Систематика та біологія бактерій роду klebsiella

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ І ВІРУСОЛОГІЇ ім. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Систематика та біологія бактерій роду klebsiella

Коваль Галина Миколаївна

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Ужгородському державному університеті, Міністерство освіти України

НАУКОВИЙ КЕРІВНИК: доктор медичних наук, старший науковий співробітник, Васюренко Зінаїда Павлівна, Київський науково-дослідний Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського Міністерства Охорони Здоров'я України.

НАУКОВИЙ КОНСУЛЬТАНТ: доктор біологічних наук, професор, Ніколайчук Віталій Іванович, Ужгородський державний університет Міністерства освіти України, завідувач кафедри фізіології рослин і біотехнології біологічного факультету

ОФІЦІЙНІ ОПОНЕНТИ: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Романовська Вікторія Олександрівна, Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного Національної Академії Наук України, провідний науковий співробітник

доктор медичних наук, старший науковий співробітник, Сельнікова Ольга Петрівна, Київський науково-дослідний Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського Міністерства Охорони Здоров'я України, директор

ПРОВІДНА УСТАНОВА: Київський університет ім. Тараса Шевченка, кафедра мікробіології та загальної імунології, Міністерство освіти України, м. Київ

Захист відбудеться “_16_” __лютого__ 2000 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 при Інституті мікробіології та вірусології ім. Д. К. Заболотного Національної Академії Наук України за адресою: м. Київ, 252143, вул. Заболотного, 154

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Клебсієли відносяться до найбільш розповсюджених в природі бактерій і тому становлять особливий інтерес, насамперед, як патогени для людини і асоціанти рослин. Незважаючи на раннє відкриття клебсієл (V.Trevisan, 1885), залишається ряд невирішених питань щодо їх таксономії та біологічних властивостей. Зміни в систематиці клебсієл в останні десятиріччя не вирішили повністю цю проблему і навіть до певної міри ускладнили її. Так, включення видів Klebsiella rhinoscleromatis i Klebsiella ozaenae у вид Klebsiella pneumoniae як підвидів суперечить ряду біологічних відмінностей зазначених бактерій від бактерій основного підвиду (I.rskov, 1984). Виділення сапрофітних клебсієл в окремі види Klebsiella terrigena (D.Izard et al.,1981) i Klebsiella planticola (S.T.Bagley et al., 1982), відновлення виду Klebsiella oxytoca (I.rskov, 1984) також потребують подальшого вивчення цих бактерій, як з точки зору таксономії, так і біології, особливо патогенного потенціалу і можливостей його реалізації у хазяїв різних рівнів організації. Для таксономічних досліджень бактерій залишається перспективним використання хемотаксономічних маркерів (складу поліамінів, жирних кислот, фосфоліпідів, тощо), які достовірно характеризують ту чи іншу групу бактерій і надають можливість простежити філогенетичні зв'язки останніх (T.G.Tornabene, 1985; З.П.Васюренко з співавт., 1992; К.Hamana, S.Matsuzaki, 1992). Проте, хемотаксономічні ознаки у клебсієл вивчені недостатньо (З.П.Васюренко із співавт., 1989; К.Hamana, 1996). Актуальним є також розкриття адаптивних механазмів, які дозволяють клебсієлам мати широкий спектр хазяїв та виступати в ролі не тільки патогенів, а й асоціантів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота є частиною науково-дослідної програми кафедри фізіології рослин та біотехнології (курс загальної та медичної мікробіології) Ужгородського державного університету по тематиці: “Дослідження фізіолого-біохімічних властивостей деяких умовно-патогенних мікроорганізмів. Пошук превентивних та терапевтичних засобів боротьби з збудниками фіто-, зоо-, антропонозних інфекцій”, згідно проблеми “Полібіотрофія Klebsiellа”. Держбюджетна тема “Розробка кормових добавок комбінованого призначення для ветеринарії шляхом селекції господарсько-цінних мікроорганізмів роду Bacillus”, номер державної реєстрації - 339, координаційний план - 15.

Мета та задачі дослідження. Виходячи з вищезазначеного, ми поставили мету провести з використанням хемотаксономічних ознак таксономічні дослідження клебсієл та вивчити ряд їх біологічних властивостей, насамперед, пов'язаних з патогенним потенціалом. Для досягнення цієї мети були поставлені такі завдання:

а) вивчити склад поліамінів у представників всіх таксономічних груп клебсієл;

б) дослідити склад жирних кислот клітин та ліпополісахаридів (ЛПС) типових штамів K.planticola, K. terrigena і K. oxytoca в порівнянні з цими ознаками у типового штаму K.pneumoniae subsp. pneumoniae;

в) дослідити з таксономічної точки зору особливості метаболізму (газообміну при зброджуванні цукрів) у представників різних видів і підвидів клебсієл;

г) вивчити наявність ряду факторів патогенності у сапрофітних клебсієл і K. pneumoniae subsp. pneumoniae та ентомопатогенну дію сапрофітних клебсієл;

д) дослідити позитивний вплив клебсієл різних таксономічних груп на ріст і розвиток рослин та продукування клебсієлами вітамінів як можливих факторів цієї дії;

е) визначити у клебсієл наявність антигенів, спільних з еритроцитами людини, та динаміку їх вмісту при довготривалому культивуванні клебсієл у тканинах рослин. бактерія klebsiella клітина рослина

Наукова новизна одержаних результатів.

