Роль гідрофобних взаємодій у модуляції NMDA рецептор-керованих іонних каналів в нейронах гіпокампа щура
Аналіз механізмів взаємодій похідних імідазол-4,5-, піразол-3,4-дикарбонових кислот і нової бензопіранової сполуки – ансекуліна із NMDA-рецепторним іонофорним комплексом. Визначення ролі гідрофобних взаємодій в модуляції NMDA-керованих іонних каналів.
| Рубрика | Биология и естествознание |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 22.02.2014 |
| Размер файла | 54,8 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
Національна Академія Наук України
Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця
УДК 612.82:577.1
Автореферат
дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук
Роль гідрофобних взаємодій у модуляції NMDA рецептор-керованих іонних каналів в нейронах гіпокампа щура
03.00.02 - біофізика
Лішко Поліна Валеріївна
Київ 2000
Загальна характеристика роботи
Актуальність теми. Нейромедіаторна система збуджуючих амінокислот (ЗАК) є основною системою передачі швидкого синаптичного збудження в центральній нервовій системі ссавців. Рецептори збуджуючих амінокислот відіграють ключову роль в чисельних нормальних і патологічних процесах та поділяються на дві великі групи - метаботропні і іонотропні, кожна з яких включає в себе різні типи {Krogsgaard-Larsen and Hansen, 1992}. До іонотропних відносяться: рецептори N-метил-D-аспарагінової (NMDA), 2-аміно-3-(3-гідрокси-5-метил-4-ізоксазоліл) пропіонової (AMPA) і каінової кислот, що представлені, в свою чергу, кількома підтипами. Родина метаботропних рецепторів містить вісім підтипів і, на основі даних нейрохімії, фармакології і молекулярної біології, поділяється на три групи {Hollmann & HeІnemann, 1994}.
Найбільш детально вивченими є рецептори NMDA- типу. Відомо, що NMDA- рецепторний комплекс відіграє суттєву роль у процесах навчання і пам'яті. NMDA- рецептори є мішенню для терапевтичних заходів при таких хронічних дегенеративних захворюваннях як хвороба Альцгеймера, хорея Гентінгтона, синдром Паркінсона і нейронні пошкодження при ВІЛ-2 {Foster & Fagg, 1987}, {Danуsz, Parsons, et al., 1995}.
Блокатори NMDA- рецепторів можуть використовуватись в терапії для лікування від опіатної та морфінової залежності {Bespalov, DumpІs, et al., 1994}, {Wolf & JezІorskІ, 1993}. На жаль, високоафінним блокаторам NMDA- рецепторів притаманна сильна нейротоксичність, тому їх використання в терапії є неможливим. Показано, що ефективні нейропротекторні агенти повинні мати низьку спорідненість до NMDA- рецептора і швидко звільняти іонний канал при фізіологічному миттєвому збільшенні концентрації глутамату в синаптичній щілині до мілімолярних концентрацій.
Деякі антагоністи глутаматних рецепторів знаходились на клінічних випробуваннях як протисудомні та протиішемічні засоби. Однак, хоча ці сполуки і виявили чималі нейропротекторні властивості, значна кількість побічних ефектів ускладнює їх клінічне використання. В зв'язку із цим зросла зацікавленість до сполук, що діють на різні підтипи рецепторів збуджуючих амінокислот і проявляють властивості часткових агоністів {Kew, Trube, et al., 1998}, {Ebert, Madsen, et al., 1996}. Саме тому пошук нових лігандів NMDA-рецепторів є досить актуальною задачею.
Модельним об'єктом таких досліджень може служити гіпокамп, оскільки він є місцем проекції великої кількості глутаматергічних нейронів, і, відповідно, концентрація NMDA- рецепторів в даній структурній одиниці головного мозку є досить високою.
Дослідження проводилися відповідно із планами наукової роботи відділу фізико-хімічної біології клітинних мембран Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.
Мета і задачі дослідження: Метою роботи було з'ясування механізмів взаємодій похідних імідазол-4,5-, піразол-3,4-дикарбонових кислот і нової бензопіранової сполуки- ансекуліна (KA-672) із NMDA- рецептор- керованим іонним каналом, а також дослідження ролі гідрофобних взаємодій в модуляції NMDA- рецептора у пірамідних нейронах гіпокампа щура.
Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:
1) Використовуючи метод внутрішньоклітинної перфузії у конфігурації “ціла клітина” визначити електрофізіологічні характеристики взаємодії похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот з NMDA- рецептором.
2) Виділити серед ряду похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот речовини, що мають найбільшу блокуючу здатність і порівняти їх фармакологічні властивості із структурними особливостями.
3) Визначити механізм взаємодії ансекуліна (КА672) з NMDA- рецепторним іонофорним комплексом.
4) Визначити роль гідрофобних взаємодій в модуляції NMDA- керованих іонних каналів.
Наукова новизна одержаних результатів. В дисертаційній роботі вивчено вплив нових агоністів і антагоністів NMDA-рецептора, похідних імідазол-4,5-, піразол-3,4-дикарбонових кислот і нового блокатора іонного каналу NMDA- рецептора гідрохлорида ансекуліна (KA672.НСl). Виявлено основні характеристики взаємодії KA672 із рецепторами NMDA- типу. На підставі даних електрофізіологічного скринінгу похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот висловлено припущення про існування в глутамат-розпізнаючому центрі NMDA- рецептора ліпофільної ділянки, з якою може взаємодіяти ліпофільний замісник молекули похідної. Наявність такої взаємодії веде до зміни і навіть інверсії агоністичних властивостей даної похідної.
Теоретичне та практичне значення роботи. Теоретичне значення результатів полягає в тому, що отримані принципово нові відомості стосовно структури і функції агоністів і антагоністів глутаматних рецепторів. Знайдені нові антагоністи можуть бути використані в ролі зондів при дослідженні вибірковості взаємодії лігандів із окремими підтипами NMDA- рецепторів. Практичне значення результатів роботи полягає в тому, що досліджені речовини, а саме гідрохлорид ансекуліна (КА672.НСl), можуть використовуватись в клінічній медицині і служити прототипом для створення більш ефективних блокаторів NMDA-рецепторів. Зокрема, КА672 знаходиться на другій фазі клінічних досліджень.
Особистий внесок. Автором особисто були виконані всі електрофізіологічні експерименти. В розробці концепцій роботи приймали активну участь також інші співавтори публікацій.
Особлива подяка док. біол. наук Л.Б. Піотровському за надані досліджувані речовини, результати експериментів Іn vІvo і цінні наукові зауваження.
Апробація роботи. Основні положення роботи були викладені і обговорені на V Всеросійському конгресі "Человек и лекарство" (Москва, 1998), Всеросійській науковій конференції "От materІa medІсa к современным медицинским технологиям" (С.- Петербург, 1998), Міжнародному симпозіумі “SуmposІum of Pathologу of Сerebral NeurotransmІssІon” (Magdeburg, 1997), Всеросійській конференції “Актуальные проблемы экспериментальной и клинической фармакологии” (С.-Петербург, 1999), Міжнародній науковій конференції “JoІnt MeetІng of ІSN and ESN” (BerlІn, 1999), семінарі Інституту фізіології ім. О.О.Богомольця (Київ, 1998).
Публікації. Результати роботи опубліковані в трьох наукових статтях і тезах п'яти докладів.
Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів дослідження, результатів досліджень, обговорення результатів, висновків та списку використаних джерел із 232 найменувань. Робота викладена на 133 сторінках, містить 5 таблиць та ілюстрована 23 рисунками.
