Роль кальцієвих і калієвих каналів у сигнальних функціях нервових клітин

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Міжнародний Центр молекулярної фізіології

Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття ученого ступеня доктора біологічних наук

РОЛЬ КАЛЬЦІЄВИХ І КАЛІЄВИХ КАНАЛІВ У СИГНАЛЬНИХ ФУНКЦІЯХ НЕРВОВИХ КЛІТИН

Спеціальність: Біофізика

ФЕДУЛОВА СВІТЛАНА АНАТОЛІЇВНА

Київ, 2001 рік

ВСТУП

Актуальність проблеми.

Однією із властивостей нервових клітин, що забезпечують їх сигнальну функцію, є електрозбудливість. Вивчення механізмів електрозбуливості нервової клітини - найбільш актуальний напрямок сучасної нейрофізіології. Електрична активність нейронів є тим ініціюючим фактором, що приводить до викиду нейромедіатора в нервових закінченнях і запуску каскаду складних реакцій, що обумовлюють такі явища, як нейрональна пластичність, навчання і пам'ять. У сомі і нейритах нервової клітини відбувається аналіз та інтегрування сигналів, що надходять через синапси аферентних сигналів та генерація відповіді у вигляді потенціалу дії (ПД), що поширюється.

Найважливіша роль у регуляції збудливості нейрона відведена різним типам потенціалокерованих натрієвих, кальцієвих і калієвих каналів у сомі та відростках нервових клітин. Особливий інтерес представляє одержання нових даних про функціювання кальцієвих каналів, що відіграють основну роль у сполученні різних внутрішньоклітинних і мембранних процесів. Кальцієвий струм, що протікає по цих каналах, може помітно змінювати концентрацію іонів кальцію всередині клітини та активувати секрецію нейромедіаторів і різноманітні внутрішньоклітинні процеси. Синаптична передача обумовлена великою кількістю мало вивчених механізмів, що стосуються контролю вивільнення нейромедіатора, опосередкованого входом іонів Са2+ у пресинаптичне закінчення.

Вихідний калієвий струм реполяризує мембрану після її деполяризації і стабілізує мембранний потенціал. Тип, кількість і щільність розподілу калієвих каналів відіграють важливу роль у регуляції властивостей збудливості нейронів, таких як здатність генерувати потенціали дії з різною частотою і модулювати тривалість і форму ПД. Зміна тривалості ПД і рівня деполяризації мембрани приводять, у свою чергу, до зміни потоку кальцію через потенціалокеровані кальцієві канали усередину клітини, що впливає на кальцій-залежні внутрішньоклітинні процеси. Актуальним є розуміння ролі та взаємодії різних типів каналів калієвого і кальцієвого струмів у складній системі функціювання нервової клітини, опис специфічних параметрів цих струмів, що визначають їх інтегративні властивості та забезпечують сигнальні функції нейронів. Вивчення участі кальцієвих і калієвих струмів у формуванні типу електричної активності на різних етапах онтногенетичного розвитку може дати ключ до розуміння того, як мембранні процеси визначають функціональні особливості сенсорних нейронів. Механізми зміни сили синаптичного зв'язку шляхом фармакологічного впливу на кальцієві і калієві канали поодинокої пресинаптичної терміналі нейронів центральної нервової системи (ЦНС) є найменш вивченими зі складних процесів, які регулюють викид нейромедіатора.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконана в рамках наукових програм відділу загальної фізіології нервової системи Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України: "Молекулярні механізми інтегративной функції нервових клітин у нормі і при мозковій патології", "Зміни калієвої провідності у тривалокультивованих нейронів гіпокампа", а також наукових тем Міжнародного Центра Молекулярної фізіології НАН України: "Дослідження механізмів квантової передачі в поодиноких синапсах центральних нейронів ссавців", "Дослідження механізмів гальмівної синаптичної передачі нейронів центральної нервової системи".

Мета роботи.

Мета роботи полягала у визначенні ролі кальцієвих і калієвих каналів у формуванні електричної активності нейронів у розвитку і з'ясуванні функціонального значення кальцієвої і калієвої провідностей у регуляції механізмів генерації потенціалу дії та викиду нейромедіатора, тобто у здійсненні нейронами, що належать до різних відділів нервової системи, іх сигнальних функцій.

