Мембранні механізми дії апаміну на іонні струми гладеньком’язової клітини

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ФІЗІОЛОГІЇ ім. О.О. БОГОМОЛЬЦЯ

УДК 577.352:612.73

МЕМБРАННІ МЕХАНІЗМИ ДІЇ АПАМІНУ НА ІОННІ СТРУМИ ГЛАДЕНЬКОМ'ЯЗОВОЇ КЛІТИНИ

03.00.02 - біофізика

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ПОВСТЯН ОЛЕКСАНДР ВІКТОРОВИЧ

КИЇВ - 2000

Дисертацією є рукопис

Роботу виконано у відділі нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Науковий керівник: академік НАН України, доктор медичних наук Шуба Михайло Федорович зав. відділом нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Веселовський Микола Сергійович заст. директора Міжнародного центру молекулярної фізіології при НАН України

кандидат біологічних наук Лук'янець Олена Олександрівна старший науковий співробітник відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України

Провідна установа:відділ біохімії м'язів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, м. Київ

Захист відбудеться “6” червня 2000 р. о “14⁰⁰” годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д-26.198.01 при Інституті фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за адресою: 01024, м. Київ, вул. Богомольця, 4.

Автореферат розісланий “6” травня 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук Сорокіна-Маріна З.О.

Повстян О.В. Мембранні механізми дії апаміну на іонні струми гладеньком'язової клітини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2000.

Робота присвячена фармако-біофізичному дослідженню компонентів сумарного трансмембранного іонного струму ГМК taenia coli морської свинки та з'ясуванню мембранних механізмів дії апаміну на кожний з ідентифікованих компонентів. З використанням методу фіксації потенціалу показано, що трансмембранний іонний струм цих клітин складається з вхідного Са²⁺ струму L-типу і вихідного К⁺ струму, в якому можна виділити три компоненти: потенціалзалежний струм “затриманого випрямлення” та два Са²⁺-залежні струми, що відрізняються не тільки провідністю каналів, через які вони переносяться, але й різною чутливістю до [Са²⁺]_i та потенціалу на мембрані, відношенню до блокаторів (апаміну, харібдотоксину, ТЕА) а також кінетичними характеристиками. Відносний внесок компонентів К⁺ струму до сумарного вихідного струму (на максимумі амплітуди) при 0 мВ становив 35 - 45 % для потенціалзалежного К⁺ струму “затриманого випрямлення”, 5 - 15 % для апамінчутливого I_K(Ca) та 45 - 55 % для харібдотоксинчутливого I_K(Ca). Крім того, виявлено новий апамін-активований катіонний струм з потенціалом реверсії близько 0 мВ. Вперше показано, що дія апаміну на трансмембранний іонний струм ГМК taenia coli морської свинки включає в себе два механізми: блокування К_Са малої провідності, з одного боку, та активування катіонної провідності, з іншого боку.

Ключові слова: гладеньком'язові клітини, taenia coli, апамін, харібдотоксин, ТЕА, кальційзалежні калієві струми, катіонний струм, внутрішньоклітинна концентрація кальцію.

Повстян А.В. Мембранные механизмы действия апамина на ионные токи гладкомышечной клетки. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Институт физиологии им. А.А. Богомольца НАН Украины, Киев, 2000.

Работа посвящена фармако-биофизическому исследованию компонентов суммарного трансмембранного ионного тока ГМК taenia coli морской свинки и выяснению мембранных механизмов действия апамина на каждый из идентифицированных компонентов. С использованием метода фиксации потенциала показано, что трансмембранный ионный ток этих клеток состоит из входящего Са²⁺ тока L-типа и выходящего К⁺ тока, в котором можно выделить три компонента: потенциалзависимый ток “задержанного выпрямлення” и два Са²⁺-зависимых тока, которые отличаются не только проводимостью каналов, через которые они переносятся, но й разной чувствительностью к [Са²⁺]_i и потенциалу на мембране, отношению к блокаторам (апамину, харибдотоксину, ТЭА), а также кинетическими характеристиками. Относительный вклад компонентов К⁺ тока в суммарный выходящий ток (на максимуме амплитуди) при 0 мВ составлял 35 - 45 % для потенциалзависимого К⁺ тока “задержанного выпрямлення”, 5 - 15 % для апаминчувствительного I_K(Ca) и 45 - 55 % для харибдотоксинчувствительного I_K(Ca). Кроме того, обнаружен новый апамин-активируемый катионный ток с потенциалом реверсии около 0 мВ. Впервые показано, что действие апамина на трансмембранный ионный ток ГМК taenia coli морской свинки включает в себя два механизма: блокирование К_Са малой проводимости, с одной стороны, и активирование катионной проводимости, с другой стороны.

Ключевые слова: гладкомышечные клетки, taenia coli, апамин, харибдотоксин, ТЭА, кальцийзависимые калиевые токи, катионный ток, внутриклеточная концентрация кальция.

Povstyan O.V. Membrane mechanisms of apamin action on smooth muscle cell ionic currents. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.02 - biophysics. - Bogomoletz Institute of Physiology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The dissertation is devoted to pharmacological and biophysical investigations of the components of transmembrane ionic current in single smooth muscle cells isolated from guinea pig taenia coli and to clarification the membrane mechanisms of apamin action on each of discovered components. Using patch-clamp technique it was shown that this transmembrane ionic current induced by depolarizing shifts of membrane potential from its holding level of -60 mV contained an initial L-type inward Ca²⁺ current, which in 30 - 40 ms was followed by the outward one. Outward current was shown to be carried by K⁺ ions and consisted, at least, of three components: voltage dependent and Ca²⁺-independent “delayed rectifier” (KV) current, and two Ca²⁺-dependent currents. First of them (SK) - is apaminsensitive current carried via small-conductance Ca²⁺-activated K⁺ channels and second (BK) - charybdotoxinsensitive current carried via high-conductance Ca²⁺-activated K⁺ channels.

