Біотехнологічні аспекти бактеріальної деструкції аніонних поверхнево-активних речовин

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МІКРОБІОЛОГІЇ ТА ВІРУСОЛОГІЇ ІМ. Д.К. ЗАБОЛОТНОГО

УДК:579.695+628.54

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

БІОТЕХНОЛОГІЧНІ АСПЕКТИ БАКТЕРІАЛЬНОЇ ДЕСТРУКЦІЇ АНІОННИХ ПОВЕРХНЕВО-АКТИВНИХ РЕЧОВИН

03.00.20 -- Біотехнологія

ДИБКОВА СВІТЛАНА МИКОЛАЇВНА

КИЇВ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка

НАН України та Інституті колоїдної хімії та хімії води ім. А.В. Думанського НАН України.

Науковий керівник:

доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Таранова Людмила Анатоліївна, Інститут біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка НАН України, завідувач відділу біотехнології захисту довкілля

Офіційні опоненти:

член-кореспондент НАН України, професор, доктор біологічних наук,

Малашенко Юрій Романович,

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу біології газоокислюючих мікроорганізмів

кандидат біологічних наук,

Кухаренко Олександр Петрович,

Інститут молекулярної біології та генетики НАН України, науковий співробітник відділу структури і функцій нуклеїнових кислот

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, відділ біохімії сенсорних та регуляторних систем

Захист відбудеться "24" січня 2001 о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.233.01 в Інституті мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (03143, м.Київ, вул. Заболотного, 154)

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України

(03143, м.Київ, вул. Заболотного, 154)

Автореферат дисертації розіслано 22 грудня 2000 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук Пуріш Л.М.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

біодеградація мікробний алкілнафталінсульфонат транскон'югантний

Актуальність теми. Поверхнево-активні речовини (ПАР), а точніше аніонні ПАР (АПАР), є найбільш розповсюдженими хімічними забруднювачами довкілля. В силу свого цільового призначення, АПАР потрапляють у воду. Найчастіше очистку стічних вод від АПАР здійснюють фізико-хімічними методами, які, на жаль, мають дуже багато обмежень, часто не забезпечують повної очистки і до того ж занадто дорого коштують.

Мікробіологічний метод, який базується на використанні мікроорганізмів-деструкторів ксенобіотиків, є найбільш перспективним. У зв'язку з цим великого значення набула селекція мікроорганізмів -- деструкторів ксенобіотиків. Поряд з традиційною селекцією використовуються молекулярно-генетичні методи з метою отримання високоактивних штамів бактерій-деструкторів. При цьому великого значення надається дослідженню генетичного контролю процесів біодеградації ксенобіотиків бактеріями.

Отже, вивчення процесів бактеріальної деструкції АПАР, генетичного контролю біодеградації цих ксенобіотиків і закономірностей селекції бактерій -- деструкторів АПАР на сьогоднішній день набуває надзвичайно великого значення з огляду на використання таких знань в біотехнології захисту довкілля від забруднення аніонними поверхнево-активними речовинами.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дану роботу було підтримано грантом Міжнародної асоціації академій наук та НАН України для молодих вчених (постанова №175 від 27.05.98 Президії Національної Академії Наук України) та науковою програмою INTAS "Biosensor feedback control of wastewater purification: photooxidation followed by biological degradation using highly active strains of surfactant degradating bacteria (BIOFEED)" № 99-0995.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було дослідження закономірностей бактеріальної деструкції аніонних ПАР та розробка стратегії селекції мікроорганізмів-деструкторів стійких до біорозпаду речовин. Відповідно до поставленої мети було визначено певні задачі:

Дослідження бактеріальної деструкції алкілнафталінсульфонату.

Вивчення генетичного контролю процесів біодеградації аніонних ПАР, характеристика плазмід біодеградації.

Виявлення експресії десульфонуючого гена, який кодує ключову реакцію детоксикації аніонних ПАР.

Вивчення стабільності плазмід біодеградації транскон'югантних штамів -- деструкторів алкілнафталінсульфонату.

Вивчення субстратної специфічності селекціонованих штамів бактерій -- деструкторів алкілнафталінсульфонату.

Створення біотехнологічної схеми мікробної очистки води від алкілнафталінсульфонату.

Наукова новизна отриманих результатів. Теоретично обгрунтовано стратегію отримання і використання бактерій-деструкторів, стійких до біорозпаду ПАР, для біотехнології мікробної очистки промислових стічних вод.

Показано принципову можливість отримання мікрооорганізмів -- деструкторів АПАР шляхом перенесення генетичних елементів -- плазмід між штамами бактерій -- деструкторів ксенобіотиків в умовах проточного культивування, іммобілізації мікроорганізмів та селективного тиску АПАР .

Вперше за умов проточного культивування під селективним тиском ксенобіотика отримано високоактивний штам бактерій -- деструкторів алкілнафталінсульфонату (АНС) на основі штамів -- деструкторів алкілбензолсульфонату (Pseudomonas alcaligenes TR [pABS]) та нафталіну (Pseudomonas putida BS438 [NPL-41]) -- Pseudomonas alcaligenes TR [NPL_41, pABS].

Показано принципову можливість видоідентифікації транскон'югантів -- деструкторів АНС методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) в умовах очистки промислових стічних вод від ПАР.

Показано плазмідну локалізацію генів, які кодують синтез ферментів біодеградації аніонних ПАР. Виявлено експресію десульфонуючого гена у бактерій-деструкторів штаму Pseudomonas rathonis T.

Практичне значення отриманих результатів. Розроблено біотехноло-гічну схему мікробної очистки стічних вод від алкілнафталінсульфонату.

Отримано штам бактерій -- деструкторів алкілнафталінсульфонату P.alcaligenes TR (NPL_41,pABS) за умов проточного культивування і селективного тиску ксенобіотика на основі плазмідовмісних штамів -- деструкторів алкілбензолсульфонату Pseudomonas alcaligenes TR (pABS) та нафталіну Pseudomonas putida BS438 (NPL_41). Таким чином показано можливість використання плазмід біодеградації в біотехнології очистки води від АПАР.

Виявлено ген, що кодує синтез десульфонуючого ферменту у бактерій штаму Pseudomonas rathonis T, що є основою для розробки методів генетичного моніторингу десульфонування у мікроорганізмів у різноманітних об'єктах довкілля.

Особистий внесок дисертантки. Постановка проблеми, аналіз і обговорення отриманих даних було проведено разом з науковим керівником.Експериментальну частину роботи, підбір та обробку літератури зроблено автором. Вивчення плазмідного контролю біодеградації аніонних повернево-активних речовин та скринінг геномної бібліотеки P.rathonis T проведено спільно з співробітниками Інституту біохімії та фізіології мікроорганізмів РАН (м.Пущино). Друковані роботи було підготовлено за безпосередньою участю автора спільно з науковим керівником.

Апробація результатів диссертації. Матеріали дисертації доповідались та обговорювались на II Відкритій міській науковій конференції молодих вчених міста Пущино (Пущино, 1997); IV Інтернаціональному симпозіумі та виставці з проблем забруднення оточуючого середовища в Центральній та Східній Європі (Варшава, 1998); Конференції-конкурсі молодих вчених м.Києва (Київ, 2000).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 3 статті, 3 тез.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота складається із вступу; огляду літератури; експериментальної частини, яка включає матеріали і методи, результати досліджень та їх обговорення; висновків; списку літератури, який містить 155 посилань. Роботу викладено на 124 сторінках машинописного тексту, вона містить 13 таблиць та 10 рисунків.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

В роботі було використано аніонні поверхнево-активні речовини (АПАР) -- алкілнафталінсульфонат (АНС), алкілбензолсульфонат (АБС), алкілсульфонат (волгонат), додецилсульфат натрію (ДСН), алкілметилтаурид (метаупон), динатрій моноалкілсукцинатсульфонат (ДНС), а також нафталін. Хімічне споживання кисню (ХСК) визначали за допомогою біхромату калію за загальноприйнятою схемою. Концентрацію АПАР визначали екстракційно-фотометричним методом (Лур'є, 1984).

У роботі було використано 11 штамів бактерій -- деструкторів ПАР родів Pseudomonas і Achromobacter із колекції Інституту біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка, 2 штами E.coli та штам P.putida BS 438 із колекції культур лабораторії біології плазмід Інституту біохімії і фізіології мікроорганізмів РАН.

Культуру накопичення, здатну утилізувати АНС, було одержано із зразків грунту, які тривалий час контактували з АНС.

Для селекції штамів бактерій -- деструкторів АНС було використано три біореактори колонного типу із інертним керамічним носієм, в які подавали повітря за допомогою мікрокомпресорів та модельний розчин АНС такого складу (г/л): Na2HPO4 - 1; NH4NO3 - 1; KCl - 0,5; MgCl2 - 0,1; АНС - 0,1, 0,2 та 0,3.

Деструкцію АНС досліджували в умовах періодичного культивування в колбах Ерленмейєра об'ємом 0,5 л, які містили 0,2 л рідкого синтетичного середовища з концентрацією АНС 0,2 та 0,3 г/л.

Морфолого-культуральні та фізіолого-біохімічні ознаки бактерій визначали загальноприйнятими методами (Герхард, 1983), таксономічне положення -- за визначниками Бергі (8-ме видання), а також за оригінальними роботами (Кіпріанова та ін. 1973, 1979, Stolp 1981).

Іммобілізацію бактерій-деструкторів в біореактори колонного типу на поверхні інертних носіїв проводили шляхом трьохразової адгезії біомаси, вирощеної на агаризованому синтетичному середовищі із 200 мг/л АНС.

Скринінг бактерій -- деструкторів АПАР на наявність плазмідної ДНК проводили за методом Екхардта (Eckhard, 1978). Плазмідну ДНК виділяли методом Бірнбойма і Долі (Birnboin, Doli, 1979) та методом Бабикіна (Бабикін, 1984). Візуалізацію ДНК здійснювали методом електрофорезу в агарозному гелі. Для вивчення функціональної значимості плазмід проводили елімінацію плазмідної ДНК за допомогою мітоміцину С (Rheinwald, 1973).

Рестрикційний аналіз плазмід біодеградації було здійснено за допомогою рестриктази EcoRI.

Кон'югаційне перенесення плазмід біодеградації АПАР здійснювали на твердому поживному середовищі.

Геномну ДНК із штамів бактерій-деструкторів виділяли з використанням фенолу (Маніатіс, 1984). Гідроліз ДНК проводили рестриктазою Sau3A. Фрагменти гідролізованої ДНК виділяли методом електроелюції із агарозного гелю.

Геномну бібліотеку P.alcaligenes TR створювали з використанням вектора pUC19.

Для виявлення гена десульфонуючого ферменту в геномній космідній бібліотеці у векторі pLAFR5 штаму -- деструктора АПАР P.rathonis T було проведено скринінг за допомогою радіоактивно-міченого 32Р ДНК-зонду, гомологічного до гена atsA P.aeruginosa PAO (бібліотека та зонд були створені Маноловим Т.В.).

Експресію десульфонуючого гена досліджували за допомогою тест-системи, що базується на якісній реакції BaCl2 із SO42- та при вирощуванні трансформантів в умовах періодичного культивування із толуолсульфонатом як єдиним джерелом вуглецю та енергії.

Видоідентифікацію транскон'югантних штамів бактерій -- деструкторів АНС в біореакторі здійснювали методом ПЛР із неспецифічним праймером 5'_CGGCAGCGCC-3'.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Бактеріальна деструкція алкілнафталінсульфонату.

Для виділення штамів бактерій -- деструкторів АНС було використано метод селективного тиску в умовах проточного культивування. Із грунту, який тривалий час контактував з АНС було виділено культуру накопичення, стійку до АНС (200 мг/л).

Для цього пробу грунту, дреновану керамічними кільцями, поміщали в циліндр і тривалий час обробляли рідким мінеральним середовищем з концентрацією АНС 200 мг/л. Через чотири місяці концентрація АНС на виході з біореактора значно знизилася і на виході було виділено активну культуру накопичення. Однак, при вирощуванні мікроорганізмів такої культури накопичення в рідкому середовищі з концентрацією АНС 200 мг/л, деструктивна активність не проявлялася. Висів комплексної культури накопичення на L_агар із 300 мг/л АНС показав, що вона складається з мікроорганізмів, які стійкі до АНС. Встановлено, що якісний склад біоценозу, який представляє собою культуру накопичення, дуже бідний, що свідчить про високу інгібуючу дію АНС на грунтову мікрофлору і представлений грамнегативними, гетеротрофними бактеріями родів Pseudomonas, Xanthomonas, Citrobacter.

