Процесс жизнедеятельности дубового шелкопряда

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

Введение

Глава 1. Обзор литературы

Глава 2. Материалы и методы исследования

Глава 3. Воздействие агониста экдистероида на процессы жизнедеятельности дубового шелкопряда

3.1 Скорость развития и жизнеспособность дубового шелкопряда при контактно-кишечном воздействии

3.2 Скорость развития и жизнеспособность дубового шелкопряда при экзогенном воздействии агониста экдистероида на яйца, гусениц, куколок и имаго

3.3 Биологическая продуктивность дубового шелкопряда при различных способах воздействия агониста экдистероида

Заключение

Список используемых источников

Введение

В настоящее время разрабатывается обширное научное направление по изучению действия регуляторов роста на различные стороны обмена веществ животных. Управление численностью насекомых-вредителей и повышение жизнеспособности и продуктивности полезных насекомых с помощью экологически безопасных химических соединений является одной из важнейших сторон данного научного направления. С открытием экдистероидов и их синтетических аналогов, получивших название регуляторов роста, изучением развития и размножения насекомых, расшифровкой их химической структуры и последующим синтезом препаратов, имитирующих гормональную активность этих соединений, появились перспективы использования биологически активных соединений в качестве альтернативы инсектицидам широкого спектра действия в интегрированных системах защиты сельскохозяйственных культур и ценных древесных пород от насекомых вредителей. (1) Особенно интенсивно стали проводится исследования по возможному использованию регуляторов роста, развитие и размножение насекомых в борьбе с насекомыми- вредителями после открытия соединений с гормональной активностью у растений.

На сегодняшний день основным требованием к средствам, применяемым в интегрированной борьбе с вредителями сельскохозяйственных культур и ценных древесных пород, является не максимальная эффективность воздействия на объекты, а максимальная вселективность действия, которая должна свести к минимуму нежелательные побочные эффекты в отношении нецелевых организмов. (2) Важной особенностью действия регуляторов роста и развития насекомых является их способность вызывать отсроченные эффекты, которые проявляются на более поздних стадиях развития после проведенной обработки. Агонисты экдистероидов, фитоэкдистероиды и минеральные комплексы относятся к таким биологически активным соединениям.

Несмотря на интенсивные работы по выяснению теоретических и практических вопросов применение биологически активных соединений в практике защиты растений от насекомых- вредителей, многие вопросы остаются неосвещенными, так как наблюдается многообразие ответных реакций насекомых на воздействие биологически активных веществ и изменчивость чувствительности насекомых к ним на разных стадиях развития. Поэтому изучение биологической активности препаратов на дубовом шелкопряде позволит пополнить знания по особенностям влияния этих соединений на насекомых с полным превращением.

Выбор данной культуры в качестве объекта настоящего исследования обусловлен тем, что, с одной стороны, китайский дубовый шелкопряд традиционно применяется в исследованиях по тестированию, с другой стороны - это вредитель(3). И конечно это очень ценный в практическом отношении вид, все стадии развития которого могут использоваться в качестве сырьевого материала в различных промышленных сферах.

Как показали работы Н.А. Тамариной (1990), А.З. Злотина (1977), Н.В. Бурова (1978), Е.Н. Поливановой (1991), Н.В. Ковганко (1990, 2004), Н.Н. Синицкого (1952), В.А. Радкевича (1980), Т.Б. Аретинской (2005, 2007, 2008 и др.) и С.И. Денисовой (2002, 2006, 2007, 2008), открытия биологически активных соединений и их синтетических аналогов позволило их использовать не только в качестве альтернативы инсектицидам широко спектра действия в интегрированных системах защиты сельскохозяйственных культур и ценных древесных пород от насекомых-вредителей, но в качестве биостимуляторов для поддержания зоокультур полезных насекомых в комплексе с другими мероприятиями, повышающими их жизнеспособность. Разведение китайского дубового шелкопряда на территории бывшего СССР началось ещё в 1942 году. Установлена возможность выращивания шелкопряда на таких нетрадиционных для него кормовых растениях, как береза бородавчатая, ива пепельная и ива корзиночная вместо дуба черешчатого(4). Необходимы дальнейшие исследования адаптации этого ценного вида к новым кормовым растениям. Применение биологически активных соединений облегчает и ускоряет процесс выявления закономерностей влияния химизма растений на возникновение трофо-физиологических адаптаций насекомых, так как практически все биологически активные вещества имеют растительное происхождение или являются синтетическими аналогами биологически активных веществ в растении.

В связи с вышеизложенным цель настоящей работы-определить степень влияния биологически активных веществ на рост, развития и питания дубового шелкопряда для разработки способов регуляции численности насекомых - вредителей и создания стабильных жизнеспособных зоокультур.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Выявить влияние агонистов экдистероидов из группы ацилгидразинов на развитие и продуктивность дубового шелкопряда на разных кормовых растениях в зависимости от вида соединения, его концентрации и способа воздействия.

2. Установить влияние агонистов экдистероидов на процессы потребления, утилизации и ассимиляции листа разных кормовых растений гусеницами дубового шелкопряда в зависимости от вида соединения, его концентрации и способа воздействия.

3. Выявить влияние агонистов экдистероидов на энергетику питания гусениц дубового шелкопряда на разных кормовых растениях.

4. Разработать способы повышения жизнеспособности гусениц дубового шелкопряда путём использования экстрактов растений и минеральных препаратов для стимулирования развития насекомого на нетрадиционном кормовом растении - берёзе бородавчатой.

