Вплив N-ацилетаноламінів на стероїдогенез в корі надниркових залоз

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна

УДК 577.115.4 + 577.175.5

Вплив N-ацилетаноламінів на стероїдогенез в корі надниркових залоз

03.00.04, біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Жуков Олександр Дмитрович

Київ 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України та в Інституті ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України

Науковий керівник - член-кор. НАН та АМН України, доктор біологічних наук ГУЛА Надія Максимівна, Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, зав. відділом біохімії ліпідів

Офіційні опоненти:

Левицький Євген Леонідович, доктор біологічних наук за с. н. с., головний науковий співробітник Інституту фармакології та токсикології,

Кульчицький Олег Костянтинович, доктор медичних наук, професор, завідувач лабораторії регуляції метаболізму Інституту геронтології АМН України

Провідна установа - Національний медичний університет ім. О. О. Богомольця МОЗ України (кафедра біоорганічної, біологічної і фармацевтичної хімії)

Захист відбудеться “ 21 ” січня 2002 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.240.01 в Інституті біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України за адресою: 01601, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України за адресою: 01030, Київ-30, вул. Леонтовича, 9.

Автореферат розіслано: “ 17 ” грудня 2001 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук КІРСЕНКО О.В.

стероїдогенез наднирковий залоза

Анотація

Жуков О.Д. Вплив N-ацилетаноламінів на стероїдогенез в корі надниркових залоз. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Інститут біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України, Київ, 2001.

Дисертацію присвячено вивченню нової ланки біологічної активності N-ацилетаноламінів - їхньої участі в регуляції функції кори надниркових залоз. Показано високе переважне включення екзогенно введених N-ацилетаноламінів в надниркові залози щурів. В дослідах in vitro в присутності NAE виявлено активацію включення доданого в середовище інкубації міченого холестеролу в стероїдні гормони альдостерон і кортикостерон, що синтезувались зрізами кори надниркових залоз щурів. Виявлено, що дофамін, який є потужним ендогенним адреномодулятором і зазвичай інгібує альдостероїдогенез, в поєднанні з сумішшю ненасичених NAE не виявляв свого інгібуючого ефекту. В дослідах in vivo показано стимуляцію стероїдогенезу при дворазовому внутрішньоочеревинному введенні щурам N_стеароїлетаноламіну. При цьому, введення NAE18:0 нестресованим щурам призводило до підвищення вмісту 11-оксикортикостероїдів в плазмі крові на таку ж саму величину, як іммобілізаційний стрес. Введення ж NAE18:0 щурам на тлі іммобілізаційного стресу призводило до ще більшого підвищення вмісту гормонів в крові. Виявлено високу спорідненість NAE до БСА, що може свідчити про можливість транспорту NAE в організмі за допомогою альбумінів.

Результати свідчать, що NAE, які як правило з`являються в клітинах за умов стресу, можуть бути фактором адаптації організму, діючи не тільки локально, на тканину, де вони утворюються за умов ушкодження, але й глобально, опосередковуючи свою дію через надниркові залози, які відповідальні за розвиток реакцій організму на стрес.

Ключові слова: N-ацилетаноламіни, анандамід, надниркові залози, стрес, стероїдогенез

Жуков А.Д. Влияние N-ацилэтаноламинов на стероидогенез в коре надпочечников. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Институт биохимии им. А.В.Палладина НАН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена изучению нового звена биологической активности N-ацилэтаноламинов - их участия в регуляции функции коры надпочечников. Показано высокое преимущественное включение экзогенно введённых N-ацилэтаноламинов в надпочечники крыс. В экспериментах in vitro в присутствии NAE выявлена активация включения добавленного в среду инкубации меченого холестерина в стероидные гормоны альдостерон и кортикостерон, которые синтезировались срезами коры надпочечников крыс. Обнаружено, что дофамин - мощный эндогенный адреномодулятор и ингибитор альдостероидогенеза - в совокупности со смесью ненасыщенных NAE не ингибировал стероидогенез, тогда как без добавления NAE в среду инкубации дофамин снижал мечение и альдостерона и кортикостерона. В опытах in vivo показана стимуляция стероидогенеза в коре надпочечников при двукратном внутрибрюшинном введении крысам N-стеароилэтаноламина. При этом введение NAE18:0 нестрессированным крысам приводило к повышению содержания 11-ОКС в плазме крови на такую же величину, что и иммобилизационный стресс. Введение же NAE18:0 крысам на фоне иммобилизационного стресса приводило к ещё большему повышению содержания гормонов в крови. Показано высокое сродство NAE к БСА, что может свидетельствовать о возможности транспорта NAE в организме с помощью альбуминов.Высказано предположение, что NAE опосредуют свое действие за счет своих мембранотропніх эффектов

Результаты свидетельствуют, что NAE, которые как правило появляются в клетках при стрессовых условиях, могут быть фактором адаптации организма, действуя не только локально, на ткань, где они образуются при повреждающих условиях, но и глобально, опосредуя своё действие через надпочечники, которые ответственны за развитие реакций организма на стресс.

