Біологічні особливості Yucca torreyI Shafer.: розмноження рослин і одержання стероїдних глікозидів in situ та in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська Академія Аграрних Наук

Державний Нікітський ботанічний сад

УДК 582.572.228: 581.16: 573.6: 581.19

Біологічні особливості Yucca torreyI Shafer.: розмноження рослин і одержання стероїдних глікозидів in situ та in vitro

03.00. 20 - біотехнологія

АВТОРЕФЕРАТ

Дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Карпов Павло Андрійович

Ялта 2000

Дисертація є рукописом

Робота виконана у відділі експериментальної біології Державного Нікітського ботанічного саду УААН

Захист відбудеться 26 травня 2000 р. о 13:00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 53.369.01 при Державному Нікітському ботанічному саді УААН за адресою: 98648, Крим, м. Ялта, Державний Нікітський ботанічний сад УААН.

З дисертацією можна ознайомитися в науковій бібліотеці Державного Нікітського ботанічного саду УААН за адресою: 98648, Крим, м. Ялта, Державний Нікітський ботанічний сад УААН.

Автореферат розісланий "22" квітня 2000р.

біологічний рослина глікозит клональний

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Представники виду Yucca L. з давніх-давен знаходили широке господарське застосування, а в другій половині XX сторіччя стали активно використовуватися як цінні джерела стероїдних глікозидів. (Cruse et al., 1973) Згідно з літературними даними, стероїдні глікозиди (СГ) досліджені у 16 представників роду.

За останніми даними рід Yucca L. нараховує 42 види, 12 з яких представлені в Арборетумі ДНБС. Серед них Y. torreyi Shafer. є найбільш великою і високодекоративною.

Yucca torreyi Shafer. (син. Y. macrocarpa Engelm.) - невелике дерево, росте тільки на південному заході Техаса, значно південно-східніше Нью-Мехіко, з ареалом, що простягається вглиб Мексіки.

На півдні України юкки широко використовуються в декоративному садівництві, проте впровадження Y. torreyi як декоративної і лікарської рослини стримується із-за відсутності запилювача (Tegeticula yuccasella), що утруднює одержання насіння. Традиційні способи вегетативного розмноження малоефективні і не застосовуються до таких великих видів як Y. torreyi. (Голубєв та ін., 1973)

Досягнення останніх років в галузі культури органів і тканин продемонстрували величезну можливість клітинних технологій як в розмноженні цінних генотипів, так і в одержанні біологічно активних речовин. (Носов, 1992; Бутенко, 1999) Методи клонального мікророзмноження були розроблені для Y. elephantipes Regel. (Pierik, et al., 1983) і Y. schidigera (Kaneda et al., 1987). Дані про використання біотехнологічних методів в розмноженні та одержанні стероїдних глікозидів Y. torreyi в літературі відсутні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувалися у відділі експериментальної біології Державного Нікітського ботанічного саду НАН України, в період з 1997 по 1999рр. у відповідності з розділом тематичного плану № 0197U004314 - "Вивчити фізіолого-біохімічні основи адаптації плодових і декоративних культур з метою оптимізації продукційного процесу і розробки теоретичних аспектів селекції екологічно стійких форм", а також планом аспірантської підготовки.

Мета і завдання досліджень. Метою даної роботи є вивчення біологічних і біохімічних особливостей рослин Y. torreyi інтродукованих в Нікітський ботанічний сад, можливості їхнього насінного і клонального мікророзмноження, а також визначення здатності рослин різного віку, культури клітин і тканин in vitro синтезувати стероїдні глікозиди. В ході роботи необхідно було вирішити такі завдання:

Вивчити морфобіологічні і біометричні особливості плодів і насіння Y. torreyi, одержаних при штучному запиленні в умовах інтродукції на Південному Березі Криму і виявити взаємозв'язок з розвитком проростків in vivo та in vitro.

Підібрати оптимальні умови для індукції адвентивного пагоноутворення in vitro в культурі епікотилю Y. torreyi. Розробити спосіб мікророзмноження рослин в умовах in vitro.

Індукувати калюсоутворення з різних експлантів Yucca torrei і виявити здатність калюсу синтезувати стероїдні глікозиди; встановити взаємозв'язок їхнього синтезу з гістогенезом і морфогенезом.

Відібрати калюс, що має здатність синтезувати СГ при відсутності виражених ознак гістогенезу і морфогенезу і провести його цитоморфометричний аналіз.

Визначити місце первинного синтезу СГ в культурі ізольованих органів і тканин in vitro.

Провести методом тонкошарової хроматографії (ТШХ) порівняльне вивчення вмісту СГ у вегетативних і репродуктивних органах і тканинах рослин Y. torreyi, здатних і не здатних зав'язувати повноцінні плоди і насіння при штучному запиленні в умовах інтродукції на ПБК, а також в ювенільних рослинах різного віку.

