Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ РОСЛИН ТА ГЕНЕТИКИ

УДК 581.557.631.84

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

СИМБІОТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ, ФОТОСИНТЕЗ ТА ПРОДУКТИВНІСТЬ РОСЛИН ГОРОХУ, ІНОКУЛЬОВАНИХ СТІЙКИМИ ДО МІНЕРАЛЬНОГО АЗОТУ КЛОНАМИ БУЛЬБОЧКОВИХ БАКТЕРІЙ

03.00.12 - фізіологія рослин

Охріменко Світлана Михайлівна

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті фізіології рослин і генетики НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор,

Старченков Юхим Полікарпович

Інститут фізіології рослин та генетики НАН України, завідувач відділу

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор

Головко Ераст Анатолійович

Центральний ботанічний сад Ім. М.М.Гришка НАН України

Завідувач відділу

Кандидат біологічних наук,

Малиновська Ірина Михайлівна

Інститут землеробства УААН,

Старший науковий співробітник

Провідна установа: Національний аграрний університет

Захист відбудеться 14 квітня 2000 р. о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д. 26.212.01 Інституту фізіології рослин і генетики НАН України за адресою: 03022, м. Київ-22, вул. Васильківська 31/17.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту

фізіології рослин і генетики НАН України.

Автореферат розісланий 13 березня 2000 р.

Вчений секретар

Спеціалізованої вченої ради Труханов В.А.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

бактерія азот клон симбіотичний

Актуальність теми. Азот є одним з основних елементів мінерального живлення рослин, а тому азотним добривам за характером їх впливу на врожай належить провідна роль серед інших видів добрив. Проблема азотного живлення не може бути вирішена тільки за рахунок хімічної промисловості, в значній мірі вона повинна вирішуватись при допомозі азотфіксаторів, тобто біологічним шляхом (Прянишников Д.Н.1945). Засвоєння азоту біологічним шляхом має велике народногосподарське значення для вирішення задачі збільшення виробництва харчового і кормового білку, який в наш час є дефіцитом. Основною зернобобовою культурою і важливим постачальником рослинного білку в кліматичних умовах України є горох. Він містить багато цінних поживних речовин, зерно його використовується в харчовій промисловості, а кормові сорта переробляються на борошно - цінний концентрований корм для сільськогосподарських тварин.

Як відомо, гороху властива дуже низька чутливість на інокуляцію бульбочковими бактеріями. В роботах Доросинського (1973, 1979) і Кожемякова (1981, 1989) це явище пояснюється такими факторами, як наявність в грунті великої кількості спонтанних і часто вірулентних, але менш ефективних штамів бульбочкових бактерій гороху. Крім цих факторів, негативний вплив на чутливість рослин гороху проявляють залишки азотних мінеральних добрив, що знаходяться в грунті після вирощування таких просапних культур як кукурудза, цукровий буряк, картопля, оскільки останні часто є попередниками гороху.

На протязі багатьох років сільськогосподарські культури вирощували за інтенсивною технологією із внесенням різні культури підвищених доз азотних добрив, що привело до зміни мікробних ценозів, появи нових штамів бульбочкових бактерій, які характеризувались більшою вірулентністю, конкурентоздатністю, але меншою ефективністю по відношенню до виробничих штамів бульбочкових бактерій.

Бобово-ризобіальна система гороху - Rhizobium leguminosarum є більш чутлива до впливу азоту при порівнянні з симбіотичними системами інших бобових культур. Літературні дані (Streeter J.G., 1985а, 1985, Waterer J.G., 1993) свідчать про те, що навіть при відносно незначних дозах азоту в середовищі вирощування, спостерігається пригнічення процесу симбіотичної азотфіксації в рослинах гороху.

У зв'язку з цим актуальною є проблема підвищення рівня симбіотичної азотфіксації у рослин шляхом створення і застосування для інокуляції штамів, здатних забезпечувати ефективну азотфіксацію в присутності мінерального азоту в субстраті. Слід відмітити, що в літературі відсутні роботи про бульбочкові бактерії гороху, одержані шляхом обробки мутагенами, які здатні утворювати ефективний бобово-ризобіальний симбіоз з рослинами гороху при підвищеному вмісті азоту в субстраті.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконувалась у відповідності з планами відділу симбіотичної азотфіксації на 1991 - 1995 рр. по темі "Вивчити механізми фізіолого-генетичних процесів фіксації азоту з метою формування високопродуктивних азотфіксуючих систем бобових рослин" (N держ. реєстрації 01.09.10 019962).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала в дослідженні симбіотичних властивостей, фотосинтезу та продуктивності рослин гороху при застосуванні для інокуляції клонів бульбочкових бактерій, стійких до мінерального азоту.

