Роль вітаміну Е у процесах функціонування клітинних ядер та мітохондрій печінки щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ ІМЕНІ ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора біологічних наук

РОЛЬ ВІТАМІНУ Е У ПРОЦЕСАХ ФУНКЦІОНУВАННЯ КЛІТИННИХ ЯДЕР ТА МІТОХОНДРІЙ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ

Спеціальність: Біохімія

Капралов Олександр Олександрович

Київ, 2000 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

У роботі використовували білих щурів масою 150-200 г. У серії дослідів для моделювання дефіциту вітаміну Е тварин з початковою масою тіла 40-50 г. утримували на Е-гіповітамінозному раціоні А40 впродовж 2 міс. (Edvin, 1961).

Виділення та фракціонування ядер печінки проводили при 0-4о С. Усі використані розчини містили як інгібітор протеіназ, 1мМ фенілметилсульфонілфторид (Ballal, 1975). Ядра виділяли за методом (Blobel, 1966), розчини 0,25 М і 2,2 М цукрози готували на ТМК- буфері (50 мм. тріс-НCl (рН 7,4), 5 мм. МgCl2, 25 мм. КСl). Виділення хроматину проводили за методом (Гілмор, 1987), ядерний матрикс отримували за методом (Kaufmann, 1986). Мітохондрії з печінки щурів отримували за методом (Parsons, 1967) у середовищі, що містило 0,225 М манніт, 0,07 М цукрозу, 0,002 М ЕДТА на 10 мм. трис-НСl буфері (рН 7,4). Солюбілізацію мембранних білків мітохондрій та ядер проводили розчином 1% тритону Х-100 за (Nicholson, 1986).

Зв'язування (3Н) токоферолу з ядрами вивчали у розчині 0,25 М цукрози на ТМК-буфері, зв'язування з хроматином - у 10 мм. трис-НСl буфері (рН 8,0) - 10% гліцерині - 1 мм. дитіотриетолі. У обох випадках проба об'ємом 0,5 мл. містила 1.0 мг. білка. У інкубаційне середовище додавали різні концентрації d,l токоферолу, розчиненого у етанолі (кінцева концентрація спирту у середовищі становила не більше 2%). Реакцію проводили впродовж 20 хв. при 20^оС, зупиняли додаючи 10-ти кратний надлишок охолодженого буфера інкубації та центрифугували. Процедуру відмивки повторювали. Осад розчиняли у 200 мкл 5% додецилсульфату натрію (ДСН), у аліквотах визначали вміст білка та радіоактивність, яку вимірювали за допомогою лічильника “SL-30” (Франція). Для визначення специфічного зв'язування проби попередньо інкубували з 5 мкМ неміченого токоферолу. Специфічне зв'язування визначали як різницю між загальним зв'язуванням та зв'язуванням у присутності надлишку неміченого токоферолу. Вивчення залежності зв'язування (3Н) токоферолу з білками мембран ядер та мітохондрій від концентрації його у пробі проводили, додаючи екстракт, отриманий після обробки ядер чи мітохондрій 1%-ним тритоном Х-100, до 50% суспензії гідроксиапатиту (ГАП) у 20 мм. К-фосфатному буфері (рН 7,2). Проба об'ємом 0,5мл містила1 мг. білка. Надлишок токоферолу відмивали центрифугуванням.

Для визначення зв'язування вітаміну з ізольованими ядрами у присутності цитозолю останній попередньо інкубували з (3Н)-токоферолом з розрахунку 100 тис.імп/хв на 1мг білка. Вітамін Е, що не зв'язався, видаляли використовуючи систему декстранвугілля (Milgrom, 1969).

Гідроліз хроматину ДНКазою I проводили, інкубуючи ядра при 4о C у СТМК буфері, що містив різні концентрації ферменту. Потім у проби додавали рівний об'єм 1н HClO4 та центрифугували. У аліквотах надосадової визначали поглинання при 260 нМ (Abe, 1982, Re, 1985).

Визначення ендогенної РНК-полімеразної активности у ізольованих ядрах, хроматині, ядерному матриксі та мітохондріях проводили за методом (Марзлаф, 1987). Середовище інкубації для визначення ДНК-полімеразної активності у ізольованих ядрах, мітохондріях, хроматині та ядерному матриксі містило 50 мм. тріс-HCl (рН 7,4), 6 мм. MgCl2, 15 мM KCl, 6 мм. 2-меркаптоетанола, 2 мм. АТР та 200 мкМ кожного з dATP, dCTP, dGTP и 20 мкМ (3Н)-dTTP. При визначенні як РНК-, так і ДНК-полімеразної активності реакцію починали додаванням 50 мкл досліджуваного матеріалу з початковою концентрацією 1-2 мг. ДНК/мл. Кінцевий об'єм інкубаційного середовища становив 100 мкл.

Проби інкубували 10-15хв. при 25^оС у разі вивчення РНК-полімеразної активності та 1 год. при 37^оС при вивченні ДНК-полімеразної активності. Реакцію зупиняли додаванням охолодженого розчину, що містив 10% трихлороцтової кислоти, 1% пірофосфату натрію. Мітку, що не включилася, видаляли використовуючи нітроцеллюлозні фільтри "Millipore" за допомогою приладу "Домбідот"(Диа-М, Росія).