1. За вивченими хемотаксономічними ознаками і характером метаболізму K. planticola, K. terrigena і K. oxytoca більш близькі, ніж K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae, до K. pneumoniae subsp. pneumoniae.

2. Суттєві відміності в жирнокислотному складі ліпополісахаридів типових штамів K. planticola, K.terrigena i K. oxytoca, з одного боку, і типового штаму K. pneumoniae subsp.pneumoniae, з іншого, вказують на наявність філогенетичної відстані між цими бактеріями і обгрунтованість виділення сапрофітних клебсієл в окремі види.

3. Визначення наявності у сапрофітних клебсієл антигенів мімікрії (антигенів, спільних із еритроцитами людини), присутності антилізоцимної активності та ентомопатогенних властивостей свідчить про можливість зростання патогенного потенціалу сапрофітних клебсієл до рівня, достатнього для спричинення при певних умовах інфекції у людини.

Практичне значення одержаних результатів.

1. Клебсієльозна інфекція у яєць і личинок колорадського жука може бути використана для боротьби з останнім.

2. Виявлені нами штами клебсієл, що найбільш ефективно поліпшують ріст та розвиток овочевих культур, доцільно використати у сільському господарстві.

Особистий внесок здобувача. Робота виконана автором особисто. Визначення жирнокислотного складу проведено в Київському науково-дослідному інституті епідеміології і інфекційних хвороб спільно з д.м.н. З.П. Васюренко і І.С. Опанасенко, метаболізму - в Інституті сільськогосподарської мікробіології (Санкт-Петербург, Росія) спільно з к.б.н. В.М. Пищик, факторів патогенності - в Інституті епідеміології і мікробіології (Санкт-Петербург, Росія) спільно з к.м.н. Н.Р. Вассер, ентомопатогенних властивостей - в Ужгородському державному університеті спільно з к.б.н. Н.В. Бойко, антигенів мімікрії - в Ужгородському державному університеті спільно з к.м.н. А.І. Туряницею і к.б.н. А.М. Петак, складу поліамінів - при консультації к.б.н. О.Є.Жеребило (Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ). Хромато-масс-спектрометричні дослідження виконано в Інституті біологічних випробовувань хімічних сполук (Москва, Росія) при консультації та технічній допомозі к.х.н. С.Т. Козлова.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались на наукових та професорсько-викладацьких конференціях Ужгородського державного університету (1986-1998), Регіональній конференції молодих вчених (Ужгород, 1987), на з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993), на Міжнародній регіональній конференції (Ужгород, 1996).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт, із них у фахових наукових журналах - 4.

Об'єм і структура дисертації. Дисертація викладена на 112 сторінках машинописного тексту і складається із вступу, огляду літератури, 7 частин власних досліджень і їх обговорення, заключення та висновків. Список цитованої літератури містить 214 джерел. Робота ілюстрована 23 таблицями і 14 рисунками.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень. Об'єктом досліджень були штами K. pneumoniae subsp. pneumoniae і K. oxytoca - типові, музейні та свіжовиділені від хворих і здорових людей, з навколишнього середовища; K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae - типові та ізольовані від хворих людей; K. planticola і K. terrigena - типові та ізольовані із філосфери рослин, води і грунту. Всього досліджено 792 штами.

Для вивчення складу поліамінів використовували метод екстракції поліамінів 2% розчином перхлорної кислоти (О.Є. Жеребило, Н. М. Вишталюк, 1985). Клебсієли вирощували на картопляному агарі протягом 18 годин. Розподіл поліамінів проводили методом електрофорезу на бумазі (Н. Inoue, A. Mizutani, 1973).

З метою дослідження жирнокислотного складу клітин клебсієли культивували в м'ясо-пептонному бульйоні (МПБ) і на м'ясо-пептонному агарі (МПА) при 370 С і 250 С протягом 24 годин, для вивчення жирнокислотного складу ЛПС - на МПА при 370 С 24 години. Гідроліз ліпідів та метилювання клітинних жирних кислот проводили 1,5 % розчином сірчаної кислоти в метанолі при 800 С 1 годину з використанням цілих бактеріальних клітин (К.М. Синяк із співавт.,1976 ). ЛПС виділяли фенол-водним методом (О. Westphal et al.,1952 ). Гідроліз ЛПС та метилювання жирних кислот ЛПС проводили 3 % HCl в метанолі при 1000 С протягом 4 годин (Т.Yamakawа, N.Ueta, 1964). Метилові ефіри жирних кислот аналізували на газових хроматографах “Цвет” серії 100 із застосуванням полуменево-іонізаційного детектора та скляних колонок довжиною 3 м і діаметром 3 мм з нерухомою фазою 3-5 % SE-30 на інертоні AW-DMCS 0,200-0,250 мм.

Для дослідження газообміну при зброджуванні цукрів (виділення СО2 і Н2 та поглинання О2) використовували газові хроматографи “Хром“ і “Цвет“, згідно методичних рекомендацій Л.М.Широкової і С.М. Євдокімова (1981).

