Метод імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний аграрний університет

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата ветеринарних наук

Спеціальність 16.00.03-Ветеринарна мікробіологія і вірусологія

Метод імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу

Нтахоншикіра Шарль

Київ 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті ветеринарної медицини Української академії аграрних наук.

Науковий керівник: кандидат ветеринарних наук, Кучерявенко Олександр Олександрович, заступник Голови Державного Департаменту ветеринарної медицини Міністерства АП України

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук Риженко Василь Петрович, завідувач лабораторією анаеробних інфекцій Інституту ветеринарної медицини УААН

кандидат ветеринарних наук, Павленко Микола Степанович, директор Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини Міністерства АП України

Провідна організація: Білоцерківський державний аграрний університет, м. Біла Церква, кафедра епізоотології, Міністерства АП України.

Захист дисертації відбудеться “ 30 “ червня 2000 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 в Національному аграрному університеті за адресою: 03041, Київ - 41, вул. Героїв оборони, 15, навчальний корпус 3, ауд. 65.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ - 41, вул. Героїв оборони, 11, навчальний корпус 10.

Автореферат розісланий “ “ 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, професор Бортнічук В.А.

1. Загальна характеристика роботи

лептоспіроз інфекція імуноферментний антиген

Актуальність теми.

Здійснення систематичного моніторингу, розробка і удосконалення системи епізоотологічного нагляду та діагностики із застосуванням сучасних приладів та методів досліджень для забеспечення надійної профілактики зооантропозоонозних хвороб, до яких відноситься лептоспіроз, є надзвичайно актуальним питанням для науки и має важливе соціальне і економічне значення. (Воліна Е.Г., Субхаш Дас Чандра, Кіктенко В.С. та інш., 1994; Шубалова Е.П., Антонова Т.В., Алексеева Е.А., 1996; Пустовар А.Я., Кліменко С.В., Тертишник А.В., 1998).

За даними МЕБ, 2000 і об'ємною науковою інформацією, проблемі вивчення лептоспірозу приділяється значна увага у світі. Проте, лептоспіроз на сьогодні лишається розповсюдженою хворобою, як в багатьох країнах світу, так і в Україні (Баришев П.М., 1981; Деревяченко В.П. та ін., 1988; Моісєєва А.В., Шабловська Є.А., 1988; Мельницька Е.П., 1995, Бернасовська Є.П., 1996).

Для мобілізації зусиль по вивченню особливостей цієї хвороби, останнім часом створено 10 міжнародних та регіональних референтних центрів з лептоспірозу, збільшилась кількість міжнародних конференцій і семінарів, присвячених проблемі лептоспірозу.

За даними Всесвітної організації охорони здоров'я, лептоспіроз віднесено до п'яти хвороб, які спричиняють найбільшу небезпеку людству. Останнім часом погіршився епізоотичний стан по лептоспірозу в Україні, реєструються випадки захворювання тварин лептоспірозом, викликаним патогенними штамами лептоспір, які раніше в країні не виявлялись. Трапляються випадки, коли ензоотичні спалахи лептоспірозу набувають форми епізоотій.

Тому для своєчасної і надійної діагностики лептоспірозної інфекції в Україні виникла необхідність забезпечити діагностичні лабораторії ветеринарної медицини більш чутливими засобами і обладнанням для здійснення діагностичних досліджень на сучасному рівні.

Загальноприйнятою серологічною реакцією для діагностики лептоспірозу є реакція мікроаглютинації (РМА). Але вона має ряд суттєвих недоліків (трудомісткість, ризик зараження при роботі з живою культурою лептоспір, постійна необхідність культивування лептоспір), тому виникає необхідність пошуку більш перспективних методів діагностики лептоспірозу. Альтернативним методом діагностики лептоспірозу може виступати, на наш погляд, метод імуноферментного аналізу (ІФА). В Україні цей метод діагностики лептоспірозу не розроблено, що і зумовило вибір теми наших досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконувалась згідно державного плану науково-дослідних робіт Інституту ветеринарної медицини УААН (номер державної реєстрації КН № 0197 і 12755 інв. № 02.02) “Вивчити епізоотологію лептоспірозу, розробити моно- та полівалентні вакцини і методи діагностики” та плану “Основні заходи оздоровлення тварин від лептоспірозу в Україні на 1999-2000роки”, який затверджено Головним Державним інспектором ветеринарної медицини і Головою Державного Департаменту ветеринарної медицини Міністерства агропромислового комплексу України наказом №2 від 18 січня 1999 року.