Впервые в Республике Беларусь апробированы новые неисследованные биопрепараты синтетического (агонисты экдистероидов, минеральные препараты: сложный дигидрофосфат марганца, магния, меди и сложный дигидрофосфат магния, марганца, кобальта) и естественного происхождения ( экстрасты коры дуба, почек берёзы, левзеи сафлоровидной) в качестве регуляторов роста и развития чешуекрылых на примере китайского дубового шелкопряда. Впервые выявлены инсектицидные, антифидантные и биостимулирующие свойства этих биопрепаратов, что послужит теоретической основой для разработки способов регуляции численности насекомых. агонист экдистероид дубовый шелкопряд

Установлено токсическое действие агонистов экдистероидов в сублетальных концентрациях на дубового шелкопряда при контактно-кишечном воздействии на гусениц и экзогенном воздействии на все стадии развития данного вида насекомых. Выявлены препараты, которые обладают наибольшей инсектицидной активностью. В результате исследований получены новые данные о проявлении агонистами экдистероидов у китайского дубового шелкопряда трёх эффектов - токсического, гормонального и адаптогенного , влияния которых зависит от вида соединения, его концентрации, способа воздействия, вида кормового растения и стадии развития насекомого.

Впервые получены данные об антифидантном действии агонистов экдистероидов на гусениц дубового шелкопряда, а так же об изменениях их энергетических балансов. Установлено, что происходит перераспределение энергии в сторону уменьшения энергозатрат на прирост зоомассы и снижения биологической продуктивности насекомого данного вида.

Полученные результаты можно использовать для решения вопросов регуляции численности насекомых-вредителей, так как высокая биологическая активность исследованных агонистов экдистероидов позволит эффективно применять препараты в качестве инсектицидов нового поколения при воздействии на вредителей в установленные критические стадии развития.

Практическая значимость работы определяется тем, что впервые разработаны способы повышения жизнеспособности и продуктивности дубового шелкопряда при разведении в условиях северо-востока Беларуси на нетрадиционном кормовом растении - берёзе повислой путём использования биопрепаратов естественного ( экстракты коры дуба, почек берёзы, левзеи сафлоровидной) и синтетического происхождения ( сложного дигидрофосфата марганца, магния, меди и сложного дигидрофосфата магния, марганца и кобальта). Результаты проведённых исследований запатентованы: патент № 25134 «Спосiб обробки грени шовкопряда» , патент № 34395 « Спосiб вигодування дубового шовкопряда» , патент № 33812 « Спосiб вигодування дубового шовкопряда» , патент № 33813 « Спосiб вигодування дубового шовкопряда».

Глава 1. Обзор литературы

Экдистероиды составляют самое распространенное и многочисленное семейство стероидных соединение в биосфере; они участвуют в жизнедеятельности практически всех классов организмов, выполняя множественные функции. Присутствие экдистероидов характерно как для растительного, так и животного мира. Еще в первой половине 20 века было выяснено, что у насекомых процессы линьки и метаморфоза находятся под контролем особых химических веществ. Исследования по выделению этих гормональных факторов из куколок тутового шелкопряда Bombyx mori были начаты в Германии в 1942 г. и привели к выделению Бутенандтом и Карлсоном в 1954 г. кристаллического вещества, названного б-экдизоном. Несколько позже из Bombyx mori был выделен второй гормон линьки и метаморфоза - в-экдизон (в современной номенклатуре 20-гидроксиэкдизон). В результате интенсивных исследований из насекомых было выделено еще несколько экдистероидов, которые были объединены в группу зооэкдистероидов. Обнаружение гормонов линьки и метаморфоза насекомых в растениях было неожиданным и поставило сразу массу вопросов об их биологических функциях. Впервые они были обнаружены К. Наканиси с сотрудниками в 1966 г в листьях растения Podocarpus nakai, произрастающего на Тайване, и получили название понастеронов (понастерон А). Почти одновременно в австралийском виде Podocarpus elatus был обнаружен 20-гидроксиэкдизон.В корнях Achyranthes fauriei вскоре были обнаружены 20-гидроксиэкдизон и инокостерон , а в корневищах обычного папоротника Polipodium vulgare - 20-гидроксиэкдизон и полиподии. В отличие от зооэкдистероидов, известных как стероидные гормоны насекомых, им дали название фитоэкдистероидов .

Несмотря на значительные усилия по исследованию, множество открытых вопросов по зоо- и фитоэкдистероидам остаются - особенно относительно механизмов проявления биологической активности и их роли в природных взаимоотношениях между растениями и фитофагами. Доподлинно известно, что 20-гидроксиэкдизон и некоторые другие являются истинными гормонами линьки для насекомых и ракообразных в концентрациях 10-7М и инициируют превращение в эмбриогенезе, в ходе развития личинки и её превращение во взрослую особь. Периодические линьки вызваны пиками экдистероидов, синтезируемых в проторокальных железах под воздействием нейропептидов, вырабатываемых в мозге насекомых. Аналогичные физиологические действия экдистероидов предполагаются в отношении моллюсков, плоских, круглых и кольчатых червей.

В активации экдистероидов по всей вероятности важную роль играют комплексы экдистероидов с водорастворимыми белками, аминокислотами, каротиноидами, флавоноидами, ненасыщенными жирными кислотами, микроэлементами и другими физиологически активными веществами .

Линька и метаморфоз относятся к очень важным процессам жизнедеятельности насекомых, которые позволяют им нормально развиваться и адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Нарушения нормального течения линьки и метаморфоза под действием экзогенных экдистероидов либо соединений, имитирующих их биологическое действие, обычно приводит к гибели насекомых. Вещества, обладающие такой селективной активностью, привлекают к себе пристольное внимание в качестве потенциальных инсектицидов, которые по механизму действия относятся к регуляторам роста насекомых.

В конце 80-х годов прошлого столетия обнаружили, что гормональной активностью насекомых обладают вещества, не похожие на экдистероиды по строению и относящиеся к ацилпроизводным гидразина. Биологические испытания соединений данной группы стали проводиться сразу же после установления их гормональной активности.

Согласно данным, приведенным в обзоре Н.В. Ковганко и С.К Ананич установлена гормональная активность агонистов экдистероидов из группы 1,2- диацилгидразинов путем биотестов in vitro с использованием разнообразных линий клеток насекомых.