Лімфоцити та нейтрофіли виділяли з крові донорів центрифугуванням у градієнті фікол-верографіну (d=1,077) (Boyum, 1968). При цьому нейтрофіли знаходилися у осаді, а лімфоцити - на межі градієнту.

Реакцію трансформації проводили за методом (Киселева,1985). Як мітогени при дослідженні клітин крові людини використовували фітогемагглютинін (ФГА), а при дослідженні клітин щурів конканавалін А.

Для підрахунку індексу стимуляції від експериментальних даних віднімали фонові (отримані за відсутності ФГА) та вираховували відношення дослід/контроль.

Концентрацію супероксиду визначали за допомогою нітросинього тетразолію (Muller, 1989).

У разі використання фракції ТЗБ її вміст у пробі становив 25-35 мкг. А23187, ФМЛП та верапаміл використовували у концентрації 1 мкМ, а ФМА - у концентрації 100 нг/мл.

Електрофорез білків у ПААГ з ДСН проводили по методу (Laemmli, 1980), використовуючи градіент концентрації акриламіду 7,5-20%. Хроматографію на гідроксиапатиті проводили по (Gasiewicz, 1982).

Статистична обробка результатів проводилася з використанням методів варіаційної статистики (Ойвин, 1960).

2. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Дія токоферолу на синтез РНК та ДНК у ізольованих ядрах та ядерному матриксі. Оскільки одним з показників функціональної активності ядер є синтез нуклеїнових кислот, перш за все була досліджена дія токоферолу на РНК- и ДНК-полімеразну активність ізольованих ядер печінки щурів. Виявлено зменшення (на 31%) РНК-полімеразної активності ядер клітин печінки вітамін Е-дефіцитних щурів порівняно з ядрами інтактних тварин. У той же час додавання у середовище інкубації токоферолу у кінцевих концентpаціях 0,25 мкМ та 1 мкМ не впливає на РНК-полімеразну активність ядеp щурів обох груп. Додавання вітаміну викликає збільшення ДНК-полімеразної активності ізольованих ядер печінки контрольних щурів. При утриманні щурів на вітамін Е-дефіцитному раціоні не спостерігалось достовірних змін цього показника порівнянне з контролем, а також не виявлялась активуюча дія токоферолу. В цілому, вплив токоферолу на синтез РНК та ДНК у Е-гіповітамінозних щурів був виражений значно менше, ніж у контрольних.

Ми припустили, що зменшення впливу токоферолу на синтез нуклеїнових кислот у ядрах Е-гіповітамінозних щурів може бути обумовлено порушенням у цих умовах синтезу ТЗБ, які відіграють важливу роль у дії цього вітаміну. Підтвердженням цієї гіпотези є дані стосовно дії токоферолу на РНК-полімеразну активність ядерного матриксу, якій відіграє важливу роль у процесах синтезу РНК та ДНК.

Як відомо, саме у складі цього компоненту ядра локалізовані ферменти реплікації та транскрипції, з ним зв'язані знов-синтезовані ділянки РНК та ДНК (Георгиев,1989, Збарский, 1988). Утримання тварин на Е-гіповітамінозному раціоні призводило до зниження РНК-полімеразної активності цього компоненту ядра порівняно з контролем. Додавання токоферолу in vitro не впливало на синтез РНК, тоді як введення токоферолу тваринам за 18 годин до забою призводило до його підвищення. Додаткове внесення на цьому фоні вітаміну Е у інкубаційне середовище призводило до повного відновлення РНК-полімеразної активності до рівня контролю. Цілком можливо, що виявлені нами відмінності у ефектах на синтез РНК у ядерному матриксі Е-гіповітамінозних тварин токоферолу доданого у інкубаційне середовище та введеного тваринам можуть бути обумовлені залученням у дію вітаміну Е, внесеного in vivo присутніх у організмі ендогенних ТЗБ.

Таким чином, виходячи з наведених результатів наших дослідів можна зробити висновок, що токоферол може впливати на процеси синтезу нуклеїнових кислот у клітинному ядрі. Більш значний вплив вітаміну на ці процеси проявляється за умови його внесення in vivo, а не in vitro, що може бути пов'язане з залученням у його дію ТЗБ.

Відомо, що однією з характерних ознак ТЗБ є здатність специфічно зв'язувати токоферол (Халмурадов, 1980, Донченко, 1988). Тому для більш детального вивчення питання про наявність ТЗБ у складі ядра ми перш за все дослідили специфічність зв'язування токоферолу з ядром та суб'ядерними компонентами. Загально прийнято, що критеріями наявності специфічної взаємодії будь-якого низькомолекулярного ліганду з біологічним матеріалом є зменшення зв'язування при попередній інкубації у присутності надлишку неміченого ліганду та наявність плато на кривій специфічного зв'язування (Варфоломєєв, 1982, Clark, 1984). Виходячи з цього у наших дослідах були використані нативні ядра, та ядра, які попередньо інкубували у присутності 600 - кратного надлишку неміченого вітаміну.

Взаємодія токоферолу з ізольованими ядрами та хроматином.

