Ефективність використання різних білкових добавок при одержанні in vitro ембріонів великої рогатої худоби

Размещено на http://www.allbest.ru/

Українська академія аграрних наук інститут тваринництва

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата сільськогосподарських наук

- Біотехнологія

Органічна хімія

Жернокльов Галина Василівна

Харків 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторії отримання гамет і ембріонів in vitro Харківського біотехнологічниго центру Української академії аграрних наук.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, професор, Бугров Олексій Дмитрович, Харківський біотехнологічний центр УААН, головний науковий співробітник

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, академік УААН Осташко Федір Іванович, Харківський біотехнологічний центр УААН, головний науковий співробітник

кандидат сільськогосподарських наук Тагіров Максуд Тагірович, Інститут птахівництва УААН, завідувач лабораторії клітинної інженерії

Провідна установа:

Державний науково-дослідний контрольний інститут ветеринарних препаратів та кормових добавок Міністерства аграрної політики України, м. Львів

Захист дисертації відбудеться “ 24 ” квітня 2001 р. о 10 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 65.356.02 Інституту тваринництва УААН за адресою: 62404, Харківська обл., Харківський р-н., с. Кулиничі.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту тваринництва УААН.

Автореферат розісланий “ 22 ” березня 2001 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої

ради, кандидат сільськогосподарських наук Чалий О.І

1. Загальна характеристика роботи

сироватка ооцит ембріон гормон

Актуальність теми. Хоча від моменту першого повідомлення про народження життєздатного потомства у результаті трансплантації ембріонів, одержаних методом дозрівання та запліднення ооцитів великої рогатої худоби in vitro, минуло більше 15 років, результативність даного методу залишається все ще досить низькою й дорівнює у кращих лабораторіях світу 30-40% бластоцист від числа відселекціонованих для дозрівання ооцитів (Trounson J. O. et al., 1994; Harvey M.B. et al. 1995; Brackett B.G et al., 1996; Niemann H. et al., 2000). Одним із шляхів вирішення цієї проблеми є удосконалення середовищ та умов культивування статевих клітин та ембріонів. Хоча загальний розвиток методу відбувається шляхом спрощення та стандартизування середовищ культивування, створення хімічно визначених середовищ, практично усі середовища не здатні забезпечувати повноцінний розвиток зародків без додавання сироваток або їх складових (Lorengan P et al., 1994; Сметаніна И.Г., 1998; Gliedt D.W. et al., 1996; Лобачьова І.В., 1997; Van Langendonckt A. et al., 1997).

Надзвичайна багатокомпонентність складу дуже утруднює визначення усіх функцій сироватки, але поки це не буде визначено, усі спроби пошуку замінників цього природного компоненту залишаться безуспішними.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась у відповідності з науково-технічними програмами Інституту тваринництва УААН та Харківського біотехнологічного центру за темами: “Розробити і удосконалити методи трансплантації ембріонів високоцінних корів для підвищення продуктивних якостей худоби і біотехнологічних завдань” 1991-1995 рр. (№ держреєстрації UA 01001316 P); “Розробити біотехнологічні методи створення сільськогосподарських тварин з заданими господарсько-корисними ознаками” 1996-2000 рр. (№ держреєстрації 0196U011388).

Мета та завдання досліджень. Метою роботи було підвищення ефективності методу отримання ембріонів корів поза організмом шляхом удосконалення середовищ дозрівання ооцитів і розвитку утворених ембріонів in vitro. Для досягнення поставленої мети ставилися такі завдання:

Вивчити та порівняти вплив різних типів сироваток на дозрівання і запліднення ооцитів in vitro.

Оцінити вплив на інтра- та екстраядерне дозрівання ооцитів комплексу екзогенних гормонів, яким доповнюють середовище культивування.

Вивчити вплив на дозрівання ооцитів і розвиток отриманих in vitro ембріонів введення до середовищ культивування інсуліноподібного-II та епідермального факторів росту.

Визначити ефективність використання при культивуванні ранніх ембріонів, отриманих поза організмом, сироватки крові суперовульованих донорів, яку було одержано у різні фази статевого циклу.

Визначити оптимальний час введення сироваткової компоненти до середовища розвитку ембріонів.

Визначити рівень стероїдних та гонадотропних гормонів у сироватках, які були використані у системі in vitro.

Визначити концентрацію загального білка і його окремих фракцій у сироватках, які були використані.

Об'єкт дослідження: ооцити, яйцеклітини та ембріони великої рогатої худоби, одержані при дозріванні та заплідненні поза організмом; сироватка крові, одержана від корів-донорів з індукованою поліовуляцією та у спонтанний цикл.

Предмет дослідження: ядерне і цитоплазматичне дозрівання ооцитів корів і розвиток утворених після запліднення in vitro ембріонів у середовищах, доповнених різними типами сироваток, гормонами та факторами росту.

При виконанні роботи використовували біотехнологічні (дозрівання ооцитів, їх запліднення та наступний розвиток утворених ембріонів in vitro), морфологічні (оцінка ооцитів, яйцеклітин та ембріонів за морфофізіологічними показниками), цитогенетичний (дослідження мейозу), радіоімунологічний (дослідження гормонального фону сироваток), електрофоретичний (дослідження концентрації загального сироваткового білка і його фракцій) методи.

Наукова новизна отриманих результатів. Автором вперше застосовано комплексний підхід до вирішення питання підвищення технологічності й ефективності методу одержання ембріонів у системі in vitro на основі аналізу змін гормонального та біохімічного складу сироватки крові, що відбуваються протягом семи діб естрального циклу корів з індукованою поліовуляцією та спонтанною охотою.

