Взаємодія екдистерону та інших С27-стероїдів із мембранами еритроцитів

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

УДК 577.171.54.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, чл.-кор. НАН України ГУЛА Надія Максимівна, завідувач відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник ТУГАЙ Василь Андрійович, провідний науковий співробітник Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України

доктор біологічних наук КОВАЛЕНКО Валентина Миколаївна, завідувач відділу загальної токсикології Інституту фармакології та токсикології АМН України

Провідна установа Київський національний університет імені Тараса Шевченка, кафедра біохімії

Захист відбудеться "_19_"_червня__2000 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознаймитися в бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України (Київ, вул. Леонтовича, 9).

Автореферат дисертації розісланий "_19_"_травня_2000 р.

Учений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

Загальна характеристика роботи

Дисертаційну роботу виконано в межах наукової теми відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії НАН України, затвердженої Президією НАН України.

Мета та завдання дослідження

Мета роботи: експериментально обгрунтувати особливості механізмів ранньої дії екдистерона у порівнянні з іншими С₂₇-стероїдами на плазматичні мембрани різних тканин та клітин ссавців.

Для досягнення цієї мети поставлено такі завдання:

- порівняти in vivo дію екдистерону й ендогенного стероїдного гормону ссавців кальцитріолу на активацію сигнальних систем клітин,

- на модельних системах in vitro дослідити можливість прямої дії екдистерону та інших С₂₇-стероїдів на плазматичні мембрани,

- вивчити фізико-хімічні властивості плазматичних мембран за умов їх взаємодії з екдистероном та іншими С₂₇-стероїдами.

Наукова новизна отриманих результатів

Вперше в комплексних дослідах in vivo на тканинах-мішенях (печінки, слизової оболонки тонкого кишечника) та інших тканинах (серця, головного мозку) щурів, одержано докази активації сфінгомієлінової сигнальної системи клітин під дією екдистерону та кальцитріолу за короткотривалий період часу (0 - 60 хв) після їх введення тваринам per os. В дослідах використано методи визначення рівня загальних фосфоліпідів і сфінгомієлінів та радіоактивності попередника сфінгомієліну - L-[³H]метилметіоніну. Одержані результати є аргументом, що підтверджує негеномну дію досліджуваних стероїдів. У дослідах in vitro з мембранами еритроцитів за допомогою мічених [³Н, ¹⁴С]С₂₇-стероїдів вивчено зв'язування екдистерону з плазматичними мембранами. Вперше показано, що екдистерон, витісняючи з мембрани кальцитріол, конкурує з ним за місця зв'язування на мембрані.

Встановлено, що взаємодія екдистерону з мембранами еритроцитів супроводжується зміною таких показників фізико-хімічного стану мембран, як величина молярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди, стійкість до кислотного гемолізу, в'язкість, поверхневий заряд, взаємодія з білковими компонентами, активність мембранозв'язаного ферменту Nа⁺,K⁺-ATФ-ази. Ці зміни аналогічні тим, які спостерігаються під час взаємодії ди- та полігідроксильованих С₂₇-стероїдів із мембранами. У разі моногідроксильованих С₂₇-стероїдів виявлено протилежні зміни.

Виявлено, що взаємодія екдистерону й інших С₂₇-стероїдів із плазматичними мембранами клітин залежить від структури молекули, зокрема від кількості та положення в ній гідроксильних групп.

Теоретичне та практичне значення отриманих результатів

Отримані дані розширюють сучасні уявлення щодо механізму дії екдистерону на клітини теплокровних тварин у ранній період (060 хв) його взаємодії з плазматичною мембраною, внаслідок чого відбувається активація сфінгомієлінової сигнальної системи. Результати досліджень дозволяють оцінити мембранотропні властивості екдистерону порівняно з іншими С₂₇-стероїдами.

Одержані в дисертаційній роботі експериментальні данні можуть бути використані при розробці препаратів на основі екдистерону для застосування їх з профілактичною та лікувальною метою, оскільки стероїд не має токсичного впливу на організм навіть у великих концентраціях. Одержані результати можуть бути використані у практичній медицині та фармації, а також у навчальному процесі під час вивчення молекулярних механізмів негеномної дії стероїдних гормонів.