Инсектицидная активность диацилгидразинов является наиболее важной в практическом отношении и поэтому изучается в настоящее время весьма интенсивно. Синтезировано более 50-ти соединений, обладающих гормональной и инсектицидной активностью к большому числу насекомых-вредителей из разных отрядов. Так, агонист экдизона RH-5992 является новым нестероидным агонистом экдистероидов, обладающим высокой селективностью действия относительно чешуекрылых. Оценено его влияние на смертность, длительность личиночного развития, вес гусениц, вес шелкоотделительной железы Bombyx mori.

Установлена токсичность двух агонистов экдизона, галофенозида и метоксифенозида для жука Harmonia axyridis.К новым диацилгидразиновым инсектицидам относится и хромофенозид, который имитирует действие экдизона и обладает отличной эффективностью против гусениц, вредящих различным сельскохозяйственным культурам. В полевых опытах по борьбе с гусеницами Archips fuscocupreanus очень хорошие результаты дало опрыскивание листьев при концентрации действующего вещества 25-50 ppm.

Содержание RH-5849, тебуфенозида, галофенозида или метоксифенозида в диете гусениц последнего возраста вызвало преждевременную линьку, ведущую к гибели. Потоксичности эти соединения располагались в следующем порядке: метоксифенозид > тебуфенозид > галофенозид > RH-5849. Оценивали способность 4 агонистов экдизона индуцировать эвагинацию in vitro у имагинальных дисков, выделенных из гусениц последнего возраста, и сравнивали её с таковой естественного гормона линьки насекомых, 20-гидроксиэкдизона. Параллельно изучали конкуренцию за связывание с целыми имагинальными крыловыми дисками, культивируемыми в присутствии меченного іH-понастерона А и различных концентраций агонистов экдизона. Установлено, что 4 вещества вызывали эффект как агонисты экдизона in vitro. Порядок токсичности этих веществ соответствовал порядку индукции эвагинации и конкуренции при связывании с имагинальными дисками. Установлено отрицательное воздействие агониста тебуфенозида на активность клеток эпителия средней кишки листовертки Choristoneura fumiferana .

При добавлении в диету гусениц Plodia interpunctella последнего возраста тебуфенозида и метоксифенозида установлено, что эти препараты подавляют рост веса гусениц (увеличение веса за 2 дня в контроле - 40%, в опыте - 50%). Смертность гусениц в опыте доходила до 90-100%, в контроле - не больше 10%.При скармливании Chrysodeixis chalcites тебуфенозида с кормом наблюдались признаки преждевременной линьки: отслоение головной капсулы и прекращение питания. Обнаружено усиленное отложение новой эпикутикулы, но прокутикула откладывалась незначительно. Признаки дегенерации имели клетки проторокальных желез и переднекишечного эпителия .

После топикальной обработки гусениц Spodoptera maurita предпоследнего и последнего возрастов, а также молодых куколок разными дозами дифторбензурона ( от 0,5 до 40 мкг/особь) зарегестрировано проявляющиеся с разной интенсивностью нарушения линьки и формирование особей со смешанными признаками (личиночно-куколочные), дефектных куколок и имаго. Обработка гусениц последнего возраста мультирезистентной популяции Spodoptera litoralis четырьмя дибензоилгидразинами ( RH-2485, RH-5992, RH-0345, RH-5849) приводила к преждевременной линьке насекомых, которая вызывала их гибель. Наиболее токсичным был RH-2485. Высокие дозы и концентрации тебуфенозида (? 100 нг/гусеницу и ? 0,001%) при топикальной и пероральной обработке Dendrolimus pini были токсичны для гусениц и снижали интенсивность их питания.

При воздействии RH-5849 на куколок табачного бражника Manduca sexta наблюдалось мгновенное прекращение диапаузы, причем имагинальное развитие после этого шло нормально, и нормально выходили бабочки. Более высокие дозы (1-2 мкг/г веса) вызывали появление имаго с деформированными крыльями. При дозах более 2,5 мкг/г веса происходило ненормальное развитие, и имаго не могло выйти из куколочной шкурки. Инъекции тебуфенозида вызывали у нимф 2 возраста Blatta orientalis паралич и они погибали , а в отношении 24 - часовых куколок Hyposoter didymator препарат не оказывал влияния на вылупление имаго паразитоида. При топическом нанесении RH-0345 на свежеслинявших куколок Tenebrio molitor происходили изменения в покровах: аполизис куколочной кутикулы и нарастание нового кутикулярного слоя, возрастала толщина новой кутикулы. Новый нестероидный агонист № 200013 вызывает преждевременную линьку у гусениц Helicoverpa armigera.Агонисты экдизона, относящиеся к классу биацилгидрозинов являются новым поколением инсектицидных соединений, которые вызывают преждевременную летальную линьку у обработанных чувствительных насекомых, а RH-5849 токсичен для широкого круга насекомых.

Помимо общих токсических эффектов, экдистероиды и их аналоги оказались активными так же, как селективные ингибиторы развития полового аппарата насекомых. Эти соединения, таким образом, представляют собой новый класс хемостерилянтов насекомых. Так, производные андростана, прегнана и холестана в больших дозах ингибировали созревание яичников и откладку яиц у самок комнатной мухи Musca domestica. Агонист экдизона галофенозид действует на прилежащие тела и физиологию размножения термита Coptotermes formosanus. Топическое нанесение 5 мкг нестероидного агониста галофенозида на самок и самцов приводило к значительному снижению отложенных яиц.Ряд авторов (Sun, Song, Barrett, 2003; Charmillot, Gourmelon, Fabre, Pasquier, 2001) указывают на овоцидную и ларвицидную активность агонистов экдистероидов из ряда диацилгидразинов. Они сильно снижают плодовитость чешуекрылых и вызывают накопление вителлогенина в гемолимфе. Корреляцию токсичности четырёх дибензол гидразинов с индукцией эвагинации у Spodoptera littoralis изучали А. Гобби и соавторы. Установлено, что тебуфенозид и метоксифенозид значительно увеличивают уровень вителлогенина в гемолимфе имаго яблонной плодожорки Cydia pomonella, если бабочек приводили в контакт с поверхностями, обработанными агонистами .