Мета і завдання досліджень. Мета досліджень - розробити метод імуноферментного аналізу при лептоспірозі. Завдання досліджень передбачають:

виявити штами лептоспір, що найбільш часто реєструються серед сільськогосподарських тварин в Україні;

сконструювати, на підставі таких штамів, комплексний антигенний препарат, або визначити штам лептоспір, який виступає як спільний групоспецифічний антиген, та використати його при розробці ІФА для діагностики лептоспірозу;

розробити імуноферментний метод для виявлення протилептоспірозних антитіл до основних штамів лептоспір, провести його діагностичну оцінку в експериментальних та практичних умовах.

Наукова новизна одержаних результатів.

вперше в Україні методом РМА і ІФА встановлена циркуляція екзотичного штаму лептоспір L.bratislava (серогрупа Australis) серед свиней та коней;

вперше в Україні розроблено метод імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу на базі широкореактивного штаму Wijnberg (серогрупа Icterohaemorrhagiae). Метод відрізняється високою активністю, специфічністю, що дозволяє виявляти захворювання в більш ранні строки, а також проводити масові скринінгові дослідження.

Практичне значення одержаних результатів. Виходячи із результатів проведених нами досліджень, вважаємо за доцільне внести L.bratislava в діагностичний набір штамів лептоспір, які використовуються обласними, районними та міськими державними лабораторіями ветеринарної медицини, в науково-дослідних центрах при дослідженнях на лептоспіроз. Розроблений імуноферментний метод дозволяє в більш ранні терміни визначати протилептоспірозні антитіла проти групи штамів, що значно скорочує витрати часу на проведення досліджень.

Конкретний особистий внесок дисертанта. Експериментальні дослідження, аналіз одержаних даних та їх узагальнення виконані дисертантом особисто.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідались і були схвалені:

на семінарі завідувачів відділами обласних і Центральної державної лабораторій ветеринарної медицини на базі лабораторії лептоспірозу Інституту ветеринарної медицини УААН, м. Київ, 1998р.;

на VI Міжнародній науково-практичній конференції “Проблеми ветеринарного обслуговування дрібних домашніх тварин”, м. Київ, 1999р.

Реалізація результатів досліджень. Проведена перевірка наборів діагностикумів для імуноферментного аналізу при лептоспірозі на базі Центральної державної лабораторії ветеринарної медицини.

Публікації. По темі дисертації опубліковано 4 роботи, з них 3 в фахових виданнях.

Структура дисертації. Загальний обсяг роботи 134 сторінки. Дисертація складається з вступу, п'яти розділів, висновків і пропозицій виробництву, додатків. Робота ілюстрована 3 малюнками, містить 21 таблицю і 3 схеми. Бібліографія -251 найменування, із них 144 іноземних.

Основна частина

Матеріали та методи. В роботі були використані до 20 серологічних варіантів лептоспір. Еталонні штами зберігаються в лабораторії лептоспірозу з музеєм штамів мікроорганізмів Інституту ветеринарної медицини. Штами були отримані із Всесоюзного науково-контрольного інституту ветеринарних препаратів (ВДНКІ) м. Москва,1991). Культивування лептоспір здійснювали на середовищі Кортгофа з додаванням 5-10% інактивованої (560С, 60хв) кролячої або овечої сироватки крові.

Антигени, що використовувались в ІФА, готували із штаму Wijnberg (серогрупа Icterohaemorrhagiae), який надійшов із референтного лептоспірозного центру (Амстердам, Голандія); із штаму Jeћ Bratislava, який отримано із Берлінського Інституту захисту прав споживачів та ветеринарної медицини; із непатогенного штаму PatocI - ВДНКІ; а також із 8 сероварів лептоспір, що найчастіше реєструються в Україні, а саме: L.polonica, L.kabura, L.pomona, L.tarassovi, L.grippotyphosa, L.canicola, L.copenhageni, L.bratislava.