Вперше визначено перевагу використання у системі одержання ембріонів in vitro естральної сироватки крові корів з індукованою поліовуляцією в порівнянні з сироваткою крові корів із спонтанною охотою. Встановлено наявність взаємозв`язку рівня мейотичного дозрівання ооцитів і концентрації ендогенного естрадіолу сироваток крові суперовульованих донорів. Вперше показано позитивний вплив комбінованого використання при дозріванні ооцитів і культивуванні ембріонів сироваток крові, одержаних у різні фази естрального циклу корів. Встановлено наявність корелятивної залежності між мейозстимулюючою дією естральної сироватки суперовульованих корів при культивуванні ооцитів in vitro та кількістю повноцінних ембріонів, одержаних від цих донорів.

Практичне значення отриманих результатів. На підставі проведених досліджень і теоретичних узагальнень, що сформульовані у дисертаційній роботі, удосконалено метод отримання пізніх морул із дозрілих та запліднених in vitro ооцитів великої рогатої худоби шляхом введення до середовищ культивування сироватки крові суперовульованих корів, одержаної у різні фази статевого циклу.

Результати роботи мають також цінність для поглиблення знань про механізми дозрівання ооцитів і доімплантаційного розвитку ембріонів.

Одержані дисертантом результати увійшли до курсу лекцій з біотехнології, генетики та біології розвитку сільськогосподарських тварин Харківського зооветеринарного інституту.

Особистий внесок здобувача. Переважну частину робіт дисертант виконав самостійно. Методологію та схеми досліджень було відпрацьовано разом з науковим керівником. Автором самостійно проведено аналіз першоджерел літератури, більшість досліджень, узагальнення, статистичну обробку та інтерпретацію одержаних результатів, формулювання висновків і пропозицій. Із спільних досліджень і публікацій дисертант використав тільки свою частину результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на науково-практичній конференції “Теоретичні і практичні аспекти породоутворювального процесу у молочному та м'ясному скотарстві” (Київ, 1995); першій міжнародній науково-практичній конференції молодих вчених і спеціалістів “Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин” (Київ, 1994); міжнародній науково-практичній конференції, присвяченій 80-річчю з дня народження члена-кореспондента ВАСГНІЛ Ф.Ф.Ейснера “Теория и практика племенного дела в животноводстве” (Харків, 1996); другій міждержавній науково-практичній конференції “Селекционно-генетические и биотехнологические проблемы разведения крупного рогатого скота” (Брест, 1995); науково-практичній конференції “Неінфекційна патологія тварин” (Біла Церква, 1995); другій міжнародній конференції “Актуальные проблемы биологии в животноводстве” (Боровск, 1995);другій міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Київ, 1998); на II та III Міжнародних конференціях “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біотехнологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998, 1999)

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладено у 8-ми друкованих працях: 4-х наукових статтях у виданнях, що входять до переліку фахових ВАК України та 4-х тезах доповідей на наукових конференціях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 136 сторінках машинописного тексту, вміщує 27 таблиць та 21 рисунок. Список літератури складається з 198 джерел.

Дослідження проводились в Інституті тваринництва УААН та Харківському біотехнологічному центрі. Роботу виконано з 1993 по 1999 рік.

Для проведення досліджень використовували яєчники корів і телиць, забитих на Харківському м'ясокомбінаті та бійні д/г “Українка”, які доставляли в лабораторію у фосфатно-сольовому буфері Дюльбекко при температурі 250С. Ооцит-кумулюсні комплекси (ОКК) вилучали методом надрізу антральних фолікулів стерильним лезом, або методом аспірації. У досліді використовували ооцит-кумулюсні комплекси з 2-3-х шаровим рівномірним кумулюсом і гомогенною цитоплазмою.

2. Зміст роботи

Дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів здійснювали протягом 24 годин за таких фізико-хімічних умов: температура - 37,50С, газова суміш з 5% СО2, 5% О2 та 90% N2, 100% вологості. Базове середовище дозрівання ооцитів складалося з ТС-199 забуференої HEPES “Sigma” з 25 мМ пірувату натрію та гентаміцином (“Reanal” -1мкг/мл). Відповідно до мети експерименту базове середовище доповнювали 20%-ми сироватки, комплексом гормонів, факторами росту. Було використано виготовлену самостійно естральну сироватку крові суперовульованих корів (ЕССК), одержану через 24 години після введення простагландину; сироватку крові корів із спонтанною охотою (ЕСК); сироватку крові новонародженого теляти (СНТ) та фетальну сироватку теляти (ФСТ) фірми “Serva”.В якості гормональних добавок до середовища дозрівання використовували препарати: ФСГ (“Sigma”, “Schering corporation”) у дозі 0,5 мкг/мл, чХГ (“Profasi” - 5 мкг/мл) та естрадіол-17 (“Sigma”) у дозі 50 нг/мл і 1мкг/мл. При дослідженні впливу факторів росту використовували рекомбінантні IGF-II і EGF (“Sigma”) у дозі 50 нг/мл.

Сироватку крові одержували за загальноприйнятою методикою від корів оброблених на суперовуляцію - протягом 6-ти діб з моменту введення простагландину з 24 годинним інтервалом, та від корів із спонтанним циклом - протягом 6-ти діб, починаючи з моменту прояву перших ознак охоти, а також від новонародженого теляти - на другий день після народження. У виготовлених сироватках радіоімунологічним методом було визначено рівень прогестерону, естрадіолу-17, ФСГ та ЛГ та методом електрофорезу - вміст загального білка й співвідношення його фракцій.

Після закінчення строку культивування частину ооцитів піддавали цитогенетичному аналізу з метою оцінки ядерного дозрівання. Решту ооцитів осіменяли капацитованою у середовищі sp-TALP за методом “ sweam-up” (Parrish J.J. at al., 1986) заморожено-відталою спермою бугая. Гамети спільно інкубували у середовищі fert-TALP протягом 16 годин. Після цього зародки для подальшого розвитку вміщували в кондиційоване епітеліальними клітинами яйцеводу корів базове середовище, доповнене відповідним типом сироватки, або хімічно визначене живильне середовище з амінокислотами CR1aa, доповнене ЕGF у дозі 10, 100 нг/мл або IGF-II у дозі 10, 50 нг/мл.