Дану культуру накопичення було іммобілізовано шляхом адгезії біомаси на інертний керамічний носій в біореактор колонного типу з примусовою аерацією. В біореактор подавали модельний розчин із концентрацією АНС 100 мг/л. Через 3 місяці роботи очисної установки отримано біоценоз, який очищає модельний стік від АНС на 80%. При підвищенні концентрації АНС до 200 мг/л ступінь очистки не змінювався (80%), а при подальшому підвищенні концентрації АНС до 300 мг/л спостерігалось різке зменшення деструктивної активності (табл. 1).

Таблиця 1.

Бактеріальна деградація алкілнафталінсульфонату (АНС) при ступінчастій селекції бактерій-деструкторів.

Концентрація АНС, мг/л	Ефективність очистки,%	ХСК, мг О2 /л	Проточність, мл/добу
вхід	вихід		вхід	вихід
100	20	80	180	135	2000
200	40	80	220	151	2500
300	176	42	-	-	2500

ПРИМІТКИ: “-“ - тест не виконували

Мікробіологічний аналіз мікрофлори біореактора на всіх етапах проточного культивування показав, що вона складається із бактерій чотирьох видів: Pseudomonas putida, Xanthomonas sp., Citrobacter intermedius, Comamonas testosteroni. При вирощуванні чистих культур, що виділені із біореактора, в умовах проточного культивування в рідкому синтетичному середовищі із концентрацією АНС 200 мг/л та 300 мг/л жодна із виділених монокультур не була здатна руйнувати АНС.

В результаті вивчення субстратної специфічності чистих культур, виділених з мікробоценозу біореактора, було показано, що всі культури є деструкторами додецилсульфату натрію, метаупону та волгонату. Алкілбензолсульфонат даними культурами не руйнувався.

Таким чином, можна констатувати, що в умовах проточного культивування та іммобілізації, під селективним тиском АНС не вдалося селекціонувати високоактивний штам бактерій -- деструкторів даного ПАР із комплексної культури накопичення, яка складалася із стійких до дії АНС мікроорганізмів. Тому подальшу роботу було спрямовано на розробку нетрадиційних підходів щодо селекції бактерій -- деструкторів персистентного АПАР -- алкілнафталінсульфонату.

Для селекції бактерій -- деструкторів персистентного ксенобіотика АНС було використано метод молекулярного бридингу. Суть методу полягає в отриманні мікроорганізмів із розширеним спектром катаболічних властивостей шляхом обміну генетичного матеріалу бактерій, в тому числі плазмід біодеградації в умовах , що підтримують можливість такого обміну, а саме під селективним тиском ксенобіотика (Chakrabarty et al, 1973). Методом молекулярного бридингу було проведено селекцію бактерій -- деструкторів аніонної ПАР алкілнафталінсульфонату (АНС) в умовах проточного культивування на основі двох плазмідовмісних штамів бактерій -- деструкторів ксенобіотиків, іммобілізованих на інертному керамічному носії. При цьому штам P.alcaligenes TR (pABS) був деструктором алкілбензолсульфонату із групи нефлюоресцюючих псевдомонад, а штам P.putida BS438 (NPL-41) -- деструктором нафталіну флюоресцюючої групи. Припускали, що транскон'югант буде здатний здійснювати як десульфонування АНС, так і розклад нафталіну. Експеримент по селекції штаму бактерій -- деструкторів АНС проходив в умовах проточного культивування в біореакторі колонного типу, за примусової аерації і в режимі підвищення концентрації субстрату від 100 до 300 мг/л.

Штами P.alcaligenes TR (pABS) і P.putida BS438 (NPL_41) були іммобілізовані в біореактор колонного типу на інертний керамічний носій.

При подачі в біореактор модельного розчину із концентрацією АНС, що зростала від 100 до 300 мг/л, було показано 81% ефективність очистки при концентрації АНС 100 мг/л та майже 70% ефективність при концентрації 200 та 300 мг/л (табл. 2).

Після стабілізації показників очистки води від АНС в різних концентраціях (табл. 2) було проведено мікробіологічний аналіз мікрофлори біореактора.

Таблиця 2.

Бактеріальна деструкція алкілнафталінсульфонату в першому біореакторі.