Для цих дослідів в якості основного поживного середовища було використано середовище Омелянського такого складу: K₂HPO₄ - 1г; (NH₄)₂HPO₄ - 1 г; MgSO₄ - 0,5 г; CaCl₂ - 0,1 г; NaCl - 0,1 г; FeSO₄ - сліди; глюкози - 10 г; дистильованої води - 1 л. При заміні аміачної форми азоту в середовищі на нітратну додавали в еквівалентних кількостях по азоту сіль NaNO₃ (1,2 г/л).

Вивчення адгезивних і інвазійних властивостей, гемаглютинації еритроцитів морської свинки, антилізоцимної активності проводили з використанням стандартних методик (М.О. Біргер, 1982). Наявність термостабільного ентеротоксину визначали на мишах-сосунках, згідно методу, описаному A.G. Dean et al. (1972), термолабільного ентеротоксину - за методом, описаним М.О.Біргер (1982).

Ентомопатогенну дію клебсієл на яйця і личинки колорадського жука вивчали в лабораторних умовах. На плантаціях картоплі відбирали листки з яйцекладками комах, а також личинки другого та четвертого віку. Яйцекладки обробляли суспензією трьохдобової культури клебсієл (1 млрд. мікробних клітин в 1 мл води). Личинки інфікували годуванням їх інокульованими (також 1 млрд мікробних клітин в 1 мл води) листочками картоплі. Після цього кладки яєць і личинки розкладали у чашки Петрі і витримували при температурі 230 С та відносній вологості 60-70 %. Розрахунки по визначенню ентомопатогенної дії клебсієл проводили за формулою:

,

де М - смертність в %;

Р1 і Р2 - кількість шкідників до і після обробки листків бактеріальною культурою;

К1 і К2 - кількість комах в контролі.

Показник ефективності ентомопатогенної дії клебсієл за вказаною формулою враховує смертність шкідників в контролі. Клебсієли, виділені із гемолімфи комах, ідентифікували мікробіологічними і серологічними методами.

Вплив клебсієл на ріст та розвиток стебла та кореня капусти і салату вивчали за методами, описаними П.А. Генкелем (1965) і К.І. Бельтюковою (1968). Продукцію клебсієлами вітамінів групи В визначали за методами, описаними Е.І. Одинцовою (1969), а також С .М. Чайковською і Є.Н. Дружиніною ( 1967 ).

Для визначення здатності клебсієл виживати в зелених плодах томатів 0,1 і 0,3 мл суспензії клебсієл (105 клітин в 1 мл) вводили в товщу плоду. Останні поміщали в вологу камеру і витримували в ній протягом 20 діб. Життєздатність культур перевіряли висівом вмісту плоду на поверхню картопляного агару. В основі визначення антигенів, споріднених еритроцитам людини груп А (ІІ) і В (ІІІ), було спостереження за зменшенням титру ізогемаглютинінів моноспецифічних сироваток анти-А і анти-В після їх виснаження біомасою бактерій, що вивчались. Для дослідів використовували ізогемаглютинуючі сироватки ІІ і ІІІ груп, виснажені досліджуваними штамами, і 5 % суспензію свіжих еритроцитів. Сироватки розводили від 1 : 2 до 1 : 128. Критерієм наявності гетерогенних антигенів було зниження рівня антитіл до еритроцитів груп А (ІІ) і В (ІІІ) в порівнянні з титром контрольних сироваток не менше, ніж на два розведення.

Результати дослідження та їх обговорення. Для вивчення у клебсієл складу поліамінів було взято в дослід по 20 штаммів К. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae, 10 штамів K. oxytoca i по 6 штамів K. planticola i K.terrigena. Використано штами різного походження (музейні, ізольовані від хворих людей та із оточуючого середовища).

Дослідження показали, що за якісним складом поліамінів клебсієли поділяються на дві чітко відокремлені групи: до першої групи входять бактерії підвиду K. pneumoniae subsp. pneumoniae та видів K. planticola, K. terrigena i K. oxytoca (містять путресцин); другу групу складають клебсієли підвидів К. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae (містять путресцин і спермідин).

Жирнокислотні профілі клітин типових штамів K. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. planticola, K. terrigena, K. oxytoca i “K. trevisanii“ (K. planticola) складаються із прямоланцюгових насичених і мононенасичених жирних кислот (С12 - С18), а також циклопропанових - метиленгексадеканової (С17) і метиленоктадеканової (С19) .Оксикислоти представлені 3-окситетрадекановою кислотою (3-ОН-С14:0). В жирнокислотному спектрі клітин переважають гексадеканова (С16:0), гексадеценова (С16:1), октадеценова (С18:1) і метиленгексадеканова кислоти.

За складом клітинних жирних кислот типові штами К. planticola, K. terrigena i K. oxytoca однорідні і мало відрізняються від типового штаму К. pneumoniae subsp. pneumoniae. Різниця заключається в основному у меншому вмісті (в 2 і більше разів) в клітинах К. pneumoniae subsp. pneumoniae додеканової кислоти (С12:0) в порівнянні із вмістом цієї кислоти в клітинах штамів вищезазначених видів.

Вивчення складу клітинних жирних кислот клебсієл при різних умовах культивування показало, що ця ознака у клебсієл підлягає тим же закономірностям, які були встановлені при дослідженні інших ентеробактерій: в умовах культивування на твердому середовищі та при більш високій температурі зростає вміст циклопропанових жирних кислот і зменшується вміст їх біосинтетичних попередників - мононенасичених жирних кислот, що пов'язано з адаптивною функцією циклопропанових жирних кислот ( З.П. Васюренко, 1980 ).