Особистий внесок здобувача

Дисертацію виконано здобувачем під науковим керівництвом чл.- кор. НАН України, д. б. н. Н. М. Гулої у тісному співробітництві з к. б. н. А. В. Коцюрубою, з яким автор має спільні публікації. Наведені в рукописі результати одержано здобувачем особисто або за безпосередньої участі у спільних експериментах. Текст дисертаційної роботи написано здобувачем особисто.

Апробація результатів дисертації

Матеріали дисертаційної роботи апробовано на: VI симпозиумі з біохімії ліпідів (Санкт-Петербург, 1994); W. Mejbaum-Kathenellebogen's Seminars: Membrane Skeleton Structure and Function (Wroclaw/Karpacz, 1995); Workshop on phytoecdysteroids (Сиктивкар, 1996); Second International Symposium on the Chemistry of Natural Compounds (Eskisehir, 1996); FEBS Special Meeting, Cell Signaling Mechanisms (Amsterdam, 1997); XIII^th Ecdysone Workshop (Jena, 1998); семінарах Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна та відділу біохімії стеринів і біохімії ліпідів.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи опубліковано 3 статті та 5 тез доповідей.

Cтруктура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їхнього обговорення, висновків і списку джерел літератури (215). Робота викладена на 117 сторінках, містить 16 рисунків та 2 таблиці.

Зміст роботи

Першим розділом роботи є огляд літератури, в якому висвітлюються основні механізми дії екдистерону в організмі теплокровних тварин у порівнянні з іншими С₂₇-стероїдами, зокрема кальцитріолом (1б,25-дигідроксивітаміном D₃). Особливу увагу приділено з'ясуванню механізму негеномної дії стероїдів, яка пов'язана з активацією сигнальних систем на рівні плазматичних мембран клітини, внаслідок чого стають можливими неспецифічні зміни фізико-хімічних властивостей ліпідного матриксу мембрани. Висловлено припущення щодо подібності механізму дії на плазматичні мембрани екдистерону та кальцитріолу.

У другому розділі описано матеріали та основні методи досліджень.

У третьому та четвертому розділах наведено основні результати роботи та їхнє обговорення.

Матеріали та методи досліджень

Досліди in vivo проведено на щурах лінії Вістар з масою тіла 120-150 г. За 24 год до декапітації щурам вводили внутрішньочеревинно по 3,7 МБк L-[метил-³H]метіоніну. Радіоактивність визначали в умовних одиницях за допомогою автоматичного сцинтилляційного лічильника Beckman LS-7000. Водно-спиртові розчини оксистеролів (2 мкмоля етанолу) вводили одноразово per os у концентраціях 10^-8 М екдистерону та 10^-12 М кальцитріолу за 0; 0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 10,0; 30,0 та 60,0 хв до декапітації тварин, яку проводили під легким ефірним наркозом. Тваринам контрольної групи (0-й час; рис. 1, 2, 3) робили ін'єкцію лише водно-спиртового розчину. Видалені для дослідження тканини після декапітації тварин негайно заморожували у рідкому азоті, потім із них одержували ліпідні екстракти.

У дослідах in vitro використовували кров донорів, до якої додавали антикоагулянт (3,8%-й розчин цитрату натрію) у співвідношенні 9 : 1.

Моделлю плазматичної мембрани слугували мембрани еритроцитів, які отримували гіпоосмотичним гемолізом клітин за методом Доджа (1963).

Для вивчення взаємодії стероїдів із мембранами еритроцитів останні інкубували з міцелярними розчинами стероїдів, які одержували за методом Field (1991), оскільки, згідно з гіпотезою “вільних гормонів”, фізіологічну активність проявляють тільки стероїди, які не зв'язані з білками плазми [Rao et al., 1981].

Ліпідні екстракти досліджуваних органів та тканин одержували за методом Blight et al. (1959). Ідентифікацію і кількісне визначення нейтральних ліпідів та фосфоліпідів проводили за допомогою методу тонкошарової хроматографії [Skipski et al., 1965; Крылов и др., 1975; Лемешко та ін., 1991]. Вміст холестеролу в ліпідних екстрактах визначали методом Zlatkis еt al. (1953), сфінгозину - методом спектрофотометрії з використанням метилового оранжевого (Lauter, 1962).

Стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу оцінювали як описано в роботі [Терсков и др., 1957]. Активність ферменту Na⁺,K⁺-ATP-ази у мембранах еритроцитів визначали за методом Post et al. (1967).

Вивчення зв'язування бромтимолового синього з мембранами еритроцитів проводили згідно з методом Древаль та ін. (1989).

Визначення мікров'язкості мембран еритроцитів здійснювали спектрофлуориметричним методом, використовуючи поліметиновий барвник 4501у [Воловик и др., 1988]. Поверхневий заряд мембран еритроцитів встановлювали за допомогою спектрофлуориметра, застосовуючи негативно заряджений флуоресцентний зонд АНС [Формазюк та ін., 1982].

Результати та їх обговорення

Активація сфінгомієлінового циклу біологічно активними оксистеролами - екдистероном та кальцитріолом

З метою встановлення можливості активації сигнальних систем клітин С₂₇-стероїдами - екдистероном та кальцитріолом - нами досліджено зміни рівня фосфоліпідів у клітинах. Встановлено, що в усіх досліджуваних тканинах (слизова оболонка тонкого кишечника, печінка, серце, головний мозок) вищезазначені стероїдні сполуки спричинюють швидке транзитне зменшення пулу загальних фосфоліпідів. Оскільки, згідно з даними літератури, стероїдний гормон кальцитріол активує сфінгомієлінову сигнальну систему [Okazaki, 1989; 1994], ми зосередили увагу на вивченні механізму цього процесу. За даними літератури, активація сфінгомієлінової сигнальної системи супроводжується гідролізом сфінгомієліну і утворенням вторинних мессенжерів - цераміду, холінфосфату, сфінгозину [Hannun et al., 1993]. Збільшення рівня сфінгозину в клітинах може відбуватися лише внаслідок двох стадій гідролізу: спочатку сфінгомієлін під дією сфінгомієлінази перетворюється у церамід, який потім гідролізується церамідазою до сфінгозину.

Дані, які наведено на рис. 1, свідчать, що через короткий проміжок часу після введення щурам стероїдів - екдистерону (10^-8 М) та кальцитріолу (10^-12 М) - у досліджуваних тканинах спостерігається зменшення рівня сфінгомієліну водночас із зростанням вмісту сфінгозину. Додатковим доказом гідролізу сфінгомієліну є зменшення радіоактивності в його пулі, попередньо міченому L-[³H]метіоніном, з якого синтезується холін. Дані наведено на рис. 2.

Отже, одержані результати свідчать про можливість активації сфінгомієлінової сигнальної системи С₂₇-стероїдами - екдистероном та кальцитріолом. Але інтимні механізми цього процесу залишаються поки що нез'ясованими.

Згідно з даними літератури, “сигнальний пул” сфінгомієліну локалізований у плазматичній мембрані [Linardic et al., 1994], що також підтверджує мембранну дію стероїдів. Можливо, що активація ферментів, які беруть участь у трансдукції сигналу, відбувається внаслідок взаємодії гормону з рецептором на плазматичній мембрані. Проте активація ферментів плазматичної мембрани стероїдами можлива і шляхом змін фізико-хімічного стану ліпідного бішару мембран.

Взаємодія екдистерону з мембранами еритроцитів

З метою перевірки гіпотези, згідно з якою активація сигнальних систем клітин спричинена взаємодією молекули С₂₇-стероїду з плазматичною мембраною і залежить від зміни фізико-хімічного стану останньої, подальші експерименти проведено на модельних системах в дослідах in vitro.

Оскільки екдистерон та кальцитріол дещо подібні за хімічною структурою молекул і мають спільного попередника у біосинтезі - 7-дегідрохолестерол [Rees, 1989], то можна було припустити подібність у взаємодії цих сполук із мембранами еритроцитів у теплокровних тварин. Крім того, викликає значний інтерес виявлення механізму мембранної дії інших С₂₇-стероїдів, молекули яких відрізняються за кількістю гідроксильних груп та положенням їх як в циклопентанпергідрофенантреновому ядрі, так і в ізооктиловому (бічному) ланцюгу.