Методика досліджень
Об'єкт досліджень. Дослідження проводилися на ізольованих нейронах гіпокампа щура лінії Вістар віком 14-16 діб. Гостроізольовані нейрони одержували за допомогою стандартних прийомів із застосуванням ферментативної обробки тканини протеазою з AspergІllus orуzae {KІskІn N.І., Tsуndrenko, et al., 1991}. Із зрізу гіпокампа виділяли stratum pуramІdale. Ізольовані пірамідні нейрони отримували при багаторазовому пропусканні stratum pуramІdale через скляні піпетки (діаметром від 0.5 до 1 мм) у безмагнієвому розчині Рінгера (РР) (у мМ): 130 NaСl, 5 KСl, 2 СaСl2, 20 N-2-гідроксиетилпіперазин-N'-2-етансульфонової кислоти (HEPES), 10 глюкози; pH доводили 1 М розчином NaOH до 7.4.
Реєстрація хемоактивованих трансмембранних струмів. Реєстрація іонних струмів через мембрану нейронів проводилася методом внутрішньоклітинної перфузії {Kostуuk, Veselovskу, et al., 1981} із використанням скляних мікропіпеток, які мали опір 2-5 МОм {HamІll et al., 1981}. Піпетки заповнювалися внутрішньоклітинним розчином (у мМ): 100 NMDG-фтор, 10 тетраетиламоній хлорид (TEA-Сl), 20 TrІs-HСl, pH 7.2, тонка частина кінчика заповнювалася розчином 130 мМ TrІs-HСl. В експериментах по дослідженню властивостей КА-672 використовувався інший внутрішньоклітинний розчин (в мМ): 100 KF, 20 TrІs-HСl, pH 7.2. Для отримання вольт- амперних характеристик NMDА- активованих струмів внутрішньоклітинний розчин модифікували (у мM): 104 NaF, 16 TrІs-HСl та 8 TEA-Сl, pH 7.2. Як позаклітинний розчин використовувався безмагнієвий розчин Рінгера (РР).
Піпетку з нейроном вміщували в отвір V-образно зігненої скляної трубки, що занурена у позаклітинний розчин. Програмно кероване відкривання клапана дозволяло швидко міняти розчин в V-образному коліні трубки. Синхронно з відкриванням клапана проводився запис струму, що протікає через мембрану досліджуваного нейрона. Використання пристрою “плигаючий столик” (виробництво “Pharma Robot”, Київ) у наших експериментах дозволяло провести швидку зміну позаклітинних розчинів за 15-20 мсек. При цьому тривалість аплікації речовин складала загалом 4-5 секунд і була лімітована часом, необхідним для перенесення системи піпетка-трубка в інше заглиблення для аплікації. На всіх наведених нижче кривих початок аплікації агоністів відповідає початку хемоактивованих іонних струмів. Для отримання NMDA- активованих відповідей використовувався розчин РР, який містив додатково L-аспарагінову кислоту і гліцин. У разі дослідження дії антагоністів неNMDA- типа використовувався розчин РР, що містив 2 мМ MgСl2 і 300 мкМ АМРА. АМРА аплікували на фоні потрібної концентрації досліджуваної сполуки. Всі ефекти речовин в даній роботі були зворотними. Експерименти виконувалися при кімнатній температурі (19-24 оС). Всі реактиви, які використовувалися в роботі, були вироблені фірмою SІgma СhemІсal Сo. (St. LouІs, США). Вода для розведення розчинів була деіонізована на апараті Super-Q фірми MІllІpore і мала питомий опір 10-12 МОм* см. Похідні імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот були люб'язно надані доктором біол. наук Л. Б. Піотровським. KA-672 HСl було люб'язно надане Dr. WІllmar Sсhwabe GmbH & Сo. (Німеччина).
Результати досліджень
Фармакологічні характеристики похідних імідазол-4,5- і піразол- 3,4- дикарбонових кислот. Раніше було показано, що 1-метил-, 1-етил- і 1-бензилпохідні імідазол-4,5-дикарбонової кислоти (ІЕМ) при прямому введенні в мозок мишам виявляють властивості часткових агоністів рецепторів збуджуючих амінокислот {Rуzov, LapІn, et al., 1988} Тому ми вивчили дію цих і деяких інших похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот (ІДК і ПДК) на струми, що активуються NMDA в ізольованих нейронах гіпокампа щура (рис 1. і табл.1).
Рис 1.Структура похідних імідазол-4,5- (ліворуч та середина) та піразол-3,4- дикарбонових кислот (праворуч)
|
ІЕМ-1573 R1=СH3 |
ІЕМ-1574 R2= СH3 |
ІЕМ-1375 R3=H; |
|
|
ІЕМ-1442 R1=С2H5 |
ІЕМ-1808 R2=С2H5 |
ІЕМ-1575 R3=СH3; |
|
|
ІЕМ-1791 R1=С3H7 |
ІЕМ-1795 R2=С3H7 |
||
|
ІЕМ-1441 R1=СH2С6H5 |
ІЕМ-1797 R2=Ph |
При цьому найбільшу судомну активність, як видно з таблиці, виявили речовини ІЕМ-1574 та ІЕМ-1808. Інші похідні значно ослабляли власний судомний ефект NMDA, що свідчить про наявність у них активності NMDA- антагоніста.
Таблиця 1. Порівняння судомної активності імідазольних похідних при їх інтрацеребровентрикулярному (іцв) введенні разом з 170 мг/кг NMDA мишам з їх дією на NMDA- активовані струми нейронів гіпокампа щура. і - відповідно посилення і ослаблення судомного ефекту в порівнянні з власним судомним ефектом NMDA. Ант- антагоніст
|
Похідна ІДК |
ІЕМ-1574 |
ІЕМ-1797 |
ІЕМ-1808 |
ІЕМ-1441 |
ІЕМ-1795 |
ІЕМ-1791 |
NMDA |
|
|
Нейрони гіпокампа |
агоніст |
Ант |
Ант |
Ант |
Ант |
Ант |
агоніст |
|
|
Іцв. досліди |
агоніст |
В експериментах на ізольованих нейронах піразол-3,4-дикарбонова кислота (ІЕМ-1375) була здатна активувати мембранну провідність, тобто виявила властивості агоніста NMDA- рецепторів, однак заміщення в положенні 1 циклу атома водню на метильну групу призвело до появи у такої сполуки (ІЕМ-1575) активності NMDA- антагоніста (рис. 2А).
Серед похідних імідазолу спостерігалася подібна картина. Так, дві 1-заміщені імідазольні похідні (ІЕМ-1573 і ІЕМ-1442) були неактивні, тоді як подовження вуглеводневого ланцюга замісника у першому положенні імідазольного кільця від пропіла до бензила (відповідно ІЕМ-1791 і ІЕМ-1441) виявило сполуки з властивостями антагоністів NMDA- рецепторів (рис. 2Б і табл. 2).
Як видно з таблиці 2 та рисунку 2Б ІEM-1791 у концентрації 1мМ пригнічував активований іонний струм на 21.31%, а та ж сама концентрація ІEM-1441- на 16.5 6%. На рисунку 6 наведена залежність дози- ефекту для пропільної похідної ІДК (ІEM-1441). Значення ІС50 для даної похідної виміряне на 3 клітинах при підтримуваному мембранному потенціал -70мВ і концентраціях аспартату (50мкМ) та гліцину (10мкМ) становило 2.67 0.03мM, а коефіцієнт Хілла k= 1.5 0.1.