Для вирішення цієї мети були поставлені такі завдання:

- одержати клони бульбочкових бактерій гороху, стійкі до підвищеного вмісту азоту в субстраті, та вивчити їх симбіотичні властивості;

- дослідити вплив одержаних клонів на інтенсивність фотосинтезу, темнового дихання, накопичення азоту і пігментів в рослинах гороху;

- вивчити вплив нових клонів на продуктивність та якість зерна гороху.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше методом хімічного мутагенезу одержані стійкі до підвищеного вмісту азоту клони бульбочкових бактерій гороху на основі виробничого штаму Rhizobium leguminosarum bv. viciae 250а.

Дослідні клони бульбочкових бактерій в присутності азоту в субстраті проявляють покращену вірулентну, азотфіксуючу активність і ефективність при порівнянні з вихідним штамом 250а.

Встановлено, що клони М-1 і М-4 та їх ізоляти із бульбочок рослин гороху, інокульованих даними клонами, показують підвищені симбіотичні властивості по відношенню до контролю (вихідного штаму 250а) на середовищах з 1,2 норми азоту по Гельрігелю, що свідчить про наслідуємість одержаних властивостей і дає можливість вважати ці клони мутантами.

Інокуляція одержаними клонами бактерій підвищує інтенсивність фотосинтезу і темнового дихання рослин.

Застосування нових клонів бактерій збільшує вміст азоту і пігментів на протязі вегетації в рослинах гороху.

Симбіотична система рослин гороху і стійких до азоту клонів бульбочкових бактерій характеризується більш інтенсивним процесом утворення біомаси і покращеною якістю зерна.

Цінність досліджень. Отримані результати досліджень дозволяють стверджувати можливість одержання ефективних стійких до підвищеного вмісту азоту клонів бульбочкових бактерій гороху методом хімічного мутагенезу і дають уявлення про вплив їх на фізіологічні процеси і продуктивність рослин, вирощених в присутності азоту в субстраті. Дослідні клони бактерій можуть бути об'єктами в модельних системах бобові рослини - ризобії для вивчення процесів стійкості симбіозу до мінерального азоту, розпізнавання партнерів при утворенні симбіозу і функціонування симбіотичної системи. Одержані клони також можуть бути рекомендовані для розробки і виготовлення препаратів бульбочкових бактерій, які забезпечували б максимальне використання біологічного азоту і одержання екологічно чистої продукції.

Особистий внесок здобувача. Дисертант особисто проробила відповідну літературу та оволоділа необхідними методами досліджень, брала участь у плануванні дослідів, підготовці матеріалів до друку в наукових журналах. Матеріали дисертаційної роботи одержано здобувачем самостійно.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на Республіканській конференції, присвяченій пам'яті чл. кор. АН УРСР Манорика А.В. (Тернопіль, 1991); доповідались і обговорювались на конференції молодих вчених "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики" (Киев, 1992), а також на конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики", присвяченій 50-й річниці з дня заснування Інституту фізіології рослин і генетики НАН України (Київ, 1996).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 робіт, у тому числі 3 статті у провідних фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із переліку умовних скорочень, вступу, шести розділів основної частини, заключення, висновків, списку використаних джерел. Робота викладена на 174 сторінці машинописного тексту, з них 50 сторінок займають 43 таблиці та 7 ілюстрацій. Список використаних у роботі літературних джерел містить 271 найменування, в тому числі 137 зарубіжних, загальним обсягом 33 сторінки.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступній частині обгрунтована актуальність проблеми, подано коротку характеристику роботи, цінність роботи та апробацію результатів досліджень.

В першому розділі представлений огляд вітчизняної та зарубіжної літератури по впливу мінерального азоту на процес симбіотичної азотфіксації у бобових рослин, методах одержання бактерій з новими властивостями та взаємозв'язку основних фізіологічних процесів з фіксацією атмосферного азоту.