Для виготовлення антигенів були випробувані декілька методик. За основу був прийнятий метод отримання полісахаридів, що виступають в якості антигену, за методом водно-формалінової екстракції по W.J. Terpstra з співавт. (1980). Імунні сироватки отримали 5 разовим введенням кролям лептоспірозних антигенів внутрівенно за методом, запропонованим S. Faine (ВООЗ, 1982). Середні титри таких імунних сироваток складали в РМА 1:102400.

Такий метод імунізації використовували і для отримання антисироваток до імуноглобулінів класу G великої рогатої худоби (ВРХ) та свиней, з метою подальшого приготування імунопероксидазних кон'югатів. Для імунізації використовували готові препарати IgG великої рогатої худоби та свиней з концентрацією 1-3 мг/ см3 білку на 1 кг живої ваги кролів. Кількість білків визначали за методом Бредфорда і Лоурі.

Імунопероксидазні кон'югати отримували шляхом мітки ферментом пероксидаза хрону (RZ - 3,0) антиімуноглобулінів класу G ВРХ і свиней із сироватки крові кролів за допомогою методу перйодатного окислення по P.Nakane і A. Kawaoi (1974).

Активність і специфічність анти-IgG і кон'югатів визначали за методом Оухтерлоні і ІФА.

Для виявлення протилептоспірозних антитіл методом ІФА у собак, коней, кролів використували кон'югати з білком А фірми “Sanofi” і компанії АТЗТ “Діапроф Мед”.

Відпрацювання імуноферментного методу діагностикти лептоспірозу проводили на 96 лункових полістиролових мікропланшетах провідних виробників в цій галузі: “Nunc” (Данія), “Dynatech” (Швейцарія), “Linbro” (США), “Corning Costar”. Облік ферментативної реакції проводили за допомогою автоматичного спектрофотометру фірми “Sanofi” і фірми “Labsystems “ при довжині хвилі 492нм.

При статистичній обробці результатів досліджень використовували загальноприйняті методи (Мітропольский А.К., 1957; Ашмарін І.П., Вороб'ев А.А, 1962; Стрелков Р.Б., 1999): визначення середньої арифметичної, середнього квадратичного відхилення, середньої квадратичної похибки результатів). Визначення кореляції вирішувалось по ППП “АРМ-Статистика” на ПК PC/АТ в Національному аграрному університеті.

Результати досліджень та їх обговорення

Вибір методу отримання моно- і полівалентних лептоспірозних антигенів для ІФА.

Матеріалом для приготування лептоспірозного антигену використовували такі штами лептоспір (табл.1).

Таблиця 1 Матеріал для приготування лептоспірозного антигену

Вид антигену	Серогрупа	Серовар	Штам	Джерело референт них штамів
Груповий	Sejroe	polonica	493 Poland	Всесоюзний науково-контрольний інститут ветеринарних препаратів (ВДНКІ), м. Москва
	Hebdomadis	kabura	Kabura
	Tarassovi	tarassovi	Periperitsin
	Pomona	pomona	Pomona
	Grippotyphosa	grippotyphosa	Moskva V
	Canicola	canicola	Hond Utrecht IV
	Icterohaemorrha giae	copenhageni	M 20
	Australis	bratislava	Yez Bratislava	Берлін, Німечина
Видовий	Semaranga	patoc	Patoc I	ВДНКІ
	Icterohaemorrha giae	сopenhageni	Wijnberg	Амстердам, Голандія

Специфічні і концентровані лептоспірозні антигени для ІФА отримували, використовуючи декілька ефективних методик (табл.2)

Контроль якості антигенів, що отримували при застосуванні таких методик, визначали в ІФА по вищих показниках позитивних контролів і при найнижчих показниках негативних контролів. В якості контролів використовували позитивні і негативні сироватки крові до лептоспірозу.

Кращі результати були отримані при використанні методу водно-формалінової теплової обробки по W.J. Terpstra. При цьому культуру лептоспір, що вирощувалась на середовищі Кортгофа або на безсироваточному твін-альбуміновому середовищі (EMJH) на протязі 10-12 діб, при 280С і з концентрацією 1х108 - 1х109 кл/см3, знешкоджували 0, 5 % розчином формаліну і піддавали термообробці при 1000С) на протязі 30 хв. Після охолодження матеріал центрифугували 30 хв при 10 тис об/хв.

