Молекулярная биотехнология

Размещено на http://www.allbest.ru/

Министерство образования Республики Беларусь

Учреждения образования "Белорусский государственный технологический университет"

Кафедра биотехнология и биоэкология

Специальность биотехнология

Контрольная работа

Молекулярная биотехнология

Исполнитель Островская Т.В.

Минск 2012

Содержание

1. Перечислите и кратко охарактеризуйте все явления, способствующие неизменности наследственной информации

2. Какие элементы в структуре гена используются при различных процессах регуляции клеточного метаболизма?

3. Особенности науки биотехнологии. Краткая история ее развития

4. Что такое "блоттинг"? Где и зачем используют данный метод? Какие разновидности метода существуют?

5. Методы молекулярного маркирования. Характеристика метода ПЦР

6. Особенности, использование и примеры сайт-специфического мутагенеза

7. Получение с помощью генетически модифицированных микроорганизмов витаминов

8. Проблемы восприятия генетической инженерии общественностью. Биоэтика

Список литературы

1. Перечислите и кратко охарактеризуйте все явления, способствующие неизменности наследственной информации

Постоянство структуры ДНК и точность копирования молекулы в процессе самоудвоения обеспечивают неизменность белков. Это означает и неизменность белков у того или иного вида в стабильных условиях геномный уровень организации наследственного материала, объединяющий всю совокупность хромосомных генов, является эволюционно сложившейся структурой, характеризующейся относительно большей стабильностью, нежели генный и хромосомный уровни. На геномном уровне система сбалансированных по дозам и объединенных сложнейшими функциональными взаимосвязями генов представляет собой нечто большее, нежели простую совокупность отдельных единиц. Поэтому результатом функционирования генома является формирование фенотипа целостного организма. В связи с этим фенотип организма нельзя представлять как простую совокупность признаков и свойств, это организм во всем многообразии его характеристик на всем протяжении индивидуального развития. Таким образом, поддержание постоянства организации наследственного материала на геномном уровне имеет первостепенное значение для обеспечения нормального развития, организма и воспроизведения у особи в первую очередь видовых характеристик.

Наследственность - это способность живых организмов передавать потомкам морфологические, физиологические, биохимические, этологические признаки, особенности онтогенеза и обмена веществ. Благодаря наследственности обеспечивается материальная и функциональная преемственность в непрерывном ряде поколений. Внешним проявлением наследственности есть структурное и фенотипическое сходство родителей и потомков и всех особей, связанных родством. Сходство между родителями и детьми не ограничивается тем, что они имеют одинаковые видоспецифичные признаки. Часто дети похожи на родителей мельчайшими индивидуальными особенностями. Это связано с тем, что наследственность есть сложный длительный процесс воплощения генетической программы в процессе онтогенеза в признаки организма. По своей сути наследственность есть "повторение в последовательных поколениях одинаковых форм обмена". Обмен веществ контролируется ферментами, а их структура и структура белков контролируется нуклеиновыми кислотами. Потомки получают программу обмена в форме молекул ДНК. На этой основе они воспроизводят специфические признаки и свойства. То есть наследственность обусловливается генотипом.

Генотип - это совокупность всех генов данной клетки, данного организма. Генотип состоит из хромотипа и плазмотипа. Генотип (идеотип) - это генетическая конституция, наследственная система, которая обусловливает развитие фенотипа. Так как генотип есть единая сложная система взаимодействующих генов, проявление каждого гена зависит от других генов, от генетической среды. Проявление гена зависит также от факторов внешней среды. Поэтому генотип определяет наследование нормы реакции по всем признакам. Вследствие этого организмы с одинаковыми генотипами, при развитии в различных условиях, имеют отличающиеся признаки. Например, красный цвет лепестков примула имеет при выращивании при температуре 15--20° С, белый - при выращивании при 30-35° С. Количество генов в генотипе разных организмов различно: у вирусов - десятки-сотни, у бактерий - тысячи, у дрозофилы - 5--15 тыс., а у человека - 20--100 тыс. Генотип - это целостная, исторически сложившаяся система. Эти качества генотип приобрел в процессе эволюции.

Генотип каждого организма, через фенотип, постоянно контролируется естественным отбором: выживают и дают более многочисленное и плодовитое потомство лишь те организмы, у которых взаимодействие генов между собой и условиями среды наиболее гармонично.

Фенотип - совокупность признаков и свойств организма, которая формируется в онтогенезе в процессе взаимодействия генотипа и условий внешней среды. Фенотип - это проявление части генотипа в виде признаков. Признак - это любая особенность морфологии, физиологии, этологии, биохимии. Ранние генетики представляли взаимоотношения гена и признака просто: "Один ген контролирует развитие одного признака". Позднее, после работ Бидла и Татума (1945), общепринятой стала концепция "один ген - один белок", "один ген - один фермент". В настоящее время общепринятой есть концепция "один ген - одна полипептидная цепь". Процессу формирования признака присуща многоэтапность. Например, окраска волос млекопитающих зависит от пигмента меланина. Этот пигмент синтезируется из аминокислот фенилаланина и тирозина. Фенилаланин гидроксилазой превращается в тирозин. Тирозиназа превращает тирозин вДОФА. Затем следует еще 6 промежуточных синтезов, и только после этого образуется меланин. Но синтез ферментов также определяется генами. К тому же под генетическим контролем находится время, количество и место синтеза пигмента. Гены также контролируют распределение меланина по длине волоса (равномерное - черный цвет, неравномерное - серый) и по его толщине. наследственный биотехнология генетический блоттинг

На фенотипическое проявление гена влияют:

· Состояние аллеля (рецессивный аллель проявляется только в доминантном состоянии).

· Полное доминирование доминантного аллеля.

· Неполное доминирование доминантного аллеля.

· Кодоминирование.

· Сверхдоминирование.

· Множественность аллелей данного гена.

· Пенетрантность.

· Экспрессивность.