Другий розділ включає об'єкти і методи досліджень. Досліди проводились протягом 1992 - 1994 рр. на спеціально обладнаному вегетаційному майданчику Інституту фізіології рослин і генетики НАН України. Об'єктами досліджень були горох (Pisum sativum L.) сорту Солара, бульбочкові бактерії гороху (Rhizobium leguminosarum bv. viciae) штаму 250а, клони бактерій, стійкі до підвищеного вмісту азоту в субстраті, та ізоляти клонів М-1 і М-4 із бульбочок рослин гороху, інокульованих даними клонами. Як мутаген використовували етилметансульфонат (ЕМС) - С₂Н₅ОSO₂CH₃. Обробку бактерій проводили по методиці, розробленій у ВНДІСГМ. Життєздатність клонів виражали в процентах колоній, які виросли в розсіві обробленої суспензії клітин, до числа колоній, які виросли в розсіві необробленої суспензії.

Клони відбирали за ознакою бульбочкоутворення в умовах мікровегетаційних дослідів в піщаній культурі. В дослідах використовували посудини на 0,5 кг з промитим стерильним піском, куди вносили 0,2 або 1,2 норми азоту та інші мінеральні елементи по 1,0 нормі за Гельрігелем. Титр суспензії бактерій для інокуляції становив 10я59 я0кл/мл. Досліди проводили в 4-кратній повторності. Для подальшої роботи відбирали клони бактерій, які утворювали найбіль кількість бульбочок, після 30 діб вегетації.

Ефективність відібраних клонів бактерій та вплив їх на хід фізіологічних процесів в рослинах вивчали в умовах вегетаційних дослідів в піщаній і грунтовій культурах. В субстраті вирощування рослин містилось 1,2 норми азоту та інших мінеральних елементів в дозі 1,0 норми за Гельрігелем. Простерілізоване 70 % - ним етиловим спиртом і промите стерильною водою насіння гороху інокулювали відібраними клонами бактерій. Оптичну густину суспензії бактерій вимірювали на спектрофотометрі СФ-26 при довжині хвилі 560 нм, інфекційне навантаження всіх дослідних клонів і штаму складало 10⁹ кл/мл. В схему досліду були включені контрольні варіанти - без інокуляції (абсолютний контроль) і з обробкою насіння суспензією бульбочкових бактерій штаму 250а (контроль) та інокуляція окремими одержаними клонами бактерій. Повторність досліду шестикратна. В кожній посудині після проривки залишали по п'ять рослин. Ефективність клонів визначали по масі сухої речовини надземної частини і коренів на протязі вегетації та по масі зерна і його якості. Проводилось дослідження динаміки утворення і наростання кореневих бульбочок гороху та вивчення їх азотфіксуючої активності по відновленню ацетилену в етилен за методом Харді [Hardy R.W.F. еt al., 1968] на газовому хроматографі "Chromatograph - 504".

Азотфіксуючу активність виражали в наномолях утвореного етилену на рослину за годину.

Інтенсивність фотосинтезу та дихання вимірювали за допомогою включеного по диференційній схемі оптико-акустичного газоаналізатора ГІАМ - 5 [Киризий Д.А., 1981]. Вміст загального азоту визначали методом К'єльдаля в модифікації Чмельової і Тютєревої [Плешков Б.П., 1985]. Вміст хлорофілу визначали спектрофотометричним методом [Починок Х.Н., 1976]. Процентний вміст білку вираховували шляхом множення показника вмісту азоту на коефіціент 5,7 [Петербургский А.В., 1968].

При вивченні впливу клонів бактерій на інтенсивність фізіологічних процесів в рослинах гороху зразки для аналізів відбирали в фазах 6-8 листків, бутонізації, цвітіння і утворення бобів. Статистична обробка даних проведена за Доспєховим (1985).

У третьому розділі "Реакція бульбочкових бактерій на дію ЕМС і симбіотичні властивості одержаних клонів бульбочкових бактерій гороху" показано, що життєздатність бульбочкових бактерій гороху штаму 250а на бобовому агарі залежить від дози мутагену: зі збільшенням дози відбувається зниження числа клітин, що вижили. Так, найбільший процент життєздатності бактерій (39,48 %) відмічено при обробці самою низькою концентрацією ЕМС (0,5 %). У варіанті з найбільшою концентрацією мутагену - 3,0 % спостерігався найнижчий ступінь життєздатності - 1,18 %. Встановлено, що процент життєздатності бульбочкових бактерій гороху, не оброблених мутагеном, знижується в залежності від концентрації мінерального азоту в середовищі росту культур, а обробка мутагеном сприяє збільшенню життєздатності ризобій на цих середовищах.