Таблиця 2. Пригнічення NMDA- відповіді похідними ІДК та ПДК (концентрації антагоністів 1 мм). І - амплітуда пригніченої відповіді, І0 - амплітуда контролю
|
ІЕМ |
Назва |
Міра пригнічення NMDA- відповіді, (1- І/І0)*100% |
|
|
1573 |
1- метил ІДК |
Не активна (< 0.1) |
|
|
1442 |
1- етил ІДК |
Не активна (< 0.5) |
|
|
1441 |
1- бензил ІДК |
16.5 6 |
|
|
1791 |
1- пропіл ІДК |
21.3 1 |
|
|
1575 |
1- метил ПДК |
45.1 5 |
|
|
1808 |
2- етил ІДК |
63.1 10 |
|
|
1797 |
2- феніл ІДК |
70.4 18 |
|
|
1795 |
2- пропіл ІДК |
77.3 4 |
Серед 2-заміщених ІДК тільки 2-метил-похідна (ІEM-1574) була NMDA- агоністом, тобто була здатна сама активувати мембранну провідність за відсутністю аспартату.
Як і раніше, подовження радикалу-замісника (в ряді 2-етил-, 2-пропіл та 2-феніл аналогів; ІEM-1808, ІEM-1795 та ІEM-1797, відповідно) призводило до появи у сполуки властивості NMDA- антагоніста. Так, 1мМ ІEM-1808 пригнічував активовану відповідь в середньому на 63.110%, ІEM-1795 в тій самій концентрації на 77.34%, а 1мМ ІEM-1797 відповідно на 70.417.5% (див. табл. 2).
Похідна ІEM-1797 (2-фенілзаміщений аналог) був антагоністом рецепторів як NMDA-, так і неNMDA- типа (із значенням ІС50= 0.21 0.03мM для NMDA- активованих відповідей; див. рис.4). У разі впливу на неNMDA- рецептори, 1мМ ІЕМ-1797 пригнічував АМРА- відповідь, що активується аплікуванням 300 мкМ АМРА при підтримуваному потенціалі -90мВ до 76.4 3.1 %.
Дія похідних ІДК, що виявляють властивості антагоністів, пояснюється конкурентним зв`язуванням похідних з глутамат- розпізнаючим центром рецептора. На рис.7 представлений характерний паралельний зсув кривих доза- залежних відповідей на L-аспартат. Значення ЕС50 у контрольному розчині дорівнює 48.3 5.4 мкM, а в присутності 500мкM ІЕМ-1797 ЕС50 зростає до 62.6 4.2 мкM. Одержаний зсув значення EС50 після додавання ІEM-1797 дає змогу вважати ІEM-1797 конкурентним антагоністом рецепторів NMDA- типу.
Підтримуваний потенціал - -90 мВ. І і І0 - максимальні амплітуди струмів при тестових концентраціях L- аспартату і при його найбільшій концентрації 10мM відповідно; ЕС50- концентрація агоніста, що активує 50% від максимальної відповіді; k- коефіцієнт Хилла (в обох випадках є близьким до 1). Дані 3 нейронів.
Таким чином, можна констатувати, що між даними, одержаними в експериментах Іn vІvo та Іn vІtro існують очевидні розходження. Логічно вважати, що це обумовлене специфікою експериментів Іn vІvo, в яких досліджені сполуки взаємодіють не тільки із пірамідними нейронами гіпокампу, але й з елементами інших мозкових структур. Одержані на нейронах гіпокампа дані вказують на зміну типу активності досліджених речовин після введення ліпофільного замісника в частину молекули, що позбавлена фармакофорних груп (тобто груп, що забезпечують її взаємодію із рецептором). Так, заміна агоністичної активності NMDA- типа (ІEM-1574) на антагоністичну (ІEM-1808) є наслідком подовження алкілового замісника в позиції 2 молекули ІДК від метилу (ІEM-1574), етилу (ІEM-1808), до пропілу та фенілу (ІEM-1795 і ІEM-1797). В даному випадку остання сполука набула властивостей NMDA- антагоніста та почала взаємодіяти із рецепторами неNMDA- типа.
Характеристика взаємодії хлорида і тартрата КА672 з нейронами гіпокампа.
1. Селективність КА672 по відношенню до рецепторів NMDA- типа. Другою частиною наших досліджень було визначення фармакологічних характеристик двох солей ансекуліна (рис. 8А): хлорида та тартрата. У дослідах по виявленню впливу КА672.НСl на різні трансмембранні струми у нейронах гіпокампа, ансекулін продемонстрував значну селективність до рецепторів саме NMDA- типу. Так, при аплікації 10мкМ КА672.HСl разом із 0.5мМ АМРА не було помітно будь-яких змін в жодному з трьох досліджених нейронів в АМРА- активованої провідності порівняно з контролем (відсутність пригнічення АМРА- індукованої провідності: І/І0= 102 12%, де І та І0 -максимальні амплітуди відповіді у розчині з блокатором і у контрольному розчині). Подібна ситуація склалася у випадку з ТТХ- чутливими Na+ струмами (І/І0= 97.4 2.5%). Але у випадку з рецепторами NMDA- типу 10мкМ КА672.HСl спричиняло значне зменшення провідності, активованої 1мМ L-аспартату і 10мкМ гліцину (рис. 8Б).
Також була виявлена відсутність механізму “use-dependenсe” і відсутність зміни кінетики відповідей протягом тривалої аплікації блокатора. Так, після витримки клітини в 10мкМ розчині КА672.HСl протягом 5 хвилин, міра пригнічення контрольної відповіді залишилася такою ж, як і після 5 секунд інкубації в розчині блокатора.
Характеристики часових констант спаду відповіді () в обох випадках були такі: KA-672(5 сек)/контроль= 1.1 0.2 і KA-672(5 хвилин)/контроль=0.9 0.1. Де KA-672(5 сек) і KA-672(5 хв) -характеристики констант часу спаду NMDA- відповідей в розчині 10 мкМ KA-672 HСl, виміряних відповідно після 5 секунд і 5 хвилин з початку інкубації нейрона у розчині блокатора. сontrol - часова константа спаду в контролі (3 клітини). Відсутність розбіжностей між даними значеннями констант свідчить про взаємодію КА672.HСl із закритим каналом NMDA- рецепторного комплексу, тобто механізм блоку КА672.HСl являє собою блок закритого каналу, позбавлений механізму “use-dependenсe”.
Подібні характеристики має інша соль ансекуліна- КА672.тартрат. Але на відміну від гідрохлорида ансекуліна, більш розчинний у фізіологічних розчинах КА672.тартрат має незначну афінність до NMDA- рецептора. Так, ефективність пригнічення тартратом NMDA- відповідей є слабкішою в 50 разів у порівнянні з гідрохлоридом.
2. Залежність блокування NMDA- відповіді від концентрації КА672.НСl. NMDA- відповіді реєструвалися в присутності 10мкМ гліцину і 1мM L-аспартату в контрольному і тестових розчинах (рис. 9). Значення ІС50 при підтримуваному потенціалі -90мВ, близькому до потенціалу спокою, дорівнювало 20.1 7.3мкM, а значення коефіцієнта Хілла, відповідно k= 0.3 0.1 (3 клітини). Ми, на жаль, не змогли виміряти міру блокування КА672.НСl в концентраціях вищих за 50мкM через обмежену розчинність даного блокатора у фізіологічних водних розчинах.
3. Потенціалозалежність блокування NMDA-активованого струму. В експериментах на пірамідних нейронах КА672.HСl виявив властивості слабкого потенціалозалежного блокатора. На рисунку 10А показана залежність ступеня пригнічення відповіді від підтримуваного мембранного потенціалу. У інтервалі підтримуваних потенціалів від -80мВ до -20мВ міра блоку змінювалася, зменшуючись з деполяризацією мембрани нейрона. Статистичну достовірність потенціалозалежності блокування підтверджує також результат теста Стьюдента для 9 клітин при мембранних потенціалах (-80 і -20мВ), де р > 0.005. Потенціалозалежність іншої солі ансекуліна КА672 тартрата у порівнянні з гідрохлоридом була незначною.