KV current was strictly voltage-dependent. With the increase of depolarization its amplitude sharply increased. The time-dependent inactivation of this current was very slow. SK current, which carried via small conductance K⁺ channels, was highly sensitive to intracellular free Ca²⁺ concentration ([Ca²⁺]_i) - only decreasing [Ca²⁺]_i to 50 nM completely blocked this current. I-V relationship of this current had a peak in the voltage range where Ca²⁺ current was maximal. This SK current was voltage-independent and did not demonstrate any time-dependent inactivation. Also it was insensitive to the action of TEA (4 - 5 mM) but was abolished by apamin (500 nM). BK current, which carried via high conductance K⁺ channels, was both voltage- and Ca²⁺-dependent: with the increase of depolarization the amplitude of this current sharply increased (as KV current), but I-V relationship had some peak in the range of maximum of Ca²⁺ current (as SK current). BK current was less sensitive to [Ca²⁺]_i compared to the SK current. Also this current had fast inactivation - the time course of decay of BK current was found to follow closely the rate of Ca²⁺ current inactivation. It is necessary entry of calcium ions via voltage dependent Ca²⁺ channels for this current activation. When cells undergo spontaneous, localized Ca²⁺ release from intracellular storages (Ca²⁺ ``sparks''), and local Ca²⁺ concentration can reach levels sufficient to regulate Ca²⁺-dependent conductances in the plasma membrane, activation of BK channels leads to appearance of spontaneous transient outward currents (STOCs). In addition, BK current was inhibited by TEA (< 1 mM) and was completely blocked by charybdotoxin (100 nM). Contributions of these components in total outward current were 35-45%, 5-15% and 45-55% respectively for KV, SK and BK currents.

It has been found that application of apamin (500 nM) led to deflection of holding current into inward direction and increased membrane conductance. This effect was observed in normal physiological salt solution (PSS) as well as in PSS, contained Cs⁺ and Co²⁺ instead of K⁺ and Ca²⁺ respectively. At the same time substitution of Na⁺ in PSS by N-methyl-d-glucamine prevented this effect. Effect of apamin reappeared upon Na⁺ returning into PSS. This apamin-induced current has reversal potential at 0 mV. The obtained results suggested that apamin activate some cationic current and Na⁺ is a main ion, which entry into the cell at -60 mV

For the first time it has been shown that action of apamin on transmembrane ionic current of guinea pig taenia coli smooth muscle cells include two mechanisms: blocking of SK channels - on one hand, and activation of cationic conductance - on the other hand. In the range of smooth muscle resting potential both these effects lead to the increasing of inward current and so promote the development of depolarization. Activation of cationic conductance plays important role in the generation of threshold depolarization for starting action potential in smooth muscle cells. Blocking of SK channels, which play main role in the development of slow action potential afterhyperpolarization, will promote the increase in frequency of action potentials generation.

Key words: smooth muscle cells, taenia coli, apamin, charybdotoxin, ТEА, calcium-dependent potassium currents, cationic current, intracellular calcium concentration.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Токсини з отрут різноманітних тварин знайшли широке застосування в біохімічних та фізіолого-біофізичних дослідженнях. На даний час апамін (поліпептид з отрути медоносної бджоли) є одним із найуживаніших токсинів, який, поруч з харібдотоксином (поліпептидом з отрути скорпіона), використовується для високоспецифічного блокування кальційзалежних калієвих каналів (К_Са). Також виявлена висока ефективність цих токсинів і щодо їх дії на нервово-м'язову передачу. Зацікавленість до вивчення дії апаміну на іонні провідності клітинних мембран виникла після того, як у 1978 р. в лабораторії Шуби М.Ф. вперше було показано, що цей токсин дуже ефективно і специфічно блокує один з типів синаптичної передачі в периферичних синапсах (Владимирова, Шуба 1978, Байдан та ін. 1978, Shuba, Vladimirova 1980, 1981). На основі цих досліджень було зроблено припущення, що апамін є специфічним блокатором неадренергічного гальмування, а медіатором цього гальмування є аденозин-5'-трифосфат (АТФ).

Згодом у лабораторії Барнстока не тільки підтвердили дані про блокування апаміном гальмування в гладеньком'язових клітинах (ГМК), але й поширили уявлення про механізм дії цього токсину (Banks et al 1979). В цій роботі були наведені дані про те, що апамін діє не на пізнавальну частину хеморецептора, а на калієві канали, що активуються за рахунок підвищення концентрації внутрішньоклітинного кальцію. Подальші дослідження, проведені в інших лабораторіях, підтримали цю концепцію (напр., Blatz, Magleby 1986, Capiod, Ogden 1989), і нині широке розповсюдження отримала точка зору, згідно якої дія апаміну пов'язана виключно з блокуванням К_Са малої провідності плазматичної мембрани. Однак, необхідно відзначити, що прямі і переконливі докази на користь даної концепції щодо мембрани ГМК досі відсутні. Лише останнім часом з'явилося декілька робіт на вісцеральних ГМК (Gagov et al 1993, Повстян та ін. 1997, Vogalis, Goyal 1997, Koh et al 1997), в яких за допомогою методу “patch-clamp” показано наявність апамінчутливого компонента Са²⁺-залежного К⁺ струму (I_K(Ca)). Тим часом, детальне вивчення мембранних механізмів дії апаміну на ГМК і, зокрема, на властивості апамінчутливого компонента I_K(Ca), потребує подальших досліджень. Аналогічні дослідження допомогли б більш глибоко з'ясувати механізми збудливості, її регуляцію, а також механізми синаптичних процесів, в яких беруть участь апамінчутливі канали.

Хоча taenia coli морської свинки вже давно і широко використовується як об'єкт біофізичного дослідження поодиноких ГМК кишкового тракту (Рекалов та ін. 1984, Ганіткевич та ін. 1985, Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989, Hu et al 1989), питання про типи К_Са мембрани цих клітин, до цього часу остаточно не вирішене. Тому, без сумніву, становить науковий інтерес розділення загального трансмембранного іонного струму на компоненти, а також порівняльна характеристика харібдотоксин- та апамінчутливого компонентів I_K(Ca) і їх регуляція іонами Са²⁺.

Дослідження проводились відповідно до планів наукової роботи відділу нервово-м'язової фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України за темами “Механізми метаболічної регуляції іонних каналів та скорочення гладеньком'язових клітин” та “З'ясування молекулярних механізмів специфічних змін провідності клітинних мембран при виникненні основних нервових процесів”.