Внаслідок проведеної серії дослідів було відібрано 540 клонів, здатних утворювати колонії в присутності підвищеної дози азоту 50 мМ/л. Після 4-5 пасажів здатність до росту і утворення колоній зберігається у 79,5 %. Попередня оцінка вірулентності цих бактерій проведена в умовах мікровегетаційного досліду при підвищеному вмісті мінерального азоту в субстраті. Встановлено, що із досліджених клонів 22 % не утворювали бульбочок, 54 % клонів утворювали 3-20 бульбочок на рослину на 30-у добу вирощування і тільки у 24 % клонів кількість утворених бульбочок досягала 15-40 на рослину, які й були використані в наших експериментах.

Дані вегетаційних дослідів (табл. 1) свідчать, що на варіантах з одержаними клонами спостерігалось більш інтенсивне протікання процесу бульбочкоутворення на протязі онтогенезу при порівнянні з контрольними варіантами, де утворювались дрібні, неактивні бульбочки в невеликій кількості. Найбільша маса бульбочок на рослину на протязі вегетації спостерігалась в фазі бутонізації і перевищувала в середньому в 2-3 рази масу бульбочок контрольних рослин.

Згідно даним по нітрогеназній активності (табл. 2), досліджувані клони бульбочкових бактерій здатні активно фіксувати атмосферний азот в симбіозі з рослинами гороху, які вирощувались на підвищеному фоні азоту в піщаній культурі. В умовах грунтової культури спостерігалось також збільшення інтенсивності процесу азотфіксації при застосуванні дослідних клонів бактерій. В контрольних варіантах азотфіксуюча активність була відсутня або незначна.

Вивчався вплив клонів бактерій М-1, М-3 і М-4 на інтенсивність процесу азотфіксації при різних дозах нітратного азоту в субстраті (0,2 норми і 1,2 норми азоту по Гельрігелю). В варіантах з застосуванням клонів спостерігалось збільшення кількості і маси бульбочок при порівнянні з інокуляцією штамом 250а . Інокуляція дослідними клонами сприяла значному підвищенню ацетиленвідновлюючої активності при 0,2 нормах азоту. На середовищі з внесенням 1,2 норми азоту в контрольних варіантах бульбочки не утворювались, тоді як дослідні клони виявили вірулентну і азотфіксуючу активність. При даній нормі азоту найбільші показники симбіотичної активності відмічені при застосуванні клону М-1. Інокуляція одержаними клонами приводить до збільшення інтенсивності прирісту біомаси при різних рівнях азотного живлення. Більш ефективними були клони М-1 і М-4.

Проводились досліди по впливу умов вирощування ризобій в чистій культурі на бульбочкоутворення рослин гороху. Показано, що бульбочкові бактерії, які вирощували на живильних середовищах з підвищеним вмістом азоту в чистій культурі, знижують здатність до бульбочкоутворення, що, можливо, пов'язано з порушенням біосинтезу позаклітинних вуглеводів (Косенко Л.В., 1995).

Для вивчення наслідуємості симбіотичних властивостей одержаних клонів проводили досліди із вихідним штамом 250а, клонами М-1 і М-4 та ізолятами даних клонів із бульбочок рослин гороху. Як свідчать дані досліду, клони М-1 і М-4 та їх ізоляти із бульбочок рослин гороху проявляють підвищені симбіотичні властивості по відношенню до контролю (вихідного штаму 250а) на середовищах з 1,2 норми азоту по Гельрігелю, а також є більш ефективними по відношенню до контролю (вихідного штаму 250а), що показує спадковий характер симбіотичних властивостей клонів і дає можливість вважати ці клони мутантами.

Таким чином, клони бульбочкових бактерій гороху, одержані методом обробки їх етилметансульфонатом, які вирощували на живильному середовищі з підвищеним вмістом азоту, здатні утворювати симбіотичну систему з рослинами гороху, яка фіксує азот в присутності цього елементу в середовищі росту.