Задачі дослідження:

1. Зробити розділення та ідентифікацію потенціалокерованих кальцієвих і калієвих струмів, що протікають через різні типи каналів соматичної мембрани сенсорних і гіпокампальних нейронів, описати електрофізіологічні і фармакологічні властивості потенціалокерованих кальцієвих і калієвих каналів;

2. Вивчити зміни щільності каналів кальцієвого та калієвого струмів нейронів в онтогенетичному розвитку і функціональну роль цих змін у формуванні електричної активності;

3. Дослідити механізми викиду нейромедіатора з поодинокої пресинаптичної терміналі гальмівних синапсів культивованих нейронів гіпокампу;

4. Вивчити вплив потенціалокерованих кальцієвих і калієвих каналів мембрани пресинаптичної терміналі нейронів гіпокампа на механізми викиду нейромедіатора;

5. Дослідити вплив на синаптичний зв'язок фармакологічних і електрофізіологічних факторів, що змінюють потенціалокеровані кальцієву та калієву провідності пресинаптичної терміналі.

Наукова новизна отриманих результатів:

1. Продемонстровано, що інтегральна калієва провідність у сенсорних нейронах формується трьома типами вихідних калієвих струмів, подібних А-, DR-, K- типам калієвих струмів, зареєстрованих у соматичнїй мембрані нейронів гіпокампа. У сомі нейронів гіпокампа, окрім цих струмів, також зареєстровано і описано D-струм;

2. Для сенсорних нейронів, вивчені зміни щільності кальцієвих і калієвих струмів в онтогенезі. Встановлено, що низькопорогові кальцієві канали, характерні для сенсорних нейронів, що розвиваються, зникають в процесі онтогенезу, у той час як високопорогові кальцієві канали присутні у соматичній мембрані протягом усього раннього онтогенезу;

3. Використовуючи експериментальні дані, що одержані при досліджені онтогенетичних змін кальцієвих і калієвих каналів, методом чисельного експерименту була проведена реконструкція можливих змін у генерації ПД, що являється однією з сигнальних функцій сенсорних нейронів. Показано, що на генерацію повторних ПД критичний вплив робить визначений баланс між низькопороговою кальцієвою провідністю і компонентом калієвої провідності, що інактивується;

4. Показано, що в культивованих нейронах гіпокампа високопороговий кальцієвий струм може бути розділений на 3 підтипи на основі їх різної фармакологічної чутливості. Показано, що основна роль у забезпеченні викиду нейромедіатора в гальмівних синапсах належить високопороговим кальцієвим каналам N- і P/Q- підтипів,а високопорогові кальцієві канали L-підтипу не беруть участі у гальмівній синаптичній передачі культивованих нейронів гіпокампу;

6. Показана можливість багатоквантового викиду нейромедіатора з поодинокої пресинаптичної терміналі нейронів гіпокампа. Викид нейромедіатора є випадковим процесом, що описується статистичним законом Пуассона. Збільшення потоку іонів Са2+ у пресинаптичну терміналь шляхом підвищення його позаклітинної концентрації або збільшення інтенсивності стимуляції приводить до росту середнього вмісту квантового викиду за рахунок збільшення ймовірності багатоквантового викиду;

7. Встановлено, що блокування потенціалокерованих калієвих каналів, опосередковано збільшуючи вхід іонів Са2+ в пресинаптичну терміналь, приводить до збільшення сили синаптичного зв'язку за рахунок збільшення ймовірності багатоквантового викиду нейромедіатора при незмінній величині одного кванта. У формуванні калієвої провідності пресинаптичного закінчення домінуючу роль грають 4-АП чутливі калієві струми (ймовірніше за все А-типу);

8. Продемонстровано, що при тривалій деполяризації пресинаптичної терміналі викид нейромедіатора може відбуватися тільки у визначені, найбільш ймовірні моменти часу, середній інтервал між викидами 2.97±0.86 мс. Кількість везикул, що вивільняються в найбільш імовірний час, є випадковою величиною. Існування найбільш імовірних часів викиду зв'язано не з виснаженням запасу везикул, готових до викиду, і не з рівнем деполяризації пресинаптичної мембрани, а залежить від потоку кальцію усередину терміналі.