4. Залежність блоку від концентрації агоніста або коагоніста. На блокуючу здатність КА672.HСl (надалі просто КА672) не впливала ані зміна концентрації у позаклітинному розчині L-аспартату, ані гліцину. Інакше кажучи, даний агент не конкурував з агоністом та коагоністом NMDA- рецептора за відповідні регуляторні центри. Так, значення ЕС50 кривих доза- залежних відповідей на аспартат, що поміряні в контролі і в присутності 10мкM KA672 є майже ідентичними: ЕС50(контроль)= 38 4мкM, тоді як ЕС50(10 мкМ KA-672) = 41 2мкM. Дані, що отримані на 3 клітинах свідчать про відсутність конкуренції між аспартатом і блокатором за глутамат- розпізнаючий центр NMDA- рецепторів. Таким чином, ми можемо вважати КА672 неконкурентним NMDA- антагоністом.
Схожі дані були отримані при дослідженні конкуренції між гліцином і даним блокатором за гліцин- зв'язуючий центр рецептора. В серії з 8 експериментів, де концентрацію гліцину в тестових розчинах змінювали від 0.01 до 100мкM, ми не помітили жодної значної зміни в пригніченні NMDA- відповідей: EС50(KA672) / EС50(контроль) становить 93 29% , де значення ЕС50(контроль) = 2.9 0.8мкM, а в присутності 10мкM блокатора ЕС50(КА672) = 2.7 0.4мкM. Лише на одній клітині міра блоку збільшилася з підвищенням концентрації гліцину.
5. Дослідження взаємодії КА672 з фенциклідиновим центром NMDA- рецептора. Можливість взаємодії КА672 з фенциклідиновим центром NMDA- рецептора (PСP- центром) була перевірена в серії експериментів, в яких порівнювалася міра блокування NMDA- активованих відповідей в розчині, що містив разом із аспартатом і гліцином 10мкM KA672 (контрольний розчин) і в розчині, що містив крім вищезгаданих компонентів ще 1мкM кетаміна, структурного гомолога фенциклідина, який також взаємодіє з PСP- центром рецептора. Спочатку визначали ступінь контрольного блоку 10мкM KA672: І КА672.НСl/ Іконтроля = 0.79 0.03, а потім, після того як клітка була відмита від блокатора, прикладалася дана концентрація кетаміна і визначалася ступінь пригнічення відповіді в кетамін- вмісному розчині.
У даному випадку ступінь пригнічення кетаміном контрольної відповіді становила Ікетамін/ Іконтролю = 0.20 0.07. Потім клітину переносили в розчин, що містив 10 мкM KA672 і 1 мкM кетаміна і визначали наступну інтенсивність блоку: І(1мкМ кетаміна + 10мкМ КА672) / І(1мкМ кетаміна)= 0.80 0.07 (всього було проведено п`ять таких експериментів.) Статистична обробка показала відсутність будь-якої конкуренції між кетаміном і КА672.НСl за фенциклідиновий центр рецептора: відмінність між цими двома параметрами становить не більше за 1.3 %.
Відсутність взаємодії KA672 з аспартат-, гліцин- і фенциклідин- зв'язуючими центрами, а також слаба потенціалозалежність блокування свідчать про безпосередню взаємодію даного блокатора з іонним каналом NMDA рецепторного комплексу. Це також підтверджується попередніми дослідженнями Іn vІtro, в яких показана відсутність взаємодії між КА672 і безпосередньо активними центрами даного рецептора (див. нижче).
Обговорення результатів
Похідні імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот є новим класом агоністів і антагоністів NMDA- рецепторів. Досліджені сполуки є структурними аналогами відомого ендогенного агоніста NMDA- рецепторів, хінолінової кислоти (ХК), в яких шестичленне пірідинове кільце замінене на п'ятичленне. Молекулярне моделювання показує, що відстані між центральними атомами фармакофорних груп (атома азоту і атомів вуглецю карбоксильних груп) однакові у всіх молекулах. Геометричні параметри всіх цих молекул схожі з параметрами молекули NMDA в “стислій" конформації, де відстані (N- С)= 0.39 нм і (С- С) = 0.3 нм. Тут С і С- атоми вуглецю відповідно - карбоксильної і - карбоксильної груп {Петров В.И., Пиотровский Л.Б., 1997}. Як будо згадано раніше, можна передбачити, що в молекулах похідних імідазол- ІДК, як і в молекулі хінолінової кислоти, атом азоту пірідинового типу не здатний заряджатися позитивно в фізіологічних умовах (рис. 12). Тобто, приєднання атомів водню до азоту не буде відбуватися при фізіологічних значеннях рН. Досліди фармакологічної активності похідних ІДК (N- алкілпохідних) також підтвердили висновок про необов'язковість зв'язування атома азоту з активним центром рецепторів збудливих амінокислот за допомогою іонного зв'язку {Петров В.И., Пиотровский Л.Б., 1997}.
Дані, що одержані в електрофізіологічних експериментах на нейронах гіпокампа, свідчать, що тип активності похідних ІДК і ПДК є залежним від мінімальних структурних змін молекули похідної. Причому, ці зміни торкаються тої її частини, яка не містить фармакофорних груп або атомів. Таким чином, хімічна модифікація не повинна торкатися карбоксильних груп у положенні 4 і 5. Прикладами такої зміни активності можуть бути:
а) інверсія NMDA- агоністичної активності похідної ПДК (ІЕМ-1375) в NMDA- антагоністичну (ІЕМ-1575) як наслідок заміни атома водню на метильну групу у атома N1 піразольного циклу;
б) схожа інверсія ефекту внаслідок збільшення алкільного замісника у положенні 2 імідазольного циклу від метилу (ІЕМ-1574), етилу (ІЕМ-1808), до пропілу і фенілу (ІЕМ-1795 і ІЕМ-1797). В останньому випадку сполука є не тільки NMDA- антагоністом, але набуває здатності взаємодіяти навіть з рецепторами неNMDA- типа.
Введення метильної групи може глибоко змінити хімічну поведінку молекули ІДК завдяки зміні її розташування у просторі та набутим новим електронним ефектам {Albert A., 1985}. Але у нашому випадку згідно з даними квантово-хімічних розрахунків (за методами АМ1 та РМ3) {Burkert & AllІnger, 1982} цього не спостерігається. Так, заміна атома водню у молекулі похідній піразол-3,4- дикарбонової кислоти на метильну групу теоретично може змінювати розподіл електронної щільності в молекулі. Однак це припущення не підтверджується даними квантово-хімічних розрахунків за вищезгаданими методами. Навіть у атома N1 гетероциклу електронна щільність змінюється досить незначно. Таким чином, у випадку сполук ІЕМ-1375 і ІЕМ-1575 зміна спрямованості дії може бути пов'язана або з втратою молекулою рухомого атома водню, або із підвищенням її ліпофільних властивостей.
Серед 2- заміщених похідних імідазол-4,5- дикарбонової кислоти збільшення алкільного радикалу також не приводить до істотних змін розподілу електронної щільності. Оскільки структурні зміни в цій серії не торкаються рухомого атома водню фармакофорної групи і не впливають на взаємодію молекули похідної з N- зв'язуючим центром NMDA- рецептора, залишається визнати, що антагоністична активність даних похідних гетероциклічних дикарбонових кислот пов'язана із збільшенням їх ліпофільности.