· Полигиния.

· Взаимодействие неаллельных генов (комплементарность, эпистаз).

· Воздействие генов-ингибиторов, генов-регуляторов, генов модификаторов.

· Плейотропное воздействие гена.

Таким образом, наследуются не признаки, а гены. Признак детерминируется генами, но признак появляется медленно; он формируется в онтогенезе, в процессе взаимодействия с условиями среды.

Фенотип любого организма различен в эмбриональном периоде, после рождения, во время полового созревания, в старости. В отличие от генотипа, фенотип формируется в процессе онтогенеза.

При передаче наследственной информации из поколения в поколение молекулы ДНК удваиваются в процессе дупликации. Каждая дочерняя клетка получает одну из двух идентичных молекул ДНК. При бесполом размножении генотип дочернего организма идентичен материнскому. При половом размножении организм потомка получает собственный диплоидный набор хромосом, собранный из гаплоидного материнского и гаплоидного отцовского наборов.

При передаче наследственной информации из ядра в цитоплазму ключевым процессом является транскрипция - синтез РНК на ДНК. Синтезированная молекула иРНК является комплементарной копией определенного фрагмента ДНК - гена и содержит информацию о строении определенного белка. Такая молекула иРНК является посредником между хранилищем генетической информации - ядром и цитоплазмой с рибосомами, где создаются белки. Рибосомы используют иРНК как матрицу ("инструкцию") для синтеза белка в процессе трансляции.

2. Какие элементы в структуре гена используются при различных процессах регуляции клеточного метаболизма?

Живая клетка - открытая система, постоянно обменивающаяся с внешней средой веществами и энергией: в неё поступают питательные вещества, которые подвергаются превращениям и используются в качестве строительного и энергетического материала, из клетки выводятся конечные продукты метаболизма. В многоклеточном организме клетка реагирует не только на изменение окружающей среды, но и на функциональную активность соседних клеток. При этом она стремится сохранить неизменным свой внутренний состав. Это состояние называют стационарным или клеточным гомеостазом.

В клетке постоянно происходит большое количество разнообразных химических реакций, которые формируют метаболические пути - последовательное превращение одних соединений в другие. Метаболизм - совокупность всех метаболических путей, протекающих в клетках организма.

Среди всех метаболических путей, протекающих в организме, выделяют противоположно направленные процессы: катаболизм и анаболизм. Катаболизм - распад сложных веществ до простых с высвобождением энергии. Анаболизм- синтез из простых более сложных веществ. Метаболические пути согласованы между собой по месту, времени и интенсивности протекания. Эта согласованность протекания всех процессов обеспечивается сложными и многообразными механизмами регуляции.

Биосинтетические пути регулируются преимущественно по механизму аллостерического ингибирования первого фермента и репрессии синтеза ферментов этого пути конечным продуктом. Регулирование разветвленных биосинтетических путей осуществляется с помощью усложненных вариантов этих же механизмов.

Основные механизмы, регулирующие катаболические пути, - индукция синтеза ферментов и катаболитная репрессия. Катаболические пути, в которых функционируют конститутивные ферменты, регулируются большей частью посредством аллостерических воздействий на активность ферментов. Одна из задач катаболических путей - обеспечение клетки энергией. У большинства прокариот возможности генерации энергии намного превышает потребности в ней клетки. Количество АТФ, которое можно синтезировать с помощью имеющихся в клетках аэробных прокариот ферментов гликолитического и дыхательного путей, значительно больше количества АТФ, необходимого для процессов биосинтеза и поддержания жизнедеятельности. Поэтому клетки должны обладать способностью контролировать потребление энергодающих субстратов и, следовательно, выработку клеточной энергии. Основной принцип контроля прост: АТФ синтезируется только тогда, когда он необходим, Иными словами, интенсивность энергетических процессов у прокариот регулируется внутриклеточным содержанием АТФ.

Адениловые нуклеотиды относятся к числу важнейших эффекторов. АМФ и АДФ действуют как положительные эффекторы, стимулирующие скорость энергетических процессов и, следовательно, повышающие выход АТФ. Наоборот, АТФ служит отрицательным эффектором, сигнализирующим о превышении процессов образования АТФ над его потреблением. В результате регуляции процессов синтеза и распада АТФ в клетке поддерживается стационарное энергетическое состояние, характеризующееся так называемым энергетическим зарядом клетки:

Величина энергетического заряда теоретически может колебаться от 1 (в клетке все адениловые нуклеотиды только в виде АТФ) до 0 (в клетке содержится только АМФ). В растущей культуре величина энергетического заряда клетки равна примерно 0,8. Уменьшение его свидетельствует об ухудшении энергообеспечения организма. Когда эта величина становится ниже 0,5, клетки погибают.

Помимо адениловых нуклеотидов в регулировании энергетических процессов активную роль играют система

НАД(Ф)+/НАД(Ф)-H2

коферментов и величина трансмембранного электрохимического градиента ионов водорода в виде обоих его составляющих (DypH и DpH). Преобладание аллостерического взаимодействия восстановленной или окисленной форм НАД (Ф) с ферментами катаболического пути приводит соответственно к понижению или повышению их активности. Достижение определенного порогового значения DmH⁺ на энергопреобразующей мембране служит определенным сигналом, тормозящим поступление ионов водорода против градиента.