Практичне значення отриманих результатів.

Дане дослідження має фундаментальне значення і значно поглиблює і розширює існуючі уявлення про функціювання кальцієвих і калієвих каналів соматичної мембрани сенсорних і центральних нейронів, їх ролі в генерації ПД, а також про механізми вивільнення нейромедіатора з нервових закінчень у центральній нервовій системі. З'ясування закономірностей експресії кальцієвих і калієвих каналів у соматичній мембрані сенсорних нейронів у процесі онтогенезу істотне для з'ясування закономірностей розвитку нервової системи. Дані про механізми синаптичної передачі в нейронах ЦНС і точний кількісний аналіз квантового викиду в поодиноких центральних синапсах мають загальнобіологічне значення, оскільки дотепер такий аналіз був практично недоступний у силу серйозних технічних обмежень. Нові знання про механізми, що лежать в основі міжклітинної комунікації, є важливими для розуміння таких явищ як навчання і пам'ять.

Проведені дослідження властивостей і функцій кальцієвих і калієвих каналів сенсорних і центральних нейронів створюють теоретичну основу для пошуку селективно діючих фармакологічних і біологічно активних препаратів і ефективної цілеспрямованої корекції патологічних станів.

Особистий внесок здобувача.

Автор самостійно розробляла методики ізоляції та культивування функціонально повноцінних нейронів різних відділів ЦНС, технічне обґрунтування методики стимуляції поодинокої пресинаптичної терміналі нейронів гіпокампа і внесла ряд удосконалень у цю методику та самостійно проводила більшу частину експериментів, аналіз, статистичну обробку й узагальнення результатів. Деякі експерименти були проведені разом з іншими співавторами опублікованих робіт, співробітниками Інституту фізіології О.О. Богомольця НАН України: академіком П.Г. Костюком, д. б. н. М.С. Веселовським, аспірантами Д.В. Васильєвим і О.В. Ісаєвою. В роботі використовувалося унікальне електрофізіологічне устаткування, створене провідним інженером С.Г. Романюком.

Апробація результатів дисертації.

Усі матеріали дисертації представлялися на семінарах Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, на Всесоюзних симпозіумах і з'їздах, на щорічних зборах нейрофізіологічного товариства США (Новий Орлеан, 1997, Лос-Анжелес, 1998, Маямі, 1999), на щорічних зборах біофізичного товариства США (Сан-Франциско, 1991, Канзас-Сіті, 1998), на Міжнародних конгресах фізіологічних наук (Гельсінкі 1989, Київ, 1997) на 5-ому Всесвітньому конгресі ІБРО (Єрусалім, 1999), на зборах фізіологічного товариства Великобританії (Бірмінгем, 1999, Лондон, 2000), на конференції НАТО "Кальцієва сигналізація" (Ель Чокко, Італія, 2000), на симпозіумах "Кальцій як молекула для клітинної інтеграції" (Кент, 2000), "Мембрани і сигналізація" (Київ, 2000), на засіданнях сектора молекулярної фізіології Інституту фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України.

Публікації.

За результатами роботи опубліковано 31 стаття у провідних вітчизняних і закордонних журналах і 17 (за останні 3 роки) тез доповідей.

Структура й обсяг дисертації.

Дисертація складається з вступу, огляду літератури, опису методів досліджень, результатів досліджень (6 розділів), аналізу й узагальнення результатів, висновків і списку 283 використаних літературних джерел. Робота викладена на 246 сторінках, містить 6 таблиць, проілюстрована 62 рисунками.

1. МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об'єкти дослідження. В експериментах використовувалися неідентифіковані нейрони чотирьох поперекових пар СГ щурів (первинні сенсорні нейрони) п'яти вікових груп: ембріони 17 дня пренатального розвитку, 1, 5-6, 14-15 і 90-100-го днів постнатального розвитку. Нейрони СГ ембріонів і новонароджених щурів ізолювалися з застосуванням ферментативно-механічної обробки. Клітини залишалися в модифікованому середовищі Ігла на час електрофізіологічних досліджень.

Для приготування первинної культури нейронів гіпокампа використовувався мозок новонароджених щурів лінії Вістар. Тварин декапітували, їх мозок поміщали у фосфатний буфер, що не містив Са2+ і Mg2+ і мав такий склад (у мМ/л): NaCl - 137, KCl - 2.7, KH2PO4 - 1.47, Na2HPO4 - 8.06, глюкоза - 20, HEPES - 15, натрієва сіль бензилпеніціліна - 25 од/мл, стрептоміцина сульфату - 25 мкг/мл. Гіпокамп виділяли і поперечно розрізали на частини товщиною 2-3 мм. Після 10-ти хвилинної обробки 0,025%-ним розчином трипсину у фосфатному буфері при 34 0С тканину промивали в мінімальному середовищі Ігла з додаванням 10% кінської сироватки. У цьому розчині клітини гіпокампа механічно дисоціювалися. Щільність клітин підраховувалася на гемоцитометрі, після чого вона доводилася до остаточної щільності висіву 35000 клітин/см2 на скло, попередньо оброблені полі-L-орнітином і ламініном. Культивування проводилося при 37 0С в повітряно-газовому середовищі, збагаченному СО2 до 5%. На другий-третій день культивування в середовище додавалося 5 мкM цитозин-А-D-арабіно-фуранозіда для придушення проліферації гліальних клітин, а через 15-20 годин після цього здійснювалася повна зміна культурального середовища.

Штучні сольові розчини. При видаленні з розчинів іонів Na+ вони замінялися еквімолярною концентрацією іонів холіну. Осмотичність модифікованих розчинів підтримувалася додаванням хлориду холіну. При реєстраціях струмів методом "петч клемп" у конфігурації "ціла клітина" склад внутрішньопіпеточного розчину був наступним (у мМ/л): СsCl- 130, ТЭA-Cl- 10, MgCl2- 5, CaCl2- 1, ЭГТА- 10, трис-Cl- 10 чи CsCl - 60, CsOH - 60, EGTA - 10, HEPES - 20, рН доводили до 7,3 додаванням СsОН і DL-аспарагінової кислоти. При реєстрації вихідних калієвих струмів клітина заповнювалася наступним розчином: KF 150, Tris-HCl 30, рН доводився за допомогою Тrіs-OH до 7.3. Розчини для зовнішньої перфузії містили (у мМ/л): холіну хлориду -150, KCl-5, CaCl2-1, MgCl2-1, HEPES-20, рН доводився до 7.4 додаванням Tris-OH. У зовнішньому розчині містився тетродотоксин (ТТХ) у концентрації 0.5-1 мкМ. Аплікація блокаторів калієвих каналів тетраетіламмонія (ТЕА) і 4-амінопіридина (4-АП) проводилася з використанням техніки швидкої локальної перфузії (Veselovsky et al., 1996) безпосередньо в області досліджуваного нейрона.

Для реєстрації викликаних гальмівних постсинаптичних струмів (вГПСС) від пари нейронів базовий розчин містив (у мM/л): NaCl - 140, KCl -3, Ca12 - 2, MgCl2 - 2, HEPES - 20, глюкоза - 30, p 7.3. Для заповнення пэтч-пипетки використовувався розчин наступного складу (у мМ/л): глюконат калію -100, KCl- 50, MgCl2 - 10, ЭГTA - 10, HEPES - 20, p 7.4. При дослідженнях поодинокої пресинаптичної терміналі розчини для зовнішньої перфузії містили (у мМ/л): NaCl-140, KCl-3, CaCl2-2, MgCl2-2, HEPES-20, рН доводився до 7.4 додаванням Tris-OH. Внутрішньопіпеточний розчин містив (у мМ/л): KGlu-100, KCl-50, EGTA-5, MgCl2-5, pН доводився до 7.4 за допомогою Tris-OH. В позаклітинний розчин додавалися блокатори AMPA- і NMDA-рецепторів збуджуючих синапсів DNQX і D-APV у концентрації 20 мкМ кожен, що було достатньо для повного їх блокування.

Реєстрація струмів. Для виміру трансмембранних струмів ізольованих нейронів був застосований метод фіксації потенціалу в конфігурації "ціла клітина", описаний раніше (Hamill et al.,1981).

Локальна стимуляція поодинокої пресинаптичної терміналі. Візуальний контроль досліджуваного постсинаптичного нейрона та нервової терміналі виконувався при сумарному збільшенні в 1000 разів. Звичайно в полі зору (діаметр 200 мкм) знаходилися 1-2 нейрона. Проводилася стимуляція одного з нейритів клітини, що контактує з іншою клітиною, у якій при цьому виникав ГПСС (ці клітини позначалися як пре- і постсинаптичні одиниці відповідно). Реєстрація ГПСС здійснювалася за допомогою методу “петч-клемп” у конфігурації "ціла клітина". Стимулююча піпетка з внутрішнім діаметром близько 1 мкм заповнювалася зовнішнім розчином (опір 8-10 МОм) і з'єднувалася зі стимулятором з ізольованим виходом. Мала амплітуда стимулюючого потенціалу (0-25 В) продуціювала загальний струм не більше 2.5 мкА. У цьому випадку стимуляція відбувалася за рахунок локальної зміни потенціалу в позаклітинному розчині поблизу стимулюючої піпетки. Цей потенціал градуально зменшувався рівномірно у всіх напрямках, як функція відстані від кінчика піпетки.

Потенціал на відстані 5 мкм від стимулюючої піпетки в поздовжньому і поперечному напрямках зменшувався до величин менших 5 мВ при стимулюючій напрузі 15 В. Звичайно стимулююча напруга, що використовувалася для стимуляції подинокої терміналі, була 6.5±3.5 В (n = 143), і діаметр зони ефективного зрушення потенціалу (0-100 мВ) не перевищував 2-3 мкм.

Аналіз даних. У процесі експерименту дані відцифровувалися аналого-цифровим перетворювачем (Axon Instruments, TL-1 interface) і зберігалися на твердому диску комп'ютера з використанням програмного пакету pClamp 6.0 (Axon Instruments). Частота відцифровки трансмембранних іонних струмів складала 0.5-10 КГц у залежності від тривалості досліджуваних подій. Аналіз струмів і даних проводився з використанням аналітичних програмних продуктів (pClamp 6.0, Axon Instruments, Origin 3.54, Microcal Software, TIDA for Windows, HEKA Elektronik). Для визначення достовірності отриманих результатів використовувався блок статистичних програм ANOVA з рівнем значимості не нижче Р = 0.05.

2. АНАЛІЗ І УЗАГАЛЬНЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ

Багато складних механізмів, що лежать в основі сигнальних функцій нервових клітин, регулюються й опосредковуються калієвою і кальцієвою провідностями. Дані, представлені в роботі, поглиблюють і розширюють існуючі представлення про роль різних типів калієвих і кальцієвих каналів у здійсненні сигнальних функцій первинних сенсорних і центральних нейронів. Результати досліджень потенціалокерованих та кінетичних характеристик і фармакологічних властивостей каналів кальцієвих і калієвих струмів дозволили визначити їх інтегративну роль у здійсненні нервовою клітиною однієї з основних сигнальних функцій - генерації потенціалу дії. Опис специфічних параметрів кальцієвих і калієвих струмів у процесі онтогенезу клітини дозволив зрозуміти причину змін, що відбуваються у параметрах потенціалів дії на різних стадіях розвитку сенсорних нейронів. Ці зміни можуть бути одним з факторів, що забезпечують формування повноцінно функціонуючої нервової системи. Іони Са2+, надходячи в сому нервової клітини по потенціалокерованим каналам, забезпечують сполучення мембранних і внутрішньоклітинних процесів. Калієві струми, беручи участь у реполяризації клітинної мембрани, регулюють потік кальцію по потенціалокерованих каналах. Щільність калієвих струмів, змінюючись у процесі онтогенезу нервової системи, впливає на потік Са2+, і таким чином, опосередковано регулює сполучення сигнальних функцій і внутрішньоклітинних процесів. Реконструкція можливих потенціалів дії методом чисельного експерименту, заснованого на використанні експериментально обмірюваних специфічних параметрів вхідних і вихідних струмів, допомогла зрозуміти природу процесів, що приводять до генерації повторних потенціалів дії. У нормальних умовах первинні сенсорні нейрони не генерують повторні ПД, однак, за допомогою експериментально визначених характеристик іонних струмів сенсорних нейронів, стало можливим моделювати умови, що можуть мати місце при визначених патологічних змінах і можуть позначатися на здійсненні нервовою клітиною однієї з основних сигнальних функцій - генерації потенціалу дії.

Другою найбільш важливою сигнальною функцією нервової клітини є синаптична передача, що лежить в основі міжклітинної комунікації. Літературні джерела вказують на виняткову важливість потенціалокерованої кальцієвої провідності у синаптичній передачі. Однак більшість досліджень кальцієвих каналів, локалізованих у пресинаптичних закінченнях, присвячена збудливій синаптичній передачі, тоді як участь кальцієвих каналів у гальмівній синаптичній передачі вивчено недостатньо. У дійсному дослідженні були описані властивості гальмівної синаптичної передачі і роль потенціалокерованих кальцієвих каналів різних типів у регуляції її ефективності на культивованих нейронах гіпокампа щурів. Перевагою культури з низькою щільністю нейронів є наявність функціональних гальмівних синапсів і можливість їх візуальної ідентифікації на відміну від досліджень, проведених на зрізах мозку. Можливість візуальної ідентифікації інтернейрона (як пресинаптичної клітини) і пірамідальних нейронів (як постсинаптичних) дозволила провести дослідження фізіологічного гальмівного синапса між парою нейронів.

У літературі висловлювалося припущення про можливість багатовезикулярного викиду в нейронах центральної нервової системи. Точне підтвердження цього припущення вимагало застосування прямих электрофізіологічних методів дослідження механізму викиду медіатора в синаптичних терміналях нейронів ЦНС. Візуальна ідентифікація поодинокої синаптичної терміналі розроблена для культивованих з низькою щільністю нейронів гіпокампа і нова методика прямої електричної стимуляції поодинокого синаптичного закінчення надали можливість вивчення механізму викиду нейромедіатора з поодинокої пресинаптичної терміналі. Застосування прямих електрофізіологічних методів дослідження механізму викиду медіатора в поодиноких синаптичних терміналях нейронів гіпокампа ЦНС дозволило одержати нові дані про механізми гальмівної синаптичної передачі, обумовленої викидом ГАМК, і регуляції цих механізмів шляхом маніпулювання вхідним потоком Са2+. Дані, отримані з застосуванням методики зовнішньої прямої електричної стимуляції поодинокої пресинаптичної терміналі, дозволили провести точний статистичний аналіз викиду нейромедиатора в центральних синапсах, що раніше було неможливо через ряд технічних обмежень. Регуляція потоку іонів Са2+ по потенціалокерованим каналам поодинокої пресинаптичної терміналі здійснювалася багатьма шляхами: селективним блокуванням різних підтипів кальцієвих каналів, зміною рівня деполяризації пресинаптичної мембрани за рахунок зміни інтенсивності стимуляції і шляхом зрушення потенціалу спокою при аплікації блокаторів різних типів калієвих каналів, зміною тривалості деполяризації пресинаптичної терміналі. Аналогічні дослідження не проводилися раніше і їх результати дозволили описати недосліджені раніше фундаментальні властивості гальмівної синаптичної передачі нейронів ЦНС, що є одним з факторів, що забезпечують сигнальну функцію нервових клітин. Аналіз результатів усіх цих експериментів показав, що викид нейромедіатора з гальмівного синаптичного закінчення обумовлений великою кількістю складних послідовних процесів, що опосередковуються входом Са2+, і в дійсній роботі описані вперше.

Нові знання про механізми, що лежать в основі такої сигнальної функції нервової клітини як гальмівна синаптична передача, мають фундаментальне значення і можуть внести свій внесок у розуміння основних питань нейрофізіології про феномени навчання і пам'яті.