Ооцити та зиготи фіксували за методом Тарковського (Tarkowski A.K., 1966), та методом, модифікованим Щегельською О.А. (1994). Цитогенетичний аналіз препаратів, забарвлених 2%-ним розчином Гімза, або 1%-ним ацетогематоксиліном, проводити під світловим мікроскопом Axiovert -35. Матеріал документували мікрофотографіями.

Статистичну обробку одержаних даних здійснювали за допомогою стандартного програмного пакету “Statistica” for Windows 95,98 з використанням критеріїв Ст'юдента та 2.

Дозрівання ооцитів корів in vitro у середовищі, доповненому різними типами сироватки. Нині не викликає сумніву факт, що умови дозрівання ооцитів впливають на результати запліднення дозрілих яйцеклітин і наступний ранній ембріорозвиток. Хоча деякі дослідники висловлюють припущення, що присутність сироваткових добавок у середовищі дозрівання ооцитів ссавців не є обов'язковою, усе ж у більшості випадків дозрівання проходить у культуральному середовищі з додаванням гомологічних і гетерологічних сироваток.

Нами досліджено інтраядерне дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів корів при культивуванні у середовищі, доповненому фетальною телячою сироваткою (ФСТ) фірми “Serva”, а також виготовленими самостійно естральною сироваткою крові корів з індукованою поліовуляцією (ЕССК), естральною сироваткою крові корів із спонтанною охотою (ЕСК) та сироваткою новонародженого теляти (СНТ), (табл.1).

Таблиця 1 Дозрівання ооцитів корів у середовищі, доповненому різними сироватками

Сироватка	Кількість ооцитів, n	Стадії мейозу:	Дегенерованих хромосом, n (%)
		метафаза I	Анафаза - телофаза I	метафаза II
		n	%	n	%	n	%
ЕССК	124	8	6,4c	10	8,1	91	73,4в	15 (12,1)
ЕСК	58	5	8,6c	10	17,2	37	63,8а	6 (10,3)
ФСТ	118	21	17,8c	13	11,0	68	57,6а	16 (13,6)
СНТ	76	20	26,3e	8	10,5	35	46,1а	13 (17,1)

Тип сироватки, яким було доповнено середовище розвитку ооцитів, впливав на процес мейотичного дозрівання. Вірогідно вищий рівень ядерного дозрівання забезпечило використання ЕССК (73,4%, р<0,01). При доповненні культурального середовища ооцитів СНТ, вірогідно більше ооцитів хоча й відновили мейоз, але припинили дозрівання на стадії метафази I (26,3%, p<0,01).

Відомо, що результативність індукування множинної овуляції характеризується високою варіабельністю індивідуальної реакції тварин. Це ставить питання про рівнозначність використання при дозріванні ооцит-кумулюсних комплексів корів естральних сироваток, отриманих від різних донорів оброблених на суперовуляцію (табл.2).

Сироватка тільки двох донорів із семи досліджених дозволила одержати високий рівень мейотичного дозрівання: стадії метафази II досягло 75,3% і 61,1% ооцит-кумулюсных комплексів при використанні сироваток донорів №5361 і №1026. В інших випадках відсоток ооцитів, що завершили мейотичне дозрівання, був вірогідно нижчим.

Таблиця 2 Дозрівання ооцитів корів у середовищі, доповненому астральною сироваткою крові, яку одержано від різних донорів

Інвентарний номер донора	Кількість ооцитів, n	Стадії мейозу:	Дегенерованих хромосом, n (%)
		Діакінез метафаза I, n (%)	Анафаза - телофаза I, n (%)	метафаза II, n (%)
5346	124	20 (16,1)	19 (15,3)	69 (55,6)a	16 (12,9)
5361	124	8 (6,4)	10 (8,1)	91 (73,4)b	15 (12,1)
1089	63	12 (19,0)	5 (7,9)	34 (53,9)a	12 (19,0)
3634	75	17 (22,7)	10 (13,3)	42 (56,0)а	6 (8,0)
1026	72	9 (12,5)	7 (9,7)	44 (61,1)с	12 (16,7)
1018	69	20 (28,9)	5 (7,2)	31 (44,9)a	13 (18,8)
3757	121	25 (20,7)	19 (15,7)	64 (52,9)a	13 (10,7)
контроль	110	29 (26,4)	11 (10,0)	59 (53,6)а	11 (10,0)

Культивування ооцит-кумулюсних комплексів у середовищі з ЕССК забезпечило також і більш повноцінне цитоплазматичне дозрівання (табл.3) порівняно з ЕСК, про що свідчить вірогідно вищий відсоток зародків з двома пронуклеусами та більш низький відсоток поліспермії (17,4% проти 43,6%, p<0,05).

Таблиця 3 Результати запліднення ооцитів, що дозрівали у середовищі, доповненому ЕССК і ЕСК

Сироватка	Кількість осіменених ооцитів, n	Кількість зародків:
		з двома пронуклеусами, n (%)	З поліспермією, n (%)
ЕССК	46	38 (82,6)а	8 (17,4)с
ЕСК	39	22 (56,4)b	17 (43,6)d

Таким чином, сироватка, одержана від донора з множинною овуляцією через 24 години після введення простагландину, забезпечила більш повноцінне як ядерне, так і цитоплазматичне дозрівання ооцитів корів у культурі in vitro порівняно з іншими сироватками.