В ЛПС типових штамів клебсієл визначені в основному прямоланцюгові насичені жирні кислоти та оксикислоти (табл. 1). Встановлено також наявність незначної кількості ненасиченої жирної кислоти С16:1. Жирнокислотні профілі ЛПС типових штамів K. oxytoca, K. terrigena i K.planticola подібні і відрізняються від профіля типового штаму К. pneumoniae subsp. pneumoniae більш високим (у 5 - 6 разів ) вмістом С12:0 і відсутністю 2-окситетрадеканової кислоти (2-ОН-С14:0), яка присутня в ЛПС штаму К. pneumoniae subsp. pneumoniae в достатньо значимій кількості - 6,8 % від загальної кількості жирних кислот в ЛПС.

Типовий штам “К. trevisanii“ має такий же склад жирних кислот клітин і ЛПС, як і типовий штам К. planticola, що підтверджує класифікацію цих бактерій як один вид (K. planticola ) за генотиповими і іншими фенотиповими ознаками.

Таблиця 1

Cклад жирних кислот ЛПС клебсієл

( в % від загальної кількості жирних кислот в ЛПС )

Таким чином, якщо за складом клітинних жирних кислот типові штами K. planticola, К.terrigena i K. oxytoca незначно відрізняються від типового штаму К. pneumoniae subsp. pneumoniae, то в складі жирних кислот ЛПС зазначених бактерій виявлені суттєві відмінності.

На таксономічну значимість наявності чи відсутності 2-оксикислот в ЛПС вперше звернули увагу К. Bryn i E.T. Rietschel (1978) при вивченні ряду ентеробактерій. Цей феномен був виявлений на видовому рівні у бактерій роду Bordetella при дослідженні клітинних жирних кислот, що без сумніву пов'язано із жирнокислотним складом ЛПС (В. bronchiseptica містить 2-ОН-С12:0 на відміну від В. pertussis i B. parapertussis, у яких ця кислота відсутня) (E.Jantzen et al.,1982; Y.Kawai, A.Moribayashi, 1982 ); на видовому рівні при дослідженні ЛПС бактерій роду Enterobacter (О.М.Чернявська, З.П.Васюренко,1984 ) та на рівні роду при вивченні ЛПС бактерій Escherichia, Salmonella і Shigella (K.Bryn, E.T.Rietschel, 1978; О.М.Чернявська, З.П.Васюренко, 1983 ). Виходячи з цих даних, можна зробити висновок про наявність філогенетичної відстані між K. planticola, K. terrigena i K.oxytoca, з одного боку, та K. pneumoniae subsp. pneumoniae, з другого, і обгрунтованість таксономічного обособлення сапрофітних клебсієл в окремі види.

Нами вивчено і оцінено з таксономічної точки зору деякі особливості метаболізму клебсієл, зокрема газообміну при зброджуванні цукрів в умовах додаткового введення в поживне середовище різних джерел вуглеводного і азотного живлення.

Досліджено 17 штамів К. pneumoniae subsp. pneumoniae різного походження; по 2 штами К.pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae, ізольованих із організму хворих людей; 4 штами K. oxytoca, також виділених від хворих людей; 7 штамів K. planticola i 17 штамів K.terrigena, ізольованих із води, грунту і рослин.

Найбільша активність бродіння виявлена у клебсієл із бутандіоловим варіантом зброджування (К. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. oxytoca, K. planticola, K terrigena). Кількісне співвідношення виділених СО2 і Н2 у них складало приблизно 2:1 (рис. 1). Бактерії, що мали змішаний варіант мурашино-кислого бродіння, продукували невелику кількість СО2 і Н2 (К.pneumoniae subsp. ozaenae), або взагалі не продукували Н2 (К. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis). При додатковому введенні в середовище із пептоном глюкози в 1,8-4,3 рази збільшувалося виділення СО2 клебсієлами, що зброджували цукри за бутандіоловим варіантом (рис. 1). При цьому значно зростала чисельність бактерій і кількість продукованих кислот.

Виділено СО2 в об'ємних процентах при розвитку бактерій на середовищах, які містять: а - пептон; б - пептон + глюкоза + N-NH4; в - пептон + глюкоза + N-NO3. Виділено Н2 в об'ємних процентах при розвитку бактерій на середовищі: г - пептон + глюкоза + N-NH4. Досліджені бактерії: 1 - K. pneumoniae subsp. pneumoniae; 2 - K. pneumoniae subsp. ozaenae; 3 - K. pneumoniae subsp. rhinosсleromatis; 4 - K.oxytoca; 5 - K. terrigena; 6 - K. planticola.

Разом з тим при введенні в середовище глюкози аналогічні показники у клебсієл, що зброджували цукри за змішаним варіантом мурашино-кислого бродіння, змінювались в незначній мірі. При введенні в середовище із пептоном сахарози були отримані подібні результати.

При заміні в середовищі росту аміачної форми азоту на нітратну або при додаванні нітратів у середовище із глюкозою спостерігалося різке пригнічення розвитку клебсієл із бутандіоловим варіантом бродіння. (рис. 1). Кількість виділеного СО2 при цьому зменшувалась у 4-5,5 разів, повністю пригнічувалась гідрогеназна активність, а чисельність бактерій зменшувалась в 1000 разів. Разом з тим бактерії K. pneumoniae subsp rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae проявляли більшу стійкість до дії нітратів. У них також відзначалось повне пригнічення гідрогеназної активності, кількість виділеного СО2 зменшувалась в 1,2 - 1,8 разів, а чисельність бактерій в 2 - 10 разів.