Мета і завдання дослідження. Враховуючи вищевикладене, метою даної роботи було дослідження мембранних механізмів дії апаміну на ГМК. Для досягнення цієї мети були поставлені наступні задачі:

Розробити методику виділення функціонально повноцінних ізольованих ГМК taenia coli морської свинки і застосувати до них метод фіксації потенціалу “patch-clamp".

Дослідити амплітудно-кінетичні характеристики інтегрального трансмембранного іонного струму мембрани ГМК taenia coli морської свинки, провести його розділення на компоненти і дослідити біофізичні та фармакологічні властивості виявлених компонентів струму, а також вплив на них апаміну.

Вивчити дію апаміну та харібдотоксину на трансмембранний іонний струм, ідентифікувати апамін- та харібдотоксинчутливі компоненти I_К(Са), провести порівняльну амплітудно-фармакологічну характеристику їх властивостей.

З'ясувати роль поза- і внутрішньоклітинних іонів Са²⁺ в регуляції виявлених компонентів I_К(Са).

Протестувати на чутливість до апаміну ГМК артерій.

Наукова новизна одержаних результатів. Методом фіксації потенціалу “patch-clamp” в режимі внутрішньоклітинного діалізу ГМК taenia coli морської свинки досліджено мембранні механізми дії апаміну. Вперше виявлена здатність апаміну активувати катіонну провідність мембрани. Вперше для даних ГМК методом “patch-clamp” виділено апамінчутливий компонент I_К(Са), досліджено його фармако-біофізичні характеристики та механізми регуляції іонами Са²⁺. Проведено порівняльну характеристику апамін- та харібдотоксинчутливого компонентів I_К(Са).

Отримані результати значно доповнюють сучасні уявлення щодо механізмів дії апаміну на вісцеральні ГМК. Показано, що дія апаміну включає в себе два механізми: блокування К_Са малої провідності, з одного боку, та активування катіонної провідності мембрани, з іншого боку. Причому, в межах потенціалу спокою ГМК, обидва ці ефекти спрямовані у напрямку збільшення вхідного струму, тобто сприяють розвитку деполяризації клітини та перешкоджають розвитку реполяризації і слідової гіперполяризації потенціалу дії.

Теоретичне та практичне значення роботи. Отримані результати перш за все мають фундаментальний інтерес, оскільки одержано принципово нові дані щодо механізмів дії апаміну на вісцеральні ГМК, а саме, виявлена здатність апаміну активувати катіонну провідність мембрани. Ідентифікація іонних провідностей, що беруть участь у переносі загального трансмембранного струму, їх кількісний аналіз та деякі, досліджені в даній дисертаційній роботі, аспекти регуляції калієвих каналів дозволяють істотно доповнити сучасні уявлення про функціонування ГМК, зробити ще один крок вперед для розшифрування механізмів електричної збудливості та її регуляції, а також механізмів, що лежать в основі спряження процесів збудження поверхневої мембрани і скорочення ГМК.

Подальші дослідження чутливості кожного з ідентифікованих компонентів трансмембранного іонного струму до фармакологічних речовин можуть привести до виявлення лікарських препаратів, що вибірково впливають на певні функції гладеньких м'язів. Тобто, результати досліджень представляють інтерес для біофізиків, фізіологів та фармакологів і можуть бути використані для дослідження механізмів дії та розробки нових фармакологічних препаратів, що використовуються для лікування захворювань шлунково-кишкового тракту (ШКТ).

Особистий внесок. Автором особисто було виконано всі електрофізіологічні дослідження інтегрального трансмембранного іонного струму та його компонентів, а також розроблено методику ферментативно-механічної ізоляції повноцінних поодиноких міоцитів taenia coli морської свинки, проведено обробку експериментального матеріалу, аналіз і узагальнення результатів досліджень. Вперше здобувачем показано здатність апаміну до активування катіонної провідності мембрани і запропоновано новий механізм дії апаміну на вісцеральні ГМК, який окрім блокування К_Са малої провідності включає в себе активування вищезгаданої катіонної провідності.

Дослідження активності поодиноких Са²⁺-залежних калієвих каналів проводилось спільно з к.б.н. Зимою О.В.

Тензометричні дослідження проводились спільно з асп. Цвіловським В.В. мембрана свинка біофізичний фармакологічний

У розробці концепцій роботи і обговоренні її результатів, а також в формуванні висновків брали активну участь інші співавтори публікацій.

Апробація роботи. Основні положення роботи доповідались і обговорювались на наукових семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (1995 - 1998), на 2-му з'їзді Українського Біофізичного товариства (Харків, 1998), на конференції “New Approaches to Pharmacotherapy for Hepatic and Gastrointestinal Ulcerative and Inflammatory Disorders" шлунково-кишкового сектору Міжнародного Фармакологічного товариства (Сперлонга, Італія, 1996), на спільному засіданні Фізіологічних товариств Угорщини та Румунії (Сегед - Тімішоара, 1996), на 40-му, 41-му, 43-му щорічних з'їздах Біофізичного товариства США (Балтімор, 1996; Новий Орлеан, 1997, Балтімор, 1999), на Міжнародному семінарі “Intracellular Signalling" (Київ, 1997), на засіданні Сектора нейрофізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України (червень 1999).

Публікації. Матеріали дисертації опубліковані в шести наукових статтях і шести тезах доповідей в матеріалах наукових зібрань.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису методики досліджень, результатів досліджень, їх обговорення, висновків та списку використаних джерел із 273 найменувань. Робота викладена на 138 сторінках (без списку літератури), ілюстрована 27 рисунками та 3 таблицями.

МЕТОДИКА ДОСЛІДЖЕНЬ

Основну частину досліджень було проведено на свіжоізольованих поодиноких ГМК поздовжнього м'язового шару сліпої кишки (taenia coli) морської свинки. Для виділення клітин шматочки taenia coli поміщали до 2 мл номінально безкальцієвого розчину, що містив 3 мг колагенази (тип IА), 2 мг бичачого сироваткового альбуміну та 2 мг соєвого інгібітора трипсину на 25 - 35 хв. при 34 ^оС. Оброблені таким чином шматочки taenia coli відмивалися від ферменту і багаторазово пропускалися через пастерівську піпетку в номінально безкальцієвому розчині. Частина експериментів була проведена на судинних ГМК (мезентеріальні артерії морської свинки та щура). Процедура виділення цих ГМК суттєво не відрізнялась від згаданої для taenia coli.