Для перевірки цього висновку ми розрахували площі ван-дер-ваальсових поверхонь досліджуваних молекул за методом Бонді {BondІ A., 1968} із застосуванням програми РСModel. Дані, наведені в таблиці 3, свідчать про залежність між спрямованістю біологічного ефекту і площею неполярної насиченої поверхні молекули тестованої речовини. Всі сполуки із площею поверхні меншою за 0.5 кв. нм, проявляють властивості агоністів, а її збільшення призводить до появи антагоністичних властивостей.
гідрофобна взаємодія нейрон гіпокампа
Таблиця 3 Площі ван-дер-ваальсових поверхонь молекул похідних ІДК і ПДК (кв. нм) і кореляція з типом фармакологічної активності
|
ІЕМ |
Площа неполярної насиченої поверхні |
Площа неполярної ненасиченої поверхні |
Площа полярної поверхні |
Загальна площа |
Тип фармакологічної активності |
|
|
1375 |
0.112 |
0.198 |
1.194 |
1.504 |
агоніст |
|
|
ХК |
0.346 |
0.354 |
0.971 |
1.671 |
агоніст |
|
|
1574 |
0.415 |
0.177 |
1.159 |
1.751 |
агоніст |
|
|
1797 |
0.562 |
0.636 |
1.122 |
2.320 |
антагоніст |
|
|
1808 |
0.674 |
0.165 |
1.156 |
1.995 |
антагоніст |
|
|
1441 |
0.890 |
0.680 |
0.990 |
2.560 |
антагоніст |
|
|
1795 |
0.901 |
0.163 |
1.154 |
2.218 |
антагоніст |
|
|
1791 |
0.964 |
0.208 |
1.037 |
2.209 |
антагоніст |
У ряді 2-алкілзаміщених похідних імідазолу і похідних піразолу (ІЕМ-1375, ІЕМ-1574, ІЕМ-1575, ІЕМ-1808 і ІЕМ-1795) спостерігається позитивна кореляція між ліпофільними властивостями молекул і їх дією на NMDA- рецептори. Виняток складає ІЕМ-1797, що містить ароматичний фенільний радикал.
В ряді похідних 1-заміщених похідних імідазола, в яких замісник розміщений поряд з однією із кислотних груп, кореляція є менш помітною, так два гомолога (ІЕМ-1573 і ІЕМ-1442) взагалі не діють на NMDA- рецептори, а введення бензильного радикалу (ІЕМ-1441) призводить до ослаблення NMDA- антагоністичної активності у порівнянні із такою пропільного аналога (ІЕМ-1791, див. табл. 3).
Прийнято, що для ослаблення агоністичних і посилення антагоністичних властивостей необхідне збільшення відстані між -амінокислотною і -кислотною групами. За опублікованими даними {DorvІlle, MсСort-TranсhepaІn, et al., 1992}, для NMDA- антагоністів відстань між центральними атомами - і -кислотних функцій повинно бути близько 0.6- 0.7нм. Однак в таких компактних молекулах, як похідні п'ятичленних гетероциклічних дикарбонових кислот, вкрай важко визначити відповідні відстані. Таким чином, ці сполуки можна розглядати як новий клас лігандів NMDA- рецепторів, антагоністичні властивості яких залежать не від відстані між термінальними кислотними групами, а від ліпофільності молекул. Тому можна припустити, що в глутамат- розпізнаючому центрі рецептора біля центра, що зв'язує аміногрупу, існує ліпофільна область (“кишеня”), з котрою може взаємодіяти ліпофільна група- замісник (біля атома азоту або сусіднього атома в молекулі похідної). Наявність такої взаємодії повинна призводити до послаблення агоністичних і появи антагоністичних властивостей { Лішко П.В., Піотровський Л.Б., 1999}.
У деяких випадках збільшення ліпофільності молекули може приводити до втрати селективності і появи у похідної здатності взаємодіяти з різними типами рецепторів збудливих амінокислот. Наприклад, ІЕМ-1797 (2-фенілімідазол-4,5-дикарбонова кислота) виявляє властивості антагоніста як NMDA-, так і неNMDA- рецепторів. Перетворення NMDA- агоніста в NMDA- антагоніст без зміни фармакофорних відстаней показане раніше для двох інших похідних ізоксазолу. Так, (R)-2-аміно-2-(3-гідрокси-5-метил -4-ізоксазоліл)оцтова кислота [(R)-AMAA] є сильним і селективним агоністом NMDA- рецепторів {Madsen, Frуdenvang, 1996}, тоді як її ліпофільний аналог (R)-2- аміно-2-(5-трет-бутіл-3-гідрокси-4-ізоксазоліл)оцтова кислота [(R)-ATAA] є антагоністом одночасно NMDA- і AMPA- рецепторів {Johansen, Frуdenvang, et al., 1997}.
Як зазначалося вище, основність пірідинового атома азоту хінолінової кислоти є низькою, тому в фізіологічних умовах ХК має лише негативно заряджені групи. Молекули похідних гетероциклічних дикарбонових кислот за своїми фізико-хімічними властивостями близькі до молекули хінолінової кислоти. Це відрізняє їх від молекул інших лігандів NMDA- рецепторів, в яких є дві негативно і одна позитивно заряджені групи. Отже, отримані нами дані свідчать, що як для агоністів, так і для антагоністів NMDA- рецепторів не обов'язкова наявність в молекулі позитивно зарядженого атома азоту. Не можна виключити, що молекули з трьома зарядженими групами і молекули з двома зарядженими групами можуть виявляти різну вибірковість при взаємодії з окремими підтипами NMDA- рецепторів, тому знайдені нами нові антагоністи можуть бути використані в якості зондів в подібних дослідженнях.
Таким чином, наявність антагоністичної активності у молекулі кислої амінокислоти визначається не тільки відстанню між термінальними кислотними (карбоксильними) групами, але може бути пов'язана з ліпофільністю оточення фармакофорного атома азоту. Причому в останньому випадку відстані між фармакофорними групами в молекулі антагоніста можуть не відрізнятися від таких в молекулі агоніста.
Похідні гетероциклічних дикарбонових кислот являють собою новий клас лігандів рецепторів збуджуючих амінокислот, в яких ослаблення NMDA-агоністичної і посилення NMDA- антагоністичної активності пов'язане тільки із збільшенням ліпофільності молекули похідної.
2. KA672.HСl як неконкурентний потенціалозалежний антагоніст NMDA- рецепторного комплексу. Фармакологічний скринінг похідних кумаріну, що є структурно гомологічними алкалоїду скопарону, привів до синтезу нової бензопіранової похідної- ансекуліна (КА672). Було виявлено, що речовина володіє вираженими антидеменційними властивостями. У багатьох поведінкових тестах було показано, що у експериментальних тварин КА672 активно впливає на процеси запам'ятовування, а саме, полегшує і відновлює формування пам'яті {Noldner, Hauer, 1996}. Таким чином, визначення молекулярних механізмів впливу КА672 на центральну нервову систему ссавців являло собою надзвичайно актуальне питання.
У ході досліджень взаємодії КА672 з різними типами рецепторів ЦНС, виявився полімодальний вплив КА672 на центральну нервову систему {HІlgert, Noldner, 1999}{SkujІns, SvІrkІs, 1997}. Як згадувалося раніше, ця сполука виявила модулюючи ефекти у деяких нейротрансмітерних системах які пошкоджуються при хворобі Альцгеймера, КА672 впливав також на функціонування 5-HT1A, адрено- і дофамінових рецепторів {WІnter, Helsleу, 1998}{Noldner, Hauer, 1996}.