Четвертий розділ "Інтенсивність вуглекислотного газообміну рослин гороху при інокуляції дослідними клонами бактерій" містить результати вегетаційних дослідів, які показують вплив одержаних клонів на інтенсивність фотосинтезу, вміст пігментів і на дихальну активність рослин на протязі вегетаційного періоду. Так, на варіантах з інокуляцією клонами бактерій спостерігалась більш висока інтенсивність фотосинтезу на протязі онтогенезу при порівнянні з контрольним варіантом, інокульованим штамом 250а. Серед вивчених клонів найбільшою активністю фотосинтезу на протязі онтогенезу виділявся варіант з інокуляцією клоном М-1, на ньому спостерігалась також більш активна фіксація молекулярного азоту, що свідчить про тісний зв'язок цих двох фізіологічних процесів. Інокуляція рослин гороху стійкими до підвищеного вмісту мінерального азоту клонами бульбочкових бактерій сприяє збільшеню інтенсивності фотосинтезу також при розрахунку в мг СО₂ на грам сухої речовини за годину на протязі вегетаційного періоду.

Дослідження вмісту хлорофілу в онтогенезі рослин гороху показали, що в фазі бутонізації вміст хлорофілу "a" в варіантах з інокуляцією клонами бактерій був вищий, порівнюючи з вмістом в контрольних рослинах на 17,2 - 34,2 %. Більш значне накопичення пігментів при розрахунку на рослину відмічалось в фазі утворення бобів. Дослідні рослини в цю фазу мали хлорофілу "а" і "в" на 12,1 49,8 % більше у порівнянні з контролем. Більш інтенсивно накопичували хлорофіл на протязі вегетації рослини, інокульовані клонами М-4 і М-6. На цих варіантах спостерігалась також максимальна активність азотфіксації (табл. 2), що підтверджує існування позитивного зв'язку цих двох процесів. Застосування одержаних клонів приводило також до збільшення вмісту пігментів при розрахунку на грам сухої речовини на протязі вегетації. Проведений кореляційний аналіз даних інтенсивності фотосинтезу і вмісту хлорофілів "a" і " в" виявив існування значного позитивного зв'язку в фазі бутонізації (r = 0,90).

Одержані дані по впливу досліджуваних клонів бульбочкових бактерій на інтенсивність темнового дихання, яке поруч з фотосинтезом і азотфіксацією є важливим елементом продукційного процесу рослин, показали, що на варіантах з інокуляцією клонами спостерігалось підвищення дихальної активності рослин в онтогенезі при порівнянні з контролем в розрахунку на рослину, особливо на варіантах із застосуванням клонів М-1 і М-2 (табл. 3). Аналогічна тенденція спостерігалась і при розрахунку на грам сухої речовини.

Таким чином, одержані дані свідчать, що інокуляція гороху новими клонами бульбочкових бактерій сприяє підвищенню інтенсивності фотосинтезу, темнового дихання і вмісту пігментів в рослинах гороху.

У п'ятому розділі "Вплив стійких до підвищеного вмісту мінерального азоту клонів бульбочкових бактерій на нагромадження загального азоту в надземній частині рослин гороху на протязі вегетаційного періоду" встановлено, що дослідні клони бульбочкових бактерій позитивно впливали на вміст азоту в надземній масі в період їх вегетації (табл. 4). Так, рослини, інокульовані клонами М-1, М-2, М-3 і М-4, в фазі бутонізації містили його відповідно 3,24; 3,07; 3,01 і 2,98 %. В контрольних рослинах, інокульованих штамом 250а, азоту було 2,78 %, в рослинах абсолютного контролю (без інокуляції) - 2,74 %. В фазі утворення бобів досліджувані рослини мали азоту більше по відношенню до контролю на 12,4 22,2 %. Аналогічні дані одержані нами і в умовах наступного досліду. Максимальний вміст азоту спостерігався в фазі бутонізації, рослини, інокульовані клонами містили більше азоту при порівнянні з контролем на 4,17 - 15,48 %. Кореляційний аналіз даних показує присутність значної позитивної залежності в фазі бутонізації між процесами азотфіксації і накопиченням азоту в надземній частині (r = 0,93), між вмістом хлорофілів і накопиченням азоту (r = 0,93), а також між процесом фотосинтезу і накопиченням азоту (r = 0,89).