Слід зазначити, що не було виявлено різниці в характері газообміну на середовищах із пептоном, цукрами і різними джерелами азотного живлення при рості штамів K. pneumoniae subsp. pneumoniae, ізольваних від людей із захворюваннями шлунково-кишкового тракту і позакишкової локалізації, від здорових людей та із навколишнього середовища (рис. 2), що вказує на відносну стабільність досліджених властивостей та їх таксономічну значимість.

Таким чином, особливості метаболізму, як і склад поліамінів, свідчать, що К. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae фенотипово більш віддалені, ніж K.planticola, K. terrigena i K. oxytoca від K. pneumoniae subsp. pneumoniae. На це вказують і літературні дані про склад клітинних жирних кислот К. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae, який суттєво відрізняється від жирнокислотного складу клітин К. pneumoniae subsp. pneumoniae відсутністю визначаємої кількості циклопропанових жирних кислот та більш високим вмістом ненасичених жирних кислот (З.П. Васюренко,1980; З.П. Васюренко із співавт.,1989). Щодо цих відмінностей, то вони були встановлені на видовому рівні при дослідженні бактерій роду Providencia (З.П. Васюренко із співавт., 1982), роду Bordetella (Y. Kawai, А. Moribayashi, 1982; З.П. Васюренко із співавт., 1984 ) та бактерій деяких інших родів.

Зазначені вище дані свідчать не на користь розглядання К. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae як підвидів виду K. pneumoniae. Визнана раніше класифікація з обособленням цих бактерій в окремі види більш відповідала їх біологічним особливостям.

Згідно даних чисельних досліджень з використанням нумеричного аналізу фенотипових ознак, бактерії “K. rinoscleromatis“ i “K. ozaenae“ чітко відособлювались в окремі види (S.T. Cowan et al.,1960; M.A. Fife et al., 1965; S. Slopek, I. Durlakova, 1967; S. Bascomb et al., 1971), що корелює із результатами вивчення хемотаксономічних маркерів.

“K. rhinoscleromatis“ i “K. ozaenae“ були включені у вид К. pneumoniae як підвиди на підставі результатів ДНК - ДНК гібридизації (D.J. Brenner et al., 1972). Ступінь реасоціації при 750 С ДНК штаму “K. ozaenae“ i штаму “K. rhinoscleromatis“ з ДНК штаму K. pneumoniae склав відповідно 74% і 77 % (D.J. Brenner et al., 1972). Проведені пізніше C. Ferragut із співавт. (1989 ) дослідження рівня гомології ДНК клебсієл різних таксонів підтвердили ці дані. Згідно D.J. Brenner (1981), для штамів одного виду запропоновано рівень гомології ДНК, що перевищує 70 %.

Хоча цей генотиповий тест визнається як ведучий в таксономії бактерій, безумовне прийняття його за основу в класифікації без врахування інших таксономічних ознак, передусім хемотаксономічних, потребує подальшого вивчення і оцінки.

При визначенні наявності ряду факторів патогенності у К. pneumoniae subsp. pneumoniae виявлена слабовиражена здатність до адгезії та інвазії у всіх досліджених штамів (291). Індекс адгезивності у штамів різного походження коливався від 3,8 до 7, 3. Продукція ентеротоксинів встановлена у 10,8 % штамів (із 291), причому клебсієли продукували в основному термостабільний ентеротоксин (9,2 %). Найбільша питома вага ентеротоксигенних культур була серед клебсієл, виділених від здорових людей (25 %), а найменша - серед культур, ізольваних із навколишнього середовища (4 %). Гемаглютинацію еритроцитів морської свинки викликало лише 4-5 % штамів (із 67 досліджених), виділених від хворих кишковими захворюваннями та захворюваннями позакишкової локалізації. Але у 90-94 % штамів (із 67 досліджених) виявлена антилізоцимна активність. Також у 18 штамів K. planticola i K. terrigena, виділених із води, рослин та грунту, встановлена наявність антилізоцимної активності. Інші досліджені фактори патогенності у сапрофітних клебсієл не виявлені.

Таким чином, у штамів K. planticola i K. terrigena в порівнянні із штамами К. pneumoniae subsp. pneumoniae проявляється дуже низький патогенний потенціал, але не його відсутність.

В літературі ми зустріли лише одне повідомлення про ізоляцію штамів K. planticola із клінічного матеріалу, в основному мокроти і сечі хворих людей (M. Mori et al., 1989 ).

Також R.Podschun із співавт. (1990) виявили експресію маннозочутливих і маннозорезистентних аглютинінів Klebsiella - типу у більшості досліджених штамів K. terrigena - відповідно у 74 і 96 %.