Проведений аналіз рівня ендогенних гонадотропних (ФСГ, ЛГ) і стероїдних (естрадіол-17b, прогестерон) гормонів, а також концентрації загального білка і його фракцій у використаних сироватках, показав наявність прямої корелятивної залежності між рівнем ооцитів, що досягли стадії метафази II та рівнем ендогенного естрадіолу (r=0,83; p<0,05) й концентрацією -глобулінів (r=0,78; p<0,05). Сироватка донора №5361, що забезпечила найбільш високий рівень ядерного та цитоплазматичного дозрівання мала найвищий рівень естрадіолу й -глобулінів. У наступних дослідах ми використовували саме цю сироватку.

Процес мейотичних перетворень відбувається більш швидко при культивуванні ооцитів у середовищі з ЕССК. Після 18-ти годин культивування у середовищі з ЕССК більшість ооцитів досягли стадії метафази I, а 6,4% вже знаходилися на стадії телофази-метафази II, тоді як при культивуванні з ФСТ на цей час більшість ооцитів були лише на стадії діакінезу та метафази I. Таку тенденцію до випередження було збережено й при аналізі стану хромосом через 20 годин культивування. По завершенні культивування доля ооцитів на завершальних стадіях мейозу була вірогідно вищою у групі з ЕССК порівняно з ФСТ.

Таким чином, культивування ооцит-кумулюсних комплексів у середовищі з ЕССК забезпечує не тільки більш високий рівень ядерного дозрівання, а й швидкість проходження мейозу. Пояснити це можна тим, що ЕССК містить якусь мейозрегулюючу речовину, або комплекс речовин.

Вплив екзогенних гормонів на дозрівання ооцитів корів in vitro. При дозріванні ооцитів більшість дослідників вказує на необхідність для забезпечення повноцінного ядерного і цитоплазматичного дозрівання додаткового екзогенного введення комплексу гормонів: ФСГ, лХГ та естрадіолу-17b (Е2). Проведені нами дослідження свідчать (табл. 5), що при культивуванні ооцитів у середовищі з ЕССК додавання комплексу гормонів не впливає на рівень ядерного дозрівання. Відсоток запліднених зигот та морул був дещо вищим при дозріванні ооцит-кумулюсних комплексів з додаванням комплексу гормонів, однак ця різниця невірогідна. Таким чином, додавання комплексу ФСГ+лХГ+Е2 до середовища з ЕССК не має позитивного впливу на мейотичне дозрівання ооцитів корів, але може впливати на цитоплазматичне дозрівання.

Відомо, що стероїдні гормони не мають суттєвого впливу на реіниціацію мейозу, однак стимулюють повноцінне цитоплазматичне дозрівання, а саме, синтез гіпотетичного фактора утворення чоловічого пронуклеусу при заплідненні.

При дозріванні ооцит-кумулюсних комплексів великої рогатої худоби, як правило, до середовища дозрівання додають Е2 у концентрації 1 мкг/мл, що відповідає рівню цього гормону у фолікулярній рідині антрального фолікула у перші 6-8 годин після піку ЛГ. Однак у кількох роботах вказується на негативний вплив таких високих доз естрадіолу на характер мейотичних перетворень у ооциті, що дозріває (Harper K.M., Brackett B.G., 1993; Mitgoti G.Z., Garcia J.M., 1995). Тому нами було досліджено рівень ядерного і цитоплазматичного дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів великої рогатої худоби при різних дозах екзогенного Е2 - 1 мкг/мл та 50 нг/мл.

Концентрацію естрадіолу-17b, що дорівнює 50 нг/мл було нами вибрано на основі літературних даних про вміст цього гормону у фолікулі, що містить зрілий ооцит (Dieleman S.J. et al., 1983). Одержані результати свідчать про перевагу використання більш низьких концентрацій цього стероїдного гормону.



Рис. 1 Дозрівання ооцитів у середовищі з різними дозами екзогенного естрадіолу

Додавання Е2 у дозі 50 нг/мл до середовища з ЕССК сприяло вірогідному збільшенню виходу ооцитів на стадії метафази II - 86,7% (p<0,05) проти 62,5% та 69,6% відповідно у середовищі з 1 мкг/мл Е2 й у середовищі, доповненому тільки ЕССК (контроль). При більш низькому рівні інтраядерного дозрівання відсоток аномалій мейотичного веретена у середовищі з 1 мкг/мл Е2 був вірогідно вищим - 12,5 проти 3,6 та 5,8 (p<0.05).

Дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів у контрольному середовищі з ендогенним естрадіолом та у групі з 50 нг/мл екзогенного гормону забезпечило також і більш повноцінне цитоплазматичне дозрівання, яке оцінювали за рівнем отриманих після ектракорпорального запліднення ембріонів (табл. 4)

Таблиця 4 Розвиток зигот, що дозріли у середовищі з різними дозами естрадіолу

Концентрація естрадіолу	Всього розділилося, n (%)	Ембріонів на стадії:
		2-4 кл. n (%)	8-16 кл. n (%)	Морули n (%)
Контроль	36 (59,0)	8 (22,2)	6 (16,7)	22 (61,1)a
50 нг/мл	42 (62,7)	6 (14,3)	4 (9,5)	32 (76,2)b
1 мкг/мл	34 (58,6)	5 (14,7)	12 (35,3)	17 (50,0)a

Хоча за загальним відсотком зародків, що розпочали в ділення, вірогідної різниці між групами не спостерігали, відсоток ембріонів, що розвинулися до стадії пізньої морули був вище у середовищі з 50 нг/мл Е2 та у контролі. На сьому добу після запліднення стадії пізньої морули досягло 76,2% та 61,1% ембріонів відповідно у 1-й групі і контролі, тоді як у 2-й групі цей показник склав 50% (p<0,05).