В основній частині експериментів для дослідження іонних струмів ізольованих ГМК застосовувалась класична “whole-cell” конфігурація методу “patch-clamp” (Hamill et al. 1981). Мікропіпетки виготовляли з м'якого молібденового скла, після заповнення розчином вони мали опір 2 - 4 МОм. Вихідний зовнішній розчин містив (мМ): NaCl 120.4; КCl 5.9; CaCl₂ 2.5; MgCl₂ 1.2; d-глюкоза 11,5; HEPES 5; pH 7.4 (NaOH). Піпетковий розчин мав такий склад (мМ): КCl 135; MgSO₄ 1; Na₂ATФ 2; ЕГТА 0.3; HEPES 10; pH 7.3 (КOH). Внутрішньоклітинна концентрація вільного Са²⁺ ([Ca²⁺]_i) при використанні останнього розчину була близькою до фізіологічної і становила приблизно 100 нМ. Дане значення оцінювалося таким чином: концентрація вільного Са²⁺ в номінально безкальцієвому розчині визначалася за допомогою флуоресцентного спектрофотометра “HITACHI” F-4000 з використанням барвника fura-2; для розрахунку істинного значення [Ca²⁺]_i в розчині застосовували програму “EQCAL”. При дослідженні Са²⁺ струму (I_Ca) іони К⁺ в розчинах еквімолярно замінювались на Cs⁺, також до зовнішнього розчину додавали 5 мМ тетраетиламонію (ТЕА). При дослідженні катіонного струму замість К⁺ та Са²⁺ використовувались відповідно Cs⁺ та Со²⁺. В частині дослідів було проведено реєстрацію активності поодиноких калієвих каналів в конфігураціях “cell-attached”, “inside-out” та “outside-out”.

Реєстрація іонних струмів проводилась за допомогою підсилювача “РОК-3М”. Сигнал з виходу перетворювача струм - напруга надходив через фільтр низьких частот (частота зрізу 1 кГц) на аналого-цифровий перетворювач і далі в комп'ютер ІВМ РС/АТ. Дані аналізувались за допомогою програм “Screen”, “DataSel”, “pCLAMP 5.5” та “Origin 5.0”.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛIДЖЕНЬ

Загальна характеристика трансмембранного іонного струму ГМК taenia coli морської свинки. В переважній більшості досліджених клітин в нормальних розчинах у відповідь на ступінчасті деполяризуючі зміщення мембранного потенціалу від -60 мВ до рівнів більш позитивних, ніж -40 мВ на початку імпульсу виникав короткочасний вхідний I_Ca, який через декілька десятків мілісекунд переходив у вихідний струм великої амплітуди, основними носіями якого є іони К⁺. За кінетичними властивостями у складі вихідного струму можна виділити, принаймні, два компоненти - початковий, зі швидкою інактивацією та наступний стаціонарний. Оскільки вхід іонів Са²⁺ в клітину є ключовим моментом для підвищення [Ca²⁺]_i і активування кальційзалежних іонних провідностей (однієї з яких є і апамінчутлива К⁺ провідність), в першій частині роботи нами було вивчено вхідний струм і можливість його модуляції апаміном. Отримані результати підтвердили проведені раніше дослідження (Ганіткевич та ін. 1985, Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989, Зима та ін. 1994), згідно яким в мембрані ГМК taenia coli морської свинки I_Ca переноситься лише через високопорогові потенціалзалежні Са²⁺ канали L-типу. Виявилося, що апамін не мав помітного впливу на цей I_Ca (рис. 1). Виходячи з цього, в наступних експериментах дію апаміну на вихідний К⁺ струм вивчали в нормальному зовнішньому фізіологічному розчині. Оскільки допускається, що “мішенню" для дії апаміну є К_Са, основну увагу в цих дослідах було приділено вивченню фармако-біофізичних характеристик I_K(Ca).

Дія селективних блокаторів К_Са на вихідний калієвий струм. У наступних експериментах була зроблена спроба розділити I_K(Ca) на компоненти. З цією метою використовувались харібдотоксин і апамін - селективні блокатори К_Са великої і малої провідності відповідно.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Дія апаміну (500 нМ) на ICa.

1 - ICa в контролі при ступінчатій деполяризації мембрани від -60 до +10 мВ; 2 - при додаванні апаміну; 3 - блокування ICa іонами Со2+.

Рис 2. Дія апаміну і харібдотоксину на трансмембранний іонний струм.

А, 1 - контроль; 2 - дія харібдотоксину; 3 - додаткова дія апаміну на фоні харібдотоксину. Б, 1 - контроль; 2 - дія апаміну; 3 - додаткова дія харібдотоксину на фоні апаміну. Струми викликали ступінчатою деполяризацією мембрани від -60 до +10 мВ.

Аплікація харібдотоксину (100 нМ) спричиняла значне зменшення вихідного струму, особливо його складової, що інактивується та істотне пригнічення осциляцій (рис. 2, А). Апамін (500 нМ) на фоні дії харібдотоксину викликав додаткове, але незначне зменшення вихідного струму. На рис. 2, Б представлена дія апаміну (500 нМ) на вихідний струм і наступна аплікація харібдотоксину (100 нМ) в присутності апаміну. Видно, що апамін заблокував вельми незначну частину вихідного струму, осциляції та кінетика струму не змінювалися, ефект же харібдотоксину в присутності апаміну знову таки був досить великим, повністю блокувалася початкова складова, що інактивується. Ці дані дозволяють говорити про те, що харібдотоксин і апамін діють на різні типи каналів не залежно один від одного, і внесок харібдотоксинчутливих каналів (тобто К_Са великої провідності) в сумарний вихідний струм суттєво більший, ніж внесок апамінчутливих каналів (тобто К_Са малої провідності).