При вивченні зв'язування з ядрами (3Н) токоферолу (1,5 нМ - 7,6 мкМ) виявлено, що предінкубація з надлишком неміченого вітаміну не викликає зниження радіоактивності ядер, тобто загальне зв'язування вітаміну Е з нативними ядрами має неспецифічний характер. При дослідженні суб'ядерної локалізації зв'язуючих його ділянок виявлено, що найбільша питома радіоактивність та процент зв'язаного ліганда (85,8 %) спостерігаються у фракції, що екстрагується при обробці ядер 1 % тритоном Х-100, у склад якої входять, головним чином, гідрофобні компоненти ядерної мембрани (Петрова, Капралов, 1992). Близько 12,1 % міченого токоферолу було знайдено у фракції хроматину, яку отримали обробкою ядер ДНКазою I. Тільки 0,93% мітки зв'язувалося з фракцією ядерного матрикса, отриманою після послідовної обробки ядра вищевказаними реагентами. Виключно у цій фракції було виявлено достовірне зменшення зв'язування мітки при додаванні надлишку неміченого ліганда, що свідчить про його специфічність. Електрофоретичні дослідження показали, що при недостатності вітаміну Е спостерігаються кількісні зміни білків ядерного матриксу, що є ще одним доказом його впливу на функції цієї структури. Виходячи з того, що значну роль у процесах функціонування клітинного ядра відіграє хроматин, ми дослідили взаємодію токоферолу з цим компонентом ядра (Петрова, Капралов, 1992). При вивченні особливостей зв'язування токоферолу з хроматином виявлено нерівномірне розподілення вітамін Е- зв'язуючих ділянок у хроматині та встановлено більш високу щільність місць зв'язування цього вітаміну у транскрипційно-активних ділянках ДНК, які мають підвищену чутливість до ДНКази I.

Зв'язування цього вітаміну з моно-, ди-, три-, тетра- нуклеосомами було значно меншим, ніж з олігонуклеосомами. Це може свідчити про те, що для взаємодії токоферолу з хроматином необхідно збереження над нуклеосомного рівня його організації. Можливо, у цьому процесі беруть участь лінкерні ділянки, доказом чого є виявлений нами взаємозв'язок між кількістю токоферолу, що зв'язався з різними компонентами хроматину, та кількістю лінкерних ділянок, що входять до їх складу.

Чутливість хроматину клітин печінки Е-гіповітамінозних щурів до гідролізу ДНКазою 1 виявилася зменшеною. Виходячи з даних літератури про кореляцію між структурними перебудовами хроматину при зміні транскрипційної активності та його чутливістю до гідролізу низькими концентраціями ДНКази I (Reeves, 1984, Beato, 1996, Bloom, 1992, Niborg, 1986), можна припустити, що при Е-гіповітамінозі змінюється структура хроматину. Ці результати, а також виявлене нами зменшення РНК полімеразної активності ядер Е-гіповітамінозних щурів збігаються з даними літератури про зменшення долі транскрипційно-активного хроматину та зміні його структури при цій патології (Губский, 1992).

Зважаючи на припущення, що специфічність дії токоферолу може бути обумовлена його взаємодією з білками, ми вважали за доцільне вивчити зв'язування токоферолу з білками різних фракцій хроматину. При хроматографії попередньо проінкубованого з токоферолом хроматина на гідроксиапатиті найбільша радіоактивність була виявлена у фракції, що елююється з сорбенту розчином, який містить 2M NaCI- 5М сечовину- 80 мм. калій-фосфатний буфер (рН 7,2), та у фракції. Перша фракція містить, в основному, негістонові білки хроматину та частину гістонів, а друга - вільну ДНК та комплекс ДНК з міцно-зв'язаними білками. При дослідженні залежності зв'язування (3Н) - токоферолу з цими фракціями хроматину від його концентрації нами виявлено, що при концентрації вітаміну більше ніж 100 нМ зв'язування з фракцією, що елююється з ГАП 2М NaCl-5М сечовиною зменшується у присутності надлишку неміченого ліганда. Це свідчить про специфічність взаємодії токоферолу з білками цієї фракції. Електрофоретичне дослідження білків фракції, що елююється з ГАП 2М NaCl-5М сечовиною показало, що за умови дефіциту вітаміну Е відбувається зменшення кількості деяких білків, що входять у її склад (Капралов, 1994).

Таким чином, результати наших дослідів свідчать про те, що токоферол здатний проникати всередину ядер печінки щурів та впливати на синтез РНК та ДНК. Цей вітамін може зв'язуватися з хроматином, ядерним матриксом та ядерною мембраною та певним чином модифікувати структуру хроматину. У складі хроматину виявлені білки, що здатні специфічно зв'язувати токоферол. У той же час зв'язування вітаміну з ядрами та хроматином має неспецифічний характер. Це може бути викликане присутністю у складі ядра великої кількості місць неспецифічного зв'язування гідрофобних молекул токоферолу, взаємодія з якими маскує специфічне зв'язування вітаміну. Ми припустили, що специфічне зв'язування токоферолу з ізольованими ядрами та хроматином може бути виявлене при використанні в експериментах не вільного токоферолу, а його комплексу з ТЗБ, які додають гідрофільного характеру його гідрофобній молекулі, беруть участь у її транспорті до специфічно зв'язуючих ділянок та зв'язуванні. Тому подальші наші досліди були присвячені вивченню ролі ТЗБ у зв'язуванні токоферолу з ізольованими ядрами та його дії на синтез РНК та ДНК. Участь білків у взаємодії токоферолу з ядрами та хроматином і їх дія на РНК- та ДНК-полімеразні активності ядер, хроматину та ядерного матриксу.