Наукова новизна роботи. Вперше визначені кореляції між морфометричними характеристиками насіння і плодів, одержаних при штучному запиленні. В процесі вивчення потенційних можливостей насінного розмноження Y. torreyi встановлений взаємозв'язок морфо-логічних і вагових характеристик насіння з їхньою схожістю. Показана залежність схожості насіння Y. torreyi in vivo та in vitro з його виповненням, строками і умовами зберігання. Визначені стадії розвитку проростків Y. torreyi і їхня тривалість в умовах in situ та in vitro. Досліджена здатність калюсу різного походження синтезувати стероїдні глікозиди. Виявлений взаємозв'язок початку синтезу СГ в культурах калюсу з гістогенезом і морфогенезом. Одержаний калюс Y. torreyi, що синтезує СГ при відсутності ознак гістогенезу і проведений його цитоморфометричний аналіз. Вперше визначені три шляхи індукції утворення адвентивних пагонів Y. torreyi і розроблені два способи одержання рослин в умовах in vitro. Виявлені СГ у вегетативних і репродуктивних органах в умовах in situ. Визначений їхній максимальний вміст в насінні і встановлена хімічна структура переважного глікозида.

Практичне значення одержаних результатів. Дані, одержані внаслідок морфологічного і морфометричного аналізу плодів і насіння Y. torreyi, мають значення при відборі посівного матеріалу. Встановлено, що насіння Y. torreyi, яке знаходиться в плодах, зберігає схожість більш тривалий час, ніж ізольоване насіння в паперових пакетах.

Розроблені три шляхи індукції адвентивного пагоноутворення Y. torreyi, що дозволяють за один цикл вирощування (1-2 місяці) одержувати від материнського пагона 7 дочірніх. Визначені живильне середовище для укорінення мікропагонів і умови адаптації in vivo рослин, одержаних in vitro. Застосування способу клонального мікророзмноження дає високий вихід рослин у порівнянні з традиційними способами насінного і вегетативного розмноження Y. torreyi, що має яскраво виражене апікальне домінування.

Проведені дослідження з аналізу СГ в органах і тканинах рослин Y. torreyi є основою для подальших більш глибоких хімічних і фарма-кологічних досліджень, а виявлені закономірності синтезу СГ в культурах ізольованих органів і тканин є основою для розробки моделі виробництва СГ біотехнологічними методами.

Особистий внесок пошукача полягає в самостійному зборі рослинного матеріалу, постановці експериментів та обробці одержаних даних, аналізі літератури, підготовці і написанні наукових статей, оформленні дисертаційної роботи. Разом з науковим керівником проведені вибір об'єктів досліджень, освоєння методик і розробка структури дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на міжнародних конференціях: на сесії ради Ботанічних садів України "Ботанічні сади - центри збереження біологічної різноманітності світової флори" (Ялта, 1995); конференції країн СНД "Інтродукція лікарських нетрадиційних культур" (Крим, Алушта, 1995); 2-му міжнародному симпозіумі присв'яченому 200-річчю дендрологічного парку “Софіївка” "Старовинні парки і проблеми їхнього збереження" (Умань, 1996); "Четверта міжнародна конференція з медичної ботаніки" (Київ, 1997); на VII Міжнародній конференції "In vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation" (Москва, 1997); "II International Symposium on Plant Biotecnology" (Kyiv, 1998); "Інтродукція рослин і віддалена гібридизація" (Москва, 1998); 7 International Meeting of Young Scientists in Horticulture (Lednice, Czech Republic, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 12 робіт, з них 4-статті в спеціалізованих наукових виданнях і 8 - матеріали і тези наукових конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, 6 розділів, висновків і переліку цитованої літератури, що включає 247 джерел, в тому числі 162 зарубіжних авторів. Робота викладена на 173 сторінках машинописного тексту і містить 58 рисунків, 28 таблиць.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

РОЗДІЛ 1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

Проведений аналіз даних, опублікованих у вітчизняній і зарубіжній літературі з біології представників р. Yucca L., біології їхнього насінного розмноження in vivo, in situ та in vitro, а також літератури, присвяченої клональному мікророзмноженню представників Yucca sp. in vitro. Опрацьована література, присв'ячена вивченню стероїдних глікозидів представників р. Yucca L. в умовах in vivo та in vitro і господарському застосуванню юкк. Проведений аналіз літератури, присв'яченої виробництву стероїдних глікозидів методами сучасної біотехнології.

РОЗДІЛ 2. ОБ'ЄКТИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1. Об'єкти дослідження

Як об'єкти дослідження були використані органи і тканини рослин Yucca torreyi Shafer., що ростуть в арборетумі ДНБС були розділені на здатні зав'язувати плоди і давати повноцінне насіння, не здатні зав'язувати плоди і насіння, а також ювенільні рослини різного віку.

2.2. Матеріали і методи досліджень

При проведенні досліджень і постановці дослідів дотримувалися методів, прийнятих в біотехнології, біохімії, ботаніці. Насіння Y. torreyi було одержано при штучному запиленні (гейтоногенії) з урахуванням рекомендацій Ф.М. Русанова (1959), В.М. Голубєва та ін. (1973), О.П. Максимова та ін., (1989).

Визначення СГ проводили методом ТШХ на пластинах Silufol UV-254, Silufol UV-366 (фірма "Kavaler", Чехія) в системі n-бутанол: етанол: аміак (7:2:5) згідно з загальноприйнятою методикою (Кинтя та ін., 1979, 1987; Зураб'ян, 1989; Hostettman & Marston, 1995). Як проявники використовували фосфорно-вольфрамову кислоту і реактив Ерліха. Аналіз структури переважного глікозида насіння проводився з залученням ЯМР - і 13С-спектроскопій.