Регуляция процессов активного транспорта, обеспечивающего поступление подавляющего большинства необходимых прокариотам веществ, происходит на уровне синтеза переносчика и его функционирования. Биосинтез белковых компонентов многих транспортных систем регулируется по типу индукции. Глюкоза, транспортная система которой у большинства прокариот конститутивна, подавляет образование транспортных систем других сахаров и ряда органических кислот путем катаболитной репрессии. Исключение составляют некоторые облигатно аэробные прокариоты, у которых транспорт органических кислот конститутивен, а индуцируемой является транспортная система глюкозы. Избыток субстрата в среде может репрессировать синтез соответствующей транспортной системы. Это особенно характерно для аминокислот. В этом случае регуляция транспорта координирована с регуляцией их последующего метаболизма. Обнаружена также регуляция транспорта по типу отрицательной обратной связи, когда субстрат, накопленный внутри клетки, подавляет собственный транспорт из внешней среды. Таким образом, процессы клеточного транспорта находятся под контролем тех же механизмов, что и внутриклеточные анаболические и катаболические процессы. Получение мутантов с нарушениями в системе регуляции клеточного метаболизма, приводящими к сверхсинтезу определенных метаболитов, широко используется для получения аминокислот, витаминов, полисахаридов и других веществ, имеющих практическое значение.

3. Особенности науки биотехнологии. Краткая история ее развития

Биотехнология - чрезвычайно наукоемкая технология. Так, например, возникшая первой в США фирма "Дженетек" расходует 76 % доходов на исследовательские разработки вместо обычных для других фирм 12 %. Среди общего числа работников НБФ около 35 % составляют доктора наук.

Таким образом, новая биотехнология--это больше научно-техническое новаторское направление, чем производственное, хотя и с довольно большими производственными перспективами. Однако это такое научно-техническое направление, которое само выступает производства, причем такого производства, которое уже не может сделать буквально ни одного шага без глубоких фундаментальных и систематических прикладных научных разработок. Подчеркивая специфику новой технологии, т. е. отличая ее и от сельского хозяйства, и от традиционной промышленности, можно так определить биотехнологию: это технология промышленного применения и эксплуатации естественных и целенаправленно созданных живых систем, прежде всего микроорганизмов, в качестве автоматически действующих сил природы для удовлетворения.

Возникновение социальных проблем биотехнологии обусловлено прежде всего тем, что это новое производство есть одно из важнейших направлений научно-технического прогресса, качественно преобразующих содержание научно-технической революции. Есть все основания предполагать, что в недалеком будущем биотехнология превратится в одно из важнейших приоритетных направлений научно-технического прогресса и тем самым может привести к переосмыслению и самих критериев этого прогресса. Это предположение зиждется на том, что глобальные проблемы современности, и в особенности экологическую, продовольственную и энергетическую, очень трудно (если не невозможно) будет решать без самого непосредственного и широкого применения биотехнологии. Важнейшие социальные проблемы возникают также и в связи с тем, что развитие биотехнологии ведет к размыванию традиционных границ между сельским хозяйством и промышленностью. Более того, возникающая в настоящее время необходимость сначала экологизации, а затем и в более широком смысле биологизации всей производственной и хозяйственной деятельности человечества может привести не только к перестройке и даже замене (сначала, конечно, частичной) привычного сельского хозяйства биотехнологией, но и к преобразованию промышленности и техники.

Примечательно, что в сфере биотехнологии целый ряд биологических наук, и прежде всего микробиология, генетика и физико-химическая биология, уже превращаются в непосредственную производительную силу.

Слияние науки и производства, превращение науки в непосредственную производительную силу, а производства в предметно - воплощающую науку как нельзя лучше характеризует это новаторское направление. Видимо, поэтому оно оказывается тем фокусом, который стягивает в себе как проблематику, традиционно относимую к сфере философии и методологии научного познания, так и проблемы социально-философского и методологического осмысления практики, производства, промышленности. К. Маркс подчеркивал, что превращение производства в материальную творческую науку становится возможным лишь "по отношению к человеку сложившемуся, в голове которого закреплены накопленные обществом знания".

Биотехнология привлекает к себе, прежде всего возможностью приспособления естественных, органических технологий живой клетки, ткани, организма, биоценоза и биосферы в целом для нужд человека как таких технологий, которые естественным образом смогут быть встроены в биологический круговорот планеты. Однако это только идея, пока существующая еще в качестве труднодостижимой мечты, поскольку теперь действующая биотехнология - это в большей мере химическая технология, в которой используются фрагменты живого. Тем не менее, и в качестве даже идеи-мечты она оказывает заметное благотворное воздействие: именно в русле этой мечты родились и задачи экологизации, и - в более широком плане - биологизации всей производственно-хозяйственной деятельности человека на планете.

Еще в начале века крупнейший французский химик П. Бертло считал, что можно создавать идеальную пищу, которая в виде питательных порошков или растворов будет вводиться прямо в желудочно-кишечный тракт или непосредственно в кровь. Эта идея фактически поддерживалась до самого последнего времени (70-е годы), однако теперь ясно, что она никогда не может быть реализована. Как отмечает А.М. Уголев, в последнее время были сделаны крупнейшие открытия, которые влияют на всю стратегию питания. Были "обнаружены неизвестные ранее типы пищеварения (лизосомальное, внутриклеточное и мембранное). А также поглощения пищевых веществ. Кроме того, установлено, что в отношении метаболизма человек (и другие высшие животные) "представляет собой не собственно организм, а надорганизм, поскольку он включает в себя целый комплекс микроорганизмов". Последнее обстоятельство особенно интересно тем, что оно привело к формированию представлений об эндоэкологии. т. е. внутренней экологии человека и других многоклеточных организмов, а также к представлению о том, что в процессе эволюции мы сформировались как организмы с определенными природными "технологиями", обойти которые не представляется возможным.