ВИСНОВКИ

1. На основі визначення потенціалокерованих і фармакологічних властивостей, у мембрані сенсорних нейронів і культивованих нейронів гіпокампа розділені й описані компоненти калієвого струму. А-струм має швидку кінетику активації й інактивації, є чуттєвим до додатку 4-АП і нечутливий до ТЕА. Струм DR-типу має більш повільну кінетику активації й інактивації, частково блокується при аплікації як 4-АП, так і ТЕА. Калієвий струм К-типу активується при найбільш позитивних потенціалах, не має часової і стаціонарної інактивації, частково пригнічується при додаванні ТЕА і нечутливий до 4-АП. Калієві струми А-, DR- K- типів у нейронах гіпокампа і сенсорних нейронах схожі своїми стаціонарними, кінетичними і фармакологічними властивостями, незважаючи на належність цих нейронів до різних відділів нервової системи. У культивованих нейронах гіпокампа, крім зазначених типів струмів, був описаний калієвий струм D-типу. Калієвий струм D-типу активувався при найбільш негативних потенціалах і був гіперчутливим до 4-АП. клітина мембрана кальцієвий

2. При вивченні змін щільностей кальцієвих і калієвих струмів в онтогенезі встановлено, що низькопорогові кальцієві канали, характерні для сенсорних нейронів, що розвиваються, зникають в процесі онтогенезу, у той час як високопорогові кальцієві канали присутні у соматичній мембрані протягом усього раннього онтогенезу. Базуючись на експериментальних даних про характерні параметри кальцієвих і калієвих струмів, методом чисельного експерименту показано, що можливість генерації повторних потенціалів дії, їх частота, тривалість і амплітуда залежать від визначеного балансу між щільностями низькопорогового кальцієвого і компонента калієвого струму, що інактивується.

3. Показано, що в культивованих нейронах гіпокампа високопороговий кальцієвий струм може бути розділений на 3 підтипи на основі їх різної фармакологічної чутливості. Показано, що основна роль у забезпеченні викиду нейромедіатора в гальмівних синапсах належить високопороговим кальцієвим каналам N або P/Q - підтипів, а високопорогові кальцієві канали L-підтипу не беруть участі у гальмівній синаптичній передачі культивованих нейронів гіпокампа. Застосування специфічних блокаторів низькопорогового кальцієвого струму показало, що потік кальцію через канали цього струму не має впливу на гальмівну синаптичну передачу культивованих нейронів гіпокампа.

4. Дослідження поодинокої гальмівної синаптичної терміналі шляхом її локальної зовнішньої електричної стимуляції показали можливість багатоквантового викиду нейромедіатора в центральних нейронах. Викид нейромедіатора є вирогідним процесом, що може бути описаний статистичним законом Пуассона. Величина одного кванта постсинаптичної відповіді дорівнює 20 пА при підтримуваному потенціалі -75 мВ.

5. Гальмівні постсинаптичні струми, що виникають як відповідь на тривалу (10-20 мс) зовнішню деполяризацію поодинокого пресинаптичного закінчення, реєструвалися у формі декількох послідовних накладених незалежних подій, що відбуваються після різних часових затримок. В усіх досліджених нейронах розподіл затримок був багатопіковим з рівновіддаленими піками. Середня відстань між піками дорівнює 2.97±0.86 мс. Амплітуди послідовних гальмівних постсинаптичних струмів флуктуювали випадковим чином, незалежно від послідовного номера події. Кількість везикул, що могли вивільнити нейромедіатор в кожний найбільш імовірний час, була випадковою.

6. Результати статистичного аналізу показують, що протягом тривалої деполяризації викид нейромедіатора може відбуватися у визначені моменти часу з максимальною ймовірністю, незалежно від того, був попередній викид чи ні. Існування найбільш імовірного часу викиду не визначається мембранним потенціалом як на пре-, так і на постсинаптичній мембрані, але залежить від входу Са2+ у пресинаптичну терміналь, і, можливо, від часу накопичення деякої граничної концентрації кальцію, необхідної для везикул.

7. Встановлено, що блокування потенціалокерованих калієвих каналів пресинаптичної терміналі, опосередковано збільшуючи вхід іонів Са2+, приводить до збільшення сили синаптичного зв'язку за рахунок збільшення імовірності багатоквантового викиду нейромедіатора при незмінній величині одного кванта. У формуванні калієвої провідності пресинаптичного закінчення домінуючу роль грають 4-АП чутливі калієві струми (імовірніше за все А-типу).

8. Збільшення потоку іонів Са2+ у пресинаптичну терміналь шляхом збільшення інтенсивності стимуляції або підвищення його позаклітинної концентрації приводять до збільшення середнього вмісту квантового викиду, за рахунок збільшення ймовірності викиду медіатора при незмінній величині одного кванта нейромедіатора, що вивільняється. Викид нейромедіатора залишається імовірним процесом, що підкоряється закону Пуассона.