Гістохімічне визначення СГ проводили на свіжому матеріалі (Brunarska et al., 1978; Гурієлідзе та ін., 1992) за допомогою реактивів Саньє (Sannie et al., 1975) на олігоспіростанозиди (ССГ), Ерліха (Kiyosawa et al., 1968) на олігофуростанозиди (ФСГ) і Лафона (Brunarska et al., 1978) на загальні сапоніни. Створення бібліотеки цифрових зображень хроматограм і відтисків зрізів листків виконували методом комп'ютерного сканування з застосуванням сканерів PRIMAX Colorado 600p і PRIMAX Colorado C4800 при оптичному дозволі 400 dpi з застосуванням інтерполяризації.

Приготування тимчасових препаратів і цитометричні дослідження проводилися за загальноприйнятою методикою (Паушева, 1980).

При одержанні асептичної культури, органів, тканин рослин Y. torreyi дотримувалися як прийнятих в біотехнології методів (Бутенко, 1964, 1999; Здруйковська-Ріхтер, 1974; Калінін та ін., 1980, 1992; Катаєва, Бутенко, 1983; George et al., 1987; Dixon & Gonzales, 1994; Gamborg & Phillips, 1995), так і методів, розроблених у відділах експериментальної біології і біотехнології ДНБС. Як первинні експланти були використані насіння місцевої репродукції та ізольовані з них зіготичні зародки.

Асептичну роботу проводили в ламінар-боксі БП-4-004. Культивування in vitro здійснювалося на модифікованих живильних середовищах МС (Murashige & Skoog, 1962) і QL (Quoirin & Lepoivre, 1977), а також на середовищах, що містять повну і половини концентрації макро- і мікросолей.

Експланти культивували в колбах Елемеєра об'ємом 300мл (Німеччина), на СПВР, при 24-28С і 16-годинному фотоперіоді. Освітлення здійснювали за допомогою люмінісцентних ламп ЛФР-150. Періодичність субкультивування складала 2-3 місяці.

Для дослідження процесів морфогенезу в живильні середовища вводили фітогормони: БАП, ІОК, ІМК, НОК, 2.4-Д. При проведенні дослідів з індукції закладки адвентивних бруньок, епікотили проростків, одержаних в асептичних умовах на середовищі МС (1962), що не містило фітогормони, поміщали на агаризовані середовища МС і QL, що містили різні концентрації і співвідношення НОК (0; 0.1; 0.4; 1.0; 2.0; 3.0; 10.0 мг/л) і 6-БАП (0; 0.1; 0.4; 1.0; 2.0; 3.0; 10.0 мг/л).

Статистичну обробку даних проводили за допомогою програми STATISTICA for Windows 5.1С, Copyright StatSoft, Inc. 1984-1996 (WEB: http:/www. statsoftinc. com) Кореляційні залежності оцінювалися на основі лінійного коефіцієнта кореляції за Пірсоном (r) (Лакін, 1973).

РОЗДІЛ 3. БІОМОРФОЛОГіЧні дослідження плодів, насіння І проростків Yucca torreyi Shafer. В зв'язку з насінним

Розмноженням в умовах інтродукції

3.1. Біоморфометричні характеристики плодів і насіння Y. torreyi

В ході досліджень, що проводилися, плоди і насіння були одержані при штучному запиленні шляхом гейтоногенії в 1994, 1996 та 1997 роках.

3.1. 1. Корелятивні зв'язки біометричних параметрів плодів

Довжина і діаметр плодів варіювали від 4,5см до 10см і від 1,8см до 3см відповідно. При цьому маса плодів становила від 6,12 г до 20,07 г і залежала від кількості насіння, яка варіювала від 9шт до 59шт. При обчисленні корелятивних зв'язків між такими біометричними параметрами плодів як маса, довжина і ширина, виявлений позитивний зв'язок, що підтверджується значеннями і величинами коефіцієнтів кореляцій. Для маси і довжини плодів r=0,99, а для маси і діаметра плодів r=0,91. Таким чином, маса плоду знаходиться у вираженому прямому корелятивному зв'язку з його лінійними розмірами, які також позитивно корелюють між собою (r=0,90)

Біоморфометричні властивості насіння Y. torreyi і їхній взаємозв'язок з біоморфометричними показниками плодів і схожістю

Для Y. torreyi характерне велике, чорне насіння. Вага 1000 насінин Yucca torrei становила 147.6 г.

Вагові характеристики насіння варіювали в різні роки (Табл.1). Їхня маса вкладалася в нормальний розподіл. Аналіз вагових біометричних показників плодів і насіння з них (Табл.2) виявив кореляційну залежність між параметрами плоду і показниками насіння і їхній зв'язок з схожістю (Табл.3).