Штами К. planticola, K. terrigena i K. oxytoca,типові і ізольовані із філосфери овочевих культур та дикоростучих рослин, а також музейний штам К. oxytoca, досліджено по 3 штами кожного виду- проявляли виражену ентомопатогенну дію на яйця і личинки колорадського жука (Leptinolarsa desemlineata). На 2-3 день після інфікування яєць спостерігалась їх 90% смертність. Максимальна інтенсивність загибелі личинок ІІ віку припадала на 4 - 7-й день спостереження.Симптоми захворювання у личинок четвертого віку появились тільки на 4 - 5 день. Визначення клебсієл у гемолімфі личинок свідчило про розвиток септицемії. Можливо, вoна викликана підвищеною проникністю стінок кишечника личинок (В. Мориг, Б. Месснер, 1969). Однією із ланок інсектицидної дії клебсієл може бути їх здатність розкладати лізоцим та хітинолітична активність (А.І. Туряниця, 1990). Отримані дані дозволяють віднести клебсієли видів К. planticola, K. terrigena i K. oxytoca до бактерій, що перспективні для використання у засобах захисту корисних рослин від колорадського жука.

Убіквітарність клебсієл та їх не тільки патогенна дія на хазяїв, а й розповсюдження у природі як асоціантів рослин, привертають увагу з точки зору визначення механізмів адаптації цих бактерій до різних екологічних ніш та їх позитивного впливу на розвиток корисних для людини рослин. Проведені нами в цих напрямках досліджненя показали стимулюючу дію клебсієл на ріст і розвиток стебла і кореня капусти (Brassica oleraceae) та салату (Lactuca satіva), а також енергію проростання насіння зазначених овочевих культур. Вивчено по 4 штами К. planticola i K. terrigena, по 2 штами К. pneumoniae 3-х підвидів і 1 штам К. oxytoca. Стимулюючий ефект спостерігався під впливом клебсієл всіх видів, а також підвидів К. pneumoniae, в тому числі патогенних для людини К. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae. Так, зокрема, найбільш виражений стимулюючий ефект на енергію проростання насіння капусти спостерігався під впливом штамів К. planticola, K. terrigena i K. pneumoniae subsp. ozaenae. Отже, одержані дані свідчать про те, що стимулююча дія на ріст і розвиток рослин притаманна представникам всіх таксономічних груп роду Klebsiella , тобто є родовою ознакою.

Досліджені штами клебсієл продукували комплекс вітамінів групи В: у значній кількості - В1, В2, В3, в дещо меншій - В6 та у незначній кількості - В12. За літературними даними, вітаміни В1, В2 і В3 мають здатність прискорювати розвиток рослин (С.С. Сидоренко, 1966). Тому продукцію вітамінів групи В ймовірно можна розглядати як один із механізмів стимулюючого впливу клебсієл на ріст і розвиток овочевих культур.

Виявлені нами штами клебсієл з найбільш вираженою позитивною дією на ріст і розвиток корисних рослин доцільно використати в сільському господарстві.

Як показали проведені нами дослідження, значна кількість штамів К. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis, K. pneumoniae subsp. ozaenae i K. oxytoca мають антигени, спільні з еритроцитами людини груп А і В, а також одиничні штами К. planticola i K.terrigena - антигени, спільні з еритроцитами людини групи В (табл. 2).У цьому експерименті були використані штами - музейні, свіжовиділені із клінічного матеріалу та філосфери рослин. 80% штамів клебсієл, що містять зазначені антигени, були ізольвані із клінічного матеріалу.

Таблиця 2

Штами клебсієл, що мають антигени, спільні із еритроцитами людини

Надбання бактеріями антигенної спорідненості із еритроцитами людини є один із прикладів антигенної мімікрії в природі, що, очевидно, можна розглядати як механізм підвищення вірулентності бактерій за рахунок дезорієнтації хазяїна (Н.Н. Жуков-Вережніков із співавт., 1973 ). Можливо, що у випадку клебсієл наявність перехресно реагуючих антигенів паразита і хазяїна доцільна для адаптації збудника до екологічної ніші та персистенції в організмі хазяїна.

При довготривалому культивуванні в зелених плодах томатів більшість штамів К. pneumoniae трьох підвидів і К. oxytoca втрачали антигени, що перехресно реагували з еритроцитами людини. Штами сапрофітних видів К. planticola i K. terrigena зберігали антигени мімікрії на протязі всіх 3-х пасажів. В ряді випадків безкапсульні штами клебсієл в процесі росту в плодах томатів придбали капсулу.

Отримані дані вказують на здатність рослини-хазяїна суттєво впливати на біологічні властивості бактерій.

Важливим ми вважаємо встановлення присутності антигенів мімікрії у деяких штамів К.planticola i K. terrigena. Цей факт, поряд із зазначеним вище (наявність у штамів сапрофітних клебсієл антилізоцимної активності та ентомопатогенних властивостей), свідчить про можливість зростання патогенного потенціалу сапрофітних клебсієл і їх майбутньої ролі як умовно-патогенних для людини бактерій.

ВИСНОВКИ

1. За якісним складом поліамінів штами K. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. oxytoca, K. planticola та K. terrigena подібні (містять путресцин), суттєво відрізняючись від штамів K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis і K. pneumoniae subsp. ozaenae, які складають за даною ознакою однорідну групу (містять путресцин і спермідин).

2. Типові штами K. oxytoca, K. planticola, K. terrigena та “K. trevisanii” мають однотипний якісний та кількісний склад клітинних жирних кислот (містять насичені, мононенасичені і циклопропанові жирні кислоти) та відрізняються від типового штаму K. pneumoniae subsp. pneumoniae в основному більш високим вмістом додеканової кислоти (у 2-3 рази).