Самцы Argyrotaenia velutinana и Choristoneura rosaceana после пребывания на поверхности, обработанной метоксифенозидом, не проявляли призывного поведения в присутствии самок. Самки этого вида после сходной экспозиции спаривались с необработанными самцами с той частотой, что и контрольные. Агонист экдизона, каким является метоксифенозид, отрицательно влиял на половое поведение самцов и в меньшей степени на поведение самок. При исследовании влияния метоксифенозида на Pieris brassicae установлено, что в полевых условиях инсектицид оказывает отрицательное действие на откладку яиц бабочкой и вызывает 100%-ную гибель гусениц 3-го возраста. Однако это соединение не вызывало антифидантного эффекта при опытах с гусеницами 4-го возраста. Метоксифенозид не оказывал губительного влияния на Apanteles glomeratus .

При действии различных повреждающих агентов на насекомых, таких, как Bombyx mori, Barathra brassica, Dendrolimus pini, были обнаружены типичные проявления адаптационного синдрома. Авторами установлено, что развитие адаптационного синдрома протекает в три стадии: реакция тревоги, стадия адаптации и стадия истощения. Для реакции тревоги характерны высокий уровень смертности, резкое усиление катаболических процессов, сопровождающихся значительной потерей веса ( до 20% в сутки), изменение функционального состояния клеток жирового тела, которое проявляется в появлении большого количества крупных суданофильных жировых вакуолей. Стадия адаптации характеризуется высоким уровнем резистентности к повреждению, что резко снижает уровень смертности, низким уровнем метаболизма, явлением неспецифической резистентности. Стадия истощения в основных чертах повторяет стадию тревоги и характеризуется повышением уровня смертности.

В условиях стресса, который вызван действием повреждающих агентов, насекомые часто могут оказываться как бы в состоянии «гипофункции» эндокринной системы, в некотором отношении аналогичной частичной гипофиз- и адреналэктомии у позвоночных. На этом фоне дотация экдистероидов из вне оказывает стимулирующее влияние на процесс адаптации.

В ряде работ ( Черныш и Лухтанов, 1981; Черныш и др., 1983, 1985) показано, что гусеницы тутового шелкопряда под влиянием введения адаптогенов способны повысить устойчивость к повреждению. Любое повреждающее действие может повысить неспецифическую устойчивость организма вызывая реакцию стресса. Повышение неспецифической устойчивости, обусловленное предварительным стрессорным воздействием, может происходить не только у позвоночных, но и у насекомых, как было показано в экспериментах на личинках синей мясной мухи. Авторы полагают, что адаптогены стимулируют устойчивость к повреждению у насекомых или позвоночных, оказывая на организм мягкое стрессорное воздействие, не сопровождающееся существенными токсическими эффектами. Адаптогены, которым можно отнести и экзогенные экдистероиды, являясь стимуляторами неспецифической резистентностью, задерживают процесс старения и увеличивают среднюю продолжительность жизни некоторых видов насекомых. Увеличение продолжительности жизни самок, в свою очередь, обеспечивает повышение плодовитости. Прямое влияние экдистероидов на процесс репродукции более существенно: оптимальные дозы гормона приводили к увеличению яйцепродукции Trichogramma embryophagum Hartig., однако при передозировки происходило значительное снижение плодовитости .

Умеренным токсическим действием недостаточным для практического применения обладают также близкие по структуре природным гормонам синтетические аналоги экдистероидов, разработке специальных методов получения которых посвящено большое число работ .

Таким образом, это новое поколение инсектицидов находит все большее применение, их производство экономически выгодно, они обладают селективностью действия и для проявления инсектицидного эффекта не требует больших доз, что делает агонисты экдистероидов из группы диацилгидразинов перспективными в борьбе с насекомыми - вредителями.

Глава 2. Материалы и методы исследований

Исследования проводили на базе биологического стационара «Щитовка» и в лабораториях биологического факультета УО «Витебский государственный университет им. П.М. Машерова». В качестве объекта исследований использовали китайского дубового шелкопряда (Antheraea pernyi G.-M.) (Attacidae), гусеницы которого, с одной стороны, являются вредителями , с другой -это очень ценный в практическом отношении вид, так как все стадии его развития могут использоваться в качестве сырьевого материала в различных промышленных сферах (5). Материалом для работы служила культура китайского дубового шелкопряда на разных стадиях онтогенеза. В качестве кормовых растений - дуб черешчатый (Quercus robur L.) как оптимальное кормовое растение и берёза бородавчатая (Betula pendula Roth.) как альтернативное кормовое растение.

В работе по изучению воздействия модельных ксенобиотиков на процессы жизнедеятельности дубового шелкопряда использовали:

1,2-бис-(2-метоксибензоил)-1-трет-бутилгидразин(R-211).

Этот препарат синтезирован в лаборатории экдистероидов института биоорганической химии НАН РБ под руководством д. х. н. Н.В. Ковганко. Для приготовления рабочих растворов навески 1мг (0.01%), 10 мг (0.1%) и 100 мг (1%) соединений помещали в мерную пробирку, добавляли 0.5 мл этанола, доводили общий объем до 10 мл дистиллированной водой, в которую предварительно добавляли ПАВ ОП-10 (1 капля на 1 л воды).

Для оценки влияния биологически активных веществ, поступающих в организм насекомого, на развитие и физиологические параметры использовались следующие тесты - метод скармливания, погружения и топического нанесения.

Метод скармливания: корм одинаковой массы для гусениц обрабатывали водным раствором R-211 1% концентрации объем 2 мл из расчета на 20 г кормового растения. Гусеницы в опыте питались обработанным кормом в течение 3 суток. Через 3 суток в опыте и в контроле обработанные листья березы регулярно, 1 раз в сутки на протяжении всего периода развития заменяли на свежие необработанные. Наблюдали за гусеницами в течение всего периода их развития. Обработку корма проводили методом опрыскивания листьев ручным пульверизатором.