Ключевые слова: N-ацилэтаноламины, анандамид, надпочечники, стресс, стероидогенез

Zhukov O. D. The influence of N-acylethanolamines on the steroidogenesis in the adrenal cortex function. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.04 - Biochemistry. O. V. Palladin Institute of Biochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The dissertation deals with the investigation of the new link of the biological activity of the N-acylethanolamines - of their participation in the regulation of the adrenal cortex function. High preference incorporation of the exogenic injected N_acylethanolamines into the rat adrenal glands was shown. Activation of the cholesterol incorporation into aldosterone and corticosterone synthesised by rat adrenal slices was established in the in vitro investigation. It was found that dopamine, which is known as endogenic adrenomodulator and aldosteroidogenesis inhibitor, in the presence of the unsaturated NAE mixture did not inhibite steroidogenesis. In the in vivo investigation the stimulation of the steroidogenesis under two-fold NAE18:0 injection was revealed. In this case injection of NAE to the unstressed rats increased the 11-HCS level by the same value as immobilization stress caused by itself. More high augmentation of the blood level of 11-HCS was observed under simutaneous two-fold injection of NAE18:0 and immobilization stress. High affinity of the NAE with BSA was detected. This fact may serve as an evidence of the NAE transport in organism by albumins.

Our results indicate, that NAEs which appear in the cells under stress, can act as the factor of the organism adaptation not only locally in the damaged tissue but in all the organism through adrenal glands, which are known to be important for the stress reaction development.

Key words: N-Acylethanolamines, anandamide, adrenal glands, stress, steroidogenesis.

1. Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Біологічно активні сполуки N-ацилетаноламіни (NAE) вперше відкрито в препаратах лецитину із сої, арахісовій олії та яєчному жовтку ще в 1958 р. і тоді ж були описані антизапалювальні властивості цих ліпідів [Ganley O.H.et al.,1958; Kuehl F.A.,et al.,1957]. Більш як через 20 років ці ліпіди було знайдено в деяких ушкоджених тканинах тварин, зокрема інфарктній зоні міокарду собаки [Epps D.E et al., 1979, 1980]. Ця знахідка призвела до інтенсивного дослідження метаболізму та біологічної активності NAE. Почали накопичуватись дані про біологічну роль NAE, що дозволили висловити припущення про високу біологічну активність цих сполук. Були описані їхні мембранотропні властивості, вплив NAE на йонні канали [Гулая Н.М и др, 1984, 1989, Gulaya N.M et al. 1988, Волков Г.Л., 1992]. На початку 90-х років були відкриті та ідентифіковані NAE в недиференційованих клітинах нейробластоми С1300 [Gulaya N.M et al., 1993]. Було показано, що цим сполукам притаманні антиоксидантні, гепатопротекторні властивості. Вони інгібують вихід Са2+ з мітохондрій [Gulaya N.M., 1997; Н.М. Гулая, 1997; Parinandi N.L 1988], тощо. Новий спалах зацікавленості NAE виник після того, як з'ясувалось, що N-арахідоноїлетаноламін (NAE 20:4, анандамід) є природним лігандом каннабіноїдних рецепторів [Devane W.A., et al. 1992]. З цього часу багато робіт з вивчення біологічних властивостей NAE було присвячено саме анандаміду [Schmid P.C, 1997, Di Marzo V, 1994; Sugiura T, 1994]. Значно рідше друкуються роботи, присвячені іншим NAE. NAE, що мають насичений залишок довголанцюгової жирної кислоти, за своїми властивостями значно відрізняються від анандаміду. Вони являють собою біологічно високо активні сполуки, що можуть впливати на перебіг багатьох процесів в організмі. Опубліковано багато робіт про накопичення NAE в клітинах за умов пошкодження [Natarajan V.,1985, Epps D.E.,1980, 1979, Gulaya, 1988]. Тим часом зовсім не досліджено роль NAE в ендокринних залозах. Відомо, що надниркові залози відповідальні за прояв стрес-реакцій організму [Selye H, 1936, Богомолець О.О., 1944], а NAE зв'являються в клітинах саме за умов стресу різного походження [Kondo S, 1998, Berdyshev E.V., 2000]. Тому не виключено взаємодію NAE з клітинами кори надниркових залоз у відповіді організму на стрес. Це питання актуальне і потребує дослідження.

Зв'язок роботи з науковими планами, програмами, темами. Робота проводилась в рамках наукової тематики відділу біохімії ліпідів Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (тема 0194U013504 - “Вивчення функціональної ролі та механізму дії природних біологічно активних ліпідів N-ацилетаноламінів”, шифр 2.28.4.7. і тема 0199U000271 “Роль ліпідів у загальному механізмі розвитку патологічних станів та вивчення протекторної дії природних N-ацилетаноламінів (NAE) та С27-стероїдів”, шифр 2.28.4.7., затверджені Президією НАН України) та лабораторії гормональної регуляції обміну речовин Інституту ендокринології ім. В. П. Комісаренка АМН України (тема 0198U001283, шифр 423 “Роль метаболізму фосфоліпідів в перенесенні сигналів агоністів та модуляторів в клітинах кори надниркових залоз” 1998-2000 гг. затверджена Президією АМН України). Також робота була підтримана грантом ДФФД № 5.4/154.