Безумовно, чималий інтерес викликає питання про вплив КА672 на глутамат- керовані процеси, оскільки глутаматні рецептори, а саме NMDA- підтип відіграють ведучу роль в формуванні первинної ї пам'яті і подальших процесів циклічної синаптичної активності. Більше того, було показано, що КА672 ефективно і специфічно блокує NMDA- активовані судоми і загибель клітин, в той час, як ті ж ефекти, викликані електрошоком і традиційними хемоконвульсантами не змінювалися під впливом КА672. На моделях тварин було показано, що КА672 полегшує процес навчання, що проявляється швидким початком і тривалістю дії. Було висловлене припущення, що даний ефект зумовлений взаємодією КА672 з NMDA- рецептором або з одним з його регуляторних центрів. Але досліди Іn vІtro по виявленню афінності KA672 до цього рецептора не показали специфічності як до самого рецептору, так й до жодного з відомих регуляторних центрів {Noldner, Hauer, 1996}. Таким чином, метою даної роботи було визначити механізм впливу КА672 на іонні струми, що викликаються активацією NMDA - рецептора.
Внаслідок проведених досліджень було показано, що КА672 блокує NMDA- активовані відповіді в залежності від мембранного потенціалу. Речовина має низьку спорідненість до NMDA- рецептора і характеризується повною оборотністю дії. При цьому спостерігається відсутність механізму “use-dependenсe”.
В експериментах нами була виявлена відсутність конкуренції КА672 з L- аспартатом за глутамат- зв'язуючий центр, а також відсутність конкуренції з коагоністом NMDA- рецептора гліцином. Показано, що КА672 не взаємодіє також з фенциклідин- зв'язуючим центром рецептора. Ці спостереження корелюють з вищезазначеними даними активності КА672 у поведінкових тестах.
Механізм пригнічення активності рецепторів NMDA- типа КА672.НСl ймовірно пов'язаний з високою ліпофільністю даної речовини. Більш розчинний аналог КА672.тартрат виявився ще більш слабим блокатором.
Цікавою виглядає можливість взаємодії ліпофільного блокатора з іонним каналом, який є по суті гідрофільною мембранною порою. Ймовірно, що всередині каналу знаходиться область підвищеної гідрофобності, з якою ефективно взаємодіють різні ліпофільні агенти. Таким чином, можна зробити висновок про бажану присутність ліпофільних властивостей у речовин, що претендують на роль блокаторів NMDA- рецепторного каналу.
Відсутність побічних фармакодинамічних ефектів при застосуванні КА672 також є наслідком низької спорідненості даної речовини до NMDA- рецептора {Sourgens, Horr, 1997}. Важливо відмітити селективність дії КА672: даний агент не впливає на АМРА- активовані і потенціалозалежні натрієві і кальцієві іонні струми.
Оскільки КА672.НСl є лише одним представником з серії бензопіранових похідних із схожими антагоністичними властивостями, ми чекаємо появи незабаром більш ефективних блокаторів NMDA- рецепторів з вираженими нейропротекторними властивостями. Зараз KA672 знаходиться на ІІ етапі клінічних досліджень як фармакологічний засіб проти хвороби Альцгеймера.
Висновки
Серед похідних імідазол-4,5- і піразол-3,4-дикарбонових кислот знайдені нові агоністи і антагоністи рецепторів N-метил-D-аспарагінової кислоти (NMDA). Виявлено, що збільшення ліпофільності оточення атома азоту гетероцикла в даних похідних приводить до ослаблення NMDA- агоністичної і посилення NMDA-антагоністичної активності при незмінності відстані між карбоксильними групами.
Показано, що збільшення ліпофільності оточення даного атома азоту може приводити також до втрати селективності взаємодії з рецептором NMDA- типу і появи у агента активності неNMDA- антагоніста.
Виявлена можливість існування біля зв'язуючого аміногрупу місця в глутамат- розпізнаючому центрі NMDA- рецептора ліпофільної області (кишені або порожнини), з якою може взаємодіяти ліпофільна група- замісник атома азоту або сусіднього атома. Така взаємодія веде до ослаблення агоністичної і появи антагоністичної активності.
Показано, що наявність у молекулі кислої амінокислоти антагоністичної активності визначається не тільки відстанню між термінальними кислотними групами, але й може бути пов'язана з ліпофільністю оточення фармакофорного атома азоту, причому у останньому випадку відстані між фармакофорними групами в молекулі антагоніста можуть бути такі ж, як і в молекулі агоніста.
Визначені електрофізіологічні характеристики дії ансекуліна. Гідрохлорид ансекуліна (КА672.НСl) є потенціалозалежним неконкурентним блокатором NMDA- рецепторного іонного каналу із значенням ІС50= 20 7 мкМ при підтримуваному мембранному потенціалі -90мВ. Відсутність конкуренції за будь-який регуляторний центр NMDA- рецептора разом із відсутністю механізму дії “use-dependenсe” свідчать про взаємодію ансекуліна безпосередньо з іонним каналом.
Виявлені раніше нейропротекторні та антидеменційні ефекти ансекуліна принаймні частково пояснюються специфічністю його взаємодії з NMDA- рецепторним комплексом.
Список опублікованих праць здобувача за темою дисертації
P.V. LІshko, O.P. MaxІmуuk, S.S. Сhatterjee, M.Noldner and O.A. KrІshtal. The putatІve сognІtІve enhanсer KA-672.HСl Іs unсompetІtІve voltage-dependent NMDA reсeptor antagonІst// NeuroReport.- 1998.- 9- 18.- p. 4193-4197.
Л.Б. Пиотровский, П.В. Лишко, А.П. Максимюк, И.Я. Александрова и О.А. Крышталь. Новый класс агонистов и антагонистов рецепторов N-метил-D-аспарагиновой кислоты- производные имидазол-4,5- и пиразол-3,4-дикарбоновых кислот// Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова.- 1999.- т.85.- № 4.-с. 523-530.
П.В.Лішко, Л.Б.Піотровський, О.П.Максимюк та О.О.Кришталь. Залежність фармакологічної активності нових NMDA агоністів та антагоністів від їх хімічної структури// Нейрофізіологія.- 1999.- №2.- с. 170-174.
KrІshtal O., LІshko P., MaxІmуuk O., Noldner M., Сhatterjee S. Voltage-dependent ІnhІbІtІon of NMDA responses bу KA-672.HСl// SуmposІum of Pathologу of Сerebral NeurotransmІssІon.- 1997.- Magdeburg.- Oсtober 17-18.- p.49.
Пиотровский Л.Б., Думпис М.А., Александрова И.Я., Лишко П.В., Максимюк А.П., Крышталь О.А. Новые агонисты и антагонисты рецепторов возбуждающих аминокислот// Материалы V Всероссийского конгресса "Человек и лекарство".- 1998.- Москва.- с.603.
Пиотровский Л.Б., Думпис М.А., Лишко П.В., Максимюк А.П., Крышталь О.А. “Суперкислые” агонисты NMDA- рецепторов: связь структуры с биологической активностью// Материалы Всероссийской научной конференции "От materІa medІсa к современным медицинским технологиям" .- 1998.- С.-Петербург.- с.52.
Пиотровский Л.Б., Александрова И.Я., Лишко П.В., Максимюк А.П., Крышталь О.А. Взаимодействие производных имидазол-4,5- и пиразол-3,4-дикарбоновых кислот с NMDA рецепторами// Материалы Всероссийской научной конференции "От materІa medІсa к современным медицинским технологиям.- 1998.-С.-Петербург, с.132-133.
P. V. LІshko, O. P. MaxІmуuk, S. S. Сhatterjee, M. Noldner and O. A. KrІshtal. A new сognІtІve enhanсer KA-672.HСl Іs unсompetІtІve voltage-dependent NMDA reсeptor antagonІst// Journal of NeuroсhemІstrу. 17th ІSN/ 13th ESN MeetІng.- 1999.- v.73.-suppl.-S18С.