3. Ліпополісахариди типових штамів K. oxytoca, K. planticola, K. terrigena та “K. trevisanii” мають у складі переважно оксикислоти і насичені жирні кислоти з домінуючими 3-окситетрадекановою і тетрадекановою кислотами та відрізняються від ліпополісахариду типового штаму K. pneumoniae subsp. pneumoniae відсутністю 2-окситетрадеканової кислоти і більш високим вмістом (у 5-6 разів) додеканової кислоти.

4. За особливостями метаболізму (газообміну при зброджуванні цукрів в умовах наявності у поживному середовищі різних субстратів) клебсієли поділяються на дві групи: перша група охоплює K. pneumoniae subsp. pneumoniae, K. oxytoca, K. planticola і K. terrigena (бутандіоловий варіант бродіння); другу групу складають K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis і K. pneumoniae subsp. ozaenae (змішаний варіант мурашино-кислого бродіння).

5. Не виявлено залежності вивченої метаболічної активності штамів K. pneumoniae subsp. pneumoniae від їх походження, що свідчить про таксономічну цінність цієї ознаки.

6. Дані про склад поліамінів і клітинних жирних кислот клебсієл (приймаючи до уваги літературні дані про склад клітинних жирних кислот K. rhinoscleromatis і K. ozaenae, а також особливості метаболізму цих бактерій свідчать не на користь включення “K. rhinoscleromatis” і “K. ozaenae” у вид K. pneumoniae як підвидів. Результати вивчення складу жирних кислот ліпополісахаридів типових штамів клебсієл підтверджують наявність певної філогенетичної відстані між K.pneumoniae subsp. pneumoniae, з одного боку, та K. planticola, K. terrigena і K. oxytoca, з другого, а також обгрунтованість виділення сапрофітних клебсієл в окремі види.

7. У вивчених штамів K. planticola і K. terrigena не виявлено здатності до адгезії, інвазії, продукції ентеротоксинів і гемаглютинації еритроцитів морської свинки на відміну від штамів K.pneumoniae subsp. pneumoniae, які проявляли зазначені фактори патогенності. Проте більшість штамів K. planticola та K. terrigena, як і K. pneumoniae subsp. pneumoniae, інактивували лізоцим у поживному середовищі.

8. В експерименті встановлена ентомопатогенна дія штамів K. oxytoca, K. planticola і K. terrigena на яйця і личинки колорадського жука (Leptіnolarsa desemlineata).

9. Показана стимуляція росту та розвитку салата (Lactuca sativa) та капусти (Brassica oleraceae) клебсієлами всіх таксономічних груп. Одним із механізмів активації можна вважати продукцію клебсієлами вітамінів групи В.

10. Виявлена наявність у значній кількості (9,4-38 %) штамів K. pneumoniae трьох підвидів та K.oxytoca антигенів, спільних з еритроцитами людини (груп А і В), та у одиничних штамів K.planticola та K. terrigena (2,1-5,5 %) - антигену, спільного з еритроцитами людини групи А.

11. При довготривалому культивуванні у зелених плодах томатів штами K. pneumoniae і K.oxytoca в тій чи іншій мірі втрачають антигени, спільні з еритроцитами людини. Цей феномен імовірно можна розглядати як один із механізмів адаптивної пластичності клебсієл.

12. Визначення наявності у сапрофітних клебсієл антигенів мімікрії (антигенів, спільних з еритроцитами людини), антилізоцимної активності та ентомопатогенних властивостей свідчить про можливість зростання патогенного потенціалу сапрофітних клебсієл до рівня, що достатній при певних умовах для викликання інфекції у людини.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Семенова Е.А., Белькова Е.И., Пищик В.Н., Коваль Г.Н., Вассер Н.Р., Черняева И.И., Смирнова Л.А., Туряница А.И. Физиолого-биохимические свойства штаммов Klebsiella pneumoniae различного происхождения // Микробиол. журн. - 1993. - 55. - № 3. - С.57-63.

2. Туряница А.И., Петак А.М., Коваль Г.Н., Шарга Б. М. Содержание антигенов мимикрии у бактерий рода Klebsiella при культивировании их в растительной ткани // Микробиол. журн. - 1994. - 56. - № 4. - С. 20-25.

3. Пищик В.Н., Черняева И.И., Семенова Е.А., Белькова Е.И., Вассер Н.Р., Коваль Г.Н., ТуряницаА.И. Особенности метаболизма бактерий рода Klebsiella // Микробиология. - 1997. - 66. - № 1. - С. 54-59.

4. Коваль Г.М., Ніколайчук В.І., Петросова В.І., Бойко Н.В. Ентомопатогенні властивості сапрофітних представників роду Klebsiella // Науковий вісник Ужгородського університету. Сер. Біологія. - 1999. - № 6. - С. 179-182.

5. Koval G.N., Turianica A.I., Sabov V.A., Pomasova V.I. Lactuca sativa and Brassica oleracеae growth stimulation by saprophytic Klebsiella // Мат. Міжнародної регіональної конф. - 1996. - Ужгород. -С. 102-103.

6. Koval G.N. Physiologo-biochemical features of saprophytic bacteria strains of genus Klebsiella // Proc. Int. regional seminar of environtment protection; modern studies in ecology and microbiology. - V. 2. - Uzhgorod. - 1997. - P. 269-271.