Крім того, нами було виявлено, що на відміну від харібдотоксину, апамін, окрім блокування вихідного К⁺ струму, в більшості досліджених клітин спричиняв також зміщення холдінгового струму (трансмембранного іонного струму що протікає при потенціалі, що підтримується) у вхідному напрямку (рис. 2). Величина такого зміщення холдінгового струму варіювала у різних клітин від десяти до ста пікоампер. Подібний феномен в дії апаміну досі в науковій літературі не згадувався, тому ми провели серію експериментів, спрямованих на його вивчення. Результати цих досліджень наведені нижче.

На рис. 3 представлені усереднені (за даними, отриманими на 9-ти клітинах) вольт-амперні характеристики (ВАХ) дії 100 нМ харібдотоксину на трансмембранний іонний струм. Видно, що харібдотоксинчутливий струм виявляв потенціалзалежні властивості: зі збільшенням рівня деполяризації спостерігалося збільшення його амплітуди, незважаючи на зменшення входу Са²⁺ в ГМК при потенціалах +20…+40 мВ. Виразний перегин на його ВАХ свідчить про Са²⁺-залежність цього струму. Внесок харібдотоксинчутливого компонента в загальний вихідний струм був більшим на максимумі останнього, аніж в кінці деполяризуючої сходинки тривалістю 300 мс. Це, очевидно, пов'язане з чутливістю струму до зниження [Ca²⁺]_i наприкінці деполяризуючого імпульсу. З тієї ж причини перегин на ВАХ, побудованій на 300-й мс деполяризуючого імпульсу, відсутній і чітко помітна тенденція до зменшення внеску цього I_К(Ca) в інтегральний трансмембранний іонний струм.

Усереднені (за даними, отриманими на 14-ти клітинах) ВАХ дії 500 нМ апаміну на трансмембранний іонний струм представлені на рис. 4. При побудові цих ВАХ для аналізу бралися лише клітини з мінімальним ефектом апаміну на холдінговий струм. По характеру ВАХ цього I_K(Ca) можна зробити висновок, що на відміну від харібдотоксинчутливого, апамінчутливий струм майже не виявляв потенціалзалежність. І на максимумі струму, і наприкінці деполяризуючого імпульсу тривалістю 300 мс, внесок апамінчутливого компонента до загального вихідного струму був приблизно однаковий.

Рис. 3. Усереднені ВАХ вихідного струму в контролі (?), на фоні дії харібдотоксину (?) і “чистого” харібдотоксин-чутливого IK(Ca) (?).

На рис. 3 та 4 ВАХ були побудовані на максимумі вихідного струму, значення якого в різних клітинах при +50 мВ нормалізувалися до 1,0.

Дія ТЕА на I_K(Ca). В наступній частині роботи ми досліджували дію ТЕА - відомого неселективного блокатора калієвих каналів - на виявлені компоненти I_K(Ca). Цей блокатор в концентрації 4 мМ інгібував вихідний струм більш, ніж на 50%. Апамін на фоні дії такої концентрації ТЕА спричиняв подальше зменшення вихідного струму (рис. 5), причому відсоток блокування становив ті ж 10 - 15%, що і в контролі (рис. 2). У той же час харібдотоксин, при додаванні його до розчину з ТЕА у концентраціях 4 і навіть 0.8 мМ, не викликав додаткового пригнічення струму.

Залежність блокуючої дії харібдотоксину і апаміну від [Са²⁺]_i. При встановленні [Са²⁺]_i на рівні 50 нМ (для цієї мети використовувався Са²⁺ - ЕГТА буфер), апамін не викликав звичайного зменшення вихідного струму. Певно, дана концентрація Са²⁺ всередині клітини була недостатньою для активації апамінчутливих К_Са (рис. 6). У той же час апамін в присутності Со²⁺ в зовнішньому розчині (коли вхід Са²⁺ до клітини через потенціалзалежні Са²⁺ канали повністю пригнічений) частково блокував вихідний К⁺ струм (рис. 7, А), у той час як харібдотоксин за цих умов не викликав достовірних змін амплітуди вихідного струму (рис. 7, Б).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 5. Дія ТЕА (4 мМ) та апаміну (500 нМ) на вихід-ний струм. 1 - контроль; 2 - на 5-й хв. дії ТЕА; 3 - на 5-й хв. наступного додавання апаміну.

На рис. 5 - 7 струми викликали ступінчатою деполяризацією мембрани від -60 до +10 мВ.

Рис. 6. Відсутність блокую-чої дії апаміну на вихідний струм при [Ca2+]i=50 нМ.

1 - струм в контролі;

2 - струм в присутності 500 нМ апаміну.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 7. Дія апаміну (500 нМ) та харібдотоксину (100 нМ) на вихідний струм при блокуванні ICa.

A, Б, 1 - контроль; 2 - заміна в зовнішньому розчині іонів Са2+ на Со2+; 3 - наступне додавання апаміну (для А) і харібдотоксину (для Б).

При аплікації розчину, що містив іони Со²⁺ замість Са²⁺, спостерігалося значне пригнічення вихідного струму, що свідчить на користь наявності в ньому досить великого Ca²⁺-залежного компонента К⁺ струму. За цих умов вихідний струм переносився в основному лише через калієві канали “затриманого випрямлення”, які є нечутливими до іонів Са²⁺.

Внесок різних компонентів іонного струму в сумарний трансмембранний струм. Ми також спробували розділити інтегральний трансмембранний іонний струм ГМК на компоненти шляхом віднімання різних складових з сумарного струму і дати кількісну оцінку внеску кожного з компонентів в інтегральний струм при 0 мВ (рис. 8). На початку експерименту реєструвався сумарний трансмембранний іонний струм (реєстрація 1), потім за допомогою апаміну усувався I_K(Ca), що переноситься через канали малої провідності (реєстрація 2), після чого зовнішній розчин замінювали гіперкалієвим розчином, концентрація іонів К⁺ в якому дорівнювала внутрішньоклітинній. За цих умов E_K, E_Cl, а також E_кат були рівними 0 мВ, тому деполяризаційне зміщення мембранного потенціалу до цього рівня активувало лише вхідний кальцієвий струм (реєстрація 3). Са²⁺-незалежний К⁺ струм виділяли аплікацією розчину з Со²⁺ (реєстрація 4). Відніманням реєстрацій 3 та 4 з реєстрації 2 одержували “чистий” I_K(Ca), що переноситься через канали великої провідності і блокується харібдотоксином (5). Кінетика спаду цього струму практично цілком співпадає з кінетикою інактивації I_Ca. “Чистий” апамінчутливий I_K(Ca), що переноситься через канали малої провідності можна отримати відніманням реєстрації 2 з реєстрації 1.

В багатьох клітинах при деполяризуючих зміщеннях мембранного потенціалу спостерігалося виникнення спонтанних вихідних струмів (СВС). СВС повністю блокувалися харібдотоксином, а також ТЕА. Аплікація кофеїну супроводжувалась появою швидкого фазного вихідного струму, після якого СВС пригнічувались.

Активування апаміном катіонної провідності плазматичної мембрани ГМК. Заключна частина досліджень присвячена вивченню вперше виявленого нами в ГМК taenia coli морської свинки апамін-індукованого зміщення холдінгового струму у вхідному напрямі. Цей ефект можна пояснити як блокуванням струму вихідного напрямку, так і активуванням струму вхідного напрямку. Вищеописане блокування апаміном вихідного I_K(Ca) не викликає сумніву. Проте в даному випадку цей механізм не спрацьовує, оскільки зміщення холдінгового струму завжди супроводжувалося збільшенням іонної провідності мембрани (рис. 9), а не зменшенням, чого слід було б очікувати у випадку блокування К_Са низької провідності. Також аплікація апаміну завжди супроводжувалась збільшенням шуму, що є ще одним доказом на користь активування, а не блокування додаткової провідності.

Рис. 8. Компоненти трансмембранного іонного струму в мембрані ГМК taenia coli морської свинки. Всі пояснення до рисунка в тексті.

Під час проведення експериментів нами було виявлено, що ключовим іоном, що відповідає за такий ефект апаміну, може бути Na⁺. Його видалення із зовнішнього розчину (в цих і наступних дослідах для еквімолярної заміни іонів Na⁺ в нормальному фізіологічному розчині використовувався мембранонепроникний N-метіл-D-глюкамін) на фоні дії апаміну супроводжувалось поступовим поверненням холдінгового струму до початкової величини, а в безнатрієвому розчині токсин не виявляв на цей струм ніякого помітного впливу.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 9. Збільшення провідності клітинної мембрани під дією апаміну. Показано реєстрацію холдінгового струму при -60 мВ з тест-імпульсами до -80 мВ.

Нижче представлені результати експериментів дії апаміну на трансмембранний іонний струм в нормальному та безнатрієвому розчинах. Рис. 10, А, Б ілюструє досить значне (близько 100 пА) і зворотнє зміщення холдінгового струму у вхідному напрямку у відповідь на додавання апаміну до нормального фізіологічного розчину. Видалення іонів Na⁺ із зовнішнього розчину в присутності апаміну призводило до відновлення вихідної величини холдінгового струму (рис. 10, В). Нами було виявлено, що безнатрієвий розчин спричиняв значне зменшення амплітуди вихідного компонента трансмембранного іонного струму, викликаного деполяризацією. Апамін за цих умов викликав звичайне додаткове зменшення вихідного струму, пов'язане з блокуванням низькопровідних К_Са (рис. 10, Г). Холдінговий струм при цьому не змінювався. З цих експериментів можна зробити висновок, що дія апаміну на трансмембранний іонний струм ГМК taenia coli морської свинки, окрім блокування К_Са низької провідності, проявляється також і в активуванні Na⁺ або Na⁺-залежної провідності, яка в області потенціалу спокою ГМК має вхідний напрямок. Для уточнення цього висновку були проведені експерименти із використанням розчинів, що містять Сs⁺ та Со²⁺ замість К⁺ і Са²⁺ відповідно. За таких умов через мембрану протікав стаціонарний струм, потенціал реверсії якого знаходився в діапазоні потенціалів -5 … 0 мВ (рис. 11). Апамін викликав збільшення цього струму як у вхідному напрямку (до потенціалу реверсії), так і у вихідному (після потенціалу реверсії). Ці дані дозволяють припустити, що каналом, відповідальним за таку дію апаміну, може бути неселективний катіонний канал, аналогічний рецепторкерованому катіонному каналу (Carl et al 1996, Zholos 1999, Farrugia 1999), який переносить всі одновалентні катіони (включаючи Na⁺, K⁺, Cs⁺).

А, Б, динаміка дії апаміну на холдінговий струм: 1 - контроль, 2 - після додавання апаміну; В, усунення апамін-індукованого збільшення холдінгового струму безнатрієвим розчином: 1 - контроль, 2 - дія апаміну, 3 - струм після вилучення іонів Na⁺ з розчину в присутності апаміну; Г, запобігання безнатрієвим розчином апамін-індукованого збільшення холдінгового струму: 1 - контроль, 2 - струм в безнатрієвому розчині, 3 - струм після додавання апаміну до безнатрієвого розчину. Всі струми були викликані зміщенням мембранного потенціалу від -60 до +10 мВ.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 10. Механізм дії апаміну (500 нМ) на холдінговий струм.

Рис. 11. ВАХ дії апаміну (500 нМ) на трансмембранний іонний струм в безкалієвому та безкальцієвому розчині.

n - контроль;

l - після аплікації апаміну.

За відсутністю іонів K⁺ і Ca²⁺ були повторені описані вище експерименти по вивченню дії апаміну на трансмембранний іонний струм в безнатрієвому розчині. Виявлено, що всі ефекти апаміну, які спостерігалися в нормальному фізіологічному розчині збереглися: видалення Na⁺ із зовнішнього розчину запобігало активуванню струму апаміном, яке, однак, спостерігалося відразу після повернення іонів Na⁺ до цього розчину. І, нарешті, було виявлено, що в присутності ТЕА ефект активування катіонного струму апаміном був повністю відсутній (рис. 1). В присутності ТЕА (рис. 5) апамін спричиняв лише блокування I_K(Ca). Отже, цей неспецифічний блокатор може бути використаний як фармакологічний інструмент для розділення ефектів блокування апаміном К_Са малої провідності та активування катіонної провідності мембрани вісцеральних ГМК.

На відміну від ГМК ШКТ, жодна з іонних провідностей плазматичної мембрани ГМК мезентеріальної артерії щурів та морських свинок не виявила чутливості до дії апаміну (Зима та ін. 1996, Хархун та ін. 2000).

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ

Дана робота присвячена фармако-біофізичному дослідженню компонентів сумарного трансмембранного іонного струму ГМК поздовжнього шару сліпої кишки (taenia coli) морської свинки та вивченню мембранних механізмів дії на кожний з них апаміну - поліпептидного нейротоксину з отрути медоносної бджоли.

Ця робота є логічним продовженням досліджень, виконаних у відділі нервово-м'язової фізіології в кінці 70-х - на початку 80-х років цього сторіччя (Владимирова, Шуба 1978, Байдан та ін. 1978, Shuba, Vladimirova 1980, 1981), в яких вперше було показано здатність апаміну специфічно блокувати неадренергічне нехолінергічне (НАНХ) синаптичне гальмування гладеньких м'язів ШКТ. Відомо (Владимирова, Шуба 1978, Владимирова, Шуба 1984, Шуба та ін. 1998), що гальмуючі синаптичні потенціали (ГСП) в усіх відділах ШКТ складаються з двох компонентів: апамінчутливого швидкого та харібдотоксинчутливого повільного. Більш того, в цих же роботах було показано, що для ГМК кільцевого та поздовжнього шарів сліпої кишки морської свинки при дії апаміну характерна навіть поява НАНХ збуджуючих синаптичних потенціалів. Що ж торкається механізму блокування апаміном ГСП, то допускається, що цей токсин блокує К_Са малої провідності, які і беруть участь в генерації ГСП. Однак, до останнього часу були відсутні прямі експериментальні дані про наявність в плазматичній мембрані ГМК ШКТ згаданих К_Са і тим більше не було даних і щодо блокування цих каналів апаміном.

У поданій роботі використано новий, у порівнянні зі згаданими роботами, методичний підхід (метод фіксації потенціалу “patch-clamp”), що дозволив розділити сумарний трансмембранний іонний струм на компоненти і вперше детально дослідити дію на кожний з них апаміну.

Результати наших досліджень показали, що при ступінчастій деполяризації основними носіями трансмембранного струму ГМК taenia coli морської свинки є іони Са²⁺ та К⁺. Причому, за нормальних умов, іони Са²⁺ переносять струм вхідного напряму через потенціалкеровані кальцієві канали L-типу, а іони К⁺ - струм вихідного напряму. В переносі останнього беруть участь принаймні три типи каналів: К⁺ канали “затриманого випрямлення”, що не залежать від Са²⁺ і два типи К_Са.

На підставі кінетичних характеристик, потенціал- і Ca²⁺ - чутливості, а також фармакологічних властивостей ідентифіковано два компоненти I_K(Ca): харібдотоксинчутливий та апамінчутливий, перший з яких переноситься через К_Са великої провідності, а другий - через К_Са малої провідності, причому внесок перших в загальний трансмембранний іонний струм істотно більший. Виявлено, що близько 90% вихідного струму переноситься через К⁺ канали “затриманого випрямлення” і харібдотоксинчутливі К_Са великої провідності. Потрібно зазначити, що результати про процентний внесок кожного з вищенаведених компонентів до вихідного струму, отримані за допомогою фармакологічного розділення, співпадають з результатами, отриманими за допомогою віднімання окремих компонентів вихідного струму. Що стосується К_Са малої провідності, то виявилося, що їхній внесок до вихідного струму вельми незначний (щонайбільше він складав 10 - 15%).

Апамінчутливий I_K(Ca) не демонстрував часзалежної інактивації, також він не виявляв потенціалзалежних властивостей. На відміну від апамінчутливого, харібдотоксинчутливий I_K(Ca) мав швидку кінетику інактивації - його спад практично співпадав з кінетикою інактивації Ca²⁺ струму. Також цей струм був потенціалзалежним - із збільшенням рівня деполяризації спостерігалося збільшення його амплітуди.

Крім того, що К_Са великої і малої провідності мають високоспецифічні блокатори - харібдотоксин та апамін відповідно, вони також значно відрізняються за чутливістю до ТЕА - неселективного блокатора К⁺ каналів. Якщо перші з означених каналів повністю блокуються ТЕА у відносно малих концентраціях (в наших експериментах вона становила всього 0,8 мМ), то апамінчутливі канали виявилися нечутливими до аплікації цього блокатора навіть в концентрації 4 - 5 мМ. Більш того, було показано (Blatz, Magleby 1986), що ТЕА не виявляє впливу на апамінчутливі К_Са навіть в ще більших концентраціях (20 - 25 мМ).

Важливою характеристикою I_K(Ca) є їхня чутливість до [Са²⁺]_i. Встановлено (Becker et al 1989, Ganitkevich, Isenberg 1991), що за фізіологічних умов [Са²⁺]_i в ГМК варіює у межах 100 - 120 нМ, а при деполяризаційних зміщеннях мембранного потенціалу до 0 мВ різко зростає, сягаючи максимуму порядку 1000 нМ, після чого спадає до стаціонарного рівня 200 - 300 нМ, на якому тримається протягом декількох секунд аж до закінчення ступінчастої деполяризації. В наших експериментах було виявлено, що апамінчутливий I_K(Са) в досліджуваних клітинах був дуже чутливим до змін [Ca²⁺]_і. Зниження [Ca²⁺]_і від 100 до 50 нМ призводило до майже повного пригнічення цього струму. Недавно аналогічні дані були отримані в експериментах на тонкому кишечникові миші (Vogalis, Goyal 1997). В цій же роботі була визначена порогова [Са²⁺]_i, необхідна для активації К_Са малої провідності. Вона становила 85 нМ. Було показано, що з підвищенням [Са²⁺]_i ймовірність знаходження цього каналу у відкритому стані зростає із ЕС₅₀ = 1.5 мкМ. К_Са великої провідності активуються при дещо більших [Са²⁺]_i (Barret et al 1982, Blatz, Magleby 1986). Проведені нами досліди із використанням Со²⁺ можуть служити додатковим тому підтвердженням.

Отримані нами дані свідчать про те, що в ГМК taenia coli морської свинки окрім викликаних вихідних струмів також можуть виникати і СВС.