Таким чином визначено, що концентрація екзогенного естрадіолу 1 мкг/мл, яка традиційно використовується у системі дозрівання поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів, негативно впливає на ядерне дозрівання, підвищуючи частку ооцитів з дегенеративними змінами хромосом і не є оптимальною для цитоплазматичного дозрівання.

Вплив екзогенних факторів росту на дозрівання ооцитів корів in vitro. Іншим класом речовин, які також присутні у фолікулярній рідині in vivo і впливають на процес дозрівання ооцитів у організмі є фактори росту. Деякі дослідники вважають, що прояв рістстимулюючої та мейозстимулюючої дії сироватки у культурі відбувається саме завдяки факторам росту, які вона містить (Matsuoka et al., 1992; Pidetoshi et al. 1995; Palma G.A. et al., 1997).

У проведених нами дослідженнях було вивчено вплив доповнення середовища культивування ооцитів великої рогатої худоби такими факторами росту, як інсуліноподібний фактор росту II (IGF-II) та епідермальний фактор росту (EGF). Результати культивування ооцит-кумулюсних комплексів у середовищі з добавленням різних факторів росту наведено на рис.2.

Рис. 2 Результати дозрівання ооцитів і розвитку утворених після запліднення ембріонів у середовищі, доповненому факторами росту

Доповнення середовища дозрівання ооцитів IGF-II вірогідно підвищувало рівень мейотичного дозрівання до 87,5% (n=56) проти 62,3% (n=53); 60,0% (n=60) й 70,0% (n=60) відповідно у контролі та у групах з EGF й IGF-II+ EGF (p<0,05). При добавленні до середовища культивування EGF рівень ооцитів, що реініціювали мейоз, але зупинилися на стадії діакінезу-метафази I, був найвищим і становив 40% (p<0.05).

Кращу здатність до розвитку після запліднення виявили також ті ооцити, дозрівання яких відбувалося у середовищі з IGF-II, або з комбінацією IGF-II і EGF. Хоча за загальним відсотком зигот, що розпочали ділення після запліднення, вірогідної різниці між групами не виявлено, відсоток зародків, що розвинулися до доімплантаційних стадій був вірогідно вищим і становив 11,5 і 12,5 відповідно у групах з інсуліноподібним фактором росту-II та комбінацією IGF-II+ EGF проти 6,3 та 4,7 - відповідно у контролі та при додаванні лише EGF (p<0,01).

Таким чином, IGF-II безпосередньо, або у комбінації з EGF, прямо, або опосередковано, приймає участь у регуляції інтра- та екстраядерного дозрівання ооцитів корів in vitro.

Розвиток отриманих in vitro ембріонів у середовищі, доповненому різними типами сироваток. У процесі розвитку зародків від незрілої гамети до ранніх ембріональних стадій їх трофічні потреби змінюються. Цей факт неможливо не враховувати при культивуванні поза організмом. Тому ми припустили, що ооцити та ранні ембріони потребують різних складових сироватки і ті сироваткові добавки, що позитивно впливали на дозрівання ооцитів, не будуть оптимальними для підтримки розвитку утворених після запліднення ембріонів. У зв'язку з цим нами було досліджено розвиток отриманих in vitro ембріонів корів у середовищі, доповненому ЕССК, ЕСК та ФСТ (табл.5).

Таблиця 5 Розвиток ембріонів корів у середовищі, доповненому різними сироватками

Сироватка	Кількість осіменених ооцитів, n	Кількість ембріонів:
		всього, n (%)	з них на стадії:
			2-4-клітин, n (%)	8-16-клітин, n (%)	морули, n (%)
ФСТ	106	45 (42,5)	11 (24,4)	18 (40,0)c	16 (35,5)a
ЕСК	70	40 (57,1)	9 (22,5)	18 (45,0)c	13 (32,5)a
ЕССК	96	51 (53,1)	12 (23,5)	8 (15,7)d	31 (60,8)b

Хоча загальна частка зародків, що розділилися після осіменіння як при культивуванні у середовищі з ЕССК, так і з ФСТ й ЕСК вірогідно не відрізнялася, встановлено відміни за відсотком ембріонів, що досягли стадії морули. Культивування зародків у кондиційованому середовищі з ЕССК сприяло подоланню ембріонального блоку розвитку, і тим самим вірогідно підвищувало вихід ембріонів, придатних до пересадки - 60,8% морул проти 35,5% й 32,5% відповідно у групах з ФСТ та ЕСК. Тоді як при доповненні середовища культивування ФСТ та ЕСК вірогідно більше зародків припинило розвиток на стадії 8-16-ти клітин - відповідно 40% та 45% (p<0,01).

У більшості випадків для отримання in vitro придатних до трансплантації ембріонів використовують спільне культивування зародків з різними типами фідерних моношарів таких як, наприклад, епітеліальні клітини яйцепроводу. Хоча за результатами більшості дослідників співкультивування необхідне для подолання 8-16-клітинного блоку розвитку ембріонів корови, деякі автори у своїх дослідженнях не спостерігали цього явища при розвитку зародків і без ко-культури (Watson A.J. et al., 1994; Van Langendockt et al., 1997). У зв'язку з цим нами було досліджено розвиток дозрілих та запліднених поза організмом зародків у кондиціонованому епітеліальними клітинами яйцепроводу середовищі, що складалося з ТСМ-199, доповненому 20% ЕССК, або у тому ж базовому середовищі без ко-культури.