На третьем съезде Европейской ассоциации биотехнологов (Мюнхен, 1984 г.) голландский ученый Е. Хаувинк выдвинул концепцию периодизации развития биотехнологии, определив пять основных периодов (см. таблицу 1)

Таблица 1. Пять основных периодов развития биотехнологии

Период (эра)	Научные достижения данного периода
Допастеровская эра (до 1865 г.)	Использование спиртового и молочнокислого брожения при получении пива, вина, хлебопекарных и пивных дрожжей, сыра. Получение ферментированных продуктов и уксуса.
Послепастеровская эра (1866-1940 гг.)	Производство этанола, бутанола, ацетона, глицерола, органических кислот и вакцин. Аэробная очистка канализационных вод. Производство кормовых дрожжей из углеводов.
Эра антибиотиков (1941-1960 гг.)	Производство пенициллина и других антибиотиков путем глубинной ферментации. Культивирование растительных клеток и получение вирусных вакцин. Микробиологическая трансформация стероидов.
Эра управляемого биосинтеза (1961-1975 гг.)	Производство аминокислот с помощью микробных мутантов. Получение чистых ферментов. Промышленное использование иммобилизационных ферментов и клеток. Анаэробная очистка канализационных вод и получение биогаза. Производство бактериальных полисахаридов.

4. Что такое "блоттинг"? Где и зачем используют данный метод? Какие разновидности метода существуют?

Если водный раствор ДНК нагреть до 100оС и повысить рН до 13, то ДНК диссоциирует на 2 цепи (денатурирует), так как комплементарные связи между основаниями разрушаются. В 1961 году было обнаружено, что этот процесс обратим: выдерживание ДНК при температуре 65^оС вело к восстановлению структуры двойной спирали. Этот процесс называется ренатурация или гибридизация. Процессы гибридизации происходят между любыми одинарными цепями, если они комплементарны: ДНК - ДНК, РНК - РНК, ДНК - РНК. Для теста необходимо иметь чистый одноцепочный фрагмент ДНК, комплементарный той последовательности, которую хотим обнаружить. Этот фрагмент получают либо клонированием, либо путем химического синтеза. Одноцепочечная ДНК, используемая в качестве индикатора, называется ДНК-зонд. Она может содержать от 15 до 1000 нуклеотидов.

ДНК-зонды применяются в различных целях. Гибридизация ДНК-зонда с РНК, выделенной из анализируемой клетки, может выявить наличие или отсутствие экспрессии гена. Если гибридизации не происходит, значит ген молчит, не работает. ДНК-зонды также позволяют проводить диагностику наследственных болезней.

В большинстве случаев мутации, ведущие к наследственным болезням, рецессивны, то есть болезнь развивается, если человек получает дефектные гены от обоих родителей. Аномальные эмбрионы лучше выявлять до рождения. Например, для серповидно-клеточной анемии в мутантном гене, кодирующем бэта-цепь гемоглобина, последовательность ГАГ заменена на ГТГ. В этом случае синтезируют олигонуклеотид длиной около 20 оснований, метят радиоактивной меткой. Из эмбриональных клеток, содержащихся в амниотической жидкости, выделяют ДНК и используют ее для гибридизации. Если эмбрион дефектен, то тест будет положительным.

Анализ проводят по следующей схеме (рис. 1): исследуемую ДНК гидролизуют рестриктазами, фракционируют электрофорезом, переносят разделенные фрагменты на нитроцеллюлозный фильтр и проводят реакцию гибридизации с мечеными олигонуклеотидами. Этот метод был разработан Саузерном в 1975 году. В отечественной литературе его принято называть "южный блоттинг". "Блоттинг" - в переводе с английского означает "промокашка", "саузерн" - "южный", в данном случае игра слов: фамилия ученого переводится как географическое направление.

Молекулы ДНК разгоняют в агарозном геле электрофорезом. ДНК в геле денатурируют щелочью. Щелочь нейтрализуют и пластину геля покрывают листом нитроцеллюлозы. Сверху на нитроцеллюлозу помещают стопку листов фильтровальной бумаги, обеспечивая медленный ток буферного раствора через гель в направлении, перпендикулярном направлению электрофореза. ДНК диффундирует из геля и связывается с нитроцеллюлозным фильтром. После прогревания фильтра при 80^оС в вакууме ДНК необратимо связывается с нитроцеллюлозой. Расположение полос иммобилизованной ДНК точно соответствует их расположению в геле.

ДНК, связанную с нитроцеллюлозным фильтром, можно гибридизовать с радиоактивно меченой ДНК. Блоттинг по Саузерну является исключительно полезным также и для локализации изучаемых генов в определенных фрагментах, полученных в результате гидролиза различными рестриктазами гибридных молекул ДНК, хромосомной ДНК и т. д.

Рис. 1. Блоттинг ДНК по Саузерну

Аналогичным методом на нитроцеллюлозу переносят молекулы РНК (Северный блоттинг) и белка (Западный блоттинг). Из частей света осталась свободной только западная, хотя вакантными остались 2 класса макромолекул - углеводы и липиды.

Одним из наиболее точных и современных методов анализа является использование чипов. Они представляют собой пластинки с иммобилизованными меченными ДНК-зондами. Каждая такая пластинка может содержать несколько десятков тысяч зондов, расположенных в определенной последовательности. Метка проявляется только в спаренных двухцепочечных фрагментах. Если в исследуемом образце есть последовательности, комплементарные последовательностям зонда, то гибридизацию можно определить визуально или с помощью специальных приборов. Как правило, детекторы соединены с компьютером, то есть процедура считывания и обработки информации автоматизирована.

Такие ДНК-чипы можно применять для комплексной диагностики инфекционных заболеваний, наследственных дефектов, установления экспрессии тех или иных генов (в этом случае идет гибридизация с мРНК), то есть отслеживания нарушений обмена веществ. Они дешевы, очень надежны, просты в обращении и могут многократно использоваться. Недостаток - дорогая аппаратура для детекции.

5. Методы молекулярного маркирования. Характеристика метода ПЦР

Метод ПЦР предложен в 1983 г. американским исследователем Карри Муллисом, удостоенным за это изобретение Нобелевской премии в 1993 г.