Таблиця 1 Вагові характеристики насіння трьох урожаїв

Рік	n (шт.)	Загальна вага (мг)	mid (мг)	min (мг)	max (мг)	Маса насіння (мг)
1994	132	20961	158.80	63	212	137,574,5
1996	283	45952	162.38	64	275	169,0105,5
1997	404	54022	111.5	22	201	111,589,5

Таблиця 2 Вагові біометричні показники плодів і насіння урожаю 1997 року

	Плоди	Насіння
Ї	m (г)	L (см)	(см)	Повноцінне насіння (шт.)	Сумарна вага повноцінного насіння (мг)	S	max (мг)	min (мг)
1	19.3	9.5	2.8	56	8149	101+79	180	22
2	20.07	10.0	3.0	59	7872	110.5+66.5	177	44
3	15.06	8.0	2.8	44	6150	135.5+65.5	201	70
4	10.66	6.5	2.6	37	4817	110+75	185	35
5	9.6	6.0	2.5	28	2822	90.5+47.5	138	43
6	9.47	5.2	2.5	39	5348	109.5+68.5	178	41
7	6.95	5.0	2.0	18	2802	119.5+65.3	185	54
8	6.12	4.5	1.8	17	2018	123.5+25.5	149	98
9	6.99	5.0	2.0	30	3869	107.5+60.5	168	47
10	6.85	4.5	2.0	9	1173	129.5+25.5	155	104

Таблиця 3 Значення коефіцієнтів кореляції (r) біометричних показників плодів і ізольованого з них насіння

	Насіння
	n	Сумарна вага виповненого насіння	S	max	min
Вага плоду	0.92	0.92	-0.91	0.46	-0.51
Довжина плоду	0.91	0.91	-0.92	0.45	-0.53
Діаметр плоду	0.91	0.87	-0.92	0.48	-0.61

Зі збільшенням у плоді Y. torreyi числа насіння, відбувається паралельне збільшення їхньої маси, хоча останній показник помітно відстає (r=0,22). В свою чергу, кількість виповненого насіння чітко позитивно корелювала з числом насіння що зійшло (r=0,99). Виражена позитивна кореляція також виявлена між вагою насіння і їхньою схожістю (r=0,89). На основі виявлених кореляційних зв'язків встановлено, що при максимальному зав'язуванні насіння в плоді Y. torreyi їхні посівні якості знижуються і кращим є насіння з плодів, виповнених не більше ніж на 70-80%. Мабуть це пов'язано з тим, що в природі 20-40% насіння, що розвивається, поїдається гусеницями запилювача. Внаслідок чого відбувається розвантаження плоду і перерозподіл живильних речовин.

РОЗДІЛ 4. Морфогенетичні потенції органів і тканин Yucca torrei В умовах in vitro в зв'язку з мікророзмноженням

3.1. 3. Морфологія проростків Y. torreyi in vivo та in vitro

Схожість свіжозібраного насіння становила 95-98%. При зберіганні його в паперових пакетах вона швидко падала і до кінця другого року практично втрачалася. Проте при зберіганні насіння всередині плодів схожість становила 70-80%. (Рис.1)

В процесі вивчення розвитку проростків на ранніх етапах онтогенезу з свіжозібраного морфологічно виповненого насіння в умовах in vivo та in vitro, було виявлено 7 стадій (I, II, III,..., VII), причому тривалість відповідних стадій в умовах in vitro була вище, ніж in vivo (Рис. 2).

Показано, що кількість насіння, що зійшла в умовах in vivo становила 89-95%. Проте, при введенні в культуру in vitro ізольованих зіготичних зародків відзначали їхню більш друж-ну, 100%-ну схо-жість.

	I	II	II	IV	V	VI	VII
in vivo	26 14	1,5 0,5	1,5 0,5	1,5 0,5	2,5 0,5	2,5 1,5	4 2
in vitro	74 64	2,5 0,5	4 2	4 2	3,5 1,5	5 3	7 4

Рис. 2 Тривалість (доба) стадій розвитку проростків Y.torreyi in vivo та in vitro

Клональне мікророзмноження юкк in vitro є перспективним методом розмноження поряд з традиційним насінним. Нами були визначені три шляхи індукції утворення адвентивних бруньок з використанням модифікованих у відділі Експериментальної біології середовищ МС та QL що містять 6-БАП, ІМК і НОК (Рис. 3).

Краща закладка адвентивних бруньок (в середньому 1:8) відбувалася при послідовному культивуванні епікотилей і мікропагонів, одержаних внаслідок розвитку зіготичних зародків на живильних середовищах: QL, доповненого 2 мг/л БАП і 0.4 мг/л ІМК та QL, що містить 2 мг/л БАП і 0.4 мг/л НОК. Активний різогенез відзначали на середовищі МС з 0.1 мг/л НОК. Приживаність рослин досягала 80-95% при пікіровці регенерантів у грунт, взятий з плато Ай Петрі. (Табл. 4, 5, 6)

Таблиця 4 Ефективність адвентивного пагоноутворення

Спосіб	Кількість адвентивних пагонів
Мікророзмноження	min	max	S x
I	1	6	3,5 2,5
II	2	14	8 6
III	2	10	6 4

Таблиця 5 Індукція розвитку бруньок і утворення пагонів Y.torreyi при трьох способах клонального мікророзмноження

Спосіб	Число бруньок (%)	Число пагони /	Інтенсивність
Мікророзмноження	Що розвиваються	Що утворюють адвентивні пагони	експлант (шт.)	проліферації
I	75 25	41 25	3,52,5
II	42,85 7,15	85.7 14,3	86	+
III	35 15	55 5	64