Було вивчено зв'язування токоферолу з ізольованими ядрами клітин печінки щурів у присутності цитозолю, у складі якого виявлені ТЗБ (Catignani, 1980, Халмурадов, 1980). При додаванні в інкубаційне середовище міченого токоферолу разом з цитозолем виявлено зменшення загального включення мітки при внесенні 600-кратного надлишку неміченого вітаміну. Крива специфічного зв'язування має у цьому випадку нелінійний характер, а рівень специфічного зв'язування ліганда складає біля 20 % від загального. Специфічне зв'язування токоферолу з ядрами було виявлене нами також при додаванні до ядер частково очищених ТЗБ цитозолю з низькою молекулярною масою (близько 30кД) (Catignani, 1980). У той же час у присутності фракції білків цитозолю з високою молекулярною масою, яка взаємодіє з токоферолом неспецифічно, специфічне зв'язування токоферолу з ядрами не виявлялось (Донченко, Маленьких, Капралов, 1988).

Таким чином, отримані дані вказують на те, що цитозольні білки низької молекулярної маси, що специфічно зв'язують вітамін Е, відіграють важливу роль у зв'язуванні токоферолу з ядрами. Припустивши, що можуть існувати не тільки цитозольні, але й ядерні ТЗБ, ми спробували виділити ці білки та дослідити їх роль у дії токоферолу.

Для виділення ядерних ТЗБ використовували екстракт ядер, отриманий після їх обробки 1% тритоном Х-100. Хроматографічне розділення інкубованого з (3Н)- токоферолом екстракту на гідроксиапатиті виявило два піки радіоактивності у фракціях, що елюються із сорбента 0,175 та 0,5 М калій-фосфатним буфером (рН 7,2) (фракції I та II, відповідно). Присутні у виділеній фракції ділянки зв'язування токоферолу мають білкову природу. Так, обробка проназою екстракту ядер 1% тритоном Х-100 зменшувала на 85-90% загальне зв'язування вітаміну і викликала зникнення специфічного зв'язування. Специфічне зв'язування токоферолу при його додаванні у фізіологічних концентраціях виявлено лише для білків першої з цих фракцій, про що свідчать дані, отримані при вивченні зв'язування (3Н)- токоферолу у присутності надлишку неміченого ліганду, а також результати дослідів, у яких замість неміченого вітаміну були використані його аналоги - хінон коротколанцюговий та токоферилацетат (Петрова, Капралов, 1991).

Фракція ядерних білків, що специфічно зв'язують токоферол, виявилася досить гетерогенною. При її розділенні методом іонообмінної хроматографії на колонці Mono Q в системі FPLC були отримані 4 фракцїі. Для трьох з них, що элюються з колонки градієнтом NaCl, було виявлено зменшення зв'язування (3Н) токоферолу в присутності надлишку неміченого вітаміну. У той же час таке зменшення не було виявлено у фракції, що елююється буфером нанесення. Ціі дані свідчать про можливе існування в складі ядер клітин печінки декількох ТЗБ.

Виявлено, що у присутності ядерних ТЗБ зв'язування (3Н) токоферолу з хроматином набуває специфічного характеру. У той же час за інкубації хроматину як з токоферолом, так і з білками фракції, що елююється з ГАП 0,5 М калій-фосфатним буфером і не здатна специфічно зв'язувати вітамін, цей ефект не спостерігався. Отже, виділена нами фракція ТЗБ може брати участь у транспорті токоферолу до хроматину та його специфічному зв'язуванні з цією структурою ядра.

Ядерні ТЗБ можуть також брати участь у дії токоферолу на синтез нуклеїнових кислот. Їх додавання у інкубаційне середовище призводить до більш значного підвищення РНК-полімеразної активності хроматину контрольних тварин порівняно з Е-дефіцитними, у той час як за відсутності ТЗБ у інкубаційному середовищі ці показники не відрізнялися. Внесення в інкубаційне середовище, що містило ТЗБ, токоферолу достовірно не викликало змін синтезу РНК у ядрах ні контрольних, ні Е-гіповітамінозних тварин. Ці результати, напевно, обумовлені тим, що виділена з ядер контрольних тварин фракція ТЗБ, вже містила у своєму складі токоферол. Тобто дія доданого вітаміну маскувалася ендогенним.

Нами не було виявлено змін РНК-полімеразної активності хроматину Е-гіповітамінозних щурів при додаванні ТЗБ, виділених з ядер клітин тварин цієї ж групи. У той же час додаткове внесення вітаміну у пробу, що містила ТЗБ, підвищувало РНК-полімеразну активність таких ядер на 25 %. Феномен, що спостерігається, може бути обумовлений тим, що хроматин та ТЗБ ядер Е-гіповітамінозних щурів містить значно менше ендогенного вітаміну Е порівняно з ТЗБ, виділеними з ядер контрольних щурів.