Таблиця 6 Розвиток ембріонів in vitro у середовищі з ЕССК з використанням та без ко-культутри

Середовище культивування	Кількість осіменених ооцитів, n	Кількість ембріонів:
		всього, n (%)	з них на стадії:
			2-4 клітин, n (%)	8-16 клітин, n (%)	морули, n (%)
ТС199+ЕССК+ кондиціоноване середовище епітеліальних клітин яйцепроводу	115	59 (51,3)*	19 (32,2)	24 (40,7)	16 (27,1)
ТСМ-199+ ЕССК	63	23 (36,5)*	7 (30,4)	11 (47,8)	5 (21,7)

Одержані результати (табл.6) свідчать про можливість фізіологічно повноцінного розвитку ембріонів великої рогатої худоби, одержаних in vitro, у середовищі без використання клітинних ко-культур. Хоча при культивуванні у кондиціонованому середовищі епітеліальних клітин яйцепроводу після запліднення у дроблення вступило більше зигот (відповідно 51,3%, проти 36,5%), однак розвиток до стадії морули відбувався добре як у середовищі з ко-культурою, так і без неї (відповідно 27,1% та 21,7%). Відсоток ембріонів, що не подолали 8-16-клітинний блок розвитку також вірогідно не відрізнявся і дорівнював відповідно 40,6 та 47,8.

Можливо, функція епітеліальних клітин яйцеводу зводиться до ролі хелаторів ембріотоксичних речовин, що містяться у середовищі культивування ембріонів і більш досконале середовище забезпечує можливість виключення ко-культури з системи одержання ембріонів поза організмом.

У наступній серії дослідів ми порівняли розвиток ембріонів у середовищі з ЕССК, яку використовували і при дозріванні ооцитів, або з сироваткою, одержаною через сім діб після введення простагландину (МССК).

При використанні як у середовищі дозрівання ооцитів, так і у середовищі розвитку ембріонів ЕССК (табл. 9) відмічено тенденцію до інгібування розвитку ембріонів на стадії 2-4-х бластомерів: у 1-й групі після закінчення строку культивунання на цій стадії знаходилося 60,5% зародків, тоді як у 2-й групі - 44,8%.

Таблиця 7 Використання сироваток різних стадій статевого циклу при дозріванні ооцитів і культивуванні утворених ембріонів корів in vitro

Група	Середовище дозрівання ооцитів	Середовище культивування ембріонів	Кількість ембріонів:
			всього, n	з них на стадії:
				2-4-х клітин, n (%)	8-16-ти клітин, n (%)	морули, n (%)
1	ТСМ-199+ЕССК	ТСМ-199+ЕССК	38	23 (60,5)	7 (18,4)	8 (21,1)a
2	ТСМ-199+ЕССК	ТСМ-199+МССК	29	13 (44,8)	5 (17,2)	11 (37,9)b

Відсоток ембріонів, що досягли стадії морули був вірогідно вищим у 2-й групі порівняно з 1-ю (відповідно 37,9 та 21,1, р<0.05). Таким чином, комбіноване використання сироватки, одержаної від корів-донорів у різні фази статевого циклу, забезпечує більш повноцінний розвиток ембріонів in vitro.

Аналіз гормонального фону та білкового спектра цих сироваток показав, що МССК містить значно менше Е2 (0,08 пг/мл проти 20,6 пг/мл) і більше прогестерону (10,68 нг/мл, проти 1,51 нг/мл). Відміни за кількістю загального білка і його окремих фракцій були незначними, але відмічено тенденцію до зростання вмісту альбумінів та -глобулінової фракції у метестральній сироватці порівняно з естральною сироваткою.

Класом речовин, що контролюють розвиток ембріонів у організмі є фактори росту, що генеруються як самими ембріонами для підтримки їх розвитку, так і яйцепроводом. Ми вивчали вплив соматомедіну А (IGF-II) та епідермального фактора росту (EGF) на розвиток ранніх ембріонів великої рогатої худоби. Зокрема визначали оптимальну концентрацію IGF-II та EGF у середовищі культивування для підвищення рівня розвитку та якості ембріонів, одержаних in vitro (табл. 8).

Введення до середовища культивування екзогенного IGF-II (10; 50нг/мл) не впливало на розвиток ембріонів, тоді як епідермальний фактор росту мав позитивний вплив у дозозалежній манері.

Таблиця 8 Розвиток ембріонів у простому середовищі, доповненому епідермальним фактором росту або інсуліноподібним фактором росту-II

Концентрація, нг/мл	Кількість двоклітинних ембріонів, n	Досягло стадії морули, (%)
EGF	IGF-II
-	0 (контроль)	28	17,8
-	10	32	25,0
-	50	17	23,5
0 (контроль)	-	23	13,0а
10	-	32	34,4в
100	-	35	20,0ав

Стадії пізньої морули досягло вірогідно більше зародків у середовищі з 10 нг/мл та 100 нг/мл EGF порівняно з контролем (відповідно 34,4% та 20,0% проти 13,0% у контролі).

Виявлену тенденцію до інгібування сироваткою розвитку ембріонів корів in vitro на початкових стадіях дроблення відмічено і в інших дослідженнях (Pinyopummintr T, Bavister B.D., 1991; 1993;1994). Це спонукало нас скорегувати час введення білкової компоненти до середовища розвитку ембріонів. Разом з тим, комплексне середовище ТС 199, що використовувалося як базове, було нами замінено на просте сольове середовище Розенкранса з амінокислотами- CR1aa (Rosenkrans C.F., First N.L., 1991).

Середовище, яке складалося з CR1aa з МССК, або доповнене сироваткою через 48 годин від початку спільної інкубації яйцеклітин та сперміїв, спричиняло інгібування подальшого розвитку двоклітинних ембріонів (табл. 9).

Таблиця 9 Розвиток ембріонів у залежності від часу введення сироватки до середовища культивування

Час додавання сироватки після осіменіння, год.	Кількість двоклітинних ембріонів, n	Час розвитку після осіменіння
		3 доби	6 діб	7 діб
		ембріонів на стадії:
		2-х кліт., n (%)	більше 2-х кліт., n (%)	пізньої морули, n (%)
0 (контроль)	45	31 (68,9)	14 (31,1)а	6 (13,3)а	10 (22,2)а
48	60	31 (51,7)	29 (48,3)аи	11 (18,3)а	16 (26,7)а
90	27	9 (33,3)	18 (66,7) в	9 (33,3)в	15 (55,6)в

Внесення білкової компоненти до культурального середовища на 4-ту добу після запліднення сприяло не тільки більш високому загальному рівню розвитку ембріонів до стадії пізньої морули, а й забезпечувало більш прискорений розвиток.