*Примітка: +активна, середня, низька

Таблиця 6 Основні характеристики рослин Y. torreyi, одержаних з зародків перед висадкою в умови in vivo

Спосіб мікророзмноження	Середня довжина головного кореня (см)	Висота надземної частини рослини (см)	Середня кількість листків (шт.)	Забарвлення листків
I	103	7,53	31	Зелене
II	11,54,5	126	3,51,5	Світло-зелене
III	9,752,25	9,52,5	3,51,5	Світло-зелене

Як показали результати дослідів, потенційна ефективність мікророзмноження Y.torreyi через індукцію адвентивного пагоноутворення in vitro значно перевершує можливості культури in vitro ізольованих зіготичних зародків (Табл. 7).

Таблиця 7 Порівняльна характеристика результатів мікророзмноження Y.torreyi в умовах in vitro

Показник	Тип експланта
	Зіготичний зародок	Апекс (епікотиль)
Тривалість початкового росту до першого пасажу (міс.)	1-1,5	1-2
Коефіцієнт розмноження (шт./рік)	400*	1.38104- 2.1108
Живильні середовища:
- що індукують розвиток	MC, 1/2MС, QL, 1/2 QL	QL+2мг/л БАП+0, 4мг/л НОК; МС+1мг/л БАП+0, 1мг/л НОК
- для укорінення	MC, 1/2MС, QL, 1/2QL	МС+0, 1мг/л НОК
Кількість мікропагонів, що укорінилися, %	98 - 100%	95 - 100%
Приживаність рослин в грунтових умовах (через 45 діб), %	90 - 95%	80 - 95%
Тривалість культивування від введення експланта до одержання регенеранта (міс.)	1	1,5-2

*- що відповідає числу насіння, одержаного при штучному запиленні 100 квіток при реальному, в умовах інтродукції, 15% - ному зав'язуванні плодів

При роботі з культурою калюсу було виявлено, що активне калюсоутворення відбувалося на середовищі МС з 0.5 мг/л БАП і 4 мг/л 2.4-Д (Табл. 8). Активний калюсогенез спостерігали з зіготичних зародків, середній - з висічок листка, слабкий - з висічок коріння. Калюс зародкового походження володів високим морфогенетичним потенціалом, що реалізується через гемогенез, різогенез та ембріоідогенез. Аналогічні типи морфогенезу відзначені в калюсі листкового походження, проте здатність їх до морфогенезу була нижча. Низький морфогенетичний потенціал відзначали у калюсів кореневого походження.

Таблиця 8 Індукція калюсоутворення на модифікованому середовищі МС, що містить 0.5 мг/л БАП і 4мг/л 2.4-Д

Первинний експлант	Число експлантів (шт.)	Колір калюсу	Щільність калюсу
	всього	що утворюють калюс
Зародок	30	27	світло-лимонний	щільний
Листок*	30	16	білий	середньої щільності
Корінь	30	3	білий	середньої щільності

* - Висічки листків бралися з базальної зони листка

Первинний калюс без ознак гістогенезу і морфогенезу не містив СГ. Синтез СГ пов'язаний з початком гістогенезу і осередки синтезу знаходились поблизу провідних елементів, що диференціюються. При цьому самі провідні елементи не містили сапоніни.

РОЗДІЛ 5. Визначення стероїдних глікозидів в

Органах і тканинах Yucca torreyi Shafer.

При вивченні здатності інтактних рослин синтезувати СГ були досліджені листя, коріння, квітки і насіння.

Результати гістохімічного аналізу СГ в листках рослин Y. torreyi, що вступили в репродуктивну фазу були ідентичні для рослин, здатних і не здатних зав'язувати насіння і показали різну локалізацію олігоспіростанозидів і олігофуростанозидів в тканинах листя. Провідні елементи ксилеми і механічні пучки реакції на сапоніни не давали. Цікаво те, що спостерігалася певна симетрія в положенні клітин-вмістилищ олігофуростанозидів відносно продихового апарату в епідермісі листка.

Аналіз СГ в листках рослин різного віку, що ростуть в умовах in vivo та in vitro виявив залежність накопичення СГ від віку рослин і зони листка. Вміст СГ був вищий в базальній частині листя однорічних рослин, що ростуть in vivo в порівнянні з рослинами, що ростуть in vitro.

Порівняльний ТШХ-аналіз олігоспіростанозидів і олігофуростанозидів рослин, що вступили в репродуктивну фазу, здатних і не здатних зав'язувати повноцінне насіння показав відмінності в хроматографічній рухливості і в числі СГ. При цьому, загальне число виявлених СГ в листках рослин, здатних зав'язувати насіння, становило 36 (23 ССГ і 13 ФСГ), а в листі рослин, не здатних зав'язувати насіння - 34 (24 ССГ і 10 ФСГ).

Визначення СГ в корінні рослин, що вступили в репродуктивну фазу, було утрудено із-за присутності в різодермі густого темно-червоного пігменту, що перешкоджає хроматографуванню. Проте, в них містилося не менше чотирьох СГ. Як показали дані гістохімічного аналізу, вміст ССГ і ФСГ в корінні залежав від віку рослини. Причому, останні були локалізовані переважно в ЦОЦ і значно в менших кількостях в клітинах первинної кори. СГ також виявлялися в корінні рослин, що ростуть in vitro, але були відсутні в культурах коріння, індукованих з ізольованих зіготичних зародків.

