муцинові гени, рекомбінантний білок.

Гут И. И. Исследование экспрессии муциновых генов в конъюнктиве глаза человека. -Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03. - молекулярная биология. Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2000.

Защищается работа, в которой приведены результаты исследований по изучению экспрессии муциновых генов в конъюнктиве глаза человека методом гибридизации in situ. На основании проведенного анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей девяти муциновых генов были отобраны специфические олигонуклеотидные пробы, которые соответствуют их тандемным повторам. Специфичность гибридизации радиоактивно-меченных олигонуклеотидних проб проверяли в тканях с высоким уровнем экспрессии муцинов.

Впервые показано, что среди девяти известных на сегодняшний день муциновых генов, в эпителии конъюнктивы экспрессируются трансмембранный (MUC1) и секреторные (MUC4 и MUC5AC) муцины. Экспрессия даных генов была исследована на клеточном уровне сочетанием методов гибридизации in situ, гистохимии и микроскопии в темном и освещенном полях зрения. Было показано, что мРНК трансмембранного муцина MUC1 экспрессируется в клетках сквамозного эпителия конъюнктивы и имеет пятнистый характер локализации. В отличие от MUC1, мРНК секреторного муцина MUC4 выявляется во всех слоях конъюнктивального эпителия и её распределение носит гомогенный характер. мРНК MUC5AC экспрессируется в базальном слое конъюнктивы и имеет пятнистый характер локализации, как и MUC1.

Создана бактериальная система экспрессии рекомбинантного N-концевого фрагмента MUC4 (N-MUC4), которая позволяет продуцировать рекомбинантный белок в больших количествах. Также, разработана методика очистки рекомбинантного His-tag/N-MUC4 с помощью аффинной хроматографии на Talon Сефарозе. Наличие высокоочищенных препаратов рекомбинантного N-MUC4 открыло перспективы для получения специфических моноклональных антител и изучения трехмерной структуры тандемных повторов этого муцина. Полученные результаты являются базой для изучения изменений в экспрессии муциновых генов при патологических состояниях глаза, а также проведения исследований по изучению биохимических свойств секреторного муцина MUC4.

Ключевые слова: эпителий, конъюнктива глаза, экспрессия, муциновые гены, рекомбинантный белок.

Gout I. I. The study of expression of mucin genes in human conjunctiva. -Manuscript.

The thesis is for seeking of a PhD degree in molecular biology.- Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The manusript presents the data on the expression of nine mucin genes in human conjunctiva. The technique of in situ hybridization was used to demonstrate that only three mucin genes (transmembrane MUC1 and secretory MUC4 and MUC5AC) are expressed in conjunctival epithelium. The combination of in situ hybridisation, histochemistry and light microscopy allowed us to study the expression of these genes on cellular level. At the same time, bacterial expression system was established for the production of the N-terminal domain of MUC4, which contains 3 tandem repeats.

Recombinant protein could be purified in large quantities and nearly to homogeneity with the use of affinity purification on Talon Sepharose. The obtained data have created the base to study the changes in mucin gene expression under pathological conditions and to initiate experiments on biochemical characterisation of secretory mucin MUC4.

Key words: epithelium, human conjunctiva, expression, mucin genes, recombinant protein.

Размещено на Allbest.ru