Вивчення механізму дії макроциклічних трихотеценів із Dendrodochium toxicum Pidopl. Et Bilai

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного

Національна академія наук України

УДК 582.288 : 615.334

03. 00. 07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Вивчення механізму дії макроциклічних трихотеценів із

Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai

Тугай Тетяна Іванівна

Київ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Зайченко Олександр Максимович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, керівник лабораторії вторинних метаболітів мікроміцетів

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, Варбанець Людмила Дмитрівна, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біохімії мікроорганізмів

доктор біологічних наук Войціцький Володимир Михайлович, Національний університет ім. Тараса Шевченка, професор кафедрою біохімії

Провідна організація: Інститут ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України, відділ мікології, м. Київ

Захист відбудеться "19" квітня 2000 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, Київ - 143, вул. Заболотного, 154.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. Заболотного, 154

Автореферат розісланий 17 березня 2000 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

Анотації

Тугай Тетяна Іванівна. Вивчення механізму дії макроциклічних трихотеценів із Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології і вірусології НАН України, Київ, 2000.

Дисертація присвячена вивченню деяких аспектів механізму дії макроциклічних трихотеценів, які синтезуються Dendrodochium toxicum, щодо тест-культур і модельних систем.

Вивчено вплив МЦТЦ на синтез білка і нуклеїнових кислот у тест-організмів. Показано, що досліджувані токсини в залежності від концентрації спричиняють як інгибуючу, так і активуючу дію на їх синтез у найпростішого представника прокаріот Acholeplasma laidlawii і інгибуючу дію на синтез цих сполук у представників Sacharomyces cerevisiae та Chlorella vulgaris еукаріот.

Вперше показано, що досліджувані МЦТЦ впливають на синтез білка дріжджів на етапі транскрипції, порушуючи функціонування основного ферменту цього етапу ДНК-залежної РНК-полімерази.

Проведений порівняльний аналіз дії досліджуваних токсинів на ріст і синтез пігментів у хлорели при різних умовах культивування.

Виявлено зниження сумарного вмісту АТФ в клітинах хлорели при освітленні під дією досліджуваних МЦТЦ.

Встановлена здатність досліджуваних токсинів підвищувати проникність мембран саркоплазматичного ретикулуму для іонів кальцію, порушуючи його градієнт на мембрані, аналогічно до впливу відомого кальцієвого іонофору А 23187.

Ключові слова, Dendrodochium toxicum, макроциклічні трихотецени, комплекс тест-системи, механізм дії, полімеразна активність.

Tugay Tetyana Ivanivna. Study of the mode of action of macrocyclic trichothecenes from Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai. - Manuscript. Thesis on competition of the candidate of biological sciences scientific degree on a speciality 03.00.07 - microbiology. - D.K. Zabolotny Institute of microbiology and virology, National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 2000.

The thesis is dedicated to analysis of some aspects of the mode of inhibitory action of the Dendrodochium toxicum macrocyclic trichothecenes, in relation to the test organisms and model systems.

Depending on concentration macrocyclic trichothecenes in rendered both activation and inhibition of the protein and nucleic acid syntheses in the primitive prokaryotic representative Acholeplasma laidlawii, and inhibition of the syntheses of these compounds in eukaryotic representatives Saccharomyces cerevisiae and Chlorella vulgaris.

For the first time it was shown, that studied macrocyclic trichothecenes influenced the protein syntheses in yeasts at the stage of transcription, inhibiting the key enzyme of this stage DNA-dependent RNA-polymerase.

Comparative analysis of action of investigated toxins on growth and on synthesis of pigments in chlorella at different conditions was conducted.

The total ATP content in cells of chlorella decreased during lightening when studied mycotoxins were applied.

The ability of investigated toxins to increase the permeability of membranes of sarcoplasma reticulum for ions of calcium was established. Dissipation of the calcium gradient across the membrane due to the mycotoxins was similar to influence of known calcium ionophore A 23187.

Keywords: Dendrodochium toxicum, macrocyclic trichothecenes, complex of test-systems, mode of action, polymerase activity.

Тугай Татьяна Ивановна. Изучение механизма действия макроциклических трихотеценов из Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2000.

Впервые в сравнительном аспекте изучена разноплановость биохимического действия метаболитов Dendrodochium toxicum 5800 - дендродохина, веррукарина А, роридина А и роридина Н с использованием тест-культур и модельных систем, отражающих специфику различных сторон биологического действия этих токсинов.

При изучении действующих концентраций микотоксинов по отношении к каждой тест культуре, установлено, что наиболее ярко выражено фитотоксическое действие, наименее - действие на микоплазмы, различия в концентрациях достигали трех порядков.

Показано, что все исследуемые токсины оказывали влияние на синтез белка, РНК и ДНК у изученных тест-культур. У Acholeplasma laidlawii величина активирующего и ингибирующего действия на синтез белка не превышала 30%, в то время как величина активации синтеза нуклеиновых кислот достигала 200% от контроля, что свидетельствует о влиянии исследуемых токсинов на белок-синтезирующую систему у простейшего представителя прокариот на этапе транскрипции.

Установлено, что исследуемые МЦТЦ оказывали ингибирующее действие на синтез белка и нуклеиновых кислот у Chlorella vulgaris и Saccharomeces cerevisiae. Действующие концентрации токсинов по отношению к этим тест-культурам различаются в 10 - 15 раз.

Впервые установлено, что исследуемые МЦТЦ влияют на синтез белка у дрожжей на этапе транскрипции, нарушая функционирование ключевого фермента этого этапа ДНК-зависимой РНК-полимеразы.