В результаті визначення місця первинного синтезу СГ встановлено, що олігоспіростанозиди і олігофуростанозиди присутні в пагонах і в корінні рослин що ростуть in vitro. В культурі адвентивних пагонів відзначали позитивну реакцію виключно на олігофуростанозиди. Проте в культурі коріння СГ не виявлені. В індукованих з калюсу корінні і ембріоїдах, що знаходяться на ранніх стадіях розвитку, СГ були відсутні. Поряд з цим, в регенерованих з калюсу бруньках виявлені олігофуростанозиди (Табл. 9). На основі цього ми можемо затверджувати, що в рослинах Y. torreyi місцем синтезу СГ є пагони.

Таблиця 9 Присутність стероїдних глікозидів in vitro в морфогенних структурах

Морфогенні структури	Олігофуростанозиди	Олігоспіростанозиди
Пагони (ювенільні рослини)	так	так
Коріння (ювенільні рослини)	так	так
Культура пазушних пагонів	так	ні
Культура коріння (від зіготичного зародка)	ні	ні
Бруньки (регенеровані з калюсу)	так	ні
Коріння (регенероване з калюсу)	ні	ні
Ембріоїди (регенеровані з калюсу)	ні	ні

Квітки, що знаходилися на різних стадіях фізіологічної зрілості дуже відрізнялися за складом СГ, причому, найбільшу різноманітність спостерігали в квітках V порядку. В квітках III порядку, що знаходилися на стадії пухкого пуп'янка і є найбільш готовими до запилення були присутні 6 СГ. При ТШХ-аналізі квіток відповідних порядків, рослин, здатних і не здатних зав'язувати насіння, відмінності в складі СГ виявлені не були. При хроматографуванні витяжок з частин квіток, рослин здатних і не здатних до зав'язування насіння, виявлено, що кількість СГ у відповідних частинах була ідентична. Хроматографічна рухомість у випадку з частинами, що відповідають за виконання репродуктивної функції, відрізнялась, а у випадку з частинами, безпосередньо не пов'язаними з репродуктивною функцією, була ідентична. Всього за даними ТШХ, з квіток різного порядку виділені не менше 28 індивідуальних сполучень.

В результаті гістохімічної реакції з реактивом Лафона СГ були виявлені як в периспермі, так і в зародку насіння. ТШХ показала наявність в насінні 9 СГ - 2 ФСГ і 7 ССГ з переважанням першого і третього.

Специфічні реакції з реактивом Ерліха і Саньє свідчать про наявність олігофуростанозидів в зародку при їхній практично повній відсутності в переспермі. Це підтверджується ТШХ, що показала присутність в зародку двох олігоспіростанозидів і двох олігофуростанозидів з перевагою останніх. В той же час в периспермі переважали олігоспіростанозиди, про що свідчать дані гістохімічного і ТШХ аналізів.

СГ насіння складали 20% від їхньої маси і були представлені переважно похідними двох генінів, з переважанням більш полярного, який був виділений в чистому вигляді з 10%-вим виходом від маси насіння. Він виявився близьким за хроматографічною рухомістю до тигогеніну і смілагеніну і більш полярним щодо гекогеніну.

Аналіз структури з залученням ЯМР- і 13С- спектроскопії, показав, що даний глікозид є 3-о--D-глюкопіранозил-(12)-о--D-галактопірано-зидом сарсапогеніна. (Табл. 10, Рис. 4)

1H-ЯМР спектр 1(, м.д., О-ТМС, С5D5N): 5:34 (д, J1,2=7,8Гц, Н-1 Gal), 4,98 (д, J1,2=7,5Гц, H-1 Glc), 3,45 (дд, J26a,26b=10,5 Гц, J26a,25e=2,5Гц, Н-26а), 1,24 (д, J27,25=63Гц, 27-СН3), 1,16 (д, J21,20=6,6Гц, 21-CH3), 1,04 (c, 19-CH3), 0,91 (c, 18-CH3).

Табл.10 Хімічні зрушення сигналів атомів 13С глюкозида 1, (, м.д., О-ТМС, C5D5N)

С-атом	Хім. зрушення	С-атом	Хім. зрушення	С-атом	Хім. зрушення
Gal
1'	102,0	1	30,7	15	30,7
2'	81,1	2	26,8	16	81,1
3'	75,2	3	76,1	17	62,7
4'	69,5	4	31,9	18	16,3
5'	76,2	5	36,7	19	23,7
6'	61,8	6	26,6	20	42,3
		7	26,6	21	14,5
Glc		8	35,4	22	109,4
1''	105,3	9	40,2	23	26,3
2''	74,8	10	35,0	24	26,0
3''	77,6	11	21,0	25	27,3
4''	71,6	12	40,2	26	64,9
5''	77,8	13	40,7	27	16,0
6''	62,8	14	56,4

РОЗДІЛ 6. Дослідження синтезу СГ в культурах

Тканин Y. torreyi

Вивчаючи можливість одержання СГ методом культури тканин, був проаналізований калюс Y. torreyi листового, кореневого і зародкового походження.