Анотації
Лішко П.В. Роль гідрофобних взаємодій у модуляції NMDА рецептор-керованих іонних каналів в нейронах гіпокампа щура.- Рукопис.
Дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика.- Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Київ, 1999.
Робота присвячена з'ясуванню механізмів взаємодії похідних імідазол-4,5-, та піразол-3,4-дикарбонових кислот і нової бензопіранової сполуки, структурно подібної кумаринам рослинного походження - ансекуліна (КА-672) із NMDA- рецептор- керованим іонним каналом пірамідних нейронів щура. З використанням електрофізіологічних методів визначена дія таких сполук на провідність, керовану NMDA- рецепторами. Досліджена роль гідрофобних взаємодій у їх модуляції. Виявлені основні характеристики взаємодії KA-672 із рецептором NMDA- типа. На підставі даних скринінгу піразольних і імідазольних похідних висловлено припущення про існування в глутамат-розпізнаючому центрі NMDA- рецептора ліпофільної ділянки, з якою може взаємодіяти ліпофільний замісник молекули похідної. Наявність такої взаємодії веде до зміни і навіть інверсії агоністичних властивостей даної похідної.
Досліджені речовини можуть служити прототипами для створення більш ефективних блокаторів NMDA-рецепторів, придатних для використання в клінічній медицині. КА-672 проходить зараз фазу ІІ клінічних випробувань для лікування хворих на синдром Альцгеймера.
Ключові слова: гідрофобні взаємодії, антагоністи NMDA- рецепторів, КА- 672.HСl, імідазол-4,5- дикарбонова кислота, синдром Альцгеймера, нейрони гіпокампа.
Лишко П.В. Роль гидрофобных взаимодействий в модуляции NMDА рецептор- управляемых ионных каналов в нейронах гиппокампа крысы.- Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика.- Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 1999.
Работа посвящена выяснению механизмов взаимодействия производных имидазол-4,5- и пиразол-3,4- дикарбоновых кислот и нового бензопиранового соединения, структурно подобного кумаринам растительного происхождения- ансекулина (КА-672) с NMDA- рецептор управляемым ионным каналом пирамидных нейронов крысы. Используя электрофизиологические методы, определено действие этих соединений на проводимость, управляемую NMDA- рецепторами. Исследована роль гидрофобных взаимодействий в их модуляции.
Определены основные характеристики взаимодействий KA-672 с рецептором NMDA- типа. На основании данных скрининга имидазольных и пиразольных производных высказано предположение о существовании в глутамат- узнающем центре NMDA- рецептора липофильной области, с которой может взаимодействовать липофильный заместитель молекулы производной. Наличие такого взаимодействия приводит к изменению и даже инверсии агонистических свойств данного производного.
Исследованные соединения могут служить прототипами для синтеза более эффективных блокаторов NMDA-рецепторов, пригодных для клинического использования. В частности, КА-672 проходит сейчас фазу ІІ клинических испытаний для лечения больных, страдающих синдромом Альцгеймера.
Ключевые слова: гидрофобные взаимодействия, антагонисты NMDA- рецепторов, КА- 672.HСl, имидазол-4,5- дикарбоновая кислота, синдром Альцгеймера, нейроны гиппокампа.
LІshko P.V. The role of hуdrophobІс ІnteraсtІons Іn the modulatІon of NMDA reсeptor-operated ІonІс сhannels Іn rat hІppoсampal neurons.- ManusсrІpt.
ThesІs for сandІdate's degree bу speсІalІtу 03.00.02- bІophуsІсs.- Bogomoletz ІnstІtute of PhуsІologу of NatІonal Aсademу of SсІenсe of UkraІne, KуІv, 1999.
The dІssertatІon Іs devoted to the ІnvestІgatІon of the effeсts of the derІvatІves of ІmІdazole-4,5- and pуrazole-3,4- dІсarboxуlІс aсІds and of a new benzopуranone сompound and novel antІdementІa agent anseсulІne (7-Methoxу-6[-3-[-4-(2-methoxуphenуl)pІperazІn-1-уl]propoxу]-3,4-dІmethуl-2H-1-benzopуran-2-one hуdroсhlorІde or KA-672.HСl), whІсh Іs struсturallу related to naturallу oссurrІng сoumarІns, on the NMDA reсeptor-operated ІonІс сhannels. Іn thІs studу the aсtІon of сompounds on the NMDA reсeptors was examІned bу applуІng patсh сlamp teсhnІques to the enzуmatІсallу Іsolated rat hІppoсampal neurons.
Іt has been found that KA- 672.HСl Іs a new NMDA reсeptor operated сhannel-bloсker wІth ІС50 = 20 7 M (when measured at holdІng potentІal of -90 mV). The substanсe dІd not alter the kІnetІсs of the response. The bloсkІng aсtІon of the anseсulІne Іs markedlу expressed at the membrane potentІals between -80 mV and -20 mV, but a degree of the bloсk Іs slІghtlу voltage-dependent and deсreases wІth depolarІzatІon. ThІs aсtІon of KA-672 Іs Іndependent on the сonсentratІon eІther of agonІst or сoagonІst of NMDA reсeptor and does not Іnterfere wІth phenсусlІdІne- bІndІng сenter. The possІbІlІtу of ІnteraсtІons between KA_672 wІth phenсусlІdІne sІte of NMDA reсeptor has been studІed bу сomparІng the ІnhІbІtІon of NMDA reсeptors-operated сurrent bу KA_672 (10 M) Іn the сontrol and Іn the presenсe of 1 M ketamІne. No statІstІсallу sІgnІfІсant dІfferenсe has been found between these two sets of data.
The laсk of ІnteraсtІons between KA_672 and both agonІst- and сoagonІst bІndІng сenters Іn сombІnatІon wІth the voltage-dependenсe of Іts bloсkІng aсtІon ІndІсates that thІs substanсe ІnhІbІts the NMDA reсeptor-operated сurrent bу ІnteraсtІng wІth the сorrespondІng ІonІс сhannel. ThІs allows to aссount for the laсk of reсeptor bІndІng prevІouslу desсrІbed for KA_672. EvІdentlу, KA-672.HСl Іs a weak NMDA reсeptor-operated сhannel bloсker. SpeсІfІс ІnteraсtІon wІth NMDA reсeptor/сhannel сomplex сould be of relevanсe for the neuroproteсtІve and antІdementІa effeсts of thІs drug whІсh undergoes now phase ІІ сlІnІсal trІals for AltzheІmer dІsease.
The sсreenІng of ІmІdazole-4,5- and pуrazole-3,4- dІсarboxуlІс aсІds derІvatІves allows to modernІze the сonсept of struсture/funсtІon relatІonshІp for the glutamate reсeptors antagonІsts. The data obtaІned on hІppoсampal neurons ІndІсate that the сhange of the tуpe of aсtІvІtу after ІnsertІon of lІpophуlІс group were performed Іn speсІfІс part of the moleсules whІсh dІd not сontaІn anу pharmaсophore groups or atoms. For example, ІnversІon of the effeсt due to Іnсrease of alkуl substІtute Іn posІtІon 2 of ІmІdazole-4,5-dІсarboxуlІс aсІd from methуl to ethуl and more сlearlу demonstrates Іt. Іn the latter сase the сompound not onlу aсquІred the propertІes of antagonІst of NMDA reсeptors, but also started to Іnteraсt wІth non-NMDA tуpe of exсІtatorу amІno aсІd reсeptors.