В подальшій роботі використовували полісахаридну фракцію, що знаходиться в надосаді і після проведення діалізу проти 0,2М карбонатно-бікарбонатного буферу з pH 9,6 отримували антигенний препарат. Метод доволі простий та ефективний і задовольняє вимогам по якості до антигенів для ІФА.

Таблиця 2 Вибір оптимального методу отримання лептоспірозних антигенів для ІФА. (r =0,92; n=5)

№	Методи	Основні етапи	Результати контролю методом ІФА
			З позитивною сироваткою	З негативною сироваткою
1	Ультразвукова обробка	10разово по 1 хв при 22 Кгц	1,2050,045	0,4200,021
2	Экстракція детергентами	Термообробка;тритон Х 100, діаліз; центифугування, інкубація 370С	0,5540,029	0,3550,022
3	Формамідна екстракція по Фуллеру	Прогрівання з формамідом, обробка спиртом, центрифугування	2,1050,093	0,6500,031
4	Водно-формалінова экстракція	Внесення формаліну, термообробка 1000С 1год, центрифугування	1,8100,060	0,0800,006

Вибір групоспецифічного лептоспірозного антигену для ІФА здійснювали за трьома напрямками:

використовували непатогенний штам Patoc I;

проводили змішування антигенних препаратів із лептоспір, які частіше реєструюся в лабораторній практиці;

використовували штам Wijnberg (серогрупа Icterohaemorrhagiae), який за літературними даними володіє спільновидовим антигеном.

В перехресних реакціях основних лептоспірозних антигенів (табл. 3) встановлено, що саме штам Wijnberg має максимальну антигенну спорідненість з основними аглютинуючими сироватками до серотипів, що частіше за інших реєструються в Україні.

В подальшій роботі визначали ступінь антигенної спорідненості штаму Wijnberg по сироватках основних діагностичних штамів (табл.4).

Наведені дані свідчать, що вибір штаму Wijnberg в якості групоспецифічного антигену для ІФА виправданий тому, що з усіма досліджуваними сироватками нами отримано позитивні результати.

Таблиця 3 Вибір групоспецифічного лептоспірозного антигену для ІФА n=3

Антигени, серовар (серогрупа, штам)

Аглютинуючі сироватки до серогруп

Javanica

Bata viae

Mini

Sejroe

Hebdo madis

Taras sovi

Pomo na

Grippotypho sa

Canicola

Ictero haemorragiae

Australis

Autumnalis

Cynopteri

Pyroge nes

Bal lum

javanica

+

+

+

Djati

+

+

Szwajizak

+

+

+

Polonica

+

+

+

Kabura

+

+

+

Tarassovi

+

Pomona

+

+

Grippotyphosa

+

Canicola

+

+

Copenhageni

+

+

+

Erinacei-europ.

+

Autumnalis

+

+

Cynopteri

+

+

Pyrogenes

+

+

+

Ballum

+

+

+

+

+

ПолиАГ

±

±

+

+

+

Wijnberg

+

+

+

+

+

±

+

+

+

+

+

+

+

+

+

Patoc

±

±

±

±

±

±

±

±

±

±

±

±

±

Таблиця 4 Визначення антигенної спорідненості штаму Wijnberg по сироватках до основних діагностичних штамів. n=3

	Сироватки до штамів
	Розведення сироваток	Polonica	Kabura	Tarasso vi	Pomona	Grippoty phosa	Canicola	Ictero haemo rrhagiae	Bratisla va	Wijnberg
Wijnberg доза- 0,1см3 (1-2х108 клітин/см3)	1:50	++	++	++	++	++	+++	++++	++++	++++
	1:100	++	++	++	++	++	+++	++++	+++	++++
	1:200	+	-	-	+	+	++	+++	++	++++
	1:400	-	-	-	-	-	+	+++	+	++++
	1:800	-	-	-	-	-	-	+++	-	++++
	> 1:800	-	-	-	-	-	-		-

Специфічність лептоспірозного антигену із штаму Wijnberg визначали при дослідженнях різних сироваток методами РМА і ІФА.

Результати таких досліджень наведені у табл.5, де показано, що з явно позитивними щодо лептоспірозу сироватками результати позитивні, а з сироватками до інших інфекційних захворювань - негативні.

2. Розробка методу імуноферментного аналізу для виявлення протилептоспірозних антитіл

Для отримання видових кон'югатів необхідно мати антиімуноглобуліни класу G. Активну імунізацію тварин-донорів проводили імуноглобулінами класу G із сироваток крові великої рогатої худоби та свиней (див. розділ “Матеріали і методи”). В роботі були використані очищені препарати фірми ”Sigma”. Концентрація препарату склала 1-3 мг/см3 на кілограм живої маси тварин.

Виділення імуноглобулінів здійснювали за допомогою методу осадження поліетиленгліколем м.6000 з послідуючою гель-хроматографією на “Сефадексі G 200”. Контроль активності визначали по Оухтерлоні і ІФА. Контроль імунологічної чистоти препаратів здійснювали електрофоретично у поліакріламідному гелі (ПААГ). Із отриманих препаратів IgG готували кон'югати за методом перйодатного окислення (див. розділ “Матеріали і методи”). Всі отримані препарати мали високу активність і специфічність.

Нами були підібрані оптимальні параметри сенсибілізуючої дози антигену на планшети (1:100), сорбційного буферного розчину (0,2М карбонатно-бікарбонатний буферний розчин, рН 9,6), час і температура імобілізації розчину антигену на планшетах (18 год 40С, або 2 год 370С), розведення сироваток, що підлягають дослідженню (1:10). Для розведення сироваток використовували буферний розчин з 0,5%-ним вмістом БСА і 0,05% детергенту “Тритон Х 100”

Таблиця 5 Визначення специфічності і активності лептоспірозного антигену із штаму Wijnberg n=3

Досліджувані сироватки	Вихідні результати	Нормовані дані
	Титри в РМА	ОЩ в ІФА	РМА	ІФА
Кролячі сироватки до лептоспір:	1:800	0,886	0,3920,018	1,6570,046
1. Icterohaemorrhagiae
2. canicola	1:400	0,600	0,1960,010	1,1280,044
3. Bratislava	1:800	0,710	0,3920,018	1,3350,045
4. Wijnberg	1:64000	> 2,0	3,13650,09	3,7610,132
5. Polonica	1:200	0,410	0,0980,003	0,7700,023
6. Kabura	1:100	0,350	0,0490,001	0,6580,022
7. Tarassovi	1:100	0,325	0,0490,001	0,6110,021
8. Grippotyphosa	1:100	0,380	0,0490,001	0,7140,022
9. Pomona	1:200	0,410	0,0980,003	0,7700,023
Імунні кролячі сироватки до КЧС	0	0,090	00	0,10390,001
Позитивні сироватки крові свиней до КЧС	0	0,074	00	0,0850,001
Сироватки крові ВРХ, позитивні до грипу	0	0,085	00	0,0980,001
Сироватки крові, позитивні до ІНАН від коней	0	0,100	00	0,1150,001
Сироватки крові, позитивні доTreponema pallidum	-	0,320	-	0,36940,03
M L	0,4950,019	0,9800,024

r=0,97

Із таблиці видно, що антиген із штаму Wijnberg реагує з усіма завідомо позитивними протилептоспірозними сироватками і не реагує з сироватками до других інфекційних захворювань, при цьому, виходячи з результатів аналізу за нормованими даними, ІФА в 2 рази перебільшує РМА по чутливості.

Концентровані препарати кон'югату зберігаються в насиченому розчині сульфату амонію, або 50%-му розчині гліцерину і робоче розведення їх складає 1:4000. Інкубація кон'югатів відбувається на протязі 40хв. Після внесення в лунки планшетів субстратної суміші (ортофенілендіаміну у цитратному буфері, рН 5,2) проводили облік результатів за допомогою автоматичного спектрофотометра.

Облік результатів вважаємо коректним, якщо позитивний контроль має значення ?0,6 оптичних одиниць при довжині хвилі 492 нм, негативний контроль не вище за 0,10 оптичних одиниць. Позитивними результатами дослідження сироваток, що підлягають тестуванню, вважаємо ті, що в два і більше разів перевищують значення оптичної щільності негативного контролю.

Таблиця 6 Схема імунізації тварин-продуцентів по S. Faine (ВООЗ, 1982) n=4

№ п/п	Послідовність етапів імунізації	Інтервали між введенням, дні
	Концентрація препарату IgG 1-3 мг/см3 на кг ваги продуцентів	0	7	14	21	28	48
1	I введення: Доза - 1 см3 внутрівенно	---
2	II введення: Доза - 2 см3 внутрівенно		---
3	III введення: Доза - 4 см3 внутрівенно			---
4	IV введення: Доза - 6 см3 внутрівенно				---
5	V введення: Доза - 6 см3 внутрівенно					---
6	Забір крові						---

Методом ІФА досліджували сироватки крові різних видів тварин, як із неблагополучних по лептоспірозу господарств, так і домашніх, екзотичних і лабораторних тварин. В таблиці 7 показано порівняння результатів досліджень сироваток крові методами ІФА і РМА.

Із таблиці видно, що результати досліджень сироваток крові в ІФА і РМА співпадають. Слід відмітити, що ІФА більш чутливий метод, тому позитивних сироваток виявлено більше методом ІФА, ніж в РМА.

На основі проведених розрахунків складені регресивні порівняння зв'язку титрів в ІФА і РМА. Середня аглютинуюча активність досліджуваних сироваток в РМА складає 1:800, середній титр цих сироваток, визначеий методом ІФА, складає 1:2540. Встановлено, що чутливість ІФА по виявленню антитіл на 12% вища ніж чутливість РМА. Коефіцієнт кореляції r дорівнює 0,956.

При проведенні масових досліджень на лептоспіроз, вперше в Україні, нами були виявлені антитіла проти екзотичного для країни штаму L.bratislava в сироватках крові свиней та коней.

Із 195 сироваток від свиней і 111 сироваток від коней антитіла проти даного штаму були визначені в 79 і 43 пробах, що складае 40,5% і 38,7% відповідно. Ні одна сироватка крові ВРХ, ДРХ, собак не була позитивною до даного штамму, що підтверджується літературними данними.

Таблиця 7 Порівняльна таблиця досліджень сироваток крові методом ІФА і РМА n=3

№ з/п	Досліджувані сироватки	Кіл-ть проб	РМА	ІФА
			позитивні	% позитивних	позитивні	% позитивних
1	Кролячі аглютинуючі сироватки	20	20	100	20	100
2	Сироватки від ВРХ	525	98	18,7	155	29,5
3	Сироватки від свиней	195	111	56,9	136	69,7
4	Сироватки від коней	111	57	51,4	71	63,9
5	Сироватки від собак	45	14	31,1	21	46,7
6	Сироватки від дельфінів	20	5	25	8	40
7	Кролячі імунні сироватки	24	24	100	24	100
	Всього	940	329	35	435	46,3

L.bratislava є головною причиною масових абортів лептоспірозної етіології у свиней і коней. Є дані про випадки захворювання у людей лептоспірозом, викликаним цим штамом.

На наш погляд актуальним є те, щоб штам Вratislava ввести до складу діагностичних штамів для практичних лабораторій ветеринарної медицини, а також при необхідності вводити такий штам в склад протилептоспірозної вакцини в тих господарствах де він реєструється і викликає захворювання на лептоспіроз.

Висновки

Визначені штами лептоспір, які найчастіше зустрічаються серед тварин на території України, а саме: L. icterohaemorrhagiae L. canicola, L. bratislava, L pomona, L. grippothyphosa.

Вперше в Україні встановлена циркуляція екзотичного штаму bratislava, який є основною причиною масових абортів у свиней і коней лептоспірозної етіології.

Розроблена методика приготування лептоспірозного антигену для ІФА на базі широко реактивного групоспеціфічного антигену із штаму Wijnberg (серогрупа Icterohaemorrhagiae).

Отримано високоактивні і специфічні антиімуноглобуліни класу G із імунних сироваток крові тварин-продуцентів і на базі таких імуноглобулінів одержано якісні препарати антивидових імунопероксидазних кон'югатів для ІФА.

Визначені основні вимоги для постановки методу ІФА при лептоспірозі, а саме: сенсибілізуюча доза антигену - 1:100; сорбційній буфер - 0,2М карбонатно-бікарбонатний буфер, рН 9,6; температура та час імобілізації антигену на планшеті- 40С, 18 год, або 370С, 2 год; розведення досліджуваних сироваток - 1:10, активність конь'югату -1:4000. Проведення обліку результатів за допомогою автоматичного спектрофотометру вважаємо коректними, якщо значення позитивного контролю не менше 0,6 о.о., а негативного не більше - 0,1 о.о. Позитивними вважаються досліджувані сироватки, значення оптичної щільності при 492 нм яких в 2 і більше разів перебільшують значення негативного контролю.