Шостий розділ "Продуктивність рослин гороху, оброблених дослідними клонами бульбочкових бактерій, при підвищеному вмісті мінерального азоту в середовищі вирощування" включає вегетаційні дослідження по впливу клонів бактерій на інтенсивність утворення біомаси рослин гороху і на масу зерна рослин гороху та його якість. В результаті підвищення інтенсивності фізіологічних процесів в рослинах під впливом дослідних клонів збільшувалось утворення надземної маси рослин на протязі вегетаційного періоду (табл. 4). Більш інтенсивний приріст надземної маси в фазі бутонізації , порівнюючи з контролем, спостерігався в рослинах, інокульованих клонами М-4, М-5 і М-6, прибавка маси по даному показнику відповідно складала 38,3 %, 32,7 % і 40,8 %. Інтенсивність приросту біомаси надземної частини в неінокульованих рослинах на протязі вегетаційного періоду була дещо нижча відносно контрольних рослин, інокульованих штамом 250а.

Наростання кореневої системи на протязі вегетації було менш інтенсивним і в меншій мірі розрізнялось по варіантам при порівнянні з надземною масою. Отже, співвідношення сухих речовин надземної маси і коренів на протязі вегетації збільшувалось. Згідно даним вегетаційного досліду, проведеного в умовах грунтової культури, всі досліджувані клони, як і в піщаній культурі, сприяли підвищенню інтенсивності утворення біомаси в період вегетації. Більш позитивний ефект був при інокуляції клонами М-1 і М-4.

Аналіз результатів досліджень (табл. 5) дозволяє зробити висновок про позитивний вплив одержаних клонів на масу зерна рослин гороху і його якість. Встановлено, що під впливом клонів М-1, М-2 і М-4 маса зерна на рослину в середньому за два роки по відношенню до контролю, підвищувалась на 26,9 - 29,8 %, вміст білку в зерні на 7,0 - 10,9 %. Більш помітний вплив на масу зерна і вміст білку спостерігався в рослинах з інокуляцією клоном М-4, прибавка при порівнянні з контролем складала відповідно 29,8 % і 10,9 %.

Таким чином, результати досліджень дають підставу стверджувати про можливість одержання ефективних стійких до підвищеного вмісту азоту клонів бульбочкових бактерій методом хімічного мутагенезу із застосуванням етилметансульфонату, і вперше показати вплив цих клонів на фізіологічні процеси і продуктивність рослин, які культивувались в присутності мінерального азоту.

ВИСНОВКИ

1. Вперше методом хімічного мутагенезу одержані клони бульбочкових бактерій гороху, здатні утворювати ефективний бобово-ризобіальний симбіоз з рослинами гороху, вирощуваних при підвищеному вмісті мінерального азоту.

2. Одержані клони мають покращену вірулентну і азотфіксуючу активність при порівнянні з вихідним штамом 250а в присутності мінерального азоту в середовищі вирощування.

3. Клони М-1, М-4 та ізоляти даних клонів із бульбочок рослин гороху, проявляють підвищені симбіотичні властивості по відношенню до контролю на середовищах з 1,2 норми азоту по Гельрігелю. Отже, властивість клонів підвищувати інтенсивність симбіотичної азотфіксації є спадковою, що дає можливість вважати ці клони мутантами.

4. Дослідні клони бактерій підвищують інтенсивність фотосинтезу на 7,2 - 66,8 %, дихальну активність на 8,4 - 54,2 %, вміст хлорофілів "a+в" на 6,1 - 47,4 % при порівнянні з контрольними варіантами.

5. Інокуляція новими клонами бактерій сприяє зростанню інтенсивності нагромадження азоту в рослинах гороху на 3,3 - 20,4 % на протязі онтогенезу.

6. Застосування одержаних клонів бактерій при внесенні мінерального азоту збільшує наростання надземної частини на 5,5 40,0 %, масу зерна на рослину - на 22,8 - 29,8 %, вміст білку в зерні на 7,0 - 10,9 %.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ

1. Мандровская Н.М., Охрименко С.М., Старченков Е.П. Симбиотические свойства клубеньковых бактерий гороха, образующих клубеньки на фоне повышенного содержания минерального азота // Физиология и биохимия культурных растений. - 1994. - т. 26, N 3. - С. 240 - 245.

2. Мандровская Н.М., Охрименко С.М., Киризий Д.А., Старченков Е.П. Влияние инокуляции азотустойчивымы клонами клубеньковых бактерий на интенсивность фотосинтеза и азотфиксации у гороха // Физиология и биохимия культурных растений. - 1995. - т. 27, N 3. С. 169 - 173.