Концентрація АНС, мг/л	Ефективність очистки,%	ХСК, мг О2 /л	Проточність, мл/добу
вхід	вихід		вхід	вихід
100	19	81	180	130	200
200	64	68	220	103	250
300	80	70	295	-	250

ПРИМІТКА: “-“ - тест не виконували.

Було показано, що в мікробоценозі домінували нефлюоресцюючі нафталінутилізуючі псевдомонади.

Скринінг нефлюоресцюючих нафталінутилізуючих клонів на наявність плазмідної ДНК за методом Екхардта показав присутність плазмід, аналогічних по електрофоретичній рухомості плазміді NPL-41 і плазміді біодеградації pABS (рис 1).

Оскільки процес селекції здійснювався в нестерильних умовах, які допускали зараження біофільтра, для підтвердження гомології штамів, виділених із біореактора із культурами, що брали участь в бридинзі, був використаний метод ПЛР із використанням неспецифічного праймера 5'_CGGCAGCGCC_3'.

Показано, що ПЛР-продукти нефлюоресцюючих нафталінутилізуючих псевдомонад мають більше гомології із ПЛР-продуктами штаму P.alcaligenes TR (pABS), ніж із ПЛР-продуктами штаму P.putida BS438 (NPL-41) (рис.2).

Таким чином, отримані в експерименті по молекулярному бридингу транскон'юганти бактерій -- деструкторів АНС споріднені з нефлюоресцюючим штамом P.alcaligenes TR в рамках біологічного виду. Отже, в проточному біореакторі під селективним тиском АНС здійснився кон'югаційний перенос плазмід, завдяки чому сформувався високоактивний транскон'югантний штам бактерій -- деструкторов АНС --P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS).

2.Генетичний контроль процесів біодеградації поверхнево-активних речовин.

Для дослідження генетичного контролю процесів біодеградації ПАР було проведено скринінг плазмідної ДНК у штамах бактерій -- деструкторів ПАР. Для виявлення плазмід у бактерій--деструкторів були використані методи виділення плазмід за Бабикіним, Бірнбоймом і Долі та метод візуалізації плазмідної ДНК за Екхардтом. Показано наявність плазмід у бактерій -- деструкторів АПАР: P.alcaligenes TR, P.rathonis T, Pseudomonas sp.2T/1, Achromobacter eurydice TK, P.aeruginosa 1C, P.putida K та штамів -- деструкторів катіонних і амфолітних ПАР: P.mеndocina TO, P.fluorescens TR, P.putida TO, P.stutzeri AT. Порівнюючи розміри виявлених плазмід та маркерних NPL-1 (100 т.п.н.), pBS2 (130 т.п.н.) та RP4 (55 т.п.н.) було встановлено, що розмір плазмідної ДНК бактерій штаму P.alcaligenes TR --130 т.п.н., а P.rathonis T, P.aeruginosa 1C, P.putida K, Achromobacter eurydice TK -- близько 100 т.п.н., плазмідна ДНК бактерій штамів P.mеndocina TO, P.fluorescens TR, P.putida TO, P.stutzeri AT -- близько 60 т.п.н. (рис 3,4).

Оскільки в межах класів досліджуваних штамів -- деструкторів ПАР плазміди дуже схожі за розмірами і функціонально, було проведено порівняння продуктів рестрикційного аналізу цих плазмід.

Для цього виділені плазміди гідролізували ферментом EcoRI. З'ясовано, що плазміди штамів P.alcaligenes TR, P.rathonis T, P.putida K, Achromobacter eurydice TK, P.mendocina TO, P.fluorescens TR мають різні продукти рестрикційного аналізу, що може свідчити про їх різну генетичну природу.

З метою визначення функціонального значення візуалізованих у бактерій -- деструкторів АПАР плазмід, було здійснено елімінацію плазмід із клітин. Як свідчать літературні дані (Rheinwald, 1973), плазміди біодеградації найефективніше елімінуються мітоміцином С. При цьому клони, які втратили здатність до утилізації ПАР, було отримано для штамів P.alcaligenes TR, P.rathonis T, Pseudomonas sp.2T/1, P.fluorescens TR. Частота виникнення таких варіантів складала 0,8-1,8%. Реверсії до ознаки утилізації ПАР у елімінантів не спостерігалися. У клонів, які втратили здатність до катаболізму ПАР, плазмідна ДНК відсутня. Отримані результати свідчать про плазмідну локалізацію детермінантів деградації ПАР.