Як випливає з рис. 3, екдистерон, його похідна сполука - 2-дезоксиекдистерон та кальцитріол належать до полігідроксильованих С₂₇-стероїдів, тоді як інші - до моно- та дигідроксильованих. Спочатку доцільно було вивчити зв'язування радіоактивно мічених С₂₇-стероїдів із мембранами еритроцитів (рис. 4), які інкубували за присутності радіоактивно мічених сполук (10^-6 М). Ефективність зв'язування холестеролу з мембранами еритроцитів було прийнято за 100%. Для холекальциферолу, який відрізняється від холестеролу модифікацією в кільці В (розірваністю його), становить майже 60% від такого у холестеролу. Зв'язування кальцитріолу, молекула якого порівняно з холестеролом містить додаткові гідроксильні групи і має розірване кільце В, було незначним.

У подальших дослідженнях для оцінки місць зв'язування С₂₇-стероїдів із мембранами нами було проведено такі експерименти. Насамперед було досліджено здатність екдистерону порівняно з іншими С₂₇-стероїдами запобігати зв'язуванню холестеролу з мембранами еритроцитів, які інкубували за присутності в середовищі 10^-6 М екдистерону та інших С₂₇-стероїдів. Через 30 хв в інкубаційну суміш додавали радіоактивно мічений холестерол у концентрації 10^-12 М, після чого інкубацію продовжували ще 30 хв. Потім визначали радіоктивність ліпідного екстракту мембран еритроцитів.

Одержані дані, які наведено на рис. 5, віддзеркалюють те, що полігідроксильований екдистерон конкурує за місця зв'язування з холестеролом менше, ніж моногідроксильований холекальциферол.

У наступному експерименті ми дослідили вплив різних концентрацій екдистерону (10^-10-10^-14 М) на включення радіоактивно мічених С₂₇-стероїдів (10^-12 М) у мембрани еритроцитів. Останні інкубували протягом 30 хв за присутності екдистерону, після чого в інкубаційну суміш додавали інші стероїди. Суміш інкубували ще 30 хв. За 100% прийнято включення радіоактивно мічених стероїдів за відсутності екдистерону.

Дані, які наведено на рис. 6, свідчать, що екдистерон не впливає на зв'язування холестеролу з мембранами еритроцитів. На відміну від цього для холекальциферолу, який порівняно з кальцитріолом має модифікації у кільці В, воно зменшується. Знижується також і дозозалежне зв'язування кальцитріолу, який подібно до екдистерону має гідроксильні групи в кільці А та в бічному ланцюгу.

На основі одержаних нами даних можна дійти висновку, що екдистерон, взаємодіючи з мембранами еритроцитів, витісняє з них кальцитріол і, отже, конкурує з останнім за місця зв'язування на мембрані. На наш погляд, екдистерон та інші стероїди з гідроксильованими бічними ланцюгами мають інші місця зв'язування, ніж негідроксильовані. Стероїдні сполуки, які мають гідроксильні групи в основному скелеті молекули та бічному ланцюгу, можливо, не можуть розміщуватися подібно до холестеролу у фосфоліпідному бішарі між залишками жирних кислот, а, ймовірно, локалізуються у зоні залишків гліцеролу або серед полярних голівок ліпідів. Ми припускаємо, що саме ця відмінність у взаємодії досліджуваних стероїдів із мембранами зумовлює неоднакові ефекти їхньої дії.

Зміни фізико-хімічних властивостей мембран еритроцитів під час їх взаємодії з екдистероном та іншими С₂₇-стероїдами

Для порівняння дії екдистерону і інших С₂₇-стероїдів на фізико-хімічний стан мембран досліджено такі показники як стійкість еритроцитів до кислотного та пероксидного гемолізу, мікров'язкість їхніх мембран, значення та величина поверхневого заряду останніх, активність мембранозв'язаного ферменту Na⁺,K⁺-ATФ-ази.