Метод погружения: обработку грены (яиц) дубового шелкопряда на 9-й день развития производили путём погружения её в водные растворы соединений вышеуказанных концентраций объёмом 10 мл на 30 сек. Растворы готовили по вышеуказанной методике. Контроль - обработка грены дистиллированной водой с добавлением этанола (0,5мл/10мл воды) и ПАВ ОП-10 (1 капля/ 1л воды). После обработки опытную и контрольную грену помещали в бумажные пакеты. Жизнеспособность яиц определяли в каждом варианте. Проводили взвешивание гусениц с момента выхода из яиц. В качестве корма использовали берёзу бородавчатую. Наблюдали за гусеницами в течение всего периода. Изучение экзогенного воздействия агониста экдистероида на гусениц дубового шелкопряда проводили путём их окунания в водные растворы веществ вышеуказанных концентраций объёмом 10 мл на 30 сек. После обработки гусениц помещали на корм - берёзу бородавчатую и вели наблюдение за их поведением в течение всего периода их развития. В опытах и контроле корм для гусениц регулярно, 1 раз в сутки, на протяжении развития заменяли на свежий. Куколок погружали в водные растворы препарата объёмом 10 мл на 1 мин. Обработанных куколок помещали в ёмкости и наблюдали за их развитием. Контроль - обработка яиц, гусениц и куколок дистиллированной водой.

Метод топического нанесения: проводили нанесение водного раствора R-211 вышеуказанных концентраций объёмом 10 мкл на среднегрудь самцов и самок имаго в первый день развития. После распаривания бабочек самок помещали в бумажные пакеты для откладки яиц. На четвёртый день после распаривания отложенные яйца счищали со стенок пакетов, дезинфицировали и подсушивали. Затем проводили взвешивание яиц и гусениц после их выхода, оценивали жизнеспособность яиц.

Контроль - обработка тех же стадий развития и корма дистиллированной водой с добавлением этанола (0,5 мл/10мл воды) и ПАВ ОП-10 (1 капля/1л воды).

В процессе исследований во всех вариантах опытов учитывали смертность гусениц по возрастам, которую определяли путём подсчёта особей в начале и в конце возраста и выражали в процентах.

Продолжительность развития гусениц по возрастам определяли сроком от линьки до линьки. Первый день следующего возраста считали с того момента, когда перелиняло 70% гусениц (6). Отдельно учитывали время пред личиночного сна и продолжительность линьки. Период коконирования определялся с момента появления первых коконов до завивки коконов основной массой гусениц (7).

Взвешивание гусениц производили в каждом возрасте 2 раза: в начале и в конце. Гусениц младших возрастов взвешивали на торсионных весах по 5-10 особей одновременно, собирая и снимая их гусиным перышком для уменьшения травмирования. Гусениц старших возрастов взвешивали на электронных весах «Scouth Pro» 400 * 0,01g по 2-3 особи одновременно. Только полинявших белоголовых гусениц взвешивали в первые 2 часа после линьки, то есть до начала приёма пищи. Конец возраста определяли по уменьшению головной капсулы относительно тела гусениц и по резкому уменьшению количества экскрементов и скорости потребления пищи (8).

Массу коконов, куколок и шелковой оболочки определяли в момент впадания куколок в диапаузу, так как к этому времени масса коконов стабилизировалась. Шелконосность коконов выражали отношением массы оболочки к массе сырого кокона в процентах.

Глава 3. Воздействие агониста экдистероида на процессы жизнедеятельности дубового шелкопряда

3.1 Скорость развития и жизнеспособность дубового шелкопряда при контактно-кишечном воздействии агониста экдистероида

Одной из задач настоящей работы явилась оценка влияния агониста экдистероида на процессы роста и развития шелкопряда на разных стадиях онтогенеза для анализа степени прямого и отсроченного воздействия биологически активных веществ данной группы по отношению к насекомым.

Изучение процессов жизнедеятельности дубового шелкопряда после попадания в его организм агониста экдистероида R-211 разной концентрации вместе с кормом показало, что биологически активныое вещество оказало сильный токсический эффект на дубового шелкопряда. После потребления листа дуба, обработанного раствором R-211 0,1% концентрации, гусеницы начали гибнуть на 8-е сутки после контакта с биологически активным веществом и всего в течение 1-2 возрастов погибло 18% особей, что на 15% больше по сравнению с контролем. Под воздействием 1% раствора агониста в течение 1-3 возрастов погибло 35% подопытных гусениц, что на 31% больше, чем в контроле.

В опыте на берёзе после контакта с агонистом 0,1% концентрации гусеницы начали гибнуть на 6-е сутки, и в течение 1-2 возрастов всего погибло 34% особей - на 28% больше по сравнению с контролем. Раствор агониста в концентрации 1% вызвал гибель гусениц уже на 2-е сутки после контакта, и в течение 1-3 возрастов смертность особей составила 55%, что на 49% больше, чем в контроле.

Агонист экдистероидов R-211 в концентрации 1% оказал более сильный токсический эффект на дубового шелкопряда на двух кормовых растениях по сравнению с воздействием раствора 0,1% концентрации, что подтверждается увеличением смертности гусениц на дубе на 16%, на берёзе - на 21%. После потребления в пищу листа берёзы, обработанного R-211, под воздействием 0,1% раствора погибло гусениц на 16% больше, а под воздействием 1% раствора - на 20% по сравнению с гусеницами, питавшимися обработанным листом дуба. После трёхсуточного контакта с R-211 гусеницы шелкопряда на дубе и берёзе смогли адаптироваться к воздействию 0,1% раствора соединения к концу 2 возраста, а к воздействию 1% раствора - к концу 3 возраста, что подтверждается отсутствием смертности до конца развития.

Попадание в организм шелкопряда 0,01% раствора агониста на дубе и берёзе не вызвало снижения выживаемости насекомого по сравнению с контролем. Наряду с гибелью дубового шелкопряда воздействие агониста экдистероида R-211 вызвало задержку в развитии насекомого(9).Согласно данным таблицы 2.1, после потребления в пищу листа дуба, обработанного R-211 0,1% концентрации, гусеницы развивались на 9 суток дольше по сравнению с контролем за счет увеличения периода активного питания на 4 суток, периода сна - на 5 суток.