ТШХ аналіз показав практично повну відсутність СГ, як в первинному калюсі, так і в живильному середовищі.

При гістохімічному аналізі калюсу тільки в зонах проліферації елементів спостерігали позитивну реакцію на олігофуростанозиди. Самі провідні елементи позитивної реакції на СГ не давали.

Позитивну реакцію на олігофуростанозиди давали клітини приблизно середнього розміру, які сусідили з дрібними і більш великими клітинами, що не давали характерне забарвлення.Введення в живильне середовище 0.01%, 0.1%, 1% холестерину як природного попередника СГ позитивного результату не дало, хоча ТШХ аналіз показав присутність холестерину в калюсних тканинах в усіх варіантах.

Таблиця 11 Цитометричні характеристики клітин калюсу Y. torreyi

Клітини	Параметри клітин	Параметри ядер	Ядерно-плазмове відношення	Об'єм Ядерця	Ядерно-ядерцеве відношення
	D Mm (мкм)	d Mm (мкм)	V Mm	D Mm (мкм)	d Mm (мкм)	V Mm	Mm	Mm	Mm
Всі клітини калюсу	330300	11793	3073333,165 3069013,273	3327	3327	18017,549145 17981,550045	0,112691183 0,112308817	35,436614064 34,874128126	0,148148675129 0,1481670665
Що містять Сапоніни	162108	7545	297836,3039 284336,6414	34,525,5	19,510,5	6810,57973125 6689,08276875	0,073584333 0,072618149	35,436614064 34,874128126	0,1487424148895 0,1475529668895

Поряд з цим в процесі культивування мікропагонів біля їхньої основи був одержаний калюс, який активно наростав на середовищі QL, що містив 2 мг/л БАП і 0.4 мг/л НУК без проявів гістогенезу.

Гістохімічний аналіз цього калюсу показав наявність в ньому груп клітин, що містили олігофуростанозиди, які давали позитивну реакцію з реактивом Ерліха (Рис.5). При ТШХ витяжки з цього калюсу були виявлені два олігофуростанозиди: Y1 с Rf=0,32 і Y2 c Rf=0,23.

СГ спіростанолового ряду були відсутні, що, очевидно, пов'я-зано з відсутністю в недиференцій-ованих тканинах -глюкозидази, що зумовлює перехід олігофуростано-зидів в спіростанолові аналоги.

Математичне вираження показників величин ядерно-плазмо-вого відношення клітин цього калю-су, так само як і величини об'ємів клітин і ядер вкладається в експоненціальний розподіл (Рис. 6).

Між об'ємом ядра і об'ємом клітини виявлений корелятивний зв'язок (r=0,68). Об'єм ядра і величина ядерно-плазмового відношення знаходилися в слабо вираженій позитивній кореляції (r=0,21). Слабка, причому негативна, кореляційна залежність спостерігалася між об'ємом клітини і ядерно-плазмовим відношенням, (r=-0,19).

Таким чином, можна зробити висновок, що в первинному калюсі Y. torreyi СГ відсутні. Їхня поява віднесена до початку гістогенезу, і осередками синтезу є судини ,що диференціюються, хоча, як було показано, синтез можливий і в калюсі без видимих ознак гістогенезу, причому, в останньому випадку СГ виявляються тільки в частині клітин, які, очевидно, є місцями їхнього синтезу. На користь останнього говорить той факт, що в клітинах калюсу без ознак гістогенезу СГ представлені виключно фізіологічно неактивними олігофуростанозидами, що є також транспортною формою СГ і здатними переходити в спіростанолові глікозиди, які в свою чергу володіють значною фізіологічною активністю і, згідно з літературним даними (Miura et al., 1987; Носов, 1991), чинять вплив на цитодиферен-ціацію і морфогенез.

Для одержання якісного посадкового матеріалу Yucca torreyi Shafer. і максимального виходу рослин при насінному розмноженні в умовах інтродукції на ПБК рекомендується використовувати насіння з плодів, виповнених не більше ніж на 70% ,що зберігалися не більше двох місяців.

При необхідності тривалого збереження насіння Y. torreyi доцільним є зберігання його всередині непошкоджених плодів.

Доцільним є використання клонального мікророзмноження in vitro через індукцію утворення адвентивних бруньок в культурі епікотилю для масового тиражування рослин Y. torreyi.

ВИСНОВКИ

Вивчені взаємозв'язки схожості насіння Yucca torreyi Shafer. з морфологією насіння і плодів, одержаних при штучному запиленні. Показано, що середня маса насіння знаходиться в негативному, близькому до функціонального, зв'язку (r=-0,91) з масою плоду, а схожість насіння знаходиться в близькому до функціонального позитивного зв'язку (r=0,89) з їхньою масою.

В процесі вивчення розвитку проростків Yucca torreyi Shafer. на ранніх етапах онтогенезу виявлено сім стадій, загальна тривалість яких в умовах in vitro на безгормональному середовищі МС і в умовах in vivo склала 138 і 140 діб відповідно.

Показано, що схожість свіжозібраного виповненого насіння Yucca torreyi Shafer. при сівбі в грунтову суміш і на безгормональне живильне середовище МС становила 78-89% і 85-98% відповідно.