Проведено сравнительное изучение влияния исследуемых токсинов на рост и синтез пигментов у хлореллы при различных режимах культивирования, когда энергообеспечение клетки осуществляется за счет либо окислительного (темновой режим) либо фотофосфорилирования (световой режим). Показано, что при темновом режиме культивирования, исследуемые токсины не оказывали влияния на рост водоросли при всех исследуемых концентрациях, а в диапазоне концентраций от 0,01 до 0.05 мкг/мл не влияли на синтез пигментов. Однако при дальнейшем увеличении концентрации токсинов от 0,05 до 0,15 мкг/мл наблюдалась существенная активация синтеза хлорофиллов а и в и каротиноидов.

Установлено, что при световом режиме культивирования хлореллы наблюдается сильно выраженное ингибирующее действие исследуемых МЦТЦ на рост и синтез пигментов, а именно: при концентрации 0,05 мкг/мл наблюдалось 30% ингибирование роста и 80% ингибирование синтеза пигментов.

Показано, что изучаемые токсины снижают суммарное содержание АТФ в клетках хлореллы на свету. Экзогенное внесение АТФ на фоне действия токсинов восстанавливает синтез пигментов. Такое действие подобно влиянию на хлореллу протонофора карбонилцианидхлорфенилгидразина.

Установлено, что исследуемые токсины повышают проницаемость мембран саркоплазматического ретикулума для ионов кальция, разрушая его градиент на мембране. Повышение проницаемости для ионов кальция способствует его накоплению в цитоплазме, что, возможно, и приводит к контрактуре мышц при дендродохиотоксикозе. Такое действие токсинов аналогично влиянию известного кальциевого ионофора А 23187.

Ключевые слова: Dendrodochium toxicum, макроциклические трихотецены, комплекс тест-систем, механизм действия, полимеразная активность.

Подяка. Автор виражає щиру подяку член-кореспонденту НАНУ, доктору біологічних наук Скрипалю І.Г. і кандидату біологічних наук Бабічеву В.В. за цінні консультації і методичну допомогу при вивченні впливу МЦТЦ на Acholeplasma laidlawii PG -.8. Автор виражає щиру подяку доктору біологічних наук, провідному науковому співробітнику Інституту біохімії НАНУ Тугаю В.А. за методичну і практичну допомогу у проведенні досліджень по впливу МЦТЦ на фрагментированний саркоплазматичний ретикулум.

Загальна характеристика роботи

Актуальнiсть проблеми. Cеред великої групи мікотоксинів трихотецени займають одне з провідних місць за кількістю токсикозів, які вони викликають, i за ступенем їх уражуючої дії [Билай, Пидопличко,, 1970, Ueno, 1986, Wilson et al., 1993].

Макроциклічні трихотецени (МЦТЦ) є причинними агентами таких тяжких захворювань людини і тварин як дендродохiо-, мiротецiо- i стахіботрiотоксикози [Бiлай, Пiдоплiчко, 1970, Forgacs et al., 1972, Croft et al., 1985, Etzel et al., 1998, Fung et al., 1998]. Цим сполукам притаманний широкий спектр біологічного впливу - фітотоксична, фунгіцидна, цитотоксична та iнші активностi [Bamburg, Strong, 1971, Okazaki et al., 1989, Зайченко, Нагорна та ін., 1992, Nikulin et al., 1997].

Впродовж останніх десятиріч досить добре досліджена хімічна структура як простих, так і макроциклічних трихотеценів [Jarvis, Mazzola, 1982, Anderson et al., 1989, Hughes et al., 1990, Jarvis et al., 1995, Зайченко, Рубежняк, 1999,], розроблені і постійно удосконалюються методи їх аналізу та ідентифікації [Cole et al., 1986, Springer, 1986, Hack et al., 1988, Mogar, 1989]. трихотецен макроциклічний білок дріжджі

Аналіз літературних даних свідчить про те, що найменш вивченим є питання механізмів ушкоджуючої дії МЦТЦ. Вони обмежені здебільшого дослідженнями щодо впливу окремих представників цієї групи на етап трансляції синтезу білка [Carrasco, 1973, Hernandez, Cannon, 1982]. Відомості щодо інших аспектів механізму дiї МЦТЦ малочисельні [Pavlovkin et al., 1983, 1993, Бабичев, 1984, Okazaki et al., 1989, Кириллова, Зайченко, 1995, 1996], і не дають змоги відтворити загальну картину дії цих сполук на клітинному рівні, охарактеризувати наявність чи відсутність їх специфічної дії на окремі процеси обміну речовин. Власне ця обставина і визначила напрямок наших досліджень.

Для створення концепції механізмів дії МЦТЦ необхідна інформація, завдяки якій можна було б розробити підходи до діагностики, профілактики та лікування відповідних токсикозів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відповідності з напрямком науково-дослідних робіт Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАНУ, зокрема з темами: "Вивчити утворення і біологічну дію фізіологічно активних метаболітів мікроміцетів" (№ державної реєстрації 01. 82. 9010969); "Біологічна дія метаболітів мікроміцетів в нормальних і екстремальних умовах" (№ державної реєстрації 01.84.0.021695); "Вивчення еколого-фізіологічних особливостей видового складу мікроміцетів, трансформуючих полі- і мономерні субстрати, з метою отримання нових біологічно активних метаболітів" (№ державної реєстрації 01.88. 00.52).

Мета i завдання роботи. Метою даної роботи було вивчення механізмів дії МЦТЦ, які синтезуються Dendrodochium toxicum Pidopl. et Bilai 5800, з використанням комплексу тест-культур та тест-систем, адекватних специфіці біологічної дії цих сполук (антифунгальної, фітотоксичної, впливу на теплокровних).

Виконання роботи передбачало вирішення наступних завдань:

- дослідити дію комплексного препарату дендродохіну і виділених з нього індивідуальних компонентів МЦТЦ на ріст тест-культур, синтез у них білка та нуклеїнових кислот;

- вивчити вплив МЦТЦ на активність виділеної ДНК - залежної РНК - полімерази дріжджів;

- провести порівняльне вивчення впливу МЦТЦ на синтез пігментів у хлорели (хлорофіли а і в, каротиноїди) при різних умовах її культивування;

- дослідити вплив МЦТЦ на синтез АТФ клітинами хлорели;

- вивчити дію МЦТЦ на Са 2+ АТФ-азну активність і проникність мембран саркоплазматичного ретикулуму (СР) (модельної системи скорочення м'язів).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше для вивчення механізму дії МЦТЦ використано комплекс тест-культур та тест-систем, адекватних щодо їх біологічної дії. Показана поліфункціональність дії дендродохіну, верукарину А, рорідинів А та Н на активність метаболічних процесів в системі еукаріот та прокаріот.

Встановлено, що МЦТЦ пригнічують синтез білка і нуклеїнових кислот у досліджених представників еукаріот, в той час як у прокаріот низькі концентрації токсинів активують синтез цих макромолекул.

Показано, що механізм дії МЦТЦ на бiлок-синтезуючу систему у дріжджів пов'язаний з порушенням активності ДНК - залежної РНК - полiмерази - ключового ферменту етапу транскрипції. Одержані дані суттєво доповнюють існуючі уявлення щодо МЦТЦ як інгібіторів окремих стадій етапу трансляції в системі еукаріот.

Виявлена стимулююча дія МЦТЦ на синтез хлорофілів а і в та каротиноїдів у Chlorella vulgaris при темновому режимі культивування і інгібуюча дія токсинів на ріст хлорели і синтез пігментів при культивуванні в умовах освітлення. Встановлено зниження сумарного вмісту АТФ у Chlorella vulgaris під дією цих токсинів. Показано, що екзогенне внесення АТФ на фоні МЦТЦ відновлює синтез пігментів i ріст клітин водорості при освітленні, що свідчить про порушення процесів фотофосфорилювання під дією цих метаболітів.

Аналіз отриманих результатів дозволив обгрунтувати явище контрактури скелетних м'язів при дендродохіотоксикозі, яке базується на здатності МЦТЦ підвищувати проникність мембран фракцій саркоплазматичного ретикулуму для іонів кальцію, яка супроводжується порушенням його градієнту на мембрані.

Теоретична i практична значимість. Результати дослідження молекулярних механізмів дiї МЦТЦ на мікроорганізми можуть мати значення для розуміння біохімічних процесів, що відбуваються при мікотоксикозах. Одержані результати можуть бути основою для розробки наукових підходів до діагностики, лікування і профілактики токсикозів, обумовлених МЦТЦ, а також для спрямованої розробки методів та засобів запобігання та зменшення прояву токсикозів.

Поряд з цим, одержані дані засвідчують можливість використання МЦТЦ як специфічних реагентів при вивченні окремих етапів синтезу білка, синтезу пігментів та процесів мембранного транспорту в різних біологічних системах.

Особистий внесок здобувача. Особиста участь дисертанта полягала в розробці методичних підходів, експериментальному обґрунтуванні та проведенні комплексу лабораторних досліджень, аналізі та узагальненні одержаних результатів та даних літератури. Отримані експериментальні дані опрацьовувались статистично.

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на VI з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Донецьк, 1984), на V з'їзді Українського біохімічного товариства (Івано-Франківськ, 1987), на Всесоюзній конференції "Антропогенна екологія мікроміцетів, аспекти математичного моделювання і охорона оточуючого середовища" (Київ, 1990).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 15 наукових праць з них 8 статей.

Структура та обсяг роботи. Загальний обсяг роботи становить 193 сторінок машинописного тексту. Вона складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини, висновків, списку використаних джерел (329 найменувань, з яких 246 - іноземних). Робота ілюстрована 4 таблицями та 38 рисунками.

Основний зміст

Розділ 1. Огляд літератури

У даному розділі, що представлений 5 підрозділами, дана коротка характеристика хімічної будови МЦТЦ та особливостей їх синтезу. Розглянута їх біологічна активність та існуючі уявлення про механізми дiї. Підкреслюється недостатність відомостей щодо механізму дії цих метаболітів, подається критичний аналіз літературних даних з проблеми, що вивчається. Окреслюються перспективні напрямки досліджень.

Розділ 2. Матеріали та методи досліджень

Головними об'єктами досліджень були МЦТЦ, що синтезуються Dendrodochium toxicum 5800: комплексний препарат дендродохін та вилучені з нього індивідуальні компоненти (верукарин А, рорідини А та Н). D. toxicum 5800 був отриманий з колекції відділу фізіології і систематики мікроміцетів. При вивченні механізму дії МЦТЦ як тест-культури використовували: Acholeplasma laidlawii PG-8, люб'язно надана в наше розпорядження докт.бiол. наук I.Г. Скрипалем, Saccharomyces cerevisiae "Феодосія" - вихідна культура, що зберігалася в музеї відділу фізіології i систематики мікроміцетів, Chlorella vulgaris L 62 люб'язно надана в наше розпорядження канд.біол.наук Н.В. Зольниковою (НДІ сільськогосподарської мікробіології, м. Пушкін, Росія). Як модельна система був також використаний саркоплазматичний ретикулум (СР), який вилучали зі скелетних м'язів кроля.

Методи досліджень. D. toxicum 5800 вирощували на стандартному середовищі Чапека. Дендродохін екстрагували із культуральних фільтратів хлороформом. Екстракти об'єднували і випаровували під зниженим тиском до одержання маслянистого залишку. Такий неочищений препарат в подальшому використовували для вилучення індивідуальних компонентів МЦТЦ в аналітично чистому вигляді. Індивідуальні токсини люб'язно надані в наше розпорядження докт. біол. наук О.М. Зайченко, за що ми йому щиро вдячні.

Дріжджі вирощували глибинним методом в експериментально відпрацьованих умовах (глюкозо-амонійне середовище). Хлорелу вирощували глибинним методом на рідкому середовищі [Методи…, 1978] в різних умовах освітлення: при помірному освітленні (4000 лк) та в темновому режимі. Протопласти дріжджів отримували з використанням ферментного препарату, вилученого нами з виноградного слимака Helix pomatia за методом Горлова та Кирилової (1978). Були експериментально підібрані умови максимального виходу протопластів. Виділення та очистку ДНК-залежної РНК-полiмерази проводили, виходячи з методів описаних у літературі [Roeder et al., 1969, Adman et al., 1972, Weil, Blatti, 1975, Valenzuela et al., 1976]. Аффiнну хроматографiю РНК-полiмерази проводили на гепарин-сефарозi 4В [Rato, Anfinsen, 1969], іонообмінну - на ДЕАЕ-сефадексi [Schwartz, Roeder, 1974]. Контроль активних фракцій полімерази проводили спектрофотометрично за вмістом білка [Bradford, 1986], а також за наявністю РНК - полiмеразної активностi, яку визначали за включенням [3Н] УТФ в кислотонерозчинний осад РНК [Adman et al., 1972]. Чистоту виділених препаратів контролювали за допомогою гель-електрофорезу в ПААГ [Laemmli, 1970] та чутливості до -аманітину [Valenzuela et al., 1976].

Виділення препарату загальної фракції мембран СР, "важкої" i "легкої" фракцій проводили згідно з методами, описаними Дядюшею i Курським (1985). Пасивне навантаження мембран фракцій CР та реєстрацію виходу кальцію з везикул СР проводили за В.А Тугай та ін. (1989).

При визначенні включення мічених попередників в ДНК, РНК i білок використовували [2 14С] тимiн (0,5 мкКі/мл), [2 14C] урацил (1 мкКі/мл), [2,3 3H] лейцин (1мкКі/мл), відповідно. Визначення вмісту АТФ в клітинах хлорели визначали використовуючи біолюмінесцентний метод в люцеферін-люциферазної реакції [Kiminich et al., 1975]. Визначення Са 2+-АТФ-азної активності фракції мембран СР проводили за Weber et al. (1966). Концентрацію неорганічного фосфору визначали за Fiske, Subbarow (1925). Результати дослідів обробляли статистично за Лакіним (1973).

Розділ 3. Вивчення динаміки росту тест-організмів та визначення діючих концентрацій досліджуваних токсинів

В основі виявлення механізмів дії МЦТЦ (дендродохіну, верукарину А, верукарину Н і рорідину А) з використанням комплексу тест-культур, адекватних особливостям їх біологічної активності. Тест-об'єкти мали суттєві відмінності в функціонуванні білок-синтезуючої системи та процесах енергозабезпечення клітини: дріжджі (вихідна культура та три адаптовані до високих концентрацій дендродохіну варіанти), хлорела як представник еукаріот та мiкоплазми - найпростіший представник прокаріот.

Вплив різних концентрацій МЦТЦ на ріст тест-культур досліджували для клітин, що знаходились в середині еспоненційної фази росту.

Параметри росту A. laidlawii були досліджені раніше [Скрипаль та ін., 1984]. Вивчення динаміки росту інших тест-культур на середовищі без токсинів показало, що вихідний штам дріжджів S.cerevisiae досягає стадії експоненційного росту на 12-14 год., а адаптовані варіанти - на 18 год. При вирощуванні Chl. vulgaris на гетеротрофному середовищі в режимі помірного освітлення час досягнення середини експоненційної фази складав 24 год., в темновому режимі - 33 год., на автотрофному середовищі - 40 год.

Встановлено, що дендродохiн в концентраціях від 2 до 100 мкг/мл пропорційно пригнічує ріст A. laidlawii, при цьому 5 мкг/мл викликає 30% пригнічення, 50 мкг/мл - 50%, а 100 мкг/мл - 75%. Токсична дія індивідуальних компонентів дендродохіну (верукарин А, рорідин А і рорідин Н) на ріст A. laidlawii була менш вираженою ніж при використанні комплексного препарату МЦТЦ.

Не спостерігалося суттєвих розбіжностей в чутливості досліджуваних культур дріжджів щодо дендродохiну. Дендродохін (10 мкг/мл) призводив до пригнічення росту вихідної культури на 65% і адаптованих варіантів 2а і 5а - на 75%. Ця обставина обумовила доцільність використання в подальших дослідженнях лише вихідної культури S. cerevisіae.

При культивуванні хлорели спостерігалась виражена iнгібуюча дія МЦТЦ на ріст культури, пропорційна концентрації досліджуваних токсинів. При концентрації індивідуальних токсинів 0,05 мкг/мл спостерігалось 30% пригнічення росту, а при 0,10 мкг/мл - 55 - 60%. Для досягнення аналогічного результату концентрація дендродохіну мала бути на порядок вищою.

Таким чином експериментально були встановлені такі діючі концентрації МЦТЦ для досліджуваних тест-культур (мкг/мл): A. laidlawii - 2 - 50; S. cerevisіae - 1 - 100; Chl. vulgaris - 0,05 - 1,0. Отже, МЦТЦ характеризувались найбільш вираженою фітотоксичною дією і найменш вираженою дією щодо мікоплазм.

Розділ 4. Вплив досліджуваних макроциклiчних трихотеценiв на синтез білка та нуклеїнових кислот у тест-організмів

Згідно даним наукової літератури, окремі представники МЦТЦ за ступенем інгібіторної дії на синтез білка, як правило, порівнюють з циклогексимiдом [Carrasco, 1973, Ueno, 1973, 1986]. Слід зазначити, що цими авторами досліджувалась дія лише верукарину А. В даній роботі ставилось завдання дослідити вплив як комплексного препарату дендродохiну так i його індивідуальних компонентів на синтез макромолекул у кожної з обраних нами тест-культур, які мали суттєві відмінності в процесах синтезу білку та енергозабезпечення клітин, що надавало можливість одержання більш повної картини пошкоджуючої дiї досліджуваних МЦТЦ в системах прокаріот i еукаріот.

Встановлено, що лише дендродохiн пригнічував як синтез білка, так i синтез нуклеїнових кислот у A.laidlawii. Ці результати узгоджуються з даними, одержаними при вивченні впливу комплексного препарату МЦТЦ на ріст A.laidlawii. Верукарин А, рорідин А та рорідин Н (1-10 мкг/мл) активували синтез РНК у A.laidlawii. Верукарин А i рорідин А також значно активували синтез ДНК, а рорідин Н - пригнічував синтез ДНК.

Індивідуальні МЦТЦ справляли різний вплив на синтез білка. Так, дія верукарину А була найменш вираженою, рорідин А - пригнічував, а рорідин Н - активував цей процес. Проте слід зазначити, що величина як активуючої, так i iнгібуючої дiї МЦТЦ на синтез бiлка не перевищувала 30%, в той час як величина активації синтезу нуклеїнових кислот досягала 200 %. Таким чином, найменш чутливим до дії досліджуваних МЦТЦ у A. laidlawii був процес синтезу бiлка. Встановлений нами вперше факт суттєвої активації синтезу ДНК i РНК у ахолеплазми вказує на те, що у цієї культури вплив токсинів на білок-синтезуючу систему відбувається вже на етапі транскрипції. Всі досліджені МЦТЦ пригнічували синтез білка, РНК, ДНК у представників еукаріот.

У хлорели найбільш чутливим до дії МЦТЦ був синтез ДНК, за ним - синтез білка i, нарешті, синтез РНК. Однак розбіжності в чутливості до дії МЦТЦ спостерігалися лише при концентраціях токсинів від 0,05 до 0,50 мкг/мл, а при 0,50 мкг/мл МЦТЦ спостерігали 90% пригнічення синтезу як бiлка, так i нуклеїнових кислот.

У дріжджів найбільш чутливим до дії токсинів виявився процес синтезу бiлка, найменш чутливим - синтез ДНК. Слід зазначити, що концентрація МЦТЦ 0,50 мкг/мл, що викликала у хлорели пригнічення включення мічених попередників як в білок, так i в нуклеїнові кислоти на 90%, не впливала на ці процеси у S. Cerevisіae.

Під дією токсинів у дріжджів порушується процес синтезу РНК, що може свідчити про те, що вплив МЦТЦ відбувається вже на етапі транскрипції, який регулює синтез РНК. Дані щодо дії вказаних токсинів на цей етап синтезу білка в доступній нам літературі відсутні. Виходячи з того, що досліджувані токсини справляли незначний вплив на синтез ДНК, ми припустили, що основною мішенню дії МЦТЦ в цьому випадку може бути ключовий фермент цього етапу - ДНК-залежна РНК-полiмераза.

Розділ 5. Вплив досліджуваних макроциклічних трихотеценiв на активність ДНК-залежної РНК-полiмерази

ДНК-залежна РНК-полiмераза була виділена нами з чутливої до дендродохіну культури S. cerevisiae шт. "Феодосія" з використанням існуючих методичних підходів [Valenzuela et al., 1976] з деякими нашими модифікаціями. Схему виділення цього ферменту можна представити наступним чином:

Елюцiя з ДЕАЕ-сефадексу дозволила виявити три піки ферментативної активностi, які елюювались при концентрації сульфату амонію в розчині 0,16 - 0,18 (фракція I), 0,22-0,25 (фракція II), 0,29 - 0,31 M (фракція III), відповідно i мали різну чутливість щодо дії - аманiтину. Отримані результати узгоджуються з даними літератури і дають підстави для ствердження, що виділена нами фракція I відповідає РНК-полiмеразi I, фракція II - РНК-полiмеразi II, фракція III - РНК-полiмеразi III.

Показано, що дендродохiн пригнічує загальну РНК-полiмеразну активність на 30%, що добре узгоджується з нашими даними щодо впливу дендродохіну на сумарний синтез РНК. Встановлено також, що досліджувані МЦТЦ по різному впливали на кожну з трьох форм ферменту.

Досліджувані МЦТЦ проявляли активуючу дію на РНК-полiмеразу I в концентраціях 1-80 мкг/мл. Максимальна активація верукарiном А спостерігалась в концентраціях від 20 до 70 мкг/мл, рорідином А - від 20 до 50 мкг/мл, а дендродохiном - 50мкг/мл. При дії рорідину Н спостерігалась активація ферменту, пропорційна його концентрації (до 160% від контролю при концентрації рорідину Н в 100 мкг/мл).

Верукарин А пригнічував, а рорідин А активував РНК-полімеразу ІІ в концентраціях від 5 до 50 мкг/мл. Рорідин Н в діапазоні концентрацій від 5 до 50 мкг/мл пригнічував активність ферменту (до 40%).

Дендродохiн у тому ж діапазоні концентрацій спричиняв активуючу дію, величина якої сягала 130%. При концентраціях рорідину Н i дендродохiну від 50 до 100 мкг/мл, перший - активував, а другий - пригнічував активність РНК-полiмерази II, а максимальна величина цих ефектів складала близько 40%.

Досліджувані МЦТЦ пригнічували активність РНК-полiмерази III. За ступенем зростання iнгібуючої дії їх можна розмістити в ряд: дендродохiн < верукарiн А < рорідин Н < рорідин А, а величини пригнічення при використанні концентрації 100 мкг/мл складали: 30%, 40%, 50%, 60%, відповідно

Одержані результати дозволяють стверджувати, що досліджувані МЦТЦ впливають на бiлок-синтезуючу систему дріжджів вже на етапі транскрипції.

Пригнічення активності РНК-полiмерази III визначає зниження синтезу як тРНК, так i 5S - РНК. При цьому спостерігається активація РНК-полiмерази I, відповідальної за синтез рРНК. Таким чином, відбувається порушення співвідношення форм РНК, яке й приводить до подальших порушень в бiлок-синтезуючiй системі дріжджів.

МЦТЦ відомі як інгібітори процесів ініціації етапу трансляції [Carrasco, 1973, Cundliffe, 1974, 1977, Wei, 1974, McLaughlin, 1977]. Отримані результати як, нам здається, суттєво доповнюють літературні дані i розширюють наші уявлення про вплив МЦТЦ на бiлок-синтезуючу систему у представників еукаріот.

Розділ 6. Вплив макроциклiчних трихотеценiв на синтез фотосинтетичних пігментів у Chlorella vulgaris

При вивченні впливу МЦТЦ на ріст i бiлок-синтезуючу систему хлорели при культивуванні її на гетеротрофному середовищі з помірним освітленням 4000лк, був встановлений факт депігментації, який може бути пов'язаний з порушенням синтезу пігментів. Дослідження впливу токсинів проводили з використанням верукарину А, рорідину А і рорідину Н. Їх вплив на процеси, що вивчалися, був практично однаковий, тому дані наводяться по одному з токсинів - рорідину А. Під дією токсинів спостерігалося зниження синтезу хлорофілів а i в та каротиноїдів, пропорційне концентрації досліджуваних токсинів.

Слід зазначити, що синтез пігментів значно чутливіший до дії токсинів ніж синтез білка. Так, при концентрації токсинів 0,05 мкг/мг (0,1 мкМ) приблизно на 50% iнгiбується синтез білка, а синтез пігментів - на 80%.

Порівняльний аналіз впливу МЦТЦ на ріст i синтез пігментів в динаміці культивування виявив, що пригнічення синтезу токсинів спостерігається на 12 год. культивування, а пригнічення росту - на 30год.

Таким чином, МЦТЦ проявляють значну дію на пігмент білковий комплекс - порушуючи, хоча i в різній мірі, як синтез білка, так i синтез пігментів.

Така дія МЦТЦ може бути наслідком порушення реакцій, пов'язаних з синтезом попередників пігментів, або ж сумарних енергетичних процесів, що забезпечуються системами фотофосфорилювання та(або) окислювального фосфорилювання. Внесення в середовище для культивування хлорели на фоні дії МЦТЦ попередника синтезу пігментів - ацетил-КоА не перешкоджало інгібуючому впливу мікотоксинів.

Для більш детального вивчення дії МЦТЦ на синтез пігментів хлорели були проведені дослідження щодо впливу різних умов культивування: темнового режиму на гетеротрофному середовищі та світловому на гетеротрофному та автотрофному середовищах. Показано, що при культивуванні хлорели у темновому режимі на гетеротрофному середовищі, коли енергетичне забезпечення клітини відбувається за рахунок процесів окислювального фосфорилювання [Kandler, 1966], рорідин А не впливав на ріст хлорели при всіх досліджуваних концентраціях, а в діапазоні концентрацій від 0,01 до 0,05 мкг/мл не впливав на синтез пігментів. При підвищенні концентрації рорідину А від 0,05 до 0,15 мкг/мл спостерігалась активація синтезу хлорофілів а і в, яка досягала в середньому 175% від контролю. Активуючий вплив на синтез каротиноїдів в межах наведених концентрацій досягав до 250%. Пояснення цього феномену потребує подальших досліджень. Одною з гіпотез, що може в якійсь мірі дати пояснення цього явища, є допущення можливості інтерференції між МЦТЦ з одного боку і пігментами - з другого, яка базується на спільності шляхів біосинтезу цих метаболітів, а, відповідно, і наявності спільних структурних елементів [Bamburg, Strong, 1971].

При автотрофному, так і на гетеротрофному середовищі, спостерігався сильно виражений iнгібуючий вплив рорідину А на ріст хлорели і синтез пігментів. При концентрації рорідину А 0,05 мкг/мл спостерігалось в середньому 30% пригнічення росту та 50% і 80% інгібування синтезу пігментів при культивуванні на гетеротрофному і автотрофному середовищі, відповідно.

В зв'язку з тим, що пригнічення синтезу пігментів під дією рорідину А відбувалося в світловому режимі культивування, коли енергозабезпечення клітини здійснюється за рахунок фотофосфорилювання [Urbach, 1964], необхідно було дослідити вплив МЦТЦ на синтез АТФ в клітинах хлорели.

Встановлено, що токсини інгибували синтез АТФ до 30%. Вплив досліджуваних МЦТЦ на рівень АТФ можна порівняти з дією такого роз'єднувача фотофосфорилювання, як карбонiлцианiдхлорфенiлгiдразина (КЦХФГ) під дією якого, згідно з даними літератури, рівень АТФ при освітленні у одноклітинних водоростей, в тому числі i у хлорели, значно зменшується [Jeanjean, 1976].

Для з'ясування ролі зниження синтезу АТФ під дією рорідину А в порушенні функціонування клітини, а саме у синтезі хлорофілів i каротиноїдів, вивчали вплив екзогенно. Вплив рорідину А внесеної АТФ (0,2 мМ) у середовище для на вміст АТФ в клітинах культивування хлорели одночасно з роріди - Chlorella vulgaris ном А. Показано, що внесення АТФ К - контроль (без токсину) викликало відновлювальну дію щодо синтезу пігментів на фоні дії токсинів, це добре узгоджується з даними літератури про те, що екзогенна АТФ може "відновлювати" фотосинтез хлорели, після пригнічення роз'єднувачем КЦХФГ [Глаголєва, 1987]. Слід зазначити, що у наших експериментах екзогенно внесена АТФ проявляла відновлювальну дію на синтез пігментів як енергетичний еквівалент, бо екзогенне внесення АДФ в тій самій концентрації не викликало "відновлювальної" дії на синтез пігментів.

Таким чином, інгібуюча дія рорідину А спрямована лише на процеси, які відбуваються в клітинах хлорели при освітленні, тобто вони пов'язані з порушенням процесів фотофосфорилювання.

Розділ 7. Вплив досліджуваних МЦТЦ на АТФ-азну активність різних фракцій саркоплазматичного ретикулуму

Згiдно з даними літератури при дендродохiотоксикозi спостерігається контрактура м'язів [Пiдоплiчко, Бiлай, 1970], однією з можливих причин якої може бути порушення функції скорочення скелетних м'язів.

Цикл "скорочення - розслаблення", як відомо, регулюється локальною зміною концентрації іонів кальцію. В цьому циклічному процесі головну роль виконують мембрани СР, які в АТФ-залежному процесі транспортують кальцій до порожнин ретикулуму проти концентраційного градієнту, забезпечуючи розслаблення [Ebashi, 1961], і під дією нервового імпульсу звільняють кальцій в цитоплазму [Rios, Pizzarro, 1988] для ініціації процесу скорочення.

Дослідження впливу різних концентрацій дендродохіну на величину АТФ-азної активності показало, що в сумарній фракції мембран не виявлено достовірних змін активності ферменту. Враховуючи той факт, що сумарна фракція мембран СР складається з "легкої" та "важкої" фракцій мембран, що різняться за активністю Mg2+, Ca₂+- АТФ-ази (Kay, Norma, 1989), при проведені даних досліджень потрібно було розділити сумарну фракцію на її складові з метою виявлення можливої дії дендродохіну на одну з них.

Встановлено, що дендродохін в концентраціях 100 - 200 мкг/мл активує Mg2+, Ca 2+- АТФ-азну активність фракцій мембран СР, збагаченої термінальними цистернами ("важка" фракція), і не впливає на Mg₂+, Ca ₂+- АТФ-азну активність фракцій мембран, які походять з продовгуватих трубочок ("легка" фракція). Ці розбіжності, можливо, пов'язані з характерними властивостями субфракцій мембран СР, а саме: співвідношення ліпід/білок у фракції мембран, які походять з термінальних цистерн складає 0,94, а в фракції мембран, які походять з продовгуватих трубочок - 0.39. Число обертів ферменту "важкої" фракції вище, ніж "легкої" і складає 640 і 440 об/хв, відповідно [Van Winkle, 1982].

Виходячи з наведених даних літератури, можна припустити, що підвищення Mg₂+, Ca₂+- АТФ-азної активності фракції мембран СР, збагаченої термінальними цистернами під впливом дендродохіну, може бути обумовлене частковим підвищенням вмісту вільних ліпідів внаслідок порушення білок-ліпідної взаємодії під впливом дендродохіну, який має яскраво виражені гідрофобні властивості. Такі порушення часто призводять до збільшення проникності мембран. Для перевірки цього припущення був виявлений вплив досліджуваних токсинів на проникність мембран СР.

На моделі замкнених мембран СР досліджували їх проникність для Са₂+ в умовах розсіювання градієнту цього катіона і вплив токсинів на цей процес. Він складається з двох фаз (Caswell, Brandt, 1981), які відрізняються за швидкістю. В першу, швидку фазу відбувається рух кальцію по специфічним каналам, тоді як більш повільна фаза відображає дифузійний процес.

Встановлено, що з підвищенням концентрації мікотоксинів в середовищі від 25 до 100 мкг/мл підвищується швидкість виходу кальцію із СР. Найбільший вплив на звільнення кальцію з везикул СР справляв верукарин А. Його дія, як і інших досліджуваних токсинів, відбувалась у першу швидку фазу, що може свідчити про вплив токсинів на канальну провідність мембран. В той же час токсини не впливали на швидкість виходу кальцію в другу фазу, обумовлену дифузією кальцію крізь мембрани СР.

Одержані нами результати щодо впливу досліджуваних МЦТЦ на транспортні процеси в мембранах СР узгоджуються з дією відомого кальцієвого iонофора А 23187, в присутності якого зростає активність Mg₂+, Ca₂+ - АТФ-ази із-за підвищеної проникності мембран для Са₂+ (Scarpa et al., 1972). Сутність цього явища полягає в тому що, по мірі накопичення Са₂+ в СР в АТФ-залежному процесі кількість Са₂+ в порожнинах ретикулуму збільшується і відповідно зростає його градієнт. При цьому, якщо проникність мембрани СР під впливом А 23187 збільшується, то градієнт Са 2+ розсіюється, і активність ферменту в такому випадку збільшується.

Кінетика виходу 45Са₂+ із везикул фрагментованого саркоплазматичного ретикулуму під впливом різних концентрацій рорідину А(А), рорідину Н (Б), верукарину А (В)

Можна припустити, що встановлена спрямованість змін в активності ферменту під впливом МЦТЦ обумовлена не прямою дією токсинів на активність ферменту, а відбувається за рахунок збільшенням проникності мембрани СР для кальцію. Підвищення проникності для Са ₂+сприяє його накопиченню в цитоплазмі, що і супроводжується контрактурою м'язів, як це має місце при дендродохіотоксикозі.

Висновки

1. Встановлені концентрації для досліджуваних МЦТЦ: дендродохіну та виділених з нього індивідуальних компонентів верукарину А, рорідину А і рорідину Н, що викликають 30-50% пригнічення росту досліджуваних тест-культур - Acholeplasma laidlawii PG-8, Saccharomyces cerevisiae, штам "Феодосія", Chlorella vulgaris L 62. Показано, що концентрації верукарину А, що викликають 30% пригнічення росту у мікоплазм становлять 50 мкг/мл, а у хлорели - 0,05 мкг/мл.

2. Дендродохін проявляв інгібуючу дію на синтез білка і нуклеїнових кислот у Acholeplasma laidlawii, а верукарин А, рорідин А спричиняли значну активуючу дію (до 200%) на синтез ДНК і РНК при концентраціях від 1 до 20 мкг/мл.

3. Дендродохін, верукарин А, рорідин А i рорідин Н пригнічують синтез білка і нуклеїнових кислот у досліджених представників эукаріот Chlorella vulgaris і Saccharomyces cerevisiae. Встановлено, що у Chlorella vulgaris найбільше чутливим до дії токсинів (0,05 і 0,5 мкг/мл) є синтез ДНК, а найменш чутливим - синтез білка. У Saccharomyces cerevisiae процеси синтезу макромолекул по чутливості до дії токсинів (10 мкг/мл) можна розташувати в такому порядку - синтез білка, синтез РНК, синтез ДНК (до 25%, 40%, 70% інгібування, відповідно).

4. Досліджувані токсини інгібують синтез білка в Saccharomyces cerevisiae на етапі транскрипції, що встановлено нами вперше. Вони активують ДНК-залежну РНК-полімеразу I, в залежності від концентрації активують або інгібують РНК-полімеразу II, інгібують РНК-полімеразу III.

5. Досліджувані токсини активують синтез хлорофілів а і в (до 175% від контролю) і каротиноїдів (до 250% від контролю) при темновому режимі культивування Chlorella vulgaris і інгібують при світловому режимі культивування на гетеротрофному і автотрофному середовищах (на 50% і 80% від контролю, відповідно).

6. Досліджувані токсини знижують сумарний вміст АТФ у клітинах Chlorella vulgaris при культивуванні в умовах освітлення. Екзогенне внесення АТФ в концентрації 0,2 мМ на фоні дії цих метаболітів спричиняє відновлювальну дію на пігмент-синтезуючу активність.

7. Вперше представлене експериментальне обгрунтування прояву контрактури скелетних м'язів у тварин, що спостерігається при дендродохіотоксикозі. МЦТЦ підвищують проникність мембран саркоплазматичного ретикулуму для іонів кальцію. При цьому розсіюється їх градієнт на мембрані і не наступає розслаблення м'язів.

8. Встановлено, що для досліджуваних МЦТЦ верукарину А, рорідину А i рорідину Н характерна поліфункціональність в дії на активність метаболічних процесів у представників эукаріот і прокаріот.

Список основних опублікованих праць

Скрипаль И.Г., Зайченко А.М., Бабичев В.В., Тугай Т.И., Малиновская Л.П. О механизме действия 12,13-эпокситрихотеценов на синтез макромолекул у моликутов //Микробиол. журн. - 1988. - 50, № 4. - С. 38 - 44.

Zaichenko A.M., Tugai T.I., Pavlovkin J. Effects of macrocyclic trichothecenes on bleaching in Chlorella vulgaris // Biologia (Bratislava). - 1989. - 44, N 11. - P. 1097 - 1105.

Tugai T.I., Zaichenko A.M., Pavlovkin J. Some aspects of the phytotoxic action of macrocyclic trichothecenes // Biologia (Bratislava). - 1989. - 44, N 11. - P. 1107 - 1112.

Зайченко А.М., Тугай Т.И., Шляховой В.В. Биосинтез 14С-макроциклических трихотеценов //Микробиол.журн. - 1989. - 51, № 2. - С. 71 - 74.

Тугай Т.И., Тугай В.А. Влияние макроциклических трихотеценов на фрагментированный саркоплазматический ретикулум скелетных мышц // Вісник проблем біології і медицини. - 1999. - 4. - С. 50 - 56.

Тугай Т.И. Новые данные о механизме действия некоторых макроциклических трихотеценов // Ред. ж. "Проблемы современной биологии" МГУ, Москва, 1986 - 4с. Деп. в ВИНИТИ. - 1986, № 6642 -В 86.

Зайченко А.М., Тугай Т.И., Павловкин Я. О развитии "альбинизма" у Chlorella vulgaris под влиянием некоторых макроциклических трихотеценов // Ред. ж. "Микробиологический журнал" - Киев, 1989 - 16 с. Деп. в ВИНИТИ 30.08.88 г., № 6961 -В 88.

Тугай Т.И., Зайченко А.М., Павловкин Я. Некоторые особенности механизмов фитотоксического действия макроциклических трихотеценов из Dendrodochium toxicum // Ред. ж. "Микробиологический журнал" - Киев, 1989 - 11 с. Деп. в ВИНИТИ. 30.08.88 г., № 6923-В 88.

Зайченко А.М., Полищук Т.И., Шляховой В.В. Об ингибировании синтеза белка и нуклеиновых кислот у Saccharomyces vini некоторыми трихотеценовыми микотоксинами // Тез. докл. VI съезда Укр.микробиол.об-ва - Киев: Наукова Думка. - 1984. - С. 60 - 61.

Зайченко А.М., Тугай Т.И. Современные представления о механизме действия трихотеценовых микотоксинов // Тез.докл. V съезда Укр.биохим.об-ва - Ив.-Франковск: Наукова Думка. 1987. - С. 58 - 59.

Тугай Т.И. Некоторые аспекты механизма действия макроциклических трихотеценов в их приложении к микотоксикозам //Тез.докл. Всесозн.конф. "Антропогенная экология микромицетов, аспекты математического моделирования и охрана окружающей среды" - Киев. 1990. - С. 70.

Размещено на Allbest.ru

...