Таблица 2.1 - Влияние агониста экдистероида R-211 на продолжительность развития гусениц дубового шелкопряда

Продолжительность развития дубового шелкопряда под воздействием агониста экдистероидов R-211 в концентрации 0,1% в опыте на дубе увеличилась на 8 суток по сравнению с контролем за счет увеличения периода активного питания на 2 суток, период сна - на 3 суток и линьки - на 3 суток. После контакта с раствором соединения в концентрации 1% гусеницы развивались на 9 суток дольше, чем в контроле, что вызвано увеличением периода активного питания на 6 суток, периода сна - на 2 суток и линьки на 1 сутки. В опыте на березе продолжительность развития гусениц под воздействием 0,1% и 1% растворов R-211 составила 68 суток, что на 5 суток больше, чем в контроле. И в первом, и во втором случаях это произошло за счет увеличения периода активного питания на 5 суток, что и отражают наши данные.

Во всех вариантах опыта кормовое растение оказывает коррелирующее влияние на продолжительность развития гусениц дубового шелкопряда при воздействии агониста - питание листом дуба ослабляет отрицательное воздействие соединений, питание листом березы его несколько усиливает.

Попадание в организм гусениц агониста R-211 вместе с кормом привело к снижению скорости весового роста и снижению зоомассы гусениц(10), кроме растворов соединений концентрации 0,01%, которые не оказали отрицательного влияния на ход накопления массы шелкопрядом. После контакта любого шелкопряда с R-211 0,1% и 1% концентраций в начале развития масса гусениц снижалась в течение развития и перед окукливанием в опыте на дубе она была меньше соответственно на 12% и 16%, чем в контроле, в опыте на березе - на 25 и 30% по сравнению с контролем. Воздействие R-211 в концентрации 1% вызвало снижение массы гусениц к концу развития в опыте на дубе на 8%, в опыте на березе - на 5% по сравнению с 0,1% раствором. После потребления листа березы, обработанного 0,1% и 1% растворами агониста гусеницы к концу развития имели массу соответственно на 3% и 2% меньше, чем при питании листом дуба.

Таблица 2.2 - Динамика массы гусениц дубового шелкопряда после контактно - кишечного воздействия агониста экдистероида R-211

После контакта дубового шелкопряда с R-211 0,1% и 1% концентраций в начале развития масса гусениц снижалась в течение развития и перед окукливанием в опыте на дубе она была меньше соответственно на 12% и 16%, чем в контроле, а опыте на березе - на 25% и 30% по сравнению с контролем. Воздействие R-211 в концентрации 1% вызвало снижение массы гусениц к концу развития в опыте дубе на 8%, в опыте на березе - на 5% по сравнению с 0,1% раствором. После потребления листа березы, обработанного 0,1% и 1% растворами агониста гусеницы к концу развития имели массу соответственно на 3% 2% меньше, чем при питании листом дуба.

3.2 Скорость развития и жизнеспособность дубового шелкопряда при экзогенном воздействии агонистов экдистероидов на яйца, гусениц, куколок и имаго

Сведения об экзогенном воздействии гормоноподобных веществ на стадию яйца насекомых в доступной нам литературе отсутствуют. Поэтому выявление степени влияния новейших агонистов экдистероидов, синтезированных в лаборатории экдистероидов института биоорганической химии НАН РБ под руководством д.х.н. Н.В. Ковганко, на процессы развития гусениц, полученных из обработанных биологически активными веществами данной группы, представляет научный и практический интерес. После проведения исследований по изучению контактно - кишечного способа воздействия агонистов экдистероидов на рост и развитие гусениц дубового шелкопряда, мы провели серию опытов по экзогенному влиянию биологически активных веществ данной группы на поведение и развитие насекомого на всех стадиях развития( яйцо, гусеница, куколка, имаго ).

При изучении физиологической активности органических соединений первостепенное значение имеет разработка соответствующих стандартных тестов характеризующихся быстротой, надежностью и простотой исполнения. Действие экдистероидов как гормонов линьки и метаморфоза насекомых оцениваются в настоящее время по нескольким тестам. Наиболее простым в исполнении является метод окунания, при котором личинки рисовой огневки Chilo suppressalis на 5 сек погружаются метанольный раствор испытуемых соединений. Последствия погружения личинок насекомых в растворы экдистероидов зависят от вида насекомого, его возраста, структуры и концентрации экдистероидов. Так при погружении личинок колораского жука Leptinotarsa decemlineata в 4% расвор 20Е отмечена гибель 64% животных, а при скармливании или инъекции - 30 - 40%.Для личинок 3 возраста Chilo suppressalis летальным является погружение в 0,001% водный раствор понастерона А и 0,005% водный раствор 20Е, а для личинок последнего возраста достаточно 0,003% понастерона А. Погружение гусениц Ephestia kuhniella последнего возраста в растворы экдистероидов разной концентрации, выделенных из надземной части Serratula coronata L., приводило к многообразию эффектов, зависящих как от природы экдистероида и его концентрации, так и от природы растворителя. В результате погружения экдистероиды проявляли три конкурирующих эффекта - токсический, адаптогенный и гормональный. Высокий процент гибели гусениц свидетельствует о слабом адаптогенном явлении этих экдистероидов (11).

Полученные нами данные подтверждают вышеуказанные проявления физиологической активности агонистов экдистероидов у гусениц дубового шелкопряда после экзогенного действия на них.

Воздействие растворов R-211 разной концентрации на гусениц китайского дубового шелкопряда оказалось тоже достаточно сильным. Так после погружения гусениц в 0,1% раствор агониста в первые сутки опыта погибло на 40% особей больше, чем в контроле, на 6-е сутки отмечена гибель 87%, а на 12-е сутки с начала эксперимента погибло 100% гусениц. В варианте с 1% раствором R-211 в первые сутки после закладки опыта погибло 68% гусениц - на 55% больше, чем в контроле, а на 6-е сутки отмечена гибель 100% особей. Из полученных данных видно, что влияние 1% раствора R-211 на организм гусениц оказалось значительно сильнее, так как все гусеницы погибли в 2 раза быстрее по сравнению с 0, 1% раствором.

При экзогенном воздействии агониста эктистероида R-211 в концентрациях 0,1% и 1% на куколок отмечалась гибель 70% и 95%. Такая реакция, вероятно, вызвана изменением функциональной активности нейроэндокринной системы при избыточном поступлении в тело агонистов экдистероида R-211 и введением насекомого в цикл метаморфоза, к которому оно физиологически не готово.

Минимальное инсектицидное действие агониста экдистероида по отношению к дубовому шелкопряду проявилось при экзогенном воздействии на грену. После обработки грены 0,1% и 1% растворами R-211 смертельность гусениц составила 13% и 20%, что на 10% и 17% больше, чем в контроле.

Следует отметить, что после экзогенного воздействия агониста экдистероида R-211 на имаго дубового шелкопряда их гибель не наблюдалась.

Наряду с гибелью вышедших из обработанной грены гусениц и обработанных гусениц наблюдалась и увеличение продолжительности их развития (12). Согласно данным таблицы 2.4 под воздействием R-211 0,1% и 1% концентраций на грену шелкопряда привело к замедлению развития гусениц на 2 и 3 суток по сравнению с контролем за счет увеличения периода активного питания.

Таблица 2.3 - Влияние агониста экдистероида R-211 на продолжительность развития гусениц дубового шелкопряда при экзогенном воздействии на яйца и гусениц по возрастам, сут.

После погружения гусениц в 0,1% раствор R-211 их продолжительность развития составила лишь 11 сут. По сравнению с контролем (64 сут). При этом период активного питания в 1 возрасте длился на 2 сут. дольше, чем в контроле, а во время периода сна все гусеницы погибли. В опыте с 1% раствором R-211 гусеницы развивались всего 3 сут., после чего все погибли. Таким образом, экзогенное воздействие раствора R-211 в концентрациях 0,1% и 1% на гусениц привело к отклонениям в их развитии - процесс линьки у гусениц резко нарушился и сопровождался массовой гибелью.

После обработки грены 0,1% и 1% растворами R-211 интенсивность роста гусениц за весь период развития ниже контроля в среднем на 17% и 35%.Интенсивность роста шелкопряда после воздействия на грену R-211 в концентрации 1% ниже у гусениц за весь период развития в среднем на 17% по сравнению с воздействием 0,1% раствора агониста.

3.3 Биологическая продуктивность дубового шелкопряда при различных способах воздействия агониста экдистероида R-211

Установлено, что помимо общих токсических эффектов, экдистероиды и их аналоги активны так же, как селективные ингибиторы развития полового аппарата насекомых. Ряд авторов ( Сharmillot et al, 2001; Sun, Song, Barrett, 2003) указывают на овоцидную и ларвицидную активность агонистов экдистероидов из ряда диацилгидрозинов. Они сильно снижают половую активность и плодовитость чешуекрылых и вызывают накопление вителлогенина в гемолимфе. Так, например, самцы Argurotaenia velutinana и Choristoneura rosaceana после пребывания на поверхности, обработанной метоксифенозидом, не проявляли призывного поведения в присутствии самок производные андростана, прегнана и холестана в больших дозах ингибировали созревание яичников и откладку яиц у самок комнатной мухи Musca domestica. Агонист экдизона галофенозид действует на прилежащие тела и физиологию размножения термита Coptotermes formosanus. Топическое нанесение 5 мкг нестероидного агониста галофенозида на самок и самцов приводило к значительному снижению отложенных яиц. При исследовании влияния метоксифенозида на Pieris brassicae установленноб что в полевых условиях инсектицид оказывает отрицательное воздействие на откладку яиц бабочкой и вызывает 100% - ную гибель гусениц 3-го возраста (13). По данным Ю. Д. Холодовой экдистерон в концентрациях 0,002 - 0,02 и 0,07- 0,1% (объём 10 мкл) при локальном нанесении на среднегрудь имаго свекловичного долгоносика вызывал торможение яйцекладки и снижение численности потомства до 21 - 24,5 и 63,6 - 74,9% соответственно. На метаморфоз лугового мотылька экдистерон в концентрыции 0.02% не влиял, тем не менее отродившееся бабочки не откладывали яиц. Гормоноподобные соединения, таким образом, представляют собой новый класс хемостерилянтов насекомых (14).

Полученные данные отражают ранее приведенные проявления физиологической активности агониста экдистероида из группы ацилгидрозинов R-211 0,1% и 1% концинтраций, которые заключаюцца в отсроченном действии биологически активных веществ данной группы на более поздних стадиях развития дубового шелкопряда после обработки, что подтверждается показателями биологической продуктивности насекомого.

Попадание в организм гусениц вместе с листом дуба R-211 0,1% и 1% концентраций вызвало снижение массы коконов на 11% и 14% по сравнению с контролем, массы шелковой оболочки - на 18% и 30%, шелконосности - на 0,71% и 1,23% соответственно. При питании обработанным агонистом 0,1% и 1% концентраций листом берёзы масса коконов снизилась на 36% и 44% по сравнению с контролем, масса шелковой оболочки - на 50% и 58%, шелконосность - на 2,19% и 2,69% соответственно. В опыте на берёзе под воздействием препарата в концентрациях 0,1% и 1% масса коконов на 19% и 10% ниже чем на дубе, масса шелковой оболочки - на 14% и 15%, шелконосность меньше на 0,46% и 0,45% соответственно. R-211 в концентрации 1% вызвал снижение массы коконов и шелковой оболочки на дубе на 11% и 16%, на берёзе - на 12% и 17% по сравнению с 0,1% раствором.

Во всех вариантах опыта наблюдается ухудшение показателей качества коконов после контактно-кишечного воздействия биологически активных соединений на гусениц при увеличении концентрации растворов с 0,1% до 1%. Кормовое растение оказывает коррелирующее влияние на массу коконов, массу шелковой оболочки и шелконосности насекомого. Питание листом дуба ослабляет отрицательное воздействие агониста на качество кокона, питание листом берёзы его усиливает, что, возможно, достигается в результате большей питательной ценности листа дуба по сравнению с листом берёзы, так как лист дуба обладает более оптимальным соотношением белковых и углеводных соединений.