Анотація

Коваль Г.М. Систематика та біологія бактерій роду Klebsiella. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук по спеціальності 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного HАН України, Київ, 1999.

Показано, що за складом поліамінів і клітинних жирних кислот та особливостями метаболізму K. planticola, K. terrigena i K. oxytoca більш близькі, ніж K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis i K. pneumoniae subsp. ozaenae, до К. pneumoniae subsp. pneumoniae. Ці дані свідчать не на користь включення “K. rhinoscleromatis” і “K. ozaenae” у вид K. pneumoniaе як підвидів. Суттєві відмінності у складі жирних кислот ліпополісахаридів К. pneumoniae subsp. pneumoniae, з одного боку, і K. planticola, K. terrigena i K. oxytoca, з другого, підтверджують наявність певної філогенетичної відстані між ними і обгрунтованість виділення сапрофітних клебсієл в окремі види. У сапрофітних клебсієл виявлені антилізоцимна активність і ентомопатогенні властивості. Досліджено ряд аспектів стимулюючої дії клебсієл на ріст і розвиток корисних рослин. Встановлено присутність у штамів всіх видів клебсієл антигенів мімікрії (споріднених із еритроцитами людини) та їх втрату при вирощуванні в тканинах рослин. Одержані дані доповнюють уявлення про механізми адаптації клебсієл до екологічних ніш та їх пластичність як патогенів і асоціантів.

Ключові слова: Klebsiella, систематика, поліаміни, жирні кислоти, ліпополісахариди, метаболізм, патогенність, антигени мімікрії.

Коваль Г.Н. Систематика и биология бактерий рода Klebsiella. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 1999.

Диссертационная работа посвящена вопросам систематики клебсиелл и их взаимодействия с организмом человека, насекомыми и растениями. Показано, что по составу полиаминов и клеточных жирных кислот, а также особенностям метаболизма (газообмена при брожении сахаров в условиях наличия в питательной среде различных субстратов) K. planticola, K. terrigena и K. oxytoca более близки, чем K.pneumoniae subsp. rhinoscleromatis и К. pneumoniae subsp. ozaenae, к K. pneumoniae subsp. pneumoniae. Эти данные свидетельствуют не в пользу включения “K.rhinoscleromatis” и “K. ozaenae” в вид K. pneumoniaе как подвидов. Существенные различия в составе жирных кислот липополисахаридов К. pneumoniae subsp. pneumoniae, с одной стороны, и K. planticola, K. terrigena и K. oxytoca, с другой, подтверждают наличие некоторой филогенетической дистанции между этими бактериями и обоснованность выделения сапрофитных клебсиелл в отдельные виды. При изучении факторов патогенности выявлено наличие антилизоцимной активности у штаммов сапрофитных клебсиелл. Установлено энтомопатогенное действие штаммов K. planticola, K. terrigena и K. oxytoca на яйца и личинки колорадского жука. Исследован ряд аспектов стимулирующего влияния клебсиелл на рост и развитие овощных культур, одним из факторов которого можно считать продукцию клебсиеллами витаминов группы В. Определены наличие у штаммов всех видов Klebsiella антигенов мимикрии (родственных эритроцитам человека) и их потеря штаммами К. pneumoniae и K. oxytoca при длительном культивировании в зеленых плодах томатов. Полученные данные дополняют представления о механизмах адаптации клебсиелл к экологическим нишам и их пластичности как патогенов и ассоциантов.

Ключевые слова: Klebsiella, систематика, полиамины, жирные кислоты, липополисахариды, метаболизм, патогенность, антигены мимикрии.

Koval G.M. Systematics and biology of the genus Klebsiella bacteria. - The manuscript.

The thesis for obtaining candidate degree in biological sciences on speciality 03.00.07 - microbiology. - D.K.Zabolotny Institute of Microbiology and Virology of NAS of Ukraine, Kyiv, 1999.

It was shown fhat K. planticola, K. terrigena and K. oxytoca were more close than K. pneumoniae subsp. rhinoscleromatis and К. pneumoniae subsp. ozaenae to K. pneumoniae subsp. pneumoniae in polyamine composition, cellular fatty acid composition and metabolism peculiarities. These data not indicate in favour of inclusion of “K.rhinoscleromatis” and “K. ozaenae” in the species K. pneumoniae as subspecies. The essential differences in lipopolysaccharide fatty acid composition of K. pneumoniae subsp. pneumoniae, on one hand, and those of K. planticola, K. terrigena and K. oxytoca, on other hand, confirm the presence of certain phylogenetic distance between these bacteria and substantiation of isolation of saprophytic klebsiellae in separate species. The antilysozymic activity and entomopathogenic properties of saprophytic klebsiellae were founded. Some aspects of stimulating influence of klebsiellae on the growth of useful plants were investigated. The presence of the mimicry antigens (related to human erythrocytes) in strains of all species of Klebsiella and their loss during cultivation in plant tissues were founded. The obtained data complete the ideas of the mechanisms of klebsiellae adaptation to ecological niches and their plasticity as pathogens and associants.

Key words: Klebsiella, systematics, polyamines, fatty acids, lipopolysaccharides, metabolism, pathogenicity, mimicry antigens.

Размещено на Allbest.ru