Таким чином, показано, що деструкція ПАР контролюється генами, розміщеними на плазмідах.

3. Виявлення гена десульфонуючого ферменту у бактерій -- деструкторів аніонних поверхнево-активних речовин.

Виявлення гена десульфонуючого ферменту у штамів бактерій --деструкторів аніонних ПАР є важливим, оскільки дає можливість отримувати біотехнологічно перспективні бактеріальні штами із розширеним спектром катаболічних активностей і створювати системи моніторингу десульфонування у мікроорганізмів, які знаходяться в різних екологічних нішах.

При клонуванні гена десульфонуючого ферменту із бактерій-деструкторів штаму P.alcaligenes TR нам не вдалося виявити експресію гена десульфонуючого ферменту. Тому було проведено скринінг геномної бібліотеки штаму P.rathonis T шляхом гібридизації in situ ДНК бактеріальних клонів із радіоактивно міченим 32Р-зондом гомологічним до гена atsA. Радіоавтографічний аналіз гібридизаційних фільтрів показав, що в бібліотеці генів існує сім клонів, ДНК яких гібридизується з даним зондом. Ці клони було перевірено на предмет розщеплення сульфоароматичних сполук. Було встановлено, що із семи клонів три росли в рідкому синтетичному середовищі із толуолсульфонатом (200 мл/л) як єдиного джерела вуглецю. Це свідчить про експресію десульфонуючого гена.

Таким чином, показано експресію десульфонуючого гена у клонів геномної біблотеки бактерій штаму P.rathonis T в умовах періодичного культивування.

4. Стабільність плазмід біодеградації.

З метою дослідження стабільності плазмід біодеградації, в лабораторних умовах було створено транскон'югантний штам P.alcaligenes TR (NPL_41, pABS) шляхом кон'югаційного схрещування бактерій штамів P.alcaligenes TR (pABS) та P.putida BS438 (NPL-41). Такий транскон'югант був іммобілізований на інертний керамічний носій в другому біореакторі колонного типу.

Дослідження стабільності отриманого транскон'юганта проходило за умов проточного культивування, примусової аерації і в режимі підвищення концентрації АНС від 100 до 300 мг/л. Було показано, що АНС розкладається штамом P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS) достатньо ефективно (табл 3).

Таблиця 3.

Бактеріальна деструкція алкілнафталінсульфонату в другому біореакторі.

Концентрація АНС, мг/л	Ефективність очистки, %	ХСК, мг О 2/мл	Проточність, мл/добу
вхід	вихід		вхід	вихід
100	20	81	180	135	200
200	64	68	220	105	250
300	67	78	295	-	250

ПРИМІТКА: “-“ - тест не виконували.

При мікробіологічному аналізі мікробоценозу біореактора було встановлено, що він складається із представників нефлюоресцюючої групи псевдомонад, ідентифікованих як P.alcaligenes TR. Скринінг нафталінутилізуючих клонів P.alcaligenes TR на наявність плазмідної ДНК показав, що їх плазмідний профіль складається із плазмід, які за розмірами відповідають плазміді NPL-41 і плазміді біодеградації pABS.

Таким чином, на основі отриманих даних можна зробити висновок, що стабільність генетично_модифікованого штаму P.alcaligenes TR (NPL_41, pABS) при очистці модельного розчину від АНС достатньо висока. Результати експерименту по вивченню плазмід в клітинах транскон'югантів отриманих різними способами (методом молекулярного бридингу в умовах проточного культивування і в результаті попереднього схрещування) показали, що транскон'югант, отриманий в умовах проточного культивування, більш стабільний, ніж транскон'югант, отриманий в результаті попереднього схрещування.

Відомо, що ефективність мікробної очистки залежить від домінування бактерій-деструкторів, які використовують ПАР в ролі єдиного джерела вуглецю та енергії. Тому необхідна розробка експрес-методів ідентифікації мікроорганізмів в очисних спорудах. Традиційні методи видоідентифікації не задовольняють цим умовам. Найбільш перспективним методом видоідентифікації бактерій в очисних спорудах є метод ПЛР. Його застосування дасть змогу контролювати мікрофлору біореактора.

Результати наших експериментів дали змогу розробити експрес-метод для видоідентифікації бактерій в очисних спорудах, який включено в біотехнологічну схему для очистки стічних вод від АПАР (рис. 5).