Отримані нами дані (рис. 7) свідчать про те, що взаємодія екдистерону з мембранами зумовлює зниження стійкості еритроцитів до кислотного гемолізу. Подібна дія характерна також для кальцитріолу, тоді як під час інкубації еритроцитів із моногідроксильованими стероїдами (холестеролом і холекальциферолом) спостерігається підвищення стійкості їх до кислотного гемолізу. Крім того, нами відзначено зміну величини молярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди в мембранах еритроцитів після їхньої інкубації з екдистероном та іншими С₂₇-стероїдами. Як випливає з рис. 7, швидкість кислотного гемолізу еритроцитів знаходиться в оберненій кореляційній залежності від молярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди в мембранах, що узгоджується з даними літератури [Халилов и др., 1982].До інтегральних параметрів, які характеризують стан ліпідного бішару мембрани, належить мікров'язкість. Як випливає з рис. 8, інкубація еритроцитів та їхніх тіней з екдистероном (10^-6 - 10^-12 М) спричинює зменшення мікров'язкості мембран. Такий самий ефект спостерігається також під час дії інших ди- та полігідроксильованих С₂₇-стероїдів, тоді як моногідроксильовані стероїди зумовлюють зменшення мікров'язкості мембран внаслідок кондесуючого ефекту, який властивий для холестеролу.

Специфіка хімічної будови холестеролу забезпечує взаємодію гідроксильної групи його молекули з карбонільним киснем ацильних ланцюгів фосфоліпідів, а також гідрофобну взаємодію між жирнокислотними залишками та стероїдним кільцем молекули. Такі особливості хімічної структури холестеролу зумовлюють його конденсуючий ефект [Slotle J.P. et al., 1994]. На наш погляд, відмінності у дії холестеролу та полігідроксильованих С₂₇-стероїдів можна пояснити тим, що введення додаткових гідроксильних груп у молекулу стероїду, особливо у бічний ланцюг, знижує її гідрофобність і, тим самим, зменшує гідрофобну взаємодію з жирнокислотними залишками фосфоліпідів.

У подальших дослідах нами було приділено увагу вивченню впливу екдистерону та інших С₂₇-стероїдів на поверхневий заряд мембран еритроцитів. Інкубування останніх та їхніх мембран з моногідроксильованими сполуками (холестеролом та 7-дегідрохолестеролом) призводить до зменшення поверхневого заряду мембран, тоді як інкубування з ди- та полігідроксильованими стероїдами збільшує величину цього показника. Зміни мікров'язкості та поверхневого заряду мембран можуть спричинити модуляцію активності мембранозв'язаних ферментів, проникності мембран для іонів та міжклітинної взаємодії [Krayenhof et al., 1993].

Згідно з даними літератури, функціональні властивості інтегрального білка плазматичної мембрани еритроцитів Na⁺,K⁺-АТФ-ази є ліпідзалежними [Cornelius et al., 1991]. Результати наших досліджень свідчать (рис. 9), що інкубація екдистерону та його 2-дезоксипохідного з еритроцитами та їхніми тінями зумовлює збільшення активності ферменту, тоді як за присутності в середовищі моногідроксильованих стероїдів (холестеролу, 7-дегідрохолестеролу, холекальци-феролу) вона знижується.

Одержані нами дані, що характеризують модуляцію активності мембранозв'язаного ферменту Na⁺,K⁺-ATФ-ази, корелюють (r = 0,72) зі зміною величини мікров'язкості. Зокрема, інкубація еритроцитів та їхніх тіней з полігідроксильованими стероїдами (екдистероном та 2-дезоксіекдистероном) призводить до зменшення мікров'язкості мембран та збільшення активності ферменту. За присутності в інкубаційному середовищі моногідроксильованих сполук (холестеролу та 7-дегідрохолестеролу) спостерігається збільшення мікров'язкості мембран та інгібування Na⁺,K⁺-ATФ-ази. Таку дію С₂₇-стероїдів, ймовірно, можна пояснити неспецифічною зміною ліпідного бішару внаслідок впливу на плазматичні мембрани досліджуваних сполук.

Отже, взаємодія екдистерону та С₂₇-стероїдів із мембранами клітин модулює фізико-хімічні властивості мембран. Ефекти, які спостерігаються, можуть відбуватися шляхом модифікації ліпідного бішару або ліпід-білкової взаємодії і зміни конформації мембранних білків. Не виключено, що це може бути причиною активації сигнальних систем клітини. Результати роботи дозволяють висловити припущення, що екдистерон, хімічна структура якого подібна до хімічної структури ендогенного гормону ссавців кальцитріолу, може спричинювати, подібно до останнього, негеномну дію в клітинах теплокровних тварин.

Висновки

Встановлено, що за умов короткочасної взаємодії (0 - 60 хв) екдистерону та кальцитріолу з тканинами-мішенями для кальцитріолу (печінка, слизова оболонка тонкого кишечника) та іншими тканинами (серце, головний мозок) щурів відбувається гідроліз сфінгомієліну з утворенням вторинного месенджера - сфінгозину, що свідчить про можливість активації сфінгомієлінової сигнальної системи.

В дослідах in vitro на мембранах еритроцитів за присутності в реакційному середовищі екдистерону та радіоактивно мічених С₂₇-стероїдів - [7-³Н]холестеролу, [4-¹⁴С]холекальциферолу та [23,24(n)-3Н]кальцитріолу - виявлено, що екдистерон витісняє з клітинних мембран кальцитріол, конкуруючи з ним за місця зв'язування.

Взаємодія екдистерону та інших С₂₇-стероїдів (холестеролу, 7- дегідрохолесте-ролу, 25-гідроксихолестеролу, 25-гідрокси-7-дегідрохолестеролу, холекальци-феролу, кальцитріолу і 2-дезоксіекдистерону) з мембранами зумовлює зміни фізико-хімічного стану останніх. Під впливом екдистерону та інших ди- і полі-гідроксильованих стероїдів знижується величина молярного співвідношення холестеролу та фосфоліпідів в мембранах, стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу, зменшується мікров'язкість мембран і збільшується поверхневий заряд. Моногідроксильовані стероїди спричинюють протилежні зміни.

Встановлена кореляційна залежність між активністю інтегрального мембранного білка еритроцитів Na⁺,K⁺-ATФ-ази та мікров'язкістю мембран у випадку дії на мембрани екдистерону та інших С₂₇-стероїдів: під впливом екдистерону і його 2-дезоксипохідного відбувається зменшення мікров'язкості та збільшення активності Na⁺,K⁺-ATФ-ази, тоді як за дії моногідроксильованих стероїдів відзначено протилежний ефект.

Виявлено зв'язок між хімічною будовою молекули С₂₇-стероїдів та їхньою дією на мембрани. Це підтверджується різноспрямованістю ефектів екдистерону і інших полі- (2-дезоксіекдистерону) та дигідроксильованих С₂₇-стероїдів (25-гідроксихолестеролу, 25-гідрокси-7-дегідрохолестеролу, кальцитріолу) порівняно з моногідроксильованими стероїдними сполуками (холестеролом, 7-дегідрохолестеролом, холекальциферолом).

Перелік робіт, що опубліковано за темою дисертації

Коцюруба А.В., Буханевіч О.М.,Туганова А.В., Тараканов С.С. Механізми ранньої дії біологічно активних оксистеринів: кальцитріолу та екдистерону. Модуляція внутрішньоклітинних пулів арахідонової кислоти та продуктів її окиснювального метаболізму // Укр. биохим. журн. 1995. 67, № 5. С. 45-52.

Коцюруба А.В., Туганова А.В., Буханевіч О.М., Тараканов С.С. Механізми ранньої дії біологічно активних оксистеринів: кальцитріолу та екдистерону. Ідентифікація обміну сфінгомієліну як ефекторного механізму ранньої дії // Укр. биохим. журн. 1995. 67, № 5. С. 53-58.

Коцюруба А.В., Буханевіч О.М.,Туганова А.В., Тараканов С.С., Бердишев А.Г. Дослідження механізмів ранньої дії біологічно активних оксистеринів: кальцитріолу та екдистерону. Модуляція систем, що генерують низькомолекулярні активатори гуанілатциклази // Укр. биохим. журн. 1995. 67, № 5. С. 58-64.

Tuganova A.V. and Kosyuruba A.V. The in vitro interaction of C₂₇-sterols with the erythrocyte membranes depends on the sterol structure and concentration. // Cellular and Molecular Biology Letters. 1996. 1, N 2. P. 129 - 135.

Туганова А.В., Коцюруба А.В. Исследование взаимодействия С₂₇-стеринов с мембранами эритроцитов // Укр. биохим. журн. 1996. 68, №6. С. 61 - 68.

Пивоваренко В.Г., Туганова А.В., Осинская Л.Ф., Холодова Ю.Д. Синтез и антиоксидантная активность изофлавонов, содержащих гидрофильные и липофильные заместители // Химико-фарм. журнал. 1997. №3. С. 14-18.