9. Одержані експериментальні дані розкривають механізми за допомогою яких, потенціал дії, що поширюється, перетворюється у внутрішньоклітинний сигнал у нервовому закінчені і приводить до вивільнення квантів нейромедіатора та стає основним процесом у міжклітинній комунікації. Продемостровано, що у цьому каскаді надзвичайно складних біофізичних процесів одну з головних ролей грає потік іонів Са2+, що регулюється потенціалокерованими кальцієвими і калієвими каналами.

ПУБЛІКАЦІЇ

1. Kostyuk P.G., Veselovsky N.S., Fedulova S.A., Tsyndrenko A.Ya. Ionic currents in the somatic membrane of rat DRG neurons. II. Potassium currents. // Neuroscience. - 1981. - v. 6. - №12, - рр. 2431-2437.

2. Fedulova S.A., Kostyuk P.G., Veselovsky N.S. Two types of calcium channels in the somatic membrane of new born rat DRG neurons. // J. Physiol. - 1985. - v. 359, - рр.431-446.

3. Веселовский Н.С., Костюк П.Г., Федулова С.А., Широков Р.Е. Деактивация кальциевых токов в соме нейронов спинальных ганглиев при выключении деполяризующего смещения мембранного потенциала. // Нейрофизиология. - 1985. - т. 17 - №5, - C. 682-691.

4. Веселовский Н.С., Федулова С.А., Широков Р.Е. Электроуправляемые натриевые каналы соматической мембраны симпатических нейронов. // Нейрофизиология. - 1986 - т. 18. - №1, - C. 108-117.

5. Н.С.Веселовский, Федулова С.А. Эффект замены ионов кальция ионами бария при исследовании входящих токов нейронов млекопитающих. // Нейрофизиология. - 1986. - т. 18. - №6, - C. 313-318.

6. Костюк П.Г., Федулова С.А., Веселовский Н.С. Изменение ионных механизмов электровозбудимости соматической мембраны сенсорных нейронов крыс в онтогенезе. Распределение ионных каналов входящего тока. // Нейрофизиология. - 1986. - т. 18 - №6, - C. 813-820.

7. Федулова С.А., П.Г. Костюк, Н.С. Веселовский Изменение ионных механизмов электровозбудимости соматической мембраны сенсорных нейронов крыс в онтогенезе. Соотношение плотностей входящих токов. // Нейрофизиология. - 1986 - т. 18, - №6, - C. 820-827.

8. Веселовский Н.С., С.А. Федулова, П.Г. Костюк Изменение ионных механизмов электровозбудимости соматической мембраны сенсорных нейронов крыс в онтогенезе. Связь кальциевых каналов с внутриклеточным метаболизмом. // Нейрофизиология. - 1986, т. 18 - C. 827-832.

9. Kostyuk P.G., Doroshenko P.A., Martynyuk A.E., Veselovsky N.S., Fedulova S.A. Calcium channels and cAMP metabolism in nerve cells. // In Calcium Electrogenesis and Neuronal Functioning (eds. U. Heinemann, M. Klee, E. Neher & W. Singer). - 1986. - Springer. - P. 9-16.

10. Федулова С.А., Шуба Я.М., Найденов В.Г., Золотухин С.Б. Трансмембранные токи в ооцитах Xenopus после инъекции мозговой мРНК. // Нейрофизиология. - 1988. - т. 20. - №6, - C. 829-832.

11. Fedulova S.A, Kostyuk P.G., Veselovsky N.S. Ionic mechanisms of electrical excitability in rat sensory neurons during postnatal ontogenesis. // Neuroscience. - 1991. - v. 41. - №1, - рр. 303-309.

12. Герасименко О.В., Костюк П.Г., Любанова О.П., Федулова С.А., Шуба Я.М. Потенциалуправляемые ионные каналы входящего тока, экспрессированные в ооцитах Xenopus после введения мозговой РНК. // Нейрофизиология. - 1991. - т. 23. - №3, - C. 344-353.

Размещено на Allbest.ru