Висновки

Використання у системі одержання поза організмом ембріонів великої рогатої худоби сироватки корів-донорів з індукованою множинною овуляцією забезпечує найбільш адекватні умови дозрівання ооцитів і розвитку доімплантаційних ембріонів порівняно з іншими типами сироваток.

Встановлено індивідуальні відміни за рівнем мейотичного дозрівання ооцитів корів при використанні естральної сироватки різних суперовульованих корів-донорів.

Здатність до мейотичного дозрівання ооцитів корів позитивно корелює (r=0,83, p<0,05) із рівнем ендогенного естрадіолу та концентрацією -глобулінів (r=0,78; p<0,05) у сироватці, яку було використано при культивуванні поза організмом.

Встановлено високу кореляційну залежність між мейозстимулюючою дією естральної сироватки суперовульованих корів у культурі in vitro та виходом повноцінних ембріонів, одержаних від цих донорів in vivo.

Використання сироватки крові корів з індукованою поліовуляцією забезпечує більш високий рівень виходу повноцінних ембріонів (морул) порівняно з сироваткою корів із спонтанною охотою і фетальною сироваткою теляти.

Концентрація екзогенного естрадіолу (1 мкг/мл), що традиційно використовується при дозріванні ооцитів корів поза організмом, негативно впливає на ядерне дозрівання, підвищуючи частку ооцитів з дегенеративними змінами хромосом. Зниження дози естрадіолу до 50 нг/мл забезпечує повноцінне ядерне і цитоплазматичне дозрівання ооцитів корів in vitro.

Комбіноване використання у середовищі дозрівання ооцитів сироватки суперовульованих корів, одержаної у фолікулярну фазу статевого циклу, а у складі середовища розвитку ембріонів сироватки, яку одержано у лютеальну фазу, підвищує вихід ембріонів, які досягли доімплантаційних стадій in vitro.

Інсуліноподібний фактор росту-II позитивно впливає на інтра- та екстраядерне дозрівання ооцитів корів при додаванні до середовища дозрівання і не впливає на розвиток отриманих ембріонів.

Доповнення середовища розвитку ембріонів корів епідермальним фактором росту у дозозалежній манері позитивно впливає на ранній ембріорозвиток.

Оптимальним строком введення білкової добавки до середовища культивування ембріонів, отриманих поза організмом, є період, коли ембріони досягають стадії 8-16-ти клітин.

Практичні пропозиції

Для розвитку поза організмом ооцит-кумулюсних комплексів великої рогатої худоби доцільно застосовувати базове комплексне середовище 199, яке доповнюють 20% естральної сироватки крові корів з індукованою поліовуляцією, яку одержують через 24 години після введення простагландину, та 50-ма нг/мл IGF-II й 50-ма нг/мл естрадіолу-17.

На етапі культивування ембріонів пропонуємо використовувати просте хімічно визначене середовище CR1аа без ко-культури, яке через 90 годин після осіменіння ооцитів доповнюють сироваткою крові корів з індукованою поліовуляцією, одержаною у лютеальну фазу естрального циклу.

Сироватку одержувати від корів-донорів з високими результатами ембріопродукції.

Список основних праць, опублікованих за темою дисертації

Жернокльов Г.В. Використання різних сироваток для культивування ооцитів корів // Тваринництво України.- 1997.- №4.- С.21.

Жернокльов Г.В. Вплив білкових добавок на розвиток ембріонів // Тваринництво України.- 1998.- №2.- С.10.

Жернокльов Г.В. Одержання ембріонів з дозрілих in vitro у середовищі з різними сироватками ооцитів великої рогатої худоби//Научно-технический бюллетень Института животноводства УААН.- Харьков.- 1998.- №73.- С.20-24.

Жернокльов Г.В. Вплив естрадіолу-17 факторів росту на ядерне і цитоплазматичне дозрівання ооцитів великої рогатої худоби поза організмом // Науково-технічний бюлетень Інституту тваринництва УААН.- Харків.- 1998.- №75.- С.124-130.

Міненко Г.В., Пивовар А.К. Гормональний фон естральної сироватки крові корів після суперовуляції // Матеріали 1-ї Міжнар. наук. конф. молодих вчених та спец-тів. “Селекційно-біотехнологічні методи використання генетичного потенціалу сільськогосподарських тварин”. - Київ.-1994.- С.57.

Миненко Г.В., Бугров А.Д. Созревание ооцитов коров в среде с эстральной сывороткой крови суперовулированных доноров // Матер. Междун. научно-практ. конф., посвященной 90-летию со дня рождения д.б.н., проф. Лукина Е.И., “Зоологическая наука и современные проблемы зоотехнии и ветеринарной медицины”.- Харьков.- 1994. - С.46.

Миненко Г.В., Бугров А.Д., Кутиков Е.С. Белки эстральной сыворотки крови коров в системе культивирования ооцитов вне организма // Материалы Междунар. научно-практич. конференции, посвященной 140-летию со дня рождения профессора Кулешова П.Н.- Харьков.- 1995.- С.73.

Миненко Г.В. Вплив білкових добавок на дозрівання ооцитів, запліднення яйцеклітин та розвиток ембріонів великої рогатої худоби in vitro // Матеріали науково-виробничої конференції.- Київ, Асоціація “Україна”.- 1996.- С.340.