V.G.Pivovarenko, A.V.Tuganova, A.S.Klimchenko, A.P.Demchenko. Flavonols as models for fluorescent membrane probes. I. The response to the charge of micelles.// Cellular and Molecular Biology Letters. 1997. v.2. P. 355 - 364.

A.S.Klimchenko, A.V.Tuganova, I.D.Petrina, V.G.Pivovarenko, A.P.Demchenko. 4'-dialkylaminoflavonolsas a model for fluorescent membrane probes // W. Mejbaum-Katzenellebogen's Seminars in Mol.Biology, Wroclaw, June 3-5, 1996.- P.5.

A.V.Tuganova, A.V.Kothyuruba. C₂₇-sterols in vitro alter lipid and protein components of erythrocyte membranes/Workshop on phytoecdysteroids, Syctyvcar, Russia, September 2.6, 1996. Р.118 - 119.

V.G.Pivovarenko, A.V.Tuganova. The synthesis and investigation of antioxidant.

Activity of isoflavones with different hydrophylic and lipophilic substituents.// Second Int. Symp. on the chemistry of natural compounds (SCNC), Eskisehir, Turkey, October 22-24, 1996.- P.146.

A.V.Tuganova, A.V.Kotsyruba. The in vitro interaction of different C₂₇-sterols with plasma membrane.// Second Int. Symp. on the chemistry of natural compounds (SCNC), Eskisehir, Turkey, October 22-24, 1996.- P.169.

A.V. Tuganova, N.L. Kindruk, G.V. Korniethz, A.V. Kotsyuruba. Steroids interaction with erythrocyte membranes. Modulation of the activity of Na⁺,K⁺-ATPase/ XIII^th Ecdysone Workshop, Jena, Germany, July 27 - 31, 1998. - Р12.

Анотація

Туганова А.В. Взаємодія екдистерону та інших С₂₇-стероїдів із мембранами еритроцитів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Київ, 1999.

Дисертацію присвячено вивченню дії екдистерону на мембрани у порівнянні з іншими біологічно активними С₂₇-стероїдами. В дослідах in vivo отримано дані щодо можливості активації у щурів сфінгомієлінового циклу у ранній період дії на них С₂₇-фітоекдистероїду - екдистерону (20-гідроксіекдизону) та ендогенного гормону теплокровних тварин кальцитріолу (1,25-дигідроксивітаміну D₃). З метою одержання доказів прямої мембранної дії екдистерону проведено досліди in vitro на моделі мембран еритроцитів. Встановлено, що екдистерон взаємодіє з плазматичними мембранами, внаслідок чого відбуваються зміни їхніх фізико-хімічних властивостей: зменшується стійкість еритроцитів до кислотного гемолізу, величина молярного співвідношення холестерол/фосфоліпіди та мікров'язкість, збільшується поверхневий заряд. Це може спричинювати модуляцію активності мембранозв'язаних ферментів, зокрема Na⁺,K⁺-АТФ-ази. Порівняння дії екдистерону та інших досліджуваних С₂₇-стероїдів дозволяє припустити, що напрямок змін фізико-хімічних властивостей мембран залежить від хімічної будови молекул стероїдів, а саме від кількості та положення гідроксильних груп. Одержані дані є суттєвими для подальшого розуміння та вивчення механізму дії екдистерону в організмі теплокровних тварин.

Ключові слова: екдистерон, С₂₇-стероїди, сфінгомієліновий цикл, плазматичні мембрани, еритроцити.

Аннотация

Туганова А.В. Взаимодействие экдистерона и других С₂₇-стероидов с мембранами эритроцитов. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины, К., 1999.

При исследовании влияния на млекопитающих экдистерона - гормона линь-ки и метаморфоза насекомых - выявлены четко выраженные фармакологические эффекты. Однако вопросу молекулярного механизма действия на них экдистерона посвящены только единичные исследования. Согласно данным литературы и наших исследований, имеется основание предполагать, что действие экдистерона по некоторым параметрам подобно негеномному действию эндогенного гормона млекопитающих - кальцитриола. Негеномный механизм действия стероидных гормонов, вероятно, связан с активацией сигнальных систем плазматических мембран клеток.