В запропонованій схемі введено етап моніторингу за допомогою ПЛР. Його застосування дасть змогу на основі домінування бактерій-деструкторів і застосування методу ПЛР контролювати бактерії--деструктори в біоплівці біореактора, а отже, і ефективність очистки.

ВИСНОВКИ

Теоретично обґрунтовано стратегію отримання бактерій -- деструкторів стійких до біорозпаду аніонних поверхнево-активних речовин.

Вперше методом молекулярного бридингу в умовах проточного культивування, іммобілізації та селективного тиску ПАР отримано транскон'югантний штам бактерій -- деструкторів алкілнафталінсульфонату -- P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS).

Показано деструктивну активність транскон'юганта P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS) в умовах проточного культивування. Показано високу стабільність плазміди NPL-41 у транскон'югантному штамі в умовах проточного культивування під селективним тиском алкілнафталінсульфонату.

Шляхом селекції в умовах проточного культивування під селективним тиском аклілнафталінсульфонату отримано мікробоценоз із бактерій чотирьох видів, який руйнує 200 мг/л аклілнафталінсульфонату. Монокультури мікробоценозу є деструкторами додецилсульфату натрію, волгонату, метаупону.

Виявлено плазміди біодеградації розміром від 60 до 130 т.п.н. у бактерій -- деструкторів поверхнево-активних речовин. Доведено плазмідний контроль біодеградації аніонних поверхнево-активних речовин у досліджених штамів.

Показано експресію десульфонуючого гена у клонах бібліотеки штаму P.rathonis T.

Показано принципову можливість використання експрес-генетичної технології на основі полімеразної ланцюгової реакції для видоідентифікації бактерій-деструкторів при мікробній очистці промислових стічних вод від аніонних поверхнево-активних речовин.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. А.М. Дубейковский, Л.А. Таранова, Л.Ф. Овчаров, С.Н. Заец, В.Г. Грищенков, Е.А. Мордухова, А.М. Боронин Генетический контроль бактериальной деструкции поверхностно-активных веществ // Микробиология.-1997.-Т.66, №3.-С.378-382.

2. С.Н. Заец, Л.А.Таранова Бактериальная деструкция алкилнафталинсульфоната // Химия и технология воды.-1998, №5.- С.550-555.

3. L.A. Taranova, S.N.Dybkova, V.G.Grishchenkov, E.A.Mordukhova, A.M.Boronin Surfactant degradative plasmids // Биополимеры и клетка 2000.-Т.16, №5. - С.420-424.

4. S.N. Zayets, L.A. Taranova Selection of bacteria-destructors of anionic surfactants by method of molecular breeding. // Symposium Program of Fourth International Symposium and Exibition of Environmental Contamination in Central and Easten Europe (Sept 15-17, 1998, Warsaw, Poland), P.155.

5. С.Н. Заец, Л.А. Таранова, Е.А.Мордухова, В.Г. Грищенков, А.М. Боронин Получение штамма-деструктора алкилнафталинсульфоната в условиях проточного культивирования // Тезисы докладов открытой городской научной конференции молодых ученых г.Пущино 1997, С.168-169.

6. С.М.Дибкова Отримання бактерій-деструкторів алкілнафталінсульфонату методом молекулярного бридингу // Тези конференції - конкурсу молодих вчених м.Києва (травень, 2000).

АНОТАЦІЯ

Дибкова С.М. Біотехнологічні аспекти бактеріальної деструкції аніонних поверхнево-активних речовин. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.20 -- біотехнологія. - Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, Київ, 2001.

В дисертаційній роботі представлено результати по вивченню закономірностей бактеріальної деструкції аніонних поверхнево-активних речовин (АПАР), дослідженню генетичного контролю процесів біодеградації АПАР та дослідженню способів селекції бактерій -- деструкторів стійкої до біорозпаду АПАР -- алкілнафталінсульфонату (АНС).

Досліджено плазмідний контроль процесів біодеградації АПАР та показано експресію гена десульфонуючого ферменту у бактерій-деструкторів P.rathonis T. Використовуючи метод селективного тиску в умовах проточного культивування, селекціоновано штами бактерій -- деструкторів АНС. Методом молекулярного бридингу селекціоновано високоактивний штам бактерій -- деструкторів АНС P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS) на основі плазмідовмісних штамів бактерій-деструкторів в умовах проточного культивування під селективним тиском АНС. Показано принципову можливість використання методу полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) для видоідентифікації бактерій в очисних спорудах.