При дослідженні ДНК-полімеразної активності ядер не було виявлено змін при додаванні як ТЗБ, так і ТЗБ разом з токоферолом. Ми припустили, що це може бути зумовлено маскуванням ефектів внесених у інкубаційне середовище сполук за рахунок вітаміну Е та білків, що містяться у складі ядра. Тому у подальшому ми додавали ТЗБ до ядер, оброблених 1% тритоном Х-100, що екстрагує з них ці білки та токоферол (табл.). Як за відсутності добавок, так і при додаванні до ядер окремо токоферолу або ТЗБ не було виявлено відмінностей між включенням мічених попередників у ДНК ядер контрольних та вітамін Е-дефіцитних тварин. На відміну від цього, одночасне додавання ТЗБ та токоферолу викликало зниження ДНК-полімеразної активності ядер Е-гіповітамінозних щурів порівняно з ядрами контрольних тварин. Аналогічний ефект був виявлений нами при вивченні дії ядерних ТЗБ на ДНК-полімеразну активність ядерного матриксу. У цих дослідах включення мічених попередників у ДНК ядерного матриксу контрольних та вітамін Е недостатніх щурів практично не відрізнялось (5420 + 230 імп/хв х мг. ДНК та 5020 + 220 імп/хв х мг., відповідно). У присутності токоферолу та ТЗБ цей показник у препаратах ядерного матриксу вітамін Е-недостатніх тварин був на менше 24% менший, ніж у ядерному матриксі контрольних щурів (6720 + 130 імп/хв х мг. ДНК та 8880 + 450 імп/хв х мг. ДНК, відповідно). Таким чином, ядерні ТЗБ відіграють важливу роль у дії токоферолу на функції ядра. Можна припустити, що зменшення кількості цих білків у вітамін Е-недостатніх щурів є однією з причин виявленого у наших дослідах зменшення інтенсивності синтезу РНК у ядрах та ядерному матриксі, виділених з печінки таких тварин та значно меншого впливу токоферолу на синтез ДНК у ядрах.

Це припущення підтверджується нашими даними про відсутність відмінностей між показниками синтезу нуклеїнових кислот у виділених з нормальних та вітамін Е-недостатніх щурів препаратах хроматину, ядерного матриксу, або ядер,екстрагованих тритоном Х-100, при отриманні яких відбувається екстракція ТЗБ. Відмінності відновлюються при додаванні до цих препаратів виділеної нами фракції ТЗБ. Тобто, виділена нами з ядер клітин печінки фракція ТЗБ не тільки сприяє специфічному зв'язуванню токоферолу з хроматином, але й бере участь у дії вітаміну Е на синтез нуклеїнових кислот у ядрі, який є важливим показником його функціональної активності. Для вивчення питання про специфічність дії токоферолу та ТЗБ ми виділили фракцію ТЗБ з мітохондрій та провели порівняльне дослідження дії ТЗБ з ядер та мітохондрій на синтез РНК та ДНК у цих органелах. Дія токоферолу та ТЗБ на РНК та ДНК-полімеразні активності мітохондрій.

Для виділення ТЗБ із мітохондрій була використана хроматографія екстракту мітохондрій 1% розчином тритону Х-100 на гідроксиапатиті (рис. 10). При цьому специфічне зв'язування міченого токоферолу виявлено лише з фракцією, що елююється 0,5 М калій-фосфатним буфером (Петрова, Капралов, 1990).

Нами не виявлено впливу токоферолу на РНК-полімеразну активність мітохондрій як нормальних, так і вітамін Е-недостатніх щурів. У той же час РНК-полімеразна активність інтактних мітохондрій зменшувалась при додаванні мітохондріальної фракції ТЗБ на 47%, а ядерної - на 19%. Одночасне додавання у середовище інкубації токоферолу та мітохондріальної фракції ТЗБ значно більшою мірою пригнічує РНК-полімеразну активність, ніж додавання токоферолу та ядерної фракції ТЗБ. Тобто ефекти ТЗБ з ядер та мітохондрій на РНК-полімеразну активність мітохондрій відрізняються. Відмінності у дії ядерної та мітохондріальної фракцій ТЗБ були виявлені також при вивченні їх дії на РНК-полімеразну активність хроматину, що свідчить про певну специфічність дії цих білків. Отримані дані свідчать також про відмінність ефектів токоферолу та ТЗБ на синтез ДНК у ядрах та мітохондріях. Додавання вітаміну у середовище інкубації не впливало на ДНК-полімеразну активність мітохондрій. Не було також виявлено відмінностей між рівнем синтезу ДНК у мітохондріях контрольних та вітамін Е недостатніх щурів. Мітохондріальні ТЗБ інгібували ДНК-полімеразну активність мітохондрій (на 23 % у мітохондріях контрольних і на 34 % - у вітамін Е-дефіцитних щурів). Ефекти ТЗБ не змінювались при одночасному додаванні ТЗБ та токоферолу (Капралов, 1997). Таким чином, дія токоферолу та ТЗБ на синтез нуклеїнових кислот у ядрах та мітохондріях відмінна. Ефекти вітаміну Е залежать також від того, з ядер чи мітохондрій отримані додані у інкубаційне середовище ТЗБ. Ці результати, що свідчить про специфічність дії цього вітаміну, є ще одним доказом того, що у механізми його дії залучені специфічні, не антиоксидантні механізми, важливу роль у яких відіграють ТЗБ.

Дія токоферолу на синтез РНК та ДНК у ядрах та мітохондріях у присутності ФМА, дибутірил с АМР та А23187.

Дані літератури свідчать, що токоферол може впливати на активність протеїнкінази С (Azzi, 1995, Maltseva, 1998) та обмін сАМР (Schroeder, 1974, Бурлакова,1985), які відіграють важливу роль у процесах функціонування клітинного ядра. Тому можна припустити, що дія токоферолу на процеси синтезу нуклеїнових кислот обумовлена не лише його безпосередньою взаємодією із структурами ядра, що залучені у ці процеси, але й опосередковується участю регуляторних систем клітини (Azzi, 1997, Traber, 1995). Для більш детального дослідження цього питання ми вивчили вплив токоферолу на синтез РНК та ДНК на фоні дії речовин, що змінюють активність регуляторних систем клітинного ядра. Перш за все був досліджений вплив токоферолу та активатора протеінкінази С форболміристат ацетату (ФМА) на синтез нуклеїнових кислот у ядрах печінки щурів. Показано, що ФМА знижує РНК - полімеразну активність ядер, тоді як додавання токоферола нівелює дію форболового ефіру на цей показник, хоча синтез РНК у присутності ФМА та токоферолу був меньшим, ніж при додаванні тільки вітаміну Е. Протилежний характер дії ФМА та токоферолу виявлений і при дослідженні ядер клітин печінки, оброблених тритоном Х-100.

Ці результати свідчать про існування спільних ланок у механізмах дії цих сполук на синтез РНК. Враховуючи наявні у літературі дані про здатність ПКС пригнічувати синтез РНК у ядрах (Malviya,1993) та протилежний характер ефектів токоферолу та ФМА на активність ПКС у цитозолі (Mahoney, 1988, Boscoboinik, 1991) можна припустити, що певна протилежність їх ефектів, виявлена у наших дослідах, є наслідком залученням ПКС у механізми дії вітаміну Е на синтез РНК у ядрах.

Взаємозалежність ефектів ФМА та токоферолу виявлена і при вивченні мітохондрій. У присутності ФМА РНК-полімеразна активність мітохондрій, виділених з контрольних щурів, була на 20% вищою, ніж мітохондрій Е-гіповітамінозних щурів, тоді як у контролі відмінностей між цими показниками не спостерігалось. Доданий разом з ФМА токоферол однаково пригнічував синтез РНК у мітохондріях як контрольних, так і вітамін Е-недостатніх щурів. Вплив ФМА та вітаміну Е на РНК-полімеразну активність ядер та мітохондрій відрізняються, тобто і у цьому випадку виявляється специфічність дії токоферолу.

Існування спільних механізмів дії на синтез нуклеїнових кислот виявлено також для токоферолу та с АМР. Так, аналог сАМР, що не гідролізується, дибутирил сАМР (db-сАМР) в концентрації 10-5 М, як і токоферол, підвищує синтез ДНК у ядрах. Разом з тим ми не виявили аддитивності стимулюючих ефектів токоферолу та db-с АМР на цей процес.

Стимулююча дія токоферолу на ДНК - полімеразну активність не виявлялась при його одночасному додаванні з db-с АМР у концентраціях 10-6 М і 10-7 М, за яких db-cAMP не впливав на синтез ДНК. Ці результати дозволяють припустити існування спільних механізмів у дії токоферолу та db-с АМР на синтез нуклеїнових кислот у ядрі. Ще одним підтвердженням цього припущення є зменшення синтезу РНК у ядрах вітамін Е-недостатніх щурів у присутності токоферолу та 10 -6 М db-с АМР порівняно з ядрами, до яких додавали тільки токоферол, тоді як у ядрах контрольних щурів цих відмінностей не виявлено.

Виходячи з того, що токоферол може впливати на обмін Са2+ у клітині (Курський, 1987, Pascoe, 1987, Sanchezmigallon,1996), ми припустили, що у реалізацію його дії на синтез РНК та ДНК у ядрах можуть бути залучені Са - залежні механізми.

Для перевірки цього припущення досліджували вплив на РНК- та ДНК-полімеразні активності ядер одночасного додавання токоферолу та кальцієвого іонофора А23187, який широко використовується як інструмент при дослідженні Са2+ залежних метаболічних процесів (Boot, 1996).

Нами виявлено, що одночасне додавання токоферолу та А23187 зменшує гальмівну дію іонофору на РНК-полімеразну активність ядер тоді, як сам вітамін не впливає на цей процес. У той же час рівень синтезу РНК при спільному додаванні токоферолу та А23187 був менший, ніж при додаванні одного вітаміну. При використанні ядер клітин печінки вітамін Е-недостатніх щурів не було виявлено впливу А23187 на включення мітки у РНК, що є ще одним свідченням взаємозалежності ефектів цих сполук (Капралов, 1997). Це припущення підтверджується також даними, отриманими нами при дослідженні ДНК-полімеразної активності ядер (Капралов, 1997).

Виходячи з цього ми припустили, що виявлені ефекти токоферолу та А23187 обумовлені існуванням спільних ланок у механізмах дії, у які залучені іони Са. Підтвердженням можливої участі іонів Са у дії А23187 на синтез нуклеїнових кислот у ядрах є також дані про інгібування дії іонофору на синтез РНК у ядрах за умови його одночасного додавання разом з іонами Са. Ефект А23187 на синтез РНК зменшувався також у випадку руйнування ядер заморожуванням-розморожуванням, яке, напевно, викликає ушкодження структур, що приймають участь у внутрішньоядерному буферуванні іонів кальцію. Про участь іонів Са у дії токоферолу на функції ядра свідчить також інгібування вітаміном синтезу ДНК у ядрах контрольних щурів у випадку додавання хелатора Са2+ ЕГТА, тоді як без нього вітамін Е збільшує цей показник (Капралов,1997).