Метод ПЦР, или специфической амплификации ДНК, позволяет избирательно синтезировать in vitro относительно небольшие участки ДНК длиной от нескольких десятков до нескольких сотен пар нуклеотидов, используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность. Необходимым условием для проведения ПЦР является знание нуклеотидной последовательности амплифицируемой области ДНК, так как специфический выбор этого участка осуществляют путем гибридизации матричной ДНК с двумя искусственно синтезированными праймерами - олигонуклеотидными последовательностями ДНК, длиной обычно от 15 до 30 п.о., комплементарными 3'-концам амплифицируемого участка на смысловой и антисмысловой нитях ДНК соответственно (рис. 14.7). Расстояние между праймерами определяет длину синтезируемых молекул.



Для проведения специфической амплификации не требуется больших количеств матричной ДНК и в принципе достаточно даже одной молекулы. Успех в разработке метода ПЦР в значительной мере связан с использованием в качестве фермента, обеспечивающего синтез ДНК, термофильной ДНК-полимеразы, выделенной из бактерий, живущих в горячих источниках, и потому устойчивой к действию высоких температур.

Как показано на схеме, на первом этапе ПЦР исследуемая двух-нитевая матричная ДНК переводится в однонитевую форму путем ее нагревания в течение нескольких минут до температуры, превышающей 95-98°С. Дальнейшая схема проведения ПЦР достаточно проста и заключается в чередовании циклов:

· гибридизации, или отжига ДНК с праймерами;

· синтеза последовательности, комплементарной матричной ДНК;

· денатурации образовавшихся двухнитевых структур.

При гибридизации, достигаемой за счет понижения температуры реакционной смеси до 30-50°С, происходит образование двухнитевого участка ДНК в строго специфичных областях, комплементарных праймерам. При температуре, оптимальной для работы ДНК-полимеразы, 60-70°С, начинается синтез ДНК в направлении 5'-3' с двухнитевого участка, образованного праймерами. Затем при нагревании раствора примерно до 80-90°С синтез прекращается и двухнитевой участок между матричными и вновь синтезированными молекулами ДНК расплавляется (денатурирует).

В первом цикле олигопраймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК, а затем (в последующих циклах) и с вновь синтезированными молекулами ДНК по мере их накопления в растворе. В последнем случае синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДНК-полимеразой границы амплифицированного участка, что и определяет в конечном счете размер вновь синтезированного участка ДНК с точностью до одного нуклеотида.

Таким образом, при каждом цикле происходит двукратное увеличение числа синтезированных копий выбранного для амплификации участка ДНК, и содержание продуктов амплификации в растворе нарастает в геометрической прогрессии.

Каждая из процедур цикла определяется двумя параметрами - температурой реакции и ее длительностью, меняющейся в диапазоне от десятков секунд до 1-3 минут, так что полный цикл длится от одной до несколько минут. За 25-30 циклов число синтезированных копий ДНК достигает нескольких миллионов.

ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы - термоциклеры или амплификаторы ДНК. Такой, прибор позволяет задавать нужное количество циклов и выбирать оптимальные временные и температурные параметры для каждой процедуры цикла из большой и часто непрерывной шкалы возможных вариантов. В техническом исполнении ПЦР очень проста. Все компоненты реакции - матричную ДНК, олигопраймеры, смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (dNТР) и термофильную ДНК-полимеразу добавляют в специфический буфер (часто одномоментно), наслаивают небольшой объем вазелинового масла для предотвращения высыхания, затем помещают пробирку с реакционной смесью в автоматический термоциклер и выбирают необходимую программу циклической смены температуры и длительности каждого шага реакции. Общий объем реакционной смеси обычно составляет от 10 до 50-100 мкл. Выбор оптимального режима работы определяется длиной и специфичностью амплифицируемого участка. Следует подчеркнуть, что реально для каждой полимеразной реакции в зависимости от типа праймеров, длины амплифицированного фрагмента, особенностей его первичной нуклеотидной структуры, а также от типа используемой термофильной ДНК-полимеразы, оптимальные режимы температуры и состав амплификацяонной смеси могут существенно варьировать и зачастую подбираются эмпирически.

С помощью ПЦР можно непосредственно исследовать места локализации предполагаемых мутаций или полиморфных сайтов, а также изучать наличие любых других специфических особенностей ДНК. Подбор системы олигопраймеров производят на основании анализа нуклеотидной последовательности амплифицируемого участка. Разработаны различные варианты автоматического поиска последовательностей ДНК, использование которых в качестве праймеров оптимизирует процедуру амплификации специфического участка геномной ДНК.

Для того чтобы гибридизация проходила строго специфично, праймеры не должны содержать повторяющихся последовательностей ДНК. В качестве источника матричной ДНК может быть использован любой, даже деструктурированный биологический материал, сохранивший в своем составе достаточно полный набор фрагментов исходных молекул ДНК. Для специфической амплификации наряду с очищенной ДНК используют высушенные на фильтровальной бумаге пятна крови, небольшие кусочки тканей, например, такие как ворсины хориона, смывы из полости рта, луковицы корней волос, культуры клеток и сливы среды с клеточных культур, содержащие неприкрепившиеся и не давшие роста клетки, соскобы с цитогенетических препаратов и, что особенно удивительно, полученные при патологоанатомическом анализе и длительно хранившиеся фиксированные ткани.

Существуют различные модификации ПЦР, применение которых зависит от конкретных целей проведения реакции или от характера последующего молекулярного анализа амплификатов. Так, для трудноамплифицируемых участков ДНК (содержащих различные повторяющиеся последовательности или необычные структурные элементы), а также в тех случаях, когда матричная ДНК присутствует в следовых количествах, ПЦР проводят в два этапа, используя в качестве матричной ДНК на втором этапе амплификации продукты ПЦР, синтезированные на первом этапе. Часто в этих случаях для повышения специфичности праймирования используют систему так называемых вмонтированных (nested) праймеров, то есть при доамплификации в качестве праймеров выбирают последовательности, локализованные внутри амплифицированного на первом этапе участка ДНК.