Мета та завдання дослідження. Метою дослідження було вивчення біологічних властивостей і специфічної фізіологічної дії NAE з різними жирнокислотними ланцюгами в корі надниркових залоз за різних умов, а саме: 1) вивчення включення міченого холестерину, в стероїдні гормони, що синтезуються зрізами кори надниркових залоз in vitro та вплив на ці процеси NAE 18:0 і суміші NAE, що містить насичені і ненасичені жирнокислотні ланцюги для з'ясування питання про безпосередній вплив NAE на тканину кори надниркових залоз; 2) вивчити вплив різних NAE на стероїдогенез в зрізах кори надниркових залоз in vitro при додаванні в середовище інкубації відомого адреномодулятора - дофаміну; 3) вивчити вплив NAE на стероїдогенез в корі надниркових залоз щурів in vivo за нормальних умов та за умов іммобілізаційного стресу, що дасть змогу з`ясувати можливість взаємодії NAE з іншими регуляторними факторами стероїдогенезу в організмі і визначити можливу роль NAE у відповіді організму на стрес. Для досягнення цієї мети було поставлено такі завдання: 1) синтезувати мічені NAE (N-стеароїлетаноламін та N_пальмітоїлетаноламін); 2) за допомогою отриманих мічених NAE дослідити їхній розподіл в тканинах щурів; 3) вивчити вплив NAE з різними жирнокислотними ланцюжками на стероїдогенез в надниркових залозах іn vіtro та in vivo у інтактних тварин та за умов імобілізаційного стресу (з використанням індивідуальних NAE (NAE16:0 і NAE18:0) та суміші NAE з різними ацильними залишками, що була наближена за складом до NAE, що синтезуються в прородних умовах [Schmid, 1980]; 4) дослідити модулюючий вплив різних NAE (з насиченими та ненасиченими жирнокислотними ланцюжками) на стероїдогенезні ефекти дофаміну в корі надниркових залоз in vitro.

Наукова новизна отриманих результатів. В результаті проведених досліджень відкрито нову ланку біологічної активності NAE, а саме вперше показано можливість участі NAE в регуляції функції кори надниркових залоз. Так, in vitro NAE18:0 і суміш NAE з насиченими і ненасиченими ацильними залишками показали підвищення утилізації доданого в середовище інкубації холестеролу для синтезу альдостерону і кортикостерону зрізами кори надниркових залоз щурів. В дослідах in vitro також показано вплив NAE на регуляторну дію дофаміну під час стероїдогенезу в зрізах кори надниркових залоз. In vivo, введений внутрішньоочеревинно щурам, NAE18:0 підвищував рівень 11-ОКС в плазмі крові, причому це підвищення було ще більш виражене за умов стресування тварин. Висловлено припущення, що каннабіноїдні рецептори (СВ2), які присутні в тканині, не беруть участі в опосередкуванні ефекту NAE. Підставою для цього є аналіз наших результатів в світлі даних літератури, які свідчать, що NAE з насиченими ацильними залишками не мають спорідненості до каннабіноїдних рецепторів. Крім того, розроблено зручний спосіб отримання в лабораторії мічених NAE з насиченими ацильними залишками.

Теоретичне і практичне значення результатів. Отримані результати розширюють наші уявлення про біологічні властивості N-ацилетаноламінів - мінорних ліпідів, що з'являються в тканинах за умов ушкодження. Показана властивість різних NAE (як насичених, так і ненасичених) однаково впливати на біологічні функції надниркових залоз - тканини, що є відповідальною за адаптацію організму до умов довкілля. Таким чином, NAE можуть бути однією з ланок регуляції захисних сил організму: утворюючись в ушкодженій клітині і діючи потім на весь організм через модуляцію функції кори надниркових залоз вони сприяють запуску механізмів, що забезпечують реалізацію біохімічних процесів захисту організму від стресу. Дія насичених і ненасичених NAE, котрі суттєво відрізняються одне від одного за деякими властивостями, зокрема, спорідненістю до каннабіноїдних рецепторів, є однонапрямленою, що підтверджує загальні мембранотропні властивості цих сполук. Наші результати свідчать, що ці сполуки відіграють захисну роль не тільки локально в місці їх синтезу в ушкоджених тканинах, але і через вплив на функцію кори надниркових залоз можуть впливати на адаптаційні процеси в цілому організмі.

Особистий внесок здобувача. Робота виконувалась у відділі біохіміі ліпідів Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України та в лабораторії гормональної регуляції обміну речовин Інституту ендокринології ім. В.П. Комісаренка АМН України під керівництвом член-кор. НАН та АМН України д.б.н. Гулої Н.М. в тісному співробітництві з д.м.н. Мікошею О.С., з яким автор має спільні публікації. Результати, описані в розділах 1, 2, 3 отримані автором особисто, описані в розділі 3.4 - за безпосередньої участі пошукувача в спільних експериментах. Текст дисертаційної роботи написано здобувачем особисто.