Метод ІФА при лептоспірозі з позитивними результатами випробувано в експериментальних і виробничих умовах. Встановлено високу чутливість і специфічність методу. Чутливість методу ІФА в 2 рази перевищує чутливість методу РМА (див.Табл. № 5). При дослідженні біля 940 проб сироваток крові від тварин результати в ІФА (46,3 % позитивних) в основному співпадають з результатами досліджень цих сироваток крові в РМА (35% позитивних). Виявлення протилептоспірозних антитіл методом ІФА на 12% перебільщує виявлення в РМА. Метод ІФА більш чутливий, тому позитивних сироваток виявлено більше, ніж в РМА.

Розроблено і запропоновано для впровадження у ветеринарну практику метод імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу, який заснований на визначенні специфічних до лептоспірозу антитіл в сироватках крові тварин.

Практичні пропозиції:

запровадити метод ІФА при лептоспірозі для масових скринінгових досліджень в лабораторіях ветеринарної медицини;

налагодити виготовлення діагностичних імуноферментних тест-систем (ІФА-лептоспіроз) в Інституті ветеринарної медицини УААН;

внести L.bratislava в діагностичний набір штамів лептоспір.

Перелік робіт, які були опубліковані за темою дисертації

Нтахоншикира Шарль, Рудь О.И., Марунчин Ф.Ф. Результаты исследований сывороток крови вакцинированных собак, собак питомника “Общество защиты животных” и черепах Киевского зоопарка на лептоспироз. // Cборник материалов IV Международной научно-практической Конференции. - Киев, 1998.-С.67-70.

Шарль Нтахоншикіра. Діагностика лептоспірозу методом імуноферментного аналізу // Ветеринарна медицина України.-1999. -№ 5. -С.33-34.

Нтахоншикіра Шарль. Методи очистки лептоспірозних культур // Вісник аграрної науки. -1999. -№ 8.-С. 83-84.

Шарль Нтахоншикіра. Виявлення антитіл проти L. bratislava у сироватці крові свиней в Україні. // Вісник Білоцерківського Державного університету. -1999. -№ 8.-С.177-181.

Аннотація

Нтахоншикира Шарль. Метод імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальностю 16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2000.

Вирішення наукових та практичних завдань у ветеринарній практиці вимагає постійного пошуку нових, більш чутливих, специфічних і ефективних методів діагностики, терапії і профілактики захворювань різної етіології.

Дисертаційна робота присвячена розробці та застосуванню чутливого методу імуноферментного аналізу для діагностики лептоспірозу - однієї з актуальних антропозоонозних інфекцій, що наносить значну економічну шкоду сільському господарству та є дуже небезпечною для здоров'я людей.

В роботі викладені одержані в ході проведених досліджень результати. Описані методи виділення лептоспірозного антигена і визначені оптимальні умови постановки ІФА при лептоспірозі.

Встановлено, що групоспецифічний антиген дозволяє виявляти антитіла до тих серогруп, які входять до його складу, а видовий антиген із штаму Wijnberg - антитіла до різних сегрогруп, що має велике практичне значення.

При проведенні ІФА були використані антивидові імунопероксидазні кон'югати і пероксидазні кон'югати з білком А, в якості ферментних субстратів застосувались ортофенілендиамін (ОФД) та 5-аміносаліцилова кислота (5-АС).

Встановлена кореляція між результатами ІФА і РМА, в той час як за чутливістю перший метод перевищив другий на 12%. Метод виявився зручним і практичним методом для масових скринінгових досліджень {3-4 планшети (228-304 зразки) проти 10-20 в РМА/людина-день/ }.

Ключові слова: лептоспіроз, антиген, антитіла, діагностика, реакція мікроаглютинації (РМА), імуноферментний аналіз (ІФА).

Аннотация

Нтахоншикира Шарль. Диагностика лептоспироза методом иммуноферментного анализа. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03 - ветеринарная микробиология и вирусология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2000.

Решение научных и практических задач в ветеринарной практике требует постоянного поиска новых, более чувствительных, специфичных и эффективных методов диагностики, терапии и профилактики заболеваний различной этиологии.