В ряде случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, то есть одновременную амплификацию нескольких участков матричной ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, добавляя в реакционную смесь меченые dNТР. Реакцию амплификации можно проводить не только в растворах, но и непосредственно на хромосомных препаратах, при этом в случае использования меченых нуклеотидов продукты амплификации будут гибридизоваться и выявлять комплементарные им участки ДНК на хромосомах (метод PRINS - polymerase reaction in ciru).

До настоящего времени доступными амплификации были участки ДНК, не превышающие по длине 5 тыс. п.о. В последнее время, благодаря внесению ряда кардинальных усовершенствований (особый подбор праймеров, использование сразу двух различных ДНК-полимераз, трицинового буфера, специального температурного режима полимеразных циклов), возможно проведение амплификации фрагментов ДНК, достигающих 35 тыс. п. о.

Возможность очень точного и специфичного выбора участка ДНК для амплификации, небольшие размеры синтезируемых молекул, их огромное количество чрезвычайно облегчают молекулярный анализ продуктов ПЦР. Как правило, амплифицированную ДНК можно непосредственно наблюдать в проходящем ультрафиолетовом свете в виде красной полосы после электрофорeтического концентрирования и обычного окрашивания геля бромидом этидия. При наличии сайтов рестрикции в амплифицированных участках ДНК после их обработки эндонуклеазами и электрофореза количество и положение окрашенных полос на геле изменяется в соответствии с положением этих сайтов. С помощью электрофореза могут быть выявлены небольшие отклонения в размерах синтезированных молекул, которые возникают за счет делений или инсерций нескольких нуклеотидов в исходной матричной молекуле ДНК; конформационные изменения в однонитевых молекулах ДНК, возникающие при замене оснований; а также структурные изменения в дуплексах между нормальными и мутантными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. И наконец, возможно определение полной нуклеотидной последовательности синтезированных молекул с идентификацией всех мутаций в исследуемом районе матричной ДНК. Разработаны варианты ПЦР, при которых синтезируются преимущественно однонитевые фрагменты ДНК, что в последующем значительно облегчает их секвенирование.

Таким образом, метод ПЦР стал одним из основных в молекулярной диагностике наследственных болезней.

Разработаны и широко используются в практике различные варианты данного метода, позволяющие быстро и эффективно идентифицировать мутации, изучать ДНК-полиморфизмы, применяемые для молекулярного маркирования мутантных хромосом. Методы идентификации уже известных мутаций в исследуемом гене, основанные на принципе ПЦР, включают:

· метод аллель-специфических олигонуклеотидов (АS0);

· метод ПЦР-опосредованного сайт-направленного мутагенеза;

· метод амплификации рефрактерной мутационной системы (АRМS);

· метод гетеро-дуплексного анализа.

Первичную идентификацию мутаций также проводят с использованием вариантов ПЦР. Это метод анализа конформацнонного полиморфизма однонитевой ДНК (SSСР); метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGЕ), метод химического расщепления некомплементарных сайтов (СМС). Подробно с этими и другими модификациями и специальными вариантами ПЦР можно ознакомиться в специальной литературе [6].

6. Особенности, использование и примеры сайт-специфического мутагенеза

Метод введения мутаций в специфические сайты клонированной ДНК с помощью мутантных олигонуклеотидов - мутагенизируемую последовательность нуклеотидов переводят в одноцепочечную форму (например, в составе вектора на основе ДНК фага М 13) и комплементарную цепь синтезируют in vitro, используя в качестве затравки для ДНК-полимеразы олигонуклеоид, содержащий требуемую мутацию, после трансформации бактериальных клеток образовавшимся гетеродуплексом и первого раунда репликации образуются мутантная и нормальная формы ДНК, которые затем разделяют биохимическими методами.

В направленном (сайт-специфическом) мутагенезе изменения в ДНК вносятся в заранее известный сайт. Для этого синтезируют короткие одноцепочечные молекулы ДНК (праймеры), комплементарные целевой ДНК за исключением места мутации.



Рис.1. Сайт-направленный мутагенез.

Синтезируют пару праймеров, несущих мутацию, и пару праймеров, комплементарных концам нужного фрагмента ДНК. В ходе первых двух реакций образуются фрагменты ДНК с мутацией, которые объединяют в третьей реакции. Полученный фрагмент вставляют в нужную генно-инженерную конструкцию.

7. Получение с помощью генетически модифицированных микроорганизмов витаминов

Микроорганизмы содержат много витаминов, которые чаще всего входят в состав ферментов. Состав и количество витаминов в биомассе зависят от биологических свойств данной культуры микроорганизмов и условий культивирования. Некоторые витамины микроорганизмы синтезируют, другие напротив усваивают в готовом виде из окружающей среды. Культура, способная синтезировать какой-либо витамин, называется автотрофной по отношению к нему, если культура не способна синтезировать данный витамин, она является автогетеротрофной.

Витамины синтезируют в основном химическим путем или получают из естественных источников. Однако эргостерин, рибофлавин (В 2), витамин В 12 и аскорбиновую кислоту (микроорганизмы используются как селективные окислители сорбита в сорбозу при производстве витамина С) получают микробиологическим путем. Для синтеза витаминов В 1, В 2, В 6, В 12 и аскорбиновой кислоты также используют кефирные грибки, а бифидобактерии - группы В, РР (никотиновая кислота) и Н, однако пока эти микроорганизмы не используются как продуценты витаминов в промышленных масштабах.

Изменяя условия среды, содержание отдельных витаминов можно увеличить. Так, количество рибофлавина зависит от интенсивности аэрации и содержания железа в среде. Количество витаминов в клетках, а также их выделение из последних можно изменить при помощи микроэлементов. Существует производство рибофлавина на основе использования дрожжеподобных грибов Eremothecium ashbyii и Ashbia gossypii. Рибофлавин продуцируется также видами Clostridium и Ascomycetes. Микроводоросль Dunalieiia viridis культивируется с целью получения в-каротина.