Дані про залучення у дію токоферолу та А23187спільних механізмів були отримані нами також при вивченні РНК- та ДНК-полімеразних активностей мітохондрій, які вважаються одним із внутрішньоклітинних депо Са2+ (Ichas, 1994, Hansford, 1994, Sheu, 1994). Так, одночасне додавання разом з токоферолом ТЗБ та А23187 викликало підвищення РНК- полімеразної активності мітохондрій контрольних щурів порівняно з пробами, до яких були додані тільки токоферол та ТЗБ. У той же час при Е-гіповітамінозі не виявлено змін синтезу нуклеїнових кислот у мітохондріях у присутності А23187 (Капралов, 1997).

Таким чином, дія токоферолу на РНК- та ДНК-полімеразну активність ядер та мітохондрій може бути опосередкована ПКС-, сАМР- та Са2+ залежними механізмами. Виявлені нами відмінності ефектів токоферолу на синтез нуклеїнових кислот у ядрах та мітохондріях у присутності ФМА та А23187 є ще одним свідченням специфічності його ефектів.

Дія токоферолу на трансформацію лімфоцитів та дихальний вибух нейтрофілів. Приймаючи до уваги отримані нами результати та дані літератури, які свідчать про важливу роль взаємозв'язку вітаміну Е з вторинними месенджерами у його ефектах на різні біохімічні процеси in vitro, ми спробували з'ясувати, чи має місце такий взаємозв'язок при дії токоферолу на синтез нуклеїнових кислот у клітинах, чи він відбувається лише при його взаємодії з ізольованими ядрами та мітохондріями. Для вивчення питання, чи здатний вітамін Е у застосованих нами низьких концентраціях (0,5 та 50 мкМ) впливати на реплікативний синтез ДНК, що передує проліферації, як модель використовували лімфоцити крові людини та щурів. При вивченні ефекту токоферолу на реакцію трансформації лімфоцитів крові людей, яка пов'язана зі збільшенням їх проліферативної активності виявлено, що внесення токоферолу у середовище інкубації клітин викликало інгібування цього процесу (індекс стимуляції був 17,5 та 23,0 при додаванні 0.5 мкМ та 50 мкМ токоферолу, відповідно, тоді як у контролі цей показник дорівнював 27,1). Дія токоферолу виявилася менш вираженою при використанні цільної крові і була достовірною лише при його додаванні у концентрації 0,5 мкМ (індекс стимуляції при додаванні токоферолу у концентрації 0,5 мкМ дорівнював 13,8, а у концентрації 50 мм. - 14,8, тоді як у контролі цей показник дорівнював 16,0).

Рівень трансформації клітин цільної крові у щурів, яких утримували на вітамін Е-дефіцитному раціоні, виявився на 20% меншим, ніж у контрольних (індекс стимуляції був відповідно 10,0 и 8,0). При цьому токоферол у концентрації 0,5 мкМ не впливав на цей показник (індекс стимуляції становив відповідно 7,4 и 7,2).

Тобто, вітамін Е може впливати на синтез нуклеїнових кислот не тільки у ізольованих ядрах і мітохондріях, але й у клітинах в культурі. Враховуючи дані літератури про існування кореляції між зменшенням у присутності токоферолу та його похідних проліферативної активності клітин та інгібування ними активності ПКС у цитозолі (Boscoboinik, 1992, Ozer, 1993, Stauble, 1994, Menchaca, 1995, Chan, 1996, Nesaretnam, 1996, Fazzio, 1997), ми припустили, що отримані нами дані також можуть бути обумовлені взаємодією токоферолу та цитозольної ПКС.

Була досліджена участь іонів Са у дії токоферолу на трансформацію клітин крові людини. Реакцію проводили у присутності іонів Са2+ та кальцієвого іонофору А23187, який викликає зміну внутрішньоклітинної концентрації цих іонів. Виявлено, що А23187 у концентрації 10-6 М пригнічує цей процес на 69%, а у концентрації 10-7 М - на 26%. У той же час спільне внесення у пробу А23187 та токоферолу, кожний з яких пригнічує рівень трансформації, не викликало додаткового зниження цього показника. Така відсутність адитивності дії цих сполук є ще одним свідченням на користь того, що дія А23187 та токоферолу відбувається із залученням спільних механизмів, пов'язаних зі зміною концентрації Са2+. Це припущення підтверджується нашими даними про те, що додавання токоферолу усуває збільшення трансформації викликане присутністю іонів Са. Взаємозалежність ефектів А23187 та токоферолу на трансформацію лімфоцитів підтверджується й результатами дослідів, у яких була використана кров вітамін Е-недостатніх щурів. А23187 пригнічував цей процес (індекс стимуляції становив 5,4, тоді як у контролі - 8,0). У той же час у присутності токоферолу інгібіторний ефект іонофору зменшувався (індекс стимуляції становив 6,5). Ці результати можуть бути обумовлені порушенням обміну Са2+ при Е-гіповітамінозі (Pascoe, 1987, Курський, 1987).

Таким чином, дія токоферолу на процеси синтезу нуклеїнових кислот, та залучення у цей процес Са2+ - та ПКС - залежних механізмів виявляються не тільки у ізольованих ядрах та мітохондріях печінки щурів, але й на клітинному рівні, тобто у системі максимально наближеній до умов in vivo.