3. Охріменко С.М. Вплив клонів бульбочкових бактерій, стійких до мінерального азоту, на фізіологічні процеси і продуктивність рослин гороху // Физиология и биохимия культурных растений. 1998. - т. 30, N 2. - С. 138 - 143.

4. Мандровская Н.М., Охрименко С.М. Влияние минерального азота на жизнедеятельность клубеньковых бактерий в чистой культуре // Тез. докл. конф. "Биологическая фиксация молекулярного азота и азотный метаболизм бобовых растений". - Киев, 1991. - С. 44.

5. Охрименко С.М. Использование этилметансульфоната для получения клонов клубеньковых бактерий гороха, устойчивых к высоким дозам азота // Конференция молодых учсных "Актуальные проблемы физиологии растений и генетики", Киев, 26-28 мая 1992 г.: Тез. докл. - К.: ИФРГ НАН Украины, 1992. - С. 46.

6. Охріменко С.М. Вплив азотстійких клонів бульбочкових бактерій гороху на інтенсивність деяких фізіологічних процесів в рослинах гороху // Конференція молодих вчених "Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики", Київ, 9-11 жовтня 1996 р.: Тези доп. К.: ІФРГ НАН України, 1996.

АНОТАЦІЯ

Охріменко С.М. Симбіотичні властивості, фотосинтез та продуктивність рослин гороху, інокульованих стійкими до мінерального азоту клонами бульбочкових бактерій. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.12 - фізіологія рослин. - Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, Київ, 2000.

Дисертацію присвячено одержанню клонів бульбочкових бактерій гороху, вивченню їх здатності до утворення симбіозу в присутності підвищеного вмісту мінерального азоту в субстраті вирощування рослин і впливу їх на основні фізіологічні процеси рослин гороху. Вперше методом хімічного мутагенезу одержані клони бульбочкових бактерій гороху, які утворюють ефективний симбіоз з рослинами гороху при даних умовах, що дає підставу вважати ці клони бактерій стійкими до підвищеного вмісту мінерального азоту.

В умовах вегетаційних дослідів (піщана і грунтові культури) вивчено вплив одержаних клонів бульбочкових бактерій гороху на інтенсивність фізіологічних процесів в рослинах гороху сорту Солара, які вирощувались на підвищеному фоні азоту (1,2 норми по Гельрігелю) в субстраті. Показано, що передпосівна інокуляція зерна гороху дослідними клонами сприяла збільшенню інтенсивності процесів бульбочкоутворення, азотфіксації, фотосинтезу, темнового дихання, наростання біомаси, нагромадження в ній азоту і пігментів, підвищенню маси і якості зерна рослин гороху.

Ключові слова: стійкі до підвищеного вмісту мінерального азоту клони бульбочкових бактерій гороху, симбіоз, інтенсивність фізіологічних процесів.

АННОТАЦИЯ

Охрименко С.М. Симбиотические свойства, фотосинтез и продуктивность растений гороха, инокулированных устойчивыми к минерального азоту клонами клубеньковых бактерий. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.12 - физиология растений. - Институт физиологии растений и генетики НАН Украины, Киев, 2000.

Дисертация посвящена получению клонов клубеньковых бактерий гороха, изучению их способности к образованию симбиоза в присутс твии повышенного содержания минерального азота в субстрате выращивания растений и влиянию их на основные физиологические процессы растений гороха. Впервые методом химического мутагенеза получены клоны клубеньковых бактерий гороха с такими свойствами, что даст основание эти клоны бактерий считать устойчивыми к повышенному содержанию минерального азота.

Установлено, что жизнеспособность клубеньковых бактерий гороха штамма 250а на бобовом агаре зависит от дозы мутагена: при увеличении дозы происходит снижение числа выживших клеток. В результате проведенной серии опытов было отобрано 540 клонов, способных образовывать колонии в присутствии повышенной дозы азота - 50 мМ/л. После 4-5 пассажей способность к росту и образованию колоний сохранялась в 79,5 %. Предыдущая оценка вирулентности этих бактерий проведена в условиях микровегетационного опыта в субстрате. Установлено, что из опытных клонов 24 % клонов образовывали 15-40 клубеньков на растение, эти бактерии и были использованы в наших последующих экспериментах.