Виявлена зворотна залежність схожості насіння Yucca torreyi Shafer. в умовах in vivo та in vitro від строків зберігання, найменш виражена при зберіганні насіння всередині плодів.

Розроблені способи мікророзмноження рослин Y. torreyi в умовах in vitro: 1) розвиток повноцінних проростків в культурі зародків і подальше одержання рослин; 2) адвентивне пагоноутворення в культурі епікотилю, різогенез мікропагонів і одержання регенерантів.

Показано, що синтез стероїдних глікозидів Y. torreyi віднесений до початку гістогенезу. Проте одержаний калюс без ознак гістогенезу, в 35% клітин якого містились два олігофуростанозиди (Rf=0,32; Rf=0,23).

Виявлені СГ в листі, корінні, квітках і насінні, їхніх частинах і тканинах. Визначена локалізація СГ в тканинах і клітинах листя і коріння різного віку і в насінні. Встановлена залежність зміни в складі СГ від місця розташування тканин і органів, віку самої рослини Y. torreyi, а також її здатності зав'язувати насіння. Показано, що високий вміст СГ був в насінні і квітках.

Вперше встановлена структура переважного глікозида насіння Yucca torreyi, що є, 3-о--D-глюкопіранозил-(12)-о--D-галактопіранозидом сарсапогеніна, що складає 10% від маси насіння , при загальному вмісті суми СГ, що складає 20%.

Негативна реакція на СГ при ТШХ і гістохімічному аналізі в культурі коріння in vitro і позитивна - в культурі мікропагонів довели, що в Yucca torreyi Shafer. синтез СГ відбувається в надземній частині рослини.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Карпов П.А. Изучение стероидных гликозидов семян некоторых представителей рода Yucca. // Бюл. Никит. ботан. сада. -1997. - Вып.78. -С.92-95.

2. Лищук А.И., Карпов П.А. Изучение стероидных гликозидов Yucca macrocarpa в вегетативных органах. // Бюл. Никит. ботан. сада. -1997. - Вып.78. -С.95-99.

3. Карпов П.А., Чирва В.Я. Изучение стероидных гликозидов в репродуктивных органах Yucca macrocarpa Engelm. // Бюл. Держ. Нікіт. ботан. саду. -1998. -Вип.80. - С.168-174.

4. Гришковец В.И., Карпов П.А., Иксанова С.В., Чирва В.Я. Стероидный гликозид из семян Yucca macrocarpa. // Химия природных соединений. -1998. -Вып.6. - С.828-830.

5. Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А Перспективы размножения Юкки крупноплодной (Yucca macrocarpa Engelm.) в условиях интродукции. // Ботанические сады - центры сохранения биологического разнообразия мировой флоры. Тез. докл. сессии совета Ботанических садов Украины. Ялта, 1995. - C.136

6. Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А Семенное размножение видов юкки в условиях Южного берега Крыма. // Селекция, экология, технологии возделывания и переработки нетрадиционных растений (посвящается творческому наследию Л.П. Симиренко): Материалы IV междунар. научно-производственной конф. г. Алушта, 11-17 сентября, 1995: Тез.докл. - Cимферополь, 1996. - С.73.

7. Максимов А.П., Новикова В.М., Карпов П.А., Капелев О.И. Арборетум Никитского ботанического сада - источник генофонда однодольных древесных интродуцентов. // Старовинні парки і проблеми їх збереження.: Тез. доп. 2-го міжнар. симпозіуму присвяченого 200-річчю дендрологічного парку “Софіївка”. Умань, 1996. - С.100.

8. Карпов П.А., Новикова В.М., Гришковец В.И., Максимов А.П., Чирва В.Я. Возможности использования видов рода Юкка (Yucca L.) для получения стероидных гликозидов. // Четверта міжнародна конференція з медичної ботаніки, г.Ялта, 24-26 сентября 1997г.: Тез. доп. Київ, 1997. - C.394-395.

9. Novikova V.M., Karpov P.A. Culture in vitro of some kinds Yucca. // In vitro Plant Cell Biology, Biotechnology and Germplasm Preservation: ABSTRACTS of the VII Intern. Conf. Moscow. 25-28 Nowember 1997. -Moscow, Russia. -P.44-45.

10. Novikova V.M., Kapelev O.I., Karpov P.A. Culture of tissues of some arboreal monocotyledonous plants. // ABSTRACTS II International Symposium on Plant Biotecnol. 4-8 October 1998.- Kyiv, Ukraine. - P.92.

11. Карпов П.А., Новикова В.М., Максимов А.П. Юкка крупноплодная (Yucca macrocarpa Engelm.) перспективы изучения и культивирования. // Интродукция растений и отдаленная гибридизация.: Междунар. конф., г.Москва, 15-17 декабря 1998г.: Тез. докл. - Москва, 1998. - С.57-58.

12. Карпов П.А. Гистохимическое определение локализации стероидных гликозидов в листьях Yucca macrocarpa Engelm. // Int. Meeting of Young Scientists in Horticulture: 7th Int. Conf. Lednice / Czech Republic, September 14-16, 1999. Materials. Lednice, 1999. -P.172-176.

Размещено на Allbest.ru

...