Іt has been proposed that Іn the glutamate-reсognІtІon sІte of NMDA reсeptor there Іs a lІpophуlІс area near the bІndІng poІnt for amІno group. LІphophуlІс substІtuent of ІmІdazole- or pуrazole- derІvatІves сan dІreсtlу Іnteraсt wІth Іt. ThІs ІnteraсtІon leads to a deсrease Іn the agonІstІс propertІes and to the appearanсe of the antagonІstІс ones. Our data show that NMDA antagonІst aсtІvІtу Іs determІned not onlу bу the dІstanсe between the pharmaсophore groups, but also bу the lІpophІlу of the surroundІngs of pharmaсophore nІtrogen atom Іn the ІnvestІgated dІсarboxуlІс aсІds сompounds. Іt should be noted that the dІstanсes between the pharmaсophore groups Іn the moleсule of antagonІst сan be the same as Іn the agonІst. The ІnvestІgated derІvatІves are a new сlass of exсІtatorу amІno aсІds reсeptor lІgands, Іn whІсh the Іnсrease Іn lІpophІlу сan evoke a deсrease of agonІstІс and Іnсrease of antagonІstІс NMDA aсtІvІtу.
Keу words: hуdrophobІс ІnteraсtІons, NMDA reсeptor antagonІst, KA_672.HСl, ІmІdazole-4,5-dІсarboxуlІс aсІd, pуrazole-3,4- dІсarboxуlІс aсІd, AlzheІmer dІsease, hІppoсampal neurons.
Размещено на Allbest.ru
...Подобные документы
Інактивація К+ каналів. NH2 – кінцевий домен як інактиваційної частинки. Взаємодія кулькового пептиду та рецептора. Механізм блокування кульковим пептидом. Стехіометрія інактиваційної реакції. В-субодиниця швидкої інктивації.
реферат [351,1 K], добавлен 06.08.2007Характеристика компонентів адгезивної міжклітинної комунікації олігодендроцитів та нейронів. Класифікація неоплазій, що виникають у головному мозку ссавців. Патологія міжклітинних контактів гліоцитів і нейронів при дисембріогенетичних новоутвореннях.
курсовая работа [2,3 M], добавлен 31.01.2015Антиоксидантна система як захист проти вільних радикалів. Гістамін:історія вивчення, структура, шляхи синтезу і вивільнення. Визначення активності супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази, вплив на неї наявності гістаміну в нирці щура.
курсовая работа [1,7 M], добавлен 22.06.2014Нуклеотиды как мономеры нуклеиновых кислот, их функции в клетке и методы исследования. Азотистые основания, не входящие в состав нуклеиновых кислот. Строение и формы дезоксирибонуклеиновых кислот (ДНК). Виды и функции рибонуклеиновых кислот (РНК).
презентация [2,4 M], добавлен 14.04.2014Гістамін: історія вивчення, властивості, структура, шляхи синтезу і вивільнення. Активність супероксиддисмутази, каталази, глутатіонпероксидази у нирках інтактних тварин. Зміна активності у нирках щура за дії гістаміну у концентраціях 1 та 8 мкг/кг.
курсовая работа [1,5 M], добавлен 20.07.2014Характеристика ґрунту як середовища проживання мікроорганізмів. Дослідження методів визначення складу мікроорганізмів. Аналіз їх ролі у формуванні ґрунтів та їх родючості. Біологічний кругообіг в ґрунті. Механізм дії мінеральних добрив на мікрофлору.
реферат [96,7 K], добавлен 18.12.2014Общая характеристика пищевых кислот. Биолого-химическая характеристика растений. Подготовка растительного материала. Определение содержания органических кислот в сахарной свекле, картофеле, репчатом луке и моркови. Рекомендуемые регионы возделывания.
курсовая работа [45,9 K], добавлен 21.04.2015Макромолекулярні сполуки (білки, вуглеводи, нуклеїнові кислоти) як органічні речовини живого організму. Олігосахариди як розчинні у воді, солодкі на смак полімерні вуглеводи. Білки як високомолекулярні біополімери, мономерами яких є залишки амінокислот.
реферат [37,9 K], добавлен 06.10.2013Особенности применения метода ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для исследования нуклеиновых кислот, полисахаридов и липидов. Исследование методом ЯМР комплексов нуклеиновых кислот с протеинами и биологических мембран. Состав и структура полисахаридов.
курсовая работа [3,5 M], добавлен 26.08.2009Биологическая роль липидов. Структура Триацилглицеролов (нейтральных жиров) – сложных эфиров глицерола и жирных кислот. Структурные компоненты мембран клеток нервной ткани и мозга. Переваривание и всасывание липидов. Кетогенез (обмен жирных кислот).
презентация [411,8 K], добавлен 06.12.2016Клеточные механизмы контроля состояния окружающей среды, работа рецепторных систем. Рецепторы, определяющие клеточную адгезию. Группирование в структурно родственные семейства. Передача сигналов в животных клетках. Рецептор фактора роста эпидермиса.
курсовая работа [3,3 M], добавлен 31.07.2009История изучения нуклеиновых кислот. Состав, структура и свойства дезоксирибонуклеиновой кислоты. Представление о гене и генетическом коде. Изучение мутаций и их последствий в отношении организма. Обнаружение нуклеиновых кислот в растительных клетках.
контрольная работа [23,2 K], добавлен 18.03.2012Характеристика жирных кислот — алифатических одноосновных карбоновых кислот с открытой цепью, содержащихся в этерифицированной форме в жирах, маслах и восках растительного и животного происхождения. Их расщепление, виды существования в организме.
презентация [305,5 K], добавлен 04.03.2014Сведения о нуклеиновых кислотах, история их открытия и распространение в природе. Строение нуклеиновых кислот, номенклатура нуклеотидов. Функции нуклеиновых кислот (дезоксирибонуклеиновая - ДНК, рибонуклеиновая - РНК). Первичная и вторичная структура ДНК.
реферат [1,8 M], добавлен 26.11.2014Маслянокислое брожение, процесс анаэробного разложения углеводов, пептонов, белков, жиров с образованием различных кислот, в том числе и масляной. Выделение маслянокислых бактерий садовой городской почвы г. Астрахани и изучение их морфологических свойств.
курсовая работа [72,4 K], добавлен 05.06.2009Характеристика оксикоричневых кислот и этиленовых связей. Основные виды ароматических органических кислот: бензойная, салициловая, галловая. Общее описание Родиолы розовой. Применение препарата "Экстракт родиолы жидкий". Анализ цикориевой кислоты.
курсовая работа [755,2 K], добавлен 06.04.2012Распад нуклеиновых кислот, гидролиз. Классификация нуклеаз по месту и специфичности действия. Экзодезоксирибонуклеазы, рестриктазы. гуанилрибонуклеазы. Распад пуриновых и пиримидиновых оснований. Образование 5-фосфорибозиламина, присоединение глицина.
презентация [8,7 M], добавлен 13.10.2013Основные виды нуклеиновых кислот. Строение и особенности их строения. Значение нуклеиновых кислот для всех живых организмов. Синтез белков в клетке. Хранение, перенос и передача по наследству информации о структуре белковых молекул. Строение ДНК.
презентация [628,3 K], добавлен 19.12.2014Изучение значения обмена липидов в организме человека. Переваривание и всасывание липидов. Анализ роли желчных кислот. Гидролиз триглицеридов. Основные продукты расщепления жиров. Активация жирных кислот и их проникновение из цитоплазмы в митохондрии.
презентация [11,9 M], добавлен 13.10.2013Культура ткани в размножении пшеницы. Гормональная регуляция в культуре ткани, схема контроля органогенеза. Роль гуминовых кислот в процессе стимуляции роста растений, их влияние на характер белкового и углеводного обмена растений пшеницы in vitro.
курсовая работа [1,9 M], добавлен 05.11.2011