С помощью микробного синтеза в настоящее время получают такие витамины, как некоторые витамины группы В: В 12, В 2, каротиноиды, витамин D и другие.

Витамин В 12(цианкобаламин). Особенность витамина В 12 по сравнению с другими витаминами группы В определяется двумя причинами: во-первых, в природе он синтезируется только микроорганизмами, во-вторых, молекула витамина состоит из 2-х частей: кобальтосодержащей и нуклеотидной.

В тканях животных концентрация витамина очень низкая (в печени быка 1 мг/ кг) для того, чтобы использовать этот источник для промышленных целей. Химический синтез очень сложен.

Синтезировать витамин В 12 способны уксуснокислые бактерии, грибы и пропионовокислые бактерии. Наибольшее промышленное значение имеют Propionibacterium и Pseudomonas (P. denitrificans).

Концентрат витамина В 12 предназначен для обогащения кормов животных. Он представляет собой однородный порошок коричневого цвета, кисловатый на вкус, имеет характерный запах. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином В 12 используют пропионовокислые бактерии как в чистом виде, так и в виде концентрата, приготовленного на молочной сыворотке.

Витамин В 2 (рибофлавин) можно в небольших количествах выделять из природного сырья. В наибольшем количестве он содержится в моркови и печени трески.

Из 1 т моркови получают 1 г витамина, из 1 т печени - 6 г.

Рибофлавин впервые был выделен в кристаллическом виде в 1933 г. Продуцентами данного витамина являются дрожжи, мицелиальные грибы и бактерии. Наиболее активными продуцентами витамина В 2 являются дрожжеподобные грибы рода Eremothecium (эремофекиум), входящие в класс аскомицетов. Культивирование проводят глубинным способом при хорошей аэрации. Максимальное накопление витамина происходит вместе с максимумом накопления биомассы на 2-е сутки, причем синтез рибофлавина начинается лишь после фазы интенсивной ассимиляции сахара.

Витамином В 2 обогащают некоторые сорта белого хлеба, его используют для окраски пищевых продуктов в оранжево-желтый цвет.

Каротиноиды - это предшественники витамина А, среди которых наиболее активен -каротин. В организме человека каротиноиды не синтезируются, поэтому должны поступать извне. В печени каротин превращается в витамин А.

Продуцентами каротиноидов могут быть грибы и дрожжи. В промышленности -каротин чаще всего получают с помощью микроскопического гриба рода Blakeslea (блакеслеа). Культивирование проводят и поверхностным, и глубинным способами на питательных средах сложного состава. Во время ферментации среду интенсивно аэрируют. Образование каротиноидов в культуре микроорганизмов не идет параллельно с образованием биомассы. Интенсивный синтез каротиноидов начинается, когда в среде использован весь азот, а рост культуры уменьшается. В качестве стимуляторов в питательные среды добавляют экстракты цитрусовых и дрожжей.

-каротин используют при изготовлении пищевых продуктов как краситель. Его применяют при изготовлении колбас с целью замены нитрита натрия и обеспечения высокой интенсивности и устойчивости цвета. Используют при производстве леденцов, пищевых паст, кексов и других кондитерских изделий. Во многих странах -каротин применяют для подкрашивания сливочного масла. Нагревают до 30 С, добавляют -каротин, который при такой температуре хорошо растворяется в масле. В Италии каротиноиды используют в производстве макаронных изделий.

-каротин применяется для стабилизации цвета мяса охлажденного и замороженного в тушах. С этой целью раствор -каротина наносят на поверхность мяса.

Кроме того, -каротин обладает антиокислительными свойствами, которые используются для продления срока хранения продукта.

Таким образом, витамины, синтезированные микроорганизмами, используют не только для повышения пищевой ценности продуктов питания, но также в качестве антиоксидантов, красителей и стабилизаторов цвета.

8. Проблемы восприятия генетической инженерии общественностью. Биоэтика

Исследование и открытия в области генетики человека, совершаемые сегодня, носят практически революционный характер. Речь идет о возможности создания "карты генома человека" или "патологической анатомии генома человека" с установлением на длинной спирали ДНК местонахождения генов, ответственных за наследственные болезни. Эти возможности лежат в основании идеи генной терапии как совокупности методов лечения или протезирования дефектных генов. Вторжение в строение и функционирование генетических систем человека может быть осуществлено на двух уровнях - соматическом и эмбриональном. В связи с этим возникли новые разделы медицины - ДНК-технологии, эмбрио- и цитотерапия, т.е. внутриутробная диагностика и лечение на стадиях эмбриона или плода. Манипуляции с эмбриональным материалом имеют непосредственное воздействие на наследственность, т.е. способны передаваться по наследству из поколения в поколение. Далее генетическая диагностика перерастает в генетичесую прогностику, определяя основания революционных изменений в медицине, которая получает возможность задолго до появления "клинической картины болезни" человека, даже до его рождения, определить, какие заболевания ему грозят. Данная ситуация фиксируется понятием "прогностическая медицина".

Этические аспекты генной инженерии выражают частный, хотя и очень значимый вопрос, входящий в круг проблем, рассматриваемых биоэтикой. Последняя включает в себя этические регулятивы отношения к живым существам, в том числе и человеку. Как уже отмечалось, биоэтика сформировалась сравнительно недавно - в конце 60-х - начале 70-х гг. Ее возникновение обусловлено, прежде всего, достижениями медицины и ее техническим перевооружением. Достижения медицины определили успех таких ее направлений, как генная инженерия, трансплантация органов, биотехнология и т. д. А эти успехи, в свою очередь, обострили старью и вызвали новые моральные проблемы, с которыми сталкивается врач в общении с пациентом, его родственниками и даже со всем обществом.