В экспериментах in vivo установлена возможность активации сфингомиелиновой сигнальной системы биологически активными С₂₇-стероидами в ранней фазе их действия на мембраны (0-60 мин): гормона линьки и метаморфоза насекомых экдистерона и эндогенного гормона млекопитающих кальцитриола (1,25-дигидроксивитамина D₃).

С целью подтверждения гипотезы о механизме мембранного действия экдистерона в сравнительном аспекте с другими С₂₇-стероидами были проведены эксперименты in vitro на модели мембран эритроцитов. В исследованиях исполь-зованы производные холестерола с модификациями в циклопентанпергидрофе-нантреновом ядре и в боковой изооктильной цепи. Установлено, что экдистерон, как и другие соединения данного класса, способен взаимодействовать с мембранами эритроцитов. Эффективность связывания С₂₇-стероидов с эритро-цитарными мембранами зависит от количества и положения гидроксильных групп в молекуле. Показано, что моно- и полигидроксилированные стероиды, к которым относится экдистерон, имеют разные локусы связывания с мембранами.

Сравнительное изучение влияния экдистерона и других С₂₇-стероидов на физико-химические свойства мембран показывает, что вследствие действия экдистерона на мембраны наблюдается снижение устойчивости эритроцитов к кислотному гемолизу, уменьшение микровязкости и величины соотношения холестерол/фосфолипиды, увеличение поверхностного заряда мембран. Аналогичные эффекты отмечены также в опытах с другими ди- и полигидрокси-лированными стероидами. Моногидроксилированные стероиды обусловливают противоположные изменения.

Изменение физико-химических свойств мембран вследствие действия экдистерона может быть причиной модуляции активности мембраносвязанных ферментов. Это предположение подтверждено данными о связи между активностью Na⁺,K⁺-ATФ-азы и степенью микровязкости мембран при действии С₂₇-стероидов. Так, инкубация эритроцитов с экдистероном, а также с другими ди- и полигидроксилированными соединениями, обусловливает уменьшение микровязкости и увеличение активности Na⁺,K⁺-ATФ-азы, в то время как моногидроксилированные стероиды способствуют ее увеличению и снижению активности фермента.

Представленные в работе результаты позволяют выдвинуть предположение о негеномном действии гормона линьки насекомых экдистерона на клетки млекопитающих, подобно эндогенному гормону млекопитающих кальцитриолу, вследствие сходства химической структуры их молекул.

Полученные нами данные имеют значение для дальнейших исследований молекулярных механизмов негеномного действия эндогенных гормонов млекопитающих и биологически активных оксистероидов, не являющихся эндогенными гормонами последних.

Ключевые слова: экдистерон, С₂₇-стероиды, сфингомиелиновый цикл, плазматические мембраны, эритроциты.

Summary

Tuganova A.V. The ecdysterone and the other C₂₇-sterols interaction with erythrocytes membranes. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by specialty 03.00.04 - Biochemistry. O.V. Palladin Institute of Biochemistry of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1999.

The dissertation deals with the investigation of ecdysterone action and comparison with others biological active C₂₇-sterols. In the in vivo experiments the activation of the sphingomyelin signal trunsduction system under the C₂₇-oxysterol - ecdysterone (20-hydroxyecdysone) as well as under endogenous C₂₇-steroid hormone calcitriol (1,25-dihydroxyvitamin D₃) early action has been shown. In order to obtain the evidence of the direct ecdysterone membrane action the in vitro experiments on the erythrocyte membrane model have been carried out. It has been shown that ecdysterone interacted with plasma membrane and caused in the changes in the chemical composition and physical properties of membranes. The increase of resistance of erythrocyte to acid hemolisys, molar ratio cholesterol/phospholipid, and microviscosity as well as decrease of surface charge under ecdysterone action have been observed. It is supposed, the modulation of the activity of membrane bounded enzymes is a result of changes in chemical composition and physical properties of membranes. Under ecdysterone action the direction of changes observed is dependent on chemical structure, namely quantity and position of hydroxyl substitutes. The data obtained are significant for further investigation and understanding of the mechanisms of the action of endogenous steroid hormones and biological active C₂₇-oxysterols that are not act as endogenous steroid hormones.

Key words: ecdysterone, C₂₇-steroids, sphingomyelin cycle, plasma membranes, erythrocytes.

Размещено на Allbest.ru