Аннотація

Жернокльов Г.В. Ефективність використання різних білкових добавок при одержанні in vitro ембріонів великої рогатої худоби.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата сільськогосподарських наук за спеціальністю 03.00.20 - біотехнологія.- Інститут тваринництва УААН, Харків, 2001.

Досліджено ефективність використання різних сироваток на етапах дозрівання ооцит-кумулюсних комплексів in vitro і культивування одержаних після запліднення ембріонів великої рогатої худоби. Визначено перевагу використання у системі in vitro естральної сироватки крові корів з індукованою поліовуляцією, одержану від донорів з високим виходом ембріонів. Встановлено наявність взаємозв`язку рівня мейотичного дозрівання ооцитів і концентрації ендогенного естрадіолу та -глобулінової фракції білка у сироватках, якими доповнено культуральне середовище. Вивчено вплив на дозрівання ооцитів і розвиток ембріонів корів in vitro екзогенних гормонів і факторів росту. Показано позитивний вплив комбінованого використання при дозріванні ооцитів і культивуванні ембріонів сироваток крові, одержаних у різні фази естрального циклу корів. Досліджено здатність до розвитку ембріонів, одержаних in vitro, у середовищі без ко-культури.

Ключові слова: ооцит, ембріон, сироватка, велика рогата худоба, культивування in vitro.

Аннотация

Жерноклев Г.В. Эффективность использования различных белковых добавок при получении in vitro эмбрионов крупного рогатого скота. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук по специальности 03.00.20 - биотехнология.- Институт животноводства УААН, Харьков, 2001.

Исследована эффективность использования различных сывороток на этапах дозревания ооцит-кумулюсных комплексов in vitro и культивирования полученных после оплодотворения эмбрионов крупного рогатого скота. Установлено преимущество использования в системе in vitro эстральной сыворотки крови коров с индуцированной полиовуляцией, полученной от доноров с высоким выходом эмбрионов. Установлено наличие взаимосвязи между уровнем мейотического созревания ооцитов и концентрацией эндогенного эстрадиола, а также концентрацией -глобулиновой фракции белка в сыворотках, которыми дополняют культуральную среду. Изучено влияние на созревание ооцитов и развитие эмбрионов коров in vitro экзогенных гормонов и факторов роста. Показано позитивное влияние комбинированного использования при дозревании ооцитов и культивировании эмбрионов сывороток, полученных в различные фазы эстрального цикла коров. Исследована способность к развитию эмбрионов, полученных in vitro в среде без ко-культуры.

Summary

Zhernoklyov G.V. Efficiency of using of different protein additions in culture media for in vitro maturation of bovine oocytes and embryo development.

Thesis for a candidate's degree of agriculture sciences on speciality 03.00.20 - biotechnology.- Institute of Animal Science, UAAS, Kharkiv, 2001.

Maturation of bovine oocyte-cumulus complexes in medium supplemented with fetal bovine serum (“Serva”) and in medium supplemented with estrous serum obtained from superovulated cows, estrous serum from cows with natural cycle, newborn calf serum, which were prepared in our laboratory, was investigated.

The supplementation of estrous serum, obtained from cows in 24 hour after prostaglandine administration, resulted in more complete both nuclear and cytoplasmic maturation in vitro of bovine oocyte-cumulus complexes in compare to maturation in medium supplemented with other sera.

The carried out analysis of gonadotropins (FSH and LH) and steroid hormones (estradiol-17b and progesterone) levels and concentrations of whole protein and different protein fractions in used sera displayed the direct correlation between rate of oocytes in metaphase II stage and endogenous estradiol-17b levels (r=0,83; p<0,05) and concentration of b-globulin fraction of protein (r=0,78, p<0,05).

There was a positive correlation between the expression of meiosis stimulating effect of estrous syperovulated cow's serum in culture medium and yield of transferable embryos, obtained from these cow-donor after embryo collection.

The maturation of oocyte-cumulus complexes in medium supplemented with estrous serum, obtained from superovulated cows, provide both more high rate of nuclear maturation and elevate speed of meiosis duration versus to the oocyte maturation in medium supplemented with fetal calf serum. Perhaps, estrous superovulated cow serum has this property due to some substance or complex of substances taking part in meiosis regulation.

The maturation of bovine oocyte-cumulus complexes in medium supplemented with various concentration of exogenous estradiol-17b ( 1 mg/ml and 50 ng/ml) had been studied. It was found, that concentration of exogenous estradiol-17b ( 1 mg/ml) traditionally using for bovine oocyte-cumulus complexes maturation in vitro had negative effect on nuclear maturation increasing percent of oocytes with degenerative chromosome changes and was not optimal for cytoplasmic maturation.

Influence of IGF-II and EGF additions in medium for in vitro maturation of bovine oocyte-cumulus complexes had been studied. It was shown, that IGF-II alone directly or in combination with EGF, took part in regulation of intro- and extro-nuclear maturation of bovine oocytes in vitro. The development of early embryos in medium with supplements of different sera and grows factors was studied. It was shown, that development of embryos in condition medium of bovine oviduct epithelial cells with supplementation of estrous serum of superovulated cows increased the rate of embryos on stage of morula versus to embryo development in medium with fetal bovine serum. The combine of the serum, obtained from superovulated cows in follicular phase of estrous cycle using in maturation medium and serum, obtained from superovulated cows in luteal phase, in medium for embryo culture, increase the rate of transferable embryos, obtained in vitro. It was established a positive effect of addition 10 ng/ml EGF to culture medium on the development of embryos. The possibility of complete physiological development of embryos in simple medium with serum addition and without co-culture was demonstrated. It was found that addition of serum into culture medium is most beneficial at 8-16-cell stage of bovine embryo development in vitro.

Key words: oocyte, embryo, serum, bovine, culture in vitro.

Размещено на Allbest.ru

...