Апробація результатів роботи. Матеріали дисертаційної роботи було представлено на конкурсі молодих вчених Інституту біохімії НАН України 1999 року та на міжінститутському конкурсі молодих вчених Києва 2000 року. Також автор брав участь в роботі XI Європейської конференції для студентів та молодих лікарів (XI ESC, Берлін 2000), яку проводив Університет імені Гумбольдта. Матеріали роботи доповідались на VI Українському З'їзді ендокринологів (Київ, 23-25 травня 2001 р.) Крім того, результати обговорювались на семінарах відділу біохімії ліпідів.

Публікації. За матеріалами дисертаційної роботи надруковано 4 статті і 2 тез доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 123 сторінках друкарського тексту. Робота складається з розділів: ВСТУП, ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ, МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ, РЕЗУЛЬТАТИ І ОБГОВОРЕННЯ, НА ЗАКІНЧЕННЯ, ВИСНОВКИ, СПИСОК ВИКОРИСТАНИХ ДЖЕРЕЛ, що налічує 243 посилання. Робота проілюстрована 15 рисунками та 7 таблицями.

2. Зміст роботи

Першим розділом роботи є огляд літератури, в якому вісвітлюється історія відкриття та наукові досягнення у вивченні біологічних властивостей довголанцюгових N_ацилетаноламінів. Основною властивістю сполук цього класу є їхня мембранотропна дія. Поворотним пунктом у вивченні NAE сталі роботи Schmid та його групи, які на початку 80-х років відкрили та ідентифікували N-ацильовані фосфогліцероліпіди в інфарктній зоні міокарду собак після оклюзії коронарної артерії. Висловлено припущення [Schmid et al. 1980], що ці сполуки генеруються, як захисні агенти, роль яких полягає в зменшенні розміру ішемічного ушкодження серцевого м'язу. З часом дослідники відкривають все нові й нові ланки активності цих мінорних ліпідів. Окремо обговорюється відкрита майже 10 років тому властивість одного з NAE - анандаміду (NAE20:4) специфічно зв'язуватись з каннабіноїдними рецепторами (СВ), що обумовило вивчення цього NAE окремо багатьма дослідниками. Зовсім не вивчено ролі NAE щодо ендокринних залоз, не дивлячись на те, що в деяких з них, зокрема в надниркових, ідентифіковано СВ2 рецептори. Надниркові залози відіграють ключівну роль в загальному метаболізмі, а крім того першими реагують на стресорні дії. Можна припустити, що NAE, які з'являються в клітинах за умов стресу, можуть взаємодіяти з наднирковими залозами, роль яких в життєзабезпеченні організму висвітлено в другій частині огляду літератури, і робити свій внесок до адаптації організму до стресорних умов.

У другому розділі описано матеріали та методи досліджень.

У третьому розділі наведено результати роботи та їхнє обговорення.

Матеріали та методи досліджень

Синтез N-ацилетаноламінів проводили за методом конденсації етаноламіну і стеаринової або пальмітинової кислот [Ulrich 1935]. Отриманий препарат NAE перекристалізовували з етанолу та перевіряли на чистоту методом мікротонкошарової хроматографії. В такий самий спосіб отримували препарати мічених [1-14С16:0]NAE і [1_14С18:0]NAE в мікрокількостях. Радіоактивність препаратів визначали на сцинтиляційному лічильнику SL-3000.

Ліпіди з тканин ектрагували хлороформ-метанольною сумішшю за методом Bligh & Dyer. Стероїди ектрагували хлороформом або метиленхлоридом. Для розділення ліпідних класів використовували одновимірну мікротонкошарову хроматографію на скляних платівках 6х9 см з нанесеним силікагелем 5/40 мкм (Чехія) в системі розчинників гексан-диетиловий ефір - льодова оцтова кислота = 85-15-1 (Schmid 198 ). Для контролю реакції синтезу NAE використовували систему розчинників хлороформ - метанол - амміак = 80 - 20 - 2. Для розділення індивідуальних фосфоліпідів використовували метод двовимірної МТШХ на платівках 6х6 см з силікагелем КСК-2 (Росія). Ідентифікацію фосфоліпідів проводили за відомими значеннями Rf та використовуючи кольорову реакцію з молібдатним реактивом (Васьковский, 1975). Вміст 11-ОКС в пробах визначали спектрофлуориметричним методом (De Moor, 1960). Аналіз жирнокислотного складу NAE проводили газо-хроматографічно після переведення NAE на метилові ефіри жирних кислот.

Розподіл мічених NAE в організмі щурів вивчали, вводячи внутрішньоочеревинно розчин NAE щурам з наступною декапітацією через 5 хвилин. З тканин готували ліпідні екстракти, радіоактивність яких вимірювали на лічильнику SL-3000.

Вплив NAE на стероїдогенез в корі надниркових залоз визначали in vitro та in vivo. in vitro зрізи тканин кори надниркових залоз щурів інкубували в живильному середовищі за додавання міченого холестеролу і NAE. Альдостерон і кортикостерон, що синтезуються зрізами, екстрагували, піддавали розділенню методом мікротонкошарової хроматографії на силуфолі і вимірювали радіоактивність гормонів. Крім того вимірювали вміст 11-ОКС в середовищі інкубації спектрофлуориметричним методом. in vivo NAE18:0 вводили щурам внутрішньоочеревинно одноразаво і дворазово (5 мг/кг) з інтервалом 45 хв. Після цього щурів піддавали іммобілізаційному стресу протягом 45 хв [Филаретов, 1987]. Щурів декапітували і вимірювали вміст 11-ОКС в плазмі крові. Для оцінки впливу дофаміну на стероїдогенез в корі надниркових залоз щурів зрізи тканини інкубували в живильному середовищі за присутності 3Н-холестерину, дофаміну (10-7, 10-6 і 10-5 М) а також за одночасної присутності дофаміну (10-6 М) і NAE (10-6 М).

Спорідненість NAE до бичачого сироваткового альбуміну визначали за графічним методом, що полягає в приготуванні розчину акцептора з наступним додаванням до нього ліганда. Після встановлення рівноваги, з системи готують декілька розведень і в кожному з них встановлюють рівноважні концентрації ліганда, що зв`язався з акцептором. За отриманими даними знаходять константу спорідненості ліганда до рецептора [Бобровник, 1998].

Реакції транспорту електронів електронтранспортними системами мітохондрій та мікросом вивчали в тканинах надниркових залоз новонароджених поросят. До препаратів мітохондрій та мікросом додавали спиртові розчини N-стеароїлетаноламіну або суміші N-ацилетаноламінів з різними ацильними залишками. Концентрація NAE у суспензії складала 10-6 М. До контрольних зразків мітохондрій та мікросом додавали рівні об'єми етанолу (кінцева концентрація 1 %). Електронний транспорт оцінювали, використовуючи штучні акцептори електронів: цитохром с та 2,6-дихлорфеноліндофенол (ДХФІФ). Відновлення цитохрому с проводили в інкубаційній суміші, яка містила 100 мкМ NADPH (Reanal, Угорщина), 50 мкМ цитохрому с (Reanal, Угорщина), 330 мкМ NaCN, 100 мМ трис-HCl буфера, pH 7,4. Інкубаційна суміш, яку використовували для вимірювання відновлення ДХФІФ, містила: 100 мкМ NADPH, 40 мкМ ДХФІФ, 100 мМ трис-HCl буфера, pH 7,4 [Карузина И.И., 1977]. Вміст білка в суспензії мітохондрій біля 200 мкг, мікросом - 100 мкг. Загальний об'єм інкубаційної суміші складав 3,1 мл. Ступінь відновлення вимірювали спектрофотометрично на спектрофотометрі СФ-46 протягом 5 хв при 550 нм для цитохрому с і 600 нм для ДХФІФ.

Для характеристики інтенсивності ПОЛ in vivo визначали вихідний рівень продуктів, що реагують з тіобарбітуровою кислотою (ТБК-РП) у післяядерній фракції гомогенату надниркових залоз та печінки [Brogan W. C., 1981]. Швидкість спонтанного ПОЛ визначали по накопиченню ТБК-РП. Реакцію простежували в 50 мМ трис-HCl буфері, який містив 1,15 % KCl на протязі 120 хв інкубації при 37 0С в атмосфері повітря. Ступінь ПОЛ оцінювали спектрофотометрично при 532 нм на СФ-46 і відносили до кількості білка або сирої тканини. Вміст ТБК-РП розраховували з використанням коефіціента молярної екстинкції малонового діальдегіду 1,56 х 105 М-1 см-1.

Результати та обговорення

1. Синтез мічених препаратів NAE та дослідження їхнього розподілу в органах і тканинах щурів. З метою дослідження розподілу NAE в організмі тварин нами було розроблено зручний спосіб отримання мічених препаратів NAE. Отримані і очищені препарати [1_14C]NAE16:0 і [1_14C]NAE18:0 було введено щурам внутрішньоочеревинно Після декапітації та приготування ліпідних екстрактів було виміряно їхню радіоактивність. З результатів, що наведені в таблиці 1, можна побачити переважне включення NAE в надниркові залози. Перше можливе припущення, що пояснює такий розподіл, полягає в тому, що надниркові залози дуже багаті на ліпіди і ліпофильні NAE захоплюються за фізико-хімічною спорідненістю. Однак накопичення N-пальмітоїлетаноламіну в тканині надниркових залоз перевищує його накопичення в паренхіматозних органах (нирки, сім`яники, печінка) в 30-80 разів, тим часом як вміст сумарних ліпідів в цих органах і надниркових залозах різниться не так суттєво. Особливо вражає різниця між плазмою крові та наднирковими залозами: в 10000 разів. Це вказує на те, що захоплення NAE тканиною залози є дуже швидким процесом. Разом з тим, роль NAE в ендокринних залозах зовсім не досліджено. А це питання, звичайно, випливає з результатів наших досліджень розподілу мітки NAE по органах.

2. Дослідження дії NAE, а також сумісної дії NAE і дофаміну на функцію кори надниркових залоз. Досліди in vitro. Для аналізу можливого впливу NAE на функцію кори надниркових залоз ми використали самі різні підходи. Дослідження було проведено in vivo, коли NAE вводили до організму тварин та оцінювався стан функції залози та in vitro з додаванням NAE в середовище інкубації. Беручи до уваги літературні дані про можливі відмінності ефектів NAE, які містять насичені і ненасичені жирні кислоти, було використано обидва типи сполук. Для оцінки процесів синтезу кортикостероїдних гормонів використали два підходи: розглядалось включення мітки холестерину в гормони, що синтезуються та оцінювалась маса 11_оксистероїдів, до яких відносяться кортикостерон та альдостерон, що є основними гормонами кори надниркових залоз щурів. Результати вивчення впливу різних NAE на включення міченого 3Н-холестерину в альдостерон та кортикостерон наведено на рис. 1. і 2. З результатів, що представлені на діаграмі рис. 1 видно, що суміш NAE в концентраціях 10-7 і 10_6 М особливо не впливає на включення мітки в кортикостерон та альдостерон. В присутності суміші NAE в концентрації 10_5 М достовірно підвищується вміст мітки в синтезованих зрізами кори надниркових залоз альдостероні та кортикостероні в порівнянні з контролем, рис. 1. На рис. 2, де показано результати впливу NAE18:0 на утилізацію холестерину під час стероїдогенезу, бачимо схожу з попередньою картину, а саме, NAE 18:0 в концентраціях 10-7 і 10_6 М не змінює вірогідно вміст мітки в синтезованих гормонах. При концентрації NAE18:0 10-5 М, спостерігалось достовірне підвищення включення мітки в кортикостерон та відмічалась тенденція до підвищення включення 3Н_холестерину в альдостерон, рис 2. Отже, загалом можна стверджувати, що як NAE18:0, так і суміш NAE, що містить похідні насичених і ненасичених жирних кислот, здатні модулювати функції кори надниркових залоз в дослідах in vitro.

Серед регуляторів та модуляторів адренокортикальної функції одним з найменш досліджених є дофамін - речовина, що продукується медулярною речовиною надниркових залоз. Дофамін - це нейромедіатор і попередник адреналіну - відомого гормону стресу. Відомо, що він інгібує секрецію альдостерону. Крім того, він відіграє важливу роль як нейромедіатор, зокрема в регуляції секреції пролактину. В свою чергу, пролактин є важливим гормоном стресу та виконує самостійну регуляторну функцію в адренокортикоцитах [Саутин Ю.Ю., 1997]. Таким чином, в організмі можливі впливи дофаміну на надниркові залози, що опосередковуються пролактином, але ймовірно, дофамін може і безпосередньо впливати на залозу. Зважаючи на це, постало питання можливості взаємодії дофаміну і NAE під час модуляції функції кори надниркових залоз. Для з'ясування цього питання поставили експерименти in vitro з міченим холестерином, в котрих визначали зміни утилізації холестерину для стероїдогенезу зрізами кори надниркових залоз щурів за одночасної дії дофаміну і NAE, які підтвердили можливість модулювання секреції альдостерону і кортикостерону дофаміном, рис. 3. Вплив дофаміну залежав від його концентрації і дещо різнився при оцінці включення мітки в альдостерон і кортикостерон. З підвищенням концентрації дофаміну мічення кортикостерону знижувалось майже лінійно; пригнічення ставало вірогідним при концентрації дофаміну 10-5 М. Мічення альдостерону слабо зростало при концентрації дофаміну 10-6 М, але при 10-5 М істотно знижувалось. Але, зауважимо, що це гальмування відбувається при досить високій концентрації дофаміну - 10-5 М. Аналіз можливої взаємодії дофаміну і NAE проведено з використанням концентрації чинників, яка сама по собі не змінювала включення мітки в альдостерон і кортикостерон - 10-6 М, рис. 4. В присутності дофаміну і кожного з препаратів NAE мітка холестерину включалась в гормони значно активніше. Радіоактивність кортикостерону зростала в порівнянні з контролем на 60-80 %.

Для альдостерону суттєве підвищення включення мітки досягалось тільки при додаванні суміші поліненасичених NAE.

Вивчення включення мітки радіоактивного холестерину в стероїди, що синтезуються, дозволяє оцінити зміну швидкості стероїдогенезу, але не дозволяє оцінити “валовий” вихід продукту. Цей підхід не дозволяє також точно назвати точку прикладення ефекту агоністів. Через це ми далі продовжили вивчати вплив NAE на масу гормонів, що синтезуються in vitro. Зараз існують чіткі дані про залежність процесу секреції кортикостероїдів від естрогенів [Ковзун О. І., 1996]. У зв`язку з цим наші подальші дослідження було проведено на щурах різної статі. Результати досліджень впливу різних NAE на утворення 11-ОКС зрізами кори надниркових залоз щурів представлено в табл. 2 і на рис. 5. Утворення 11_ОКС (в щурів це майже винятково кортикостерон) в самиць дещо вище, як в самців, що відповідає даним, які є в літературі, про стимуляцію синтезу кортистероїдів естрогенами. Різниця відповіді в самців і самиць прослідковувалась і по відповіді секреції на агоністи.

Стеароїлетаноламін суттєво збільшував утворення 11-ОКС в надниркових залозах самиць. Схоже реагували зрізи надниркових залоз самиць і на суміш поліненасичених NAE, рис. 5. В зрізах надниркових залоз самців утворення 11-ОКС в присутності обох NAE пригнічувалось, табл. 2 Цікаво, що достовірне підвищення перетворення холестерину прослідковувалось на зрізах надниркових залоз щурів-самиць тільки за високої концентрації NAE - 10-5 М, рис. 1 і 2 та було виражене для альдостерону, котрий не визначається флуоресцентним методом як 11_ОКС. В присутності стеароїлетаноламіну дофамін знижував утворення 11-ОКС до контрольних величин, рис. 5, але під час інкубації зрізів з поліненасиченими NAE дофамін не інгібував синтезу гормонів. Те, що дофамін не інгібує активацію, яка викликана сумішшю NAE, дозволяє припустити, що під впливом NAE відбувається зміна умов функціонування рецепторів дофаміну чи умов переносу сигналів з мембранних рецепторів дофаміну в присутності саме цього NAE. Питання залежності відповіді на NAE від статі тварин обговорювати вкрай важко, тому що природа впливу естрогенів на синтез кортикостероїдів досліджена дуже слабо. Раніше знаходили статеві відмінності щільності місць зв'язування канабіноїдів в деяких структурах мозку та зміни їх зв'язування під впливом статевих гормонів, але функційна вагомість цих відмінностей не досліджена [Rodriguez de Fonseca F. 1994].

Аналіз можливих місць прикладання дії NAE на стероїдогенез в наших дослідженнях включав вивчення переносу електронів мітохондріальними та мікросомальними препаратами надниркових залоз. В огляді літератури представлені відомості про важливість просторової організації комплексів НАДФН-ферредоксин оксидоредуктаза/адренодоксин/цитохром Р450 в мітохондріях та НАДФН-феррицитохром с оксидоредуктаза в мікросомах. Взаємодія NAE з ліпідами мембран цих структур могла б змінити властивості гідроксилазних комплексів.

Результати вивчення впливу NAE на електронний транспорт наведено в табл. 3. Швидкість відновлення цитохрому с фракцією мікросом кори надниркових залоз поросят була дещо вищою, ніж така фракцією мітохондрій, але ці величини не зазнавали змін за додавання в середовище інкубації NAE18:0 або суміші NAE. Дихлорфеноліндофенол відновлювався майже вдвічі слабше, але і для нього ні NAE18:0 ні суміш NAE не змінювали швидкості відновлення. Тобто, в цих умовах NAE не змінюють активності НАДФ-залежних редуктаз. Між змінами стероїдогенезу під впливом NAE, про які свідчать попередні дані, та відсутністю змін електронного транспорту, зафіксованими в табл. 3, протиріч не виникає. Відновлення акцепторів в тому дослідженні аналізувалося не з цитохромом Р450, котрий є акцептором в природних умовах, а з акцепторами, відновлення яких можливо фіксувати in vitro, тобто з цихромом с і дихлорфеноліндофенолом. Треба також врахувати, що перенос електронів у звичайних умовах не є лімітуючою стадією стероїдогенезу, тому встановлене підвищення синтезу 11-ОКС не слід зв`язувати з обов`язковим прискоренням електронного транспорту.

3. Дослідження дії NAE на функцію кори надниркових залоз за умов іммобілізаційного стресу. Досліди in vivo. Здатність надниркових залоз накопичувати NAE при введенні в організм може бути пов`язана з невідомою на сьогодні регуляторною функцією N-ацилетаноламінів. Враховуючи центральне місце цієї залози в розвитку стрес-реакції, було проведено експерименти, завданням яких було з`ясувати, чи зміниться під впливом NAE відповідь надниркових залоз за умов стандартного стресування. Як модель стресу використовували фіксацію тварин протягом 45 хвилин на спині - гуманну модель, адекватну сучасним вимогам.

Дворазове введення NAE18:0 в дозі 5 мг/кг нестресованим щурам, викликало зростання вдвічі вмісту загальних 11-ОКС в крові. Дворазове введення NAE18:0 щурам, яких піддавали іммобілізаційному стресу, викликало підвищення рівня 11-ОКС майже в чотири рази, рис. 6, стовпчик 5. Можемо зробити висновок, що підвищення рівня 11_ОКС вчетверо є результатом дії двох чинників - іммобілізаційного стресу і NAE18:0, тобто спостерігається додавання ефекту стресу і NAE. Дане явище може розглядатися з двох точок зору. З одного боку можна припустити, що NAE активує механізм, еволюційно сформований для реалізації відповіді організму на стрес. З іншого - можливо NAE самостійно активує стероїдогенез і його вплив сумується з впливом кортикотропіну та інших агоністів, що функціонують під час стресу.

4. До механізму дії NAE на функцію кори надниркових залоз. На підставі однонапрямленої дії насичених і ненасичених NAE на стероїдогенез, ми припускаємо, що NAE діють на кору надниркових залоз не через канабіноїдні рецептори (СВ), як це можна було б припустити, зважаючи на існуючі дані про часткову специфічну спорідненість декотрих NAE (зокрема NAE20:4 і інших поліненасичених NAE, але не для насичених NAE) до цих рецепторів. СВ рецептори присутні в корі надниркових залоз, але їхня роль в цій тканині невідома. Маловірогідно, щоб NAE 18:0 стимулювало утворення головного регуляторного фактору стероїдогенезу - АКТГ, діючи на гіпоталамо-гіпофізарну вісь, оскільки в мозку виявлено дуже малу кількість мітки N_[1_14C]-пальмітоїлетаноламіну мабуть через погану проникливість NAE через гемато-енцефалічний бар'єр. З іншого боку, адитивність ефектів ендогенного АКТГ і NAE 18:0 під час стресу нами виявлена вірогідно. На основі цих даних можемо припустити, що дія NAE18:0 реалізується безпосередньо в надниркових залозах. Зараз ще важко чітко локалізувати місце впливу NAE на стероїдогенез, але його безпосередній вплив на мембрани представляється вельми вірогідним.

Нами показано високу спорідненість NAE18:0 до БСА (К=2,5х108 M_1), що може свідчити про можливість транспортування NAE в організмі від ушкоджених тканин, де вони утворюються, до кори надниркових залоз за допомогою альбуміну через кров`яне русло, адже відомо, що надниркові залози досить інтенсивно постачаються кров'ю. Таким чином NAE можуть бути не тільки локальними протекторними сполуками на рівні клітин і тканин, де вони утворюються, а, потрапляючи до надниркових залоз, здійснювати загальний протекторний ефект на рівні організму.

Висновки

В результаті проведеної роботи виявлено новий факт біологічної активності N-ацилетаноламінів - їхню здатність модулювати функцію кори надниркових залоз. З`ясовано такі питання:

1. Розроблено простий метод синтезу мічених NAE з насиченими ацильними залишками, за допомогою яких виявлено швидке включення мітки екзогенного NAE в надниркові залози in vivo , яке значно перевищує його включення в інші тканини щурів.

2. Показано, що N-ацилетаноламіни беруть участь в регуляції функції кори надниркових залоз: NAE стимулювали утилізацію доданого в середовище інкубації холестеролу для синтезу альдостерону і кортикостерону зрізами кори надниркових залоз щурів in vitro;

3. Виявлено модулюючий ефект NAE на функцію кори надниркових залоз in vitro: підвищення кількості 11-оксикортикостероїдів, що синтезуються зрізами тканини кори надниркових залоз.

4. Встановлено, що кількість de novo синтезованих кортикостероїдів, що утворюються, змінюється в присутності NAE в залежності від умов функціонування тканини. Під час стресу N_стеароїлетаноламін підвищує секреторну активність надниркових залоз щурів.

5. Висловлено припущення, що NAE здійснюють свій ефект на кору надниркових залоз не через СВ2 рецептори, а вбудовуючись безпосередньо в мембрану і, таким чином змінюючи її властивості.

Список робіт за темою дисертації

A. Mikosha, O. Kovzun, A. Zhukov and N. Gulaya // Effect of dopamine and long-chain N-acylethanolamines on steroidogenesis in rat adrenal gland in vitro// Medical Science Researchs, 1998, 26, P. 85-88.

1. В.М.Маргітич, О.Д.Жуков, М.В.Артамонов, Н.М.Гула // Зручний спосіб лабораторного синтезу міченого за жирною кислотою N_([1_14С]пальмітоїл)етаноламіну. // Укр. Біохім. Журн.-1999.- т. 71.-6.-С. 108-110.

2. Жуков О.Д., Артамонов М.В., Клімашевський В.М., Говсеєва Н.М., Маргітич В.М., Гула Н.М. // N-ацилетаноламіни - новий клас природних адренотропних модуляторів.// Укр. Біохім. Журн. 2000.- т. 72.- 2.- С. 56-63. С. 24-27.

3. Жуков О.Д., Мікоша О.С., Гула Н.М., Челнакова І.С. // Дія N_ацилетаноламінів на функцію кори надниркових залоз. // Укр. Біохім. Журн.-2001.- 73.-1.-C. 96-100.

4. Zhukov A., Gulaya N., Mikosha A., Chelnakova I. Investigation of the effect of N-acylethanolamines on the adrenal cortex function under normal and stress conditions. 11th European Students Conference at the Charitй Berlin for Medical Students and Young Doctors.-November 22-26.-2000.

5. А.Д.Жуков, Н.М.Гулая, А.С.Микоша, И.Н.Шуба Влияние N-стеароилэтаноламина на функцию коры надпочечников. // Ендокринологія.-2001.-Т.6.-Додаток-С. 102. Матеріали VI з'їзду ендокринологів України.-Київ.-23-25 травня, 2001 р.

Размещено на Allbest.ru