Великий інтерес являє питання про джерело Са²⁺, необхідного для активації кожного із згаданих компонентів I_K(Ca). До цього часу остаточна відповідь на це запитання не дана. В наших, а також раніше проведених (Жолос та ін. 1986, Yamamoto et al 1989, Cole, Sanders 1989) дослідженнях було показано, що амплітуда вихідного К⁺ струму значно залежить від амплітуди вхідного I_Ca. Нами виявлено, що для активації К_Са великої провідності в ГМК taenia coli морської свинки обов'язково необхідний вхід Са²⁺ до клітини через потенціалзалежні Са²⁺ канали L-типу. В той же час, для активування К_Са малої провідності, очевидно, необхідно підвищення [Са²⁺]_i вище деякого порогового рівня (близько 50 - 85 нМ) незалежно від джерела надходження Са²⁺.

Спонтанні короткочасні потоки іонів Ca²⁺ із саркоплазматичного ретикулуму (СР) - Са²⁺ спарки - також можуть викликати активацію К_Са великої провідності, але останні в цьому випадку будуть проявляти свою активність у вигляді СВС (Benham, Bolton 1986, Gordienko et al 1998). Наші дані підтверджують припущення (Benham, Bolton 1986, Ганіткевич, Шуба 1988), що СВС - це вторинний ефект періодичного вивільнення Ca²⁺ із кофеїнчутливого СР. Це вивільнення Са²⁺ також викликає і одночасну активацію харібдотоксинчутливих К_Са великої провідності.

Підсумовуючи вищевикладені дані, можна зробити висновок, що в ГМК taenia coli морської свинки є два типи I_K(Ca), що відрізняються не тільки провідністю каналів, через які ці струми переносяться, але й різною чутливістю до [Са²⁺]_i та потенціалу на мембрані, відношенню до блокаторів (апаміну, харібдотоксину, ТЕА) а також кінетичними характеристиками.

І, нарешті, в заключній частині роботи нами була показана здатність апаміну активувати катіонну провідність мембрани. Внесок цієї провідності в інтегральний трансмембранний іонний струм значно менший у порівнянні з I_Ca або I_K, однак, в межах потенціалу спокою ГМК активування катіонних каналів може відігравати ключову роль в процесах деполяризації клітинної мембрани, активуванні потенціалзалежних Са²⁺ каналів і, отже, збудливості ГМК.

Питання щодо функціональної ролі виявлених іонних струмів остаточно не вирішене. Що стосується Са²⁺ каналів L-типу, то вони є основним шляхом входу іонів Са²⁺ до клітини які відіграють ключову роль в спряженні між збудженням та скороченням ГМК. Активація катіонних каналів - головний механізм деполяризації мембрани при агоніст-індукованому збудженні ГМК ШКТ. Активація К⁺ каналів має важливе значення в контролі мембранного потенціалу і модуляції збудливості ГМК.

ГМК taenia coli морської свинки електрично збудливі - у відповідь на стимуляцію вони генерують потенціал дії (ПД) з “овершутом” в 10 - 15 мВ та слідовою гіперполяризацією (рис. 12). ПД ГМК є результатом сумарного, але строго регульованого, руху іонів через плазматичну мембрану. В більшості міоцитів фаза порогової деполяризації за фізіологічних умов, мабуть, опосередкована потоком іонів натрію (та, можливо, хлору) через катіонні (та хлорні) канали. Початкова порогова деполяризація, що розвивається при відкриванні цих каналів призводить до активації потенціалзалежних Ca²⁺ каналів L-типу. Фаза реполяризації формується балансом інактивації вхідного I_Ca, і активацією вихідного I_K через потенціал- та Са²⁺-залежні К⁺ канали. Слідова гіперполяризація зумовлена роботою, в основному тільки К_Са малої провідності, які мають більш високу чутливість до [Ca²⁺]_i ніж К_Са великої провідності. Виходячи з результатів наших досліджень, можна зробити припущення, що апамін здатний блокувати фазу слідової гіперполяризації, а також ініціювати фазу порогової деполяризації ПД. Друга можливість раніше в літературі описаною не була, і може бути важливою доповнюючою ланкою в механізмі дії апаміну. Як показано в нашій роботі, внесок апамінчутливого компоненту I_K(Ca) в сумарний трансмембранний іонний струм ГМК taenia coli морської свинки вельми незначний. При 0 мВ (потенціал реверсії катіонного струму), коли ефект апаміну полягає лише в блокуванні К_Са малої провідності, внесок апамінчутливого I_K(Ca) до загального трансмембранного іонного струму становить всього 10 - 15 %. В межах потенціалу спокою вхід Са²⁺ до клітини через потенціалкеровані Са²⁺ канали відсутній, проте апамінчутливі К_Са малої провідності можуть активуватися за рахунок вивільнення Са²⁺ з ІР₃-чутливого СР. В гладеньких м'язах ШКТ цей механізм може пояснити гальмівну дію АТФ, який передбачається (Владимирова, Шуба 1978, Байдан та ін. 1978, Shuba, Vladimirova 1980, 1981) на роль медіатора НАНХ синаптичного гальмування. Механізм цього АТФ-індукованого гальмування полягає в зв'язуванні АТФ з Р2У рецептором, активації фосфоліпази С, що призводить до збільшення синтезу ІР₃ та підвищення рівня [Ca²⁺]_i, яке і призводить до активації К_Са малої провідності чутливих до блокуючої дії апаміну (Kong et al 2000).

Таким чином, дія апаміну на трансмембранний іонний струм в ГМК taenia coli морської свинки включає в себе два механізми: блокування К_Са малої провідності, з одного боку, та активування катіонної провідності, з іншого боку. Причому, в районі потенціалу спокою ГМК, обидва ці ефекти спрямовані в бік збільшення вхідного струму, тобто сприяють розвитку деполяризації ГМК. Активування катіонної провідності відіграє важливу роль в розвитку порогової деполяризації для генерації ПД ГМК. Блокування ж К_Са малої провідності, що відіграють основну роль в розвитку повільної слідової гіперполяризації, сприятиме збільшенню частоти генерації ПД.

ВИСНОВКИ