После экзогенного воздействия агониста экдистероида на яйца дубового шелкопряда так же произошло снижение биологической продуктивности насекомого.

После обработки яиц R-211 0,1% и 1% концентраций наблюдалось снижение массы коконов на 20% и 32%, массы шелковой оболочки - на 22% и 38%, шелконосности - на 0,38% и 0,92% соответственно по сравнению с контролем. Воздействие 1% раствора агониста привело к снижению массы коконов на 16%, массы шелковой оболочки - на 20%, шелконосности - на 0,54% по сравнению с воздействием 0,1% раствора. Анализ полученных данных показывает, что агонист экдистероид R-211 сильнее проявляет отсроченное действие на более поздних стадиях развития о чем свидетельствует ухудшение показателей качество коконов шелкопряда, которые снижаются при увеличении концентрации препаратов с 0,1% до 1%.

Таким образом, ухудшение качества коконов шелкопряда (уменьшение массы коконов, шелковой оболочки, шелконосности) при различных способах воздействия агониста экдистероида, вероятно, можно рассматривать как адаптивнуюю реакцию организма на негативное воздействие биологически активных веществ данной группы, в результате которого белки гемолимфы шелкопряда использовались гусеницами не на формирование шелка в шелкоотделительной железе, а на усиленный энергетический обмен, направленный на детоксикацию повреждающих агентов. Наибольшая чувствительность шелкопряда к агонисту экдистероиду проявилась при экзогенном воздействии соединений на гусениц, минимальное - при экзогенном воздействии на яйца, а промежуточное положение по чувствительности к биологически активным веществам занимает контактно-кишечный способ воздействия на гусениц.

Согласно данным таблицы 2.3, разные способы воздействия агониста экдистероида на дубового шелкопряда приводят к снижению плодовитости насекомого. Установлено, что после воздействия 1% раствора R-211 на гусениц, выхода имаго не наблюдалось вследствие гибели куколок, как на дубе, так и на березе.

При контактно-кишечном воздействии R-211 0,1% и 1% на гусениц шелкопряда наблюдалось уменьшение массы куколок по сравнению с контролем на дубе на 10% и 20%, на березе - на 35% и 42% соответственно. Плодовитость бабочек и выживаемость грены после воздействия 0,1% раствора снизилась на дубе на 51% и 67%, на березе - на 63% и 75% соответственно по сравнению с контролем.

Таблица 2.4 - Плодовитость бабочек дубового шелкопряда после обработки куколок и имаго агонистом экдистероидом

Обработка яиц R-211 0,1% и 1% концентраций привела к уменьшению массы куколок на 18% и 30% по сравнению с контролем, и снижению плодовитости бабочек на 11% и 21% соответственно. Соединение в концентрации 1% вызвало уменьшение массы куколок на 15% и плодовитости бабочек - на 11% по сравнению с 0,1% раствором.

Суммируя полученные данные по биологической продуктивности дубового шелкопряда после контактно - кишечного воздействия на гусениц и экзогенного воздействия на яйца, гусениц, куколок и имаго агониста экдистероида R-211 можно сказать, что раствор соединения в концентрации 0,01% при разных способах обработки не вызвал снижения качества коконов и плодовитости насекомого. При воздействии агониста экдистероида сублетальной концентрации у дубового шелкопряда наблюдается снижение массы коконов, куколок, шелковой оболочки, уменьшение шелконосности по сравнению с контрольными показателями, а также снижение плодовитости имаго независимо от способа обработки. Растворы препаратов в концентрациях 0,1% и 1% вызвали стерилизующий эффект у дубового шелкопряда, проявляющийся в торможении яйцекладки и снижении выживаемости потомства, которые усиливались при 10-кратном увеличении концентраций препаратов с 0,1% до 1%.

Заключение

Установлено, что агонист экдистероид R-211 оказал достаточно сильный токсический эффект на разных стадиях онтогенеза дубового шелкопряда. Наиболее чувствительными к действию соединения были гусеницы и куколки. При их погружении в раствор препарата отмечена 100%-ная смертность. Наименьшая инсектицидная активность препарата наблюдалась при обработке имаго и яиц насекомого. После локального нанесения раствора агониста экдистероида на среднегрудь бабочек, их гибели не наблюдалось. Погружение яиц в раствор соединения привело к гибели только 25% яиц относительно контроля. Промежуточное положение по чувствительности к агонисту экдистероиду занимают гусеницы в организм которых препарат поступал вместе с кормом. Следует отметить, что активность агониста экдистероида была более заметна при питании гусениц листом березы, чем дуба.

Следовательно, степень активности агониста экдистероида по отношению к дубовому шелкопряду зависит от его концентрации, способа обработки, стадии развития и кормового растения.

Установлено, что агонист экдистероид при разных способах воздействия вызывает отсроченный эффект у китайского дубового шелкопряда, который проявляется в замедлении развития гусеничной фазы, уменьшении массы гусениц, коконов и куколок, снижении плодовитости бабочек.

Полученные нами данные о процессах жизнедеятельности дубового шелкопряда после воздействия агониста R-211 в концентрациях 0,1% и 1% иллюстрируют проявление адаптогенного эффекта, который протекает в три стадии- реакция тревоги, стадия адаптации и стадия истощения. Реакция тревоги характеризуется высоким уровнем смертности, который вызван стрессорным воздействием агониста сублетальных концентраций. В нашем случае реакция тревоги проявлялась в младших возрастах гусениц. Следующая за ней стадия характеризуется высоким уровнем резистентности к повреждениям, низким уровнем смертности или её отсутствием. В старших возрастах гибели гусениц не наблюдалось. Гусеницы были жизнеспособны, вили коконы, окукливались. Третья стадия - стадия истощения, которая проявляется в гибели на стадии куколок.