Дані, які свідчать про взаємозалежність ефектів токоферолу та вторинних месенджерів, були отримані нами і при вивченні дихального вибуху нейтрофілів, який зумовлений значним зростанням швидкості утворення активних форм кисню з одночасним збільшенням його споживання. Дихальний вибух викликали додаванням хемотаксичного пептиду ФМЛП (форміл-метионіллейцилфенілаланін) та іонофору А23187, які у більшій мірі впливають на Са2+ - залежні механізми, а також ФМА, що активує ПКС.

Виявлено, що вільний токоферол більш виражено пригнічує реакцію, що ініціюється за допомогою Са2+ залежних механізмів, тоді як у присутності плазми крові, яка містить токоферозв'язуючі білки, ефект був більш виражений при ініціації дихального вибуху по ПКС-залежним механізмам. Тобто вторинні месенджери можуть бути залучені у взаємодію токоферолу з вільними радикалами. Виходячи з даних літератури, які свідчать про участь вільних радикалів і, зокрема, супероксиду, у регуляторних процесах (Осипов, 1990, Adolfo,1986, Burton, 1988, Burton, 1989, Halliwell, 1992) та про утворення цих молекул у ході функціонування клітинних ядер та мітохондрій, можна припустити, що подібна взаємодія може мати місце і у клітинних ядрах та мітохондріях.

ВИСНОВКИ

1. Здатність токоферолу зв'язуватися з ядерною мембраною, хроматином та ядерним матриксом, а також наявність у ядрах специфічних токоферолзв'язуючих білків, які сприяють його дії на синтез РНК та ДНК, свідчать про те, що цей вітамін бере участь у процесах функціонування клітинного ядра. Дія токоферолу на ці процеси опосередкована через ПКС-, сАМР-залежні механізми та іони Са.

2. Токоферол збільшує ДНК-полімеразну активність ізольованих ядер клітин печінки щурів. Е-гіповітаміноз спричиняє зниження РНК - полімеразної активності ядер. Цей показник не повертається до рівня контролю при додавання у інкубаційне середовише екзогенного токоферолу.

3. Вітамін Е специфічно зв'язується з ядерним матриксом та впливає на його РНК-полімеразну активність, а білковий склад цього компоненту клітинного ядра змінюється при Е-гіповітамінозі, що свідчить про те, що у дію токоферолу на функції ядра залучений ядерний матрикс.

4. Здатність токоферолу взаємодіяти з олігонуклеосомами, нерівномірне розподілення зв'язуючих його ділянок у хроматині та зміна структури хроматину при Е-гіповітамінозі вказують на участь цього вітаміну у функціонуванні хроматину.У взаємодію токоферолу з хроматином залучені міцно зв'язані негістонові білки.

5. Взаємодія токоферолу з ядрами та хроматином відбувається за участю токоферолзв'язуючих білків. Внесення у інкубаційне середовище токоферолзв'язуючіх білків цитозолю викликає значне збільшення специфічності зв'язування вітаміну з ядрами.

6. Виділена та частково очищена білкова фракція, до складу якої входять ядерні токоферолзв'язуючі білки. Білки цієї фракції сприяють специфічному зв'язуванню токоферолу з хроматином та беруть участь у його дії на РНК- та ДНК-полімеразні активності ядер, хроматину та ядерного матриксу. хроматин рибонуклеїновий дезоксирибонуклеїновий

7. Токоферол впливає на РНК- та ДНК- полімеразні активності мітохондрій. Реалізація його дії на процеси синтезу нуклеїнових кислот відбувається за участі мітохондріальних токоферолзв'язуючих білків, які відрізняються за фізико-хімічними властивостями від відповідних білків ядра. Відмінності у ефектах ядерних та мітохондріальних токоферол-зв'язуючи білків на синтез РНК та ДНК у мітохондріях та ядрах свідчать про специфічність дії цього вітаміну.

8. Взаємозалежність ефектів токоферолу та активатора протеїнкінази С - форболміристат ацетата, або аналога сАМР, що негідролізується, дибутирил сАМР, чи Са2+ іонофора А23187 на синтез нуклеїнових кислот у ядрах та мітохондріях контрольних та вітамін Е-недостатніх щурів свідчить про залучення у реалізацію дії токоферолу на ці процеси ПКС-, сАМР-, та Са2+ - залежних механізмів.

9. Відсутність адитивності у ефектах інгібування трансформації лімфоцитів крові людини при додаванні токоферолу та А23187, а також відмінності у ефектах цих сполук на трансформацію лімфоцитів контрольних та вітамін Е недостатніх щурів свідчить про залучення Са2+-залежних механізмів у дію токоферола на синтез ДНК не тільки у ядрах і мітохондріях, але й на клітинному рівні.

10. токоферол впливає на Са2+ - та ПКС- залежні механізми дихального вибуху нейтрофілів. Вільний токоферол більш виражено пригнічує реакцію, що ініціюється за допомогою Са2+ залежних механізмів, тоді як у присутності плазми крові, яка містить токоферозв'язуючі білки, ефект був більш виявлений при ініціації дихального вибуху через ПКС-залежні механізми. Отже, механізми внутрішньоклітинної регуляції за участю вторинних посередників можуть бути залучені у антиоксидантні ефекти токоферолу.

Размещено на Allbest.ru