Диссертационная работа посвящена разработке и применению чувствительного метода иммуноферментного анализа для диагностики лептоспироза - одной из актуальных антропозоонозных инфекций, причиняющей огромный экономический ущерб сельскому хозяйству и представляющей большую угрозу для здоровья людей.

В работе изложены результаты собственных исследований. Описаны методы выделения лептоспирозного антигена и определены оптимальные условия постановки ИФА при лептспирозе.

Установлено, что приготовленный комплексный групповой антиген позволяет выявлять антитела к тем серогруппам, которые входят в его состав, а видовой антиген Wijnberg - антитела к разным серогруппам, что имеет большое практическое значение.

При проведении ИФА были использованы антивидовые иммунопероксидазные конъюгаты и пероксидазные конъюгаты с белком А, а в качестве ферментных субстратов применялись ортофенилендиамин (ОФД) и 5-аминосалициловая кислота (5-АС).

Установлена корреляция между результатами ИФА и РМА, в то время как по чувствительности первый метод превысил второй на 12%. ИФА оказался удобным практическим методом для массовых скрининговых исследований.

Ключевые слова: лептоспироз, антиген, антитела, диагностика, реакция микроагглютинации (РМА), иммунофементный анализ (ИФА).

Summary

Ntahonshikira Charles. The enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of leptospirosis. - Manuscript.

The thesis manuscript is submitted for the degree of Doctor of philosophy in the speciality 16.00.03 - veterinary microbiology and virology - National Agriculture University, Kyiv, 2000.

Leptospirosis is an infectious disease of man and animals caused by one or several pathogenic spirochaetae Leptospira interrogans. The health hazard and the economic losses of the disease make it a potential problem worldwide. Moreover, the eradication of the infection is hampered by a certain number of constraints: the big amount of strains (more than 200 known serovars and 23 serogroups!), the prevalence of common for most infectious diseases and hence the lack of pathognomic symptoms, the presence of different strains in different regions, the lack of sensitive diagnostic methods for early recognition of the disease.

The aim of the present work was to improve the diagnostic techniques for leptospirosis by performing a well-adapted to the country ELISA technique using locally ciculating strains (L. polonica, L. kabura, L. pomona, L. tarassovi,

L. grippotyphosa, L. canicola, L. copenhageni, L. bratislava, as well as the genus specific antigens from the strain Wijnberg of the copenhageni serovar (Icterohaemorrhagiae serogroup) and from the saprophytic strain PatocI of the Semaranga serogroup.

In our work formalin-water extracted antigens (method by W.J. Terpstra et al., 1980, 1985), detergent extracts (R. Sting and U. Dura, 1994), formamide extracts (Fuller, 1938), whole cell sonicated extracts (Adler et al., 1980) were used as antigens.

The protein concentration in the antigenic preparations was determined using the Lowry method. Only a pure, young 7-14 days old culture without self-agglutinated leptospires with abundant growth (1 - 2 x 108 leptospires/ml) could be used as the source of antigens.

The reactivity spectrum of the antigenic preparations was determined by detecting antibodies in field and immune sera (195 swine sera, 525 bovine sera, 111 equine sera, 45 canine sera and 44 immune rabbit sera with known MAT titers and serovars). The antigen adsorption onto the polystirol surface of the plates was carried out at room temperature till full evaporation of the liquid (method by WJ Terpstra et al., 1980,1985), by overnight incubation of the sensitised plates at 40C, or by a two-hour incubation at 370C.

For antibody detection in bovine and swine sera immunoperoxidase conjugates were used, whereas for canine and rabbit sera ProteinA-peroxidase conjugates were used. OPD was used as a peroxidase substrate for automated reading and 5-amino-2-salicylic acid for eye reading of the results.

The ELISA diagnostic kits were tested in the field and experimental conditions. The results were compared to those of the MAT and correlation was observed. However, the ELISA was found to be more sensitive than the MAT (41,4 against 35,4% positive). Thus, the enzyme-linked immunosorbent assay turned to be a reliable tool for the early diagnosis of leptospirosis and a good epidemiological screening test, when a big number of samples had to be examined.

Key words: leptospirosis, antigen, antibodies, diagnosis, the microagglutination test (MAT), the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).

Размещено на Allbest.ru

...