Проблемы, о которых идет речь, возникли как неизбежность и часто не имеют однозначного решения. Они становятся очевидными, когда мы задаем такие вопросы: с какого момента следует считать наступление смерти (каков ее основной критерий? Допустима ли эфтаназия (легкая смерть)? Имеются ли пределы поддержания жизни смертельно больного человека и если да, то каковы они? С какого момента зародыш следует считать живым существом? Допустимо ли преждевременное прекращение беременности, убийство ли это живого существа? В одном ряду с этими вопросами находится и проблема генной инженерии человека. Ее можно сформулировать так: допустимо ли, с точки зрения моральных норм, хирургическое вмешательство в генотип человека?

Актуальность генной инженерии человека обнаруживается сразу, как только мы обратимся к необходимости лечения больных с наследственными болезнями, обусловленными геномом 1. При этом особенно важна забота о будущих поколениях, которые не должны расплачиваться собственным здоровьем за недостатки и ущербность своего генома и генофонда сегодняшнего поколения. Проблемы, связанные с генной инженерией, сегодня, без преувеличения, приобретают глобальный масштаб. Заболевания на генном уровне все чаще обусловлены развитием цивилизации. В настоящее время человечество пока не склонно отказаться от определенной части техники и технологий, несущих не только комфорт и материальные блага, но и деградацию естественной среды обитания людей. Поэтому в ближайшей перспективе будут иметь место побочные явления научно-технического прогресса, отрицательно влияющие на организмы человека. Развитие атомной энергетики, получение синтезированных химических соединений, использование гербицидов в сельском хозяйстве и т. д. создают новую природную среду, которая очень часто, мягко говоря, не является идеальной для здоровья человека. Повышенная радиация и увеличение доли химических веществ в пище и атмосфере становятся факторами, вызывающими мутации у человека. Многие из них как раз и проявляются в виде наследственных болезней и аномалий.

Имеющиеся исследования свидетельствуют о том, что у современных поколений около 50% патологий обусловлены теми или иными нарушениями в структуре и функциях наследственного аппарата. Каждые 5 новорожденных из 100 имеют выраженные генетические дефекты, связанные с мутациями либо хромосом, либо генов. Следует отметить, что генотипические факторы играют важную роль не только в появлении физических болезней, но также и в развитии отклонений в психической деятельности человека. Так, в результате проведенных исследований выяснилось, что около 50% усыновленных детей, родители которых были психически больны, даже попав с годовалого возраста в нормальную семью, в последующем страдали психическими заболеваниями. И наоборот, дети, родившиеся от нормальных родителей, попадая в условия психически больных семей, не отличались по частоте заболеваний от нормальной популяции. Имеются также данные о влияние биологических факторов на предрасположенность к различного рода отклонениям от нормального поведения, в частности к правонарушениям. Необходимость исправления "ошибок природы", генной терапии наследственных болезней выдвигает на первый план такую область молекулярной генетики, которую называют генной (или генетической) инженерией. Генная инженерия - это раздел молекулярной биологии, прикладная молекулярная генетика, задачей которой является целенаправленное конструирование новых, не существующих в природе сочетаний генов при помощи генетических и биохимических методов. Она основана на извлечении из клеток какого-либо организма гена или труппы генов, соединении их с определенными молекулами нуклеиновых кислот и внедрении полученных гибридных молекул в клетки другого организма.

Генная инженерия, безусловно, открывает широкие просторы и множество путей решения проблем медицины, генетики, сельского хозяйства, микробиологической промышленности и т. д. С ее помощью можно целенаправленно манипулировать генетическим материалом с целью создания новых или реконструкции старых генотипов. Имеющиеся достижения в этой области показывают перспективность генной терапии наследственных болезней.

Однако возникает законный вопрос о социально-этической оценке и значимости генной инженерии вообще и генной терапии человека в особенности. Спрашивается, где гарантии того, что генная терапия не будет использована во вред человеку, как это произошло со многими открытиями в области физики, химии и других наук. Иными словами, человечество столкнулось с дилеммой: затормозить прогресс или дать миру новые источники тревог.

На этот вопрос предлагаются различные ответы. Некоторые ученые, например академик Н.П. Дубинин, полагают, что надо вести борьбу за "охрану существующей наследственности человека" и не пытаться "заменить эту наследственность чем-то кажущимся в данное время лучшим". Он считает, что наследственность современного человека не нуждается в улучшении и оспаривает правомочность вмешательства в естественный процесс. Другие ученые, в частности А. Нейфах, призывают различать невежественное вмешательство в наследственность человека и катастрофическое по своим последствиям невмешательство.

Возникает проблема, связанная и с тем, что генная терапия основана на введении в организм чужеродного генетического материала. А это означает непосредственное вмешательство в генотип человека. На данном основании некоторые авторы также выступают против генной инженерии.

Думается, что при существующем уровне развития генной инженерии большинство ученых не возьмут на себя смелость дать однозначный ответ на все возникающие вопросы. Но вместе с тем, по всей вероятности, возражение против генной инженерии на том основании, что в организм человека вводится чужеродный материал, явно устарело. Достаточно привести в пример факты, доказывающие, скольким людям помогли операции по трансплантации органов, спасшие им жизнь. Эти операции воспринимаются сегодня как нормальное явление и не вызывают каких-либо серьезных возражений этического плана. Кроме того, в случае введения в организм генетического материала вместо аналогичного, но не справляющегося со своими функциями, вообще не будет происходить изменение генома. И наконец, противникам генной инженерии следует иметь в виду, что любое лекарственное вещество, введенное в организм, является для него чужеродным телом и довольно часто сопровождается отрицательными последствиями.

Люди, связывающие исследования генома человека с покушением на свободное развитие личности и выступающие в связи с этим за их приостановление, вольно или невольно допускают возможность ограничения процесса познания вообще. Но этого, в принципе, сделать нельзя. Новые знания, получаемые человеком, - это естественный фактор его собственной эволюции. Само познание, научные исследования не несут в себе ни добра, ни зла. Главное, в чьих руках (или в каких головах) они находятся. Открытие атома автоматически не влечет за собой угрозу атомной войны или Чернобыль.

...