В условиях вегетационных опытов (песчаные и почвенные культуры) изучено влияние полученных клонов на интенсивность физиологических процессов в растениях гороха сорта Солара, которые выращивались на повышенном фоне азота (1,2 нормы по Гельригелю) в субстрате. Данные свидетельствуют, что на вариантах с полученными клонами наблюдается более интенсивное протекание процесса клубенькообразования на протяжении онтогенеза при сравнении с контрольными вариантами, где образовывались мелкие, неактивные клубеньки в небольшом количестве. Опытные клоны бактерий более активно фиксировали атмосферный азот в симбиозе с растениями гороха, В контрольных вариантах азотфиксирующая активность отсутствовала или была незначительной. Инокуляция полученными клонами бактерий увеличивала интенсивность азотфиксации и образование биомассы не только при повышенном содержании азота (1,2 нормы ), но и при низкой концентрации азота (0,2 нормы). Обнаружено, что клоны М-1, М-4 и изоляты данных клонов из клубеньков растений гороха проявляют повышенные симбиотические свойства по отношению к контролю (исходному штамму 250а), что свидетельствует о наследуемости полученных свойств и дает возможность считать эти клоны бактерий мутантами. На вариантах с инокуляцией клонами наблюдалася более высокая интенсивность фотосинтеза при расчете в мг СО₂ на растение за час и в мг СО₂ на грамм сухого вещества за час. Применение клонов приводило также к увеличению содержания пигментов на протяжении вегетации. Опытные клоны повышают дыхательную активность растений в онтогенезе при сравнении с контролем. Установлено, что инокуляция полученными клонами увеличивает содержание азота в надземной массе в период их вегетации. Максимальное содержание азота наблюдалось в фазу бутонизации. Растения, инокулированные клонами содержали больше азота при сравнении с контролем на 4,17-15,48 %. Обнаружено, что в результате повышения интенсивности физиологических процессов в растениях под влиянием клонов увеличивалось образование надземной массы и корней растений на протяжении вегетационного периода как в песчаной, так и в почвенной культурах. Наиболее положительный эффект был при инокуляции клонами М-1, М-4, М-6. Анализ результатов исследований свидетельствует о том, что применение клонов повышает массу зерна растений гороха и улучшает его качество.

Результаты исследований полученных клонов бактерий, по влиянию их на уровень симбиотического питания и интенсивность физиологических процессов в растениях показывают возможность создания штаммов клубеньковых бактерий гороха, устойчивых к повышенному содержанию минерального азота, с целью максимального использования биологического азота для выращивания экологически чистой продукции. Опытные клоны могут быть объектами в модельных системах бобовые растения - ризобии для изучения процессов устойчивости симбиоза к минеральному азоту, распознавания партнеров при образовании симбиоза и функционирования симбиотической системы.

Ключевые слова: устойчивые к повышенному содержанию минерального азота клоны клубеньковых бактерий гороха, симбиоз, интенсивность физиологических процессов.

ANNOTATION

Oкhrimenko S.M. Symbiotic properties, photosyntesis and productivity of pea plants, inoculated with clones of nodule bacteria, resistant to mineral nitrogen. - Manuscript.

The thesis for Ph. D. degree (Biology), speciality 03.00.12 plant physiology. - Institute of Plant Physiology and Genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The thesis is devoted to the reception of pea nodule bacterium clones and to investigating of their ability to create effective symbiosis in the presence of the increased content of combined nitrogen in growth medium. Pea nodule bacterium clones with properti to form effective symbiosis with pea plant under these growth conditions were obtained for the first time owing to chemical mutagene. This indicates gives reason to consider that these clones are resistant to heightened mineral nitrogen content.

The effect of the clones under investigation on the intensity of physiological processes in pea plant (Solara cv) grown against the heightened nitrogen background (1,2 of Gelrigel normal) in the substrate was studied in vegetative experiments (sand and soil cultures). It has been shown that the presowing inoculation of pea grain grown by the above mentioned clones contributted to the increase in the intensity of nodule development, nitrogen fixation, photosynthesis, dark respiration processes, biomass and nitrogen and pigment accumulation, the rise in grain weight and protein contents in it.

Key words: pea nodule bacterium clones, resistant to heightened nitrogen content, symbiosis, intensity of physiological processes.

Размещено на Allbest.ru