Створено технологічну схему очистки промислових стічних вод від АПАР, яка включає етап моніторингу деструкторів за допомогою ПЛР.

Ключові слова: алкілнафталінсульфонат, плазміди біодеградації, ген десульфонуючого ферменту, полімеразна ланцюгова реакція, метод молекулярного бридингу.

АННОТАЦИЯ

Дыбкова С.Н. Биотехнологические аспекты бактериальной деструкции анионных поверхностно-активных веществ. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.20 - биотехнология. Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины, Киев, 2001.

В диссертационной работе представлены результаты по изучению закономерностей бактериальной деструкции анионных поверхностно-активных веществ (АПАВ), исследованию генетического контроля процессов биодеградации АПАВ и исследованию способов селекции бактерий -- деструкторов чрезвычайно устойчивого к биоразложению АПАВ алкилнафталинсульфоната (АНС).

Исследования по генетическому контролю биодеградации АПАВ показали, что эти процессы контролируются плазмидами размером 60-130 т.п.н.

Под селективным давлением АНС в условиях проточного культивирования из накопительной культуры устойчивой к АНС получен микробоценоз разлагающий 200 мг/л АНС. При выращивании монокультур микробоценоза в условиях периодического культивирования с АНС в качестве единственного источника углерода и энергии, деструктивной активности к высоким концентрациям АНС не наблюдалось.

Методом молекулярного бридинга на основе плазмидосодержащих штаммов бактерий -- деструкторов алкилбензолсульфоната P.alcaligenes TR (pABS) и нафталина P.putida BS438 (NPL-41) в условиях проточного культивирования под селективным давлением АНС селекционирован высокоактивный штамм бактерий -- деструкторов АНС P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS). Показана высокая стабильность плазмиды NPL-41 в полученном трансконъюганте. Оказалось, что плазмида NPL-41 более стабильна в трансконъюганте, полученном методом молекулярного бридинга, а не в трансконъюганте, полученном методом конъюгационных скрещиваний. Штамм P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS) имеет более широкий спектр субстратной специфичности, чем бактерии микробоценоза, разлагающего АНС.

Используя метод полимеразной цепной реакции с неспецифическим праймером, удалось идентифицировать полученный методом молекулярного бридинга трансконъюгантный штамм как P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS).

Создана технологическая схема очистки промышленных сточных вод от АПАВ, которая позволяет регулировать эффективность очистки путем мониторинга деструкторов посредством ПЦР.

Ключевые слова: алкилнафталинсульфонат, плазмиды биодеградации, ген десульфонирующего фермента, полимеразная цепная реакция, метод молекулярного бридинга.

SUMMARY

Dybkova S.M. Biotechnological aspects of bacterial degradation of anionic surfactants.-Manuscript.

Thesis for scientific degree of candidate of biological sciences by speciality 03.00.20-biotechnology.- D.K.Zabolotnogo Institute of Microbiology and Virology of National Academy of Science of Ukraine, Kyiv, 2001.

The thesis contains the results on investigation of appropriates of bacterial destruction of anionic surfactants and genetic control of anionic surfactant biodegradation and investigation of methods for selection of bacteria--degraders of alkylnaphtalenesulfonate (ANS)--persistent anionic surfactant.

The plasmids control of anionic surfactants biodegradation and detection of expression of desulfonation enzyme gene was investigated by method of selective press in condition of flow cultivation the strains of bacteria destructors of ANS was selected. By method of molecular breeding on the bases of plasmid bearing microorganisms-destructors in conditions of flow cultivation under selective press of ANS the highly active strains of bacteria-destructors P.alcaligenes TR (NPL-41, pABS) was selected.

The possibility of using the method of polimerase chain reaction (PCR) with nonspecific primer for identification of bacteria in bioreactors was shown.

The technological scheme for waste water purification from anionic surfactants, which consist the stage of monitoring of bacteria by PCR with nonspecific primer was created.

Key words: alkylnaphthalenesulfonate, biodegradative plasmids, desulfonation enzyme gene, polymerase chain reaction, method of molecular breeding.

Размещено на Allbest.ru

...