Сумісна дія іонізуючої радіації та важких металів на фібробласти мишей в культурі

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 614.876:546.3:57.085.23

СУМІСНА ДІЯ ІОНІЗУЮЧОЇ РАДІАЦІЇ ТА ВАЖКИХ МЕТАЛІВ

НА ФІБРОБЛАСТИ МИШЕЙ В КУЛЬТУРІ

03.00.01 - радіобіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ДУДЧЕНКО ТАРАС МИКОЛАЙОВИЧ

КИЇВ - 2001



Дисертацією є рукопис

Робота виконана у відділі радіобіології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Серкіз Ярослав Іванович Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу радіобіології

Офіційни опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Хижняк Світлана Володимирівна Київський національний університет імені Тараса Шевченка, провідний науковий співробітник лабораторії фізико-хімічної біології біологічного факультету;

доктор біологічних наук Дружина Микола Олександрович Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, провідний науковий співробітник відділу біофізики канцерогенезу

Провідна установа: Науковий центр радіаційної медицини АМН України, Інститут експериментальної радіології, м. Київ

Захист відбудеться " 19 " листопада 2001 року на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.24 у Київському національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, проспект Глушкова 2, корпус 12, біологічний факультет, ауд. 215.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58

Автореферат розісланий "16" жовтня 2001 року

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Брайон О.В.



АННОТАЦИЯ

Дудченко Т.Н. Сочетанное действие ионизирующей радиации и тяжелых металлов на фибробласты мышей в культуре. - Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.01 - радиобиология. - Киевский национальний университет имени Тараса Шевченко. - Киев. - 2001 г.

Диссертация посвящена исследованиям особенностей раздельного и сочетанного действия радионуклидов 137Cs и рентгеновского излучения, а также ионов тяжелых металов (Ni2+, Cu2+, Ba2+, Cr6+, Pb2+) в разных дозах и концентрациях на жизнеспособность клеток линии L929 в культуре. Разработана дозиметрическая модель облучения клеток в моношаре, которая при исследовании влияния радионуклидов 137Cs позволяет коректно определить величину поглощенной дозы радиации.

Показано, что рентгеновское излучение 0,1 Гр не приводит к видимым изменениям показателей жизнедеятельности клеток, 0,5-1,0 Гр - обуславливает дозозависимое угнетение пролиферативной активности клеток, а также повышение уровня поликариоцитов, что указывает на характерные радиогенные нарушения.

Сравнительний анализ влияния разных видов излучений на клетки при разных дозовых нагрузках показал увеличение биологической эффективности радиационных факторов в последовательности: g-кванты 137Cs (внешнее облучение) < рентгеновские лучи < радионуклиды 137Cs (внешнее и внутреннее облучение).

Показано, что кинетика роста клеток в моношаровых культурах в зависимости от концентрации ионов тяжелых металлов имеет вид спадающей экспоненты. Определены среднеэффективные дозы металлов, которые за интенсивностью нарушений показателей жизнеспособности клеток увеличиваются по ряду (в мкг/мл): Cr6+(2,3), Pb2+(2,5), Cu2+(3,8), Ni2+(12,6) и Ba2+(349,0).

Установлено, что рентгеновские лучи и радионуклиды 137Cs (в равнозначных дозах 1,0 Гр) с тяжелыми металлами (Cr, Pb, Cu, Ni и Ba) в ЕС50 вызывают антагонистические эффекты за показателями гибели клеток на 1-5 сутки их культивирования, при этом коэффициенты суммации существенно выше при использовании 137Cs, чем R-квантов. Последнее свидетельствует о большей биологической эффективности радионуклидов в сравнении с рентгеновским излучением, очевидно, за счет b-компоненты при контакте 137Cs с клетками, что важно в объяснении величины эффектов, детерминированных внешним и внутренним облучением.

Суммация эффектов сочетанного действия R-квантов или радионуклидов 137Cs и тяжелых металлов за показателем образования поликариоцитов, как маркера репродуктивной гибели клеток, при разных дозах и концентрациях факторов и терминов культивирования может проявлять как антагонистическую так и аддитивную или синергическую зависимость.

Ключевые слова: ионизирующая радиация, радионуклиды 137Cs, R-лучи, тяжелые металлы, культура клеток, сочетанное действие.



АНОТАЦІЯ

Дудченко Т.М. Сумісна дія іонізуючої радіації та важких металів на фібробласти мишей в культурі. - Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.01 - радіобіологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка. - Київ. - 2001 р.

Дисертація присвячена дослідженням особливостей окремої та сумісної дії радіонуклідів 137Cs і рентгенівського випромінювання, а також іонів важких металів (Ni2+, Cu2+, Ba2+, Cr6+, Pb2+) у різних дозах і концентраціях на життєздатність клітин лінії L929 в культурі. Розроблена дозиметрична модель опромінення клітин в моношарі, що при дослідженні впливу радіонуклідів 137Cs дозволяє коректно визначити величину поглинутої дози радіації.

Показано, що доза рентгенівського випромінювання 0,1 Гр не призводить до видимих змін показників життєздатності клітин, 0,5-1,0 Гр - обумовлює дозозалежне пригнічення проліферативної активності клітин, а також підвищення рівня полікаріоцитів, що вказує на характерні радіогенні порушення. радіонуклід метал рентгенівський іон

Установлено, що виживання клітин від концентрації металів має вид спадаючої експоненти. Визначено середньоефективні концентрації досліджуваних металів для мишачих фібробластів та побудовано ряд їх цитотоксичності.

Установлено, що рентгенівські промені та радіонукліди 137Cs (у рівновеликих дозах 1,0 Гр) із важкими металами (Cr, Pb, Cu, Ni та Ba) у ЕС50 викликають антагоністичні ефекти за показниками загибелі клітин на 1-5 доби їх культивування, причому коефіцієнти сумації є істотно вищими при використанні 137Cs, ніж R-квантів. Останнє свідчить про більшу біологічну ефективність радіонуклідів у порівнянні із рентгенівським випромінюванням, очевидно, за рахунок b-компоненти при контакті 137Cs із клітинами, що є важливим при тлумаченні величини ефектів, детермінованих зовнішнім та внутрішнім опроміненням.

Сумація ефектів сумісної дії R-квантів чи радіонуклідів 137Cs та важких металів за показником утворення полікаріоцитів, як маркера репродуктивної загибелі клітин, при різних дозах та концентраціях чинників і термінів культивування може проявляти як антагоністичну так і адитивну чи синергічну залежність.

Ключові слова: іонізуюча радіація, радіонукліди 137Cs, R-промені, важкі метали, культура клітин, сумісна дія.



SUMMARY

Dudchenko T.N. Combined influence of ionizing radiation and heavy metals on the mouse fibroblasts in the culture. - Manuscript

Thesis for Ph.D. (Biolodgy) on a speciality 03.00.01 - radiobiolodgy. - National Taras Shevchenko university of Kyiv. - Kyiv. - 2001.

The thesis is about peculiarities of separate and combined influence of heavy metal ions (Ni2+, Cu2+, Ba2+, Cr6+, Pb2+ in different concentrations) and radionuclides of 137Cs (with dose value of 1,0 Gy) as well as X-rays (with dose value of 0,1; 0,5 and 1,0 Gy) on the L929 cell vitality.

The dosimetric model of exposure of the cells in monolayer has been developed. This model are used for investigation of radionuclide action and allows to detect the absorbed dose value.

Exposure of the cells to X-rays with dose of 1,0 Gy was not shown to cause the essential changes in the cell vitality indices. Irradiation with doses of 0,5-1,0 Gy causes a dose-dependent decrease of proliferative and mitotic cell activity and an increase of the number of polycariocytes, that can indicate the radiogenic disturbances. It has been detected that dependence of cell survival on metal concentracion is reverse. The middle-effective concentracions of the definite metals have been detected and cytotoxity level has been estimated for mouse fibroblasts.

X-rays and radionuclides of 137Cs (with dose of 1,0 Gy) in combination with heavy metals (Cr, Pb, Cu, Ni and Ba) at the EC50 cause antagonistic effects for cell vitality indices. More over, the integral coefficient is higher for 137Cs than for X-rays. The high biolodgical efficacy of the radionuclides in comparison to X-rays is likely to formed by b-radiation after direct interaction with radionuclides.

Using indices of polycariocyte formation as a marker of reproductive cell death it has been detected that the integral effect of either X-rays or radionuclides of 137Cs with heavy metals (with different doses and concentration) can have antagonistic, aditive or sinergic character.

Key words: ionizing radiation, radionuclides of 137Cs, X-rays, heavy metals, cell culture, combined influence.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Забруднення навколишнього середовища фізичними та хімічними чинниками порушує рівновагу екологічних систем, що ставить людину за межі звичних умов життєздатності. В зв'язку з цим, виникає необхідність оцінки та періодичної переоцінки результатів впливу цих факторів на живі організми.

Серед напрямків сучасної радіобіології проблема біологічної дії малих доз радіації є однією із пріоритетних [Спитковский, 1992; Serkiz at all., 1994, 2001; Бурлакова и др., 1996, 2001]. Забрудненність значних територій радіонуклідами в результаті ядерних інцидентів призводить не тільки до збільшення фону зовнішнього g-випромінювання, але і накопичення їх у тканинах організму. Це зумовлює складну картину радіаційного навантаження на організм [Москалев, 1991; Норми радіаційної безпеки України, 1997; Основні санітарні правила протирадіаційного захисту, 2001].

Дослідження біологічних ефектів різних видів іонізуючого випромінювання в широкому діапазоні доз у сукупності з дією інших чинників довкілля, визначення типових змін та особливостей структурних і функціональних порушень в біологічних системах набуває актуальності у зв'язку із негативним їх впливом на біоту [Ершов и др., 1992; Василенко, 1993; Трахтенберг и др., 1994; Позолотина, 1996; Медведь и др., 1997; Вишневский и др., 2001]. Численні літературні дані вказують на причиннонаслідкові патогенетичні зміни в організмі людини та тварин, що ініційовані сумісною дією різних фізичних та хімічних факторів [Руднев и др., 1992; Белов и др., 1993; Иваницкий, 1995; Барабой та ін., 1999; Шестопалов та ін., 2001; Чаяло та ін., 2001; Бебешко и др., 2001]. Однак на сьогоднішній день характер сумації біологічних ефектів від сумісної дії декількох чинників вивчений недостатньо. Існуючі дані експериментальних досліджень є фрагментарними, часто суперечливими, в яких не встановлені динаміка та дозові залежності ефектів, не запропоновані прийнятні науково обгрунтовані механізми їх формування.

Після аварії на Чорнобильській АЕС особливо гострою постала проблема забруднення навколишнього середовища чинниками різної природи. Це викликано тим, що до хімічних забруднювачів техногенного походження внаслідок аварії додався радіаційний. Крім того, в гострий аварійний період в жерло реактора було скинуто значну кількість свинцю, що призвело до сумісного радіаційно-хімічного забруднення значних територій [Всебічна оцінка ризиків внаслідок аварії на ЧАЕС, 1998]. Тому особливий інтерес являє собою вивчення ступеня токсичності різних металів у сукупності з радіаційно-ушкоджуючим агентом.

Важливими є дослідження закономірностей впливу випромінювання в умовах сумісної дії його з важкими металами на клітинному рівні. Саме тут формується основа порушень, які пізніше проявляються у вигляді різноманітних патологічних порушень на рівні організму.

У відомій нам літературі є окремі повідомлення про результати експериментальних досліджень сумісної дії важких металів та іонізуючого випромінювання [Иваницкий, 1995; Привезенцев и др., 1996; Витвицкий и др., 1997; Черников и др., 1998; Шевцова, 2001], в той час як дослідженню впливу кожного з цих факторів окремо присвячена значна кількість робіт. Тому, доцільним є подальше поглиблене вивчення ефектів сумісної дії радіації та важких металів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відділі радіобіології Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАН України як складова частина наукових тем "Дослідити можливість формування адаптивних змін до дії малих доз іонізуючого випромінювання на різних рівнях організації живих систем", що виконувалась у 1997-1999 рр. за постановою Бюро відділення МББЕКФ НАН України, протокол №12 від 21.11.96, № державної реєстрації 0197U006235, шифр 2.28.10.3 та “Дослідити радіобіологічні особливості “доза-час-ефект” на клітинному, системному та організмовому рівнях за умов пролонгованого опромінення в малих дозах радіонуклідами цезію та стронцію”, що виконується з 2000 р. за Постановою Бюро відділення МББЕКФ НАН України, протокол №13 від 25.11.99, № державної реєстрації 0100U000626, шифр 2.2.5.222.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було дослідити особливості біологічної ефективності сумісної дії різних видів іонізуючої радіації та важких металів за показниками життєздатності клітин в культурі.

В задачі дослідження входило:

1) вибрати об'єкт дослідження, обгрунтувати доцільність та коректність використання обраної моделі, як адекватної для вивчення радіогенних змін у ізольованих клітин при додатковій дії іонів важких металів (ВМ);

2) розробити модель розрахунку поглинутих доз радіації в моношарі клітин при опроміненні їх радіонуклідами 137Cs (РН) та рентгенівським випромінюванням (РВ);

3) дослідити вплив РВ в широкому діапазоні величин доз за показниками кінетики росту, мітотичної активності та утворення полікаріоцитів у культурі клітин лінії L929;

4) дослідити вплив РН 137Cs за показниками кінетики росту, мітотичної активності та утворення полікаріоцитів у культурі клітин лінії L929;

5) дослідити концентраційні залежності та установити середньоефективні дози (ЕС50) для ряду ВМ: Pb, Cu, Ba, Ni та Cr за показниками життєздатності клітин;

6) вивчити особливості формування клітинних ефектів за сумісної дії іонізуючої радіації та ВМ.

Об'єкт дослідження - ефекти сумісної дії іонізуючого випромінювання та іонів ВМ у клітинах in vitro.

Предмет дослідження - життєздатність клітин в культурі.

Методи дослідження - культивування ізольованих клітин; визначення їх життєздатності (кінетика росту, мітотична активність, утворення полікаріоцитів); моделювання і розрахунку поглинутих доз радіації від зовнішніх та внутрішніх випромінювачів; радіометричні; оптичної мікроскопії для характеристики стану популяції та окремих клітин після дії факторів, що вивчаються; математичної статистики.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше отримано результати експериментальних досліджень сумісного впливу іонізуючого випромінювання (РН 137Cs, РВ) та ряду найпоширеніших ВМ у широкому діапазоні доз і концентрацій на клітини in vitro. Визначено внесок кожного із факторів у біологічний ефект та особливості його формування за сумісної дії чинників.

Встановлено, що РВ та РН 137Cs (у рівновеликих дозах 1,0 Гр) із ВМ (Cr, Pb, Cu, Ni та Ba) у ЕС50 викликають антагоністичні ефекти за показниками загибелі клітин в культурі, причому коефіцієнти сумації є істотно вищими при використанні 137Cs, ніж R-квантів, що свідчить про більшу біологічну ефективність РН у порівнянні із РВ.

Сумація ефектів сумісної дії РВ чи РН 137Cs та ВМ за показником утворення полікаріоцитів, як маркера репродуктивної загибелі клітин, при різних дозах та концентраціях чинників і термінів культивування може проявляти як антагоністичну так і адитивну чи синергічну залежність.

Вперше показано, що характер сумації ефектів за сумісної дії радіації та ВМ залежить від природи агента, величини дози (концентрації) та часу, що минув після експозиції.

Практичне значення одержаних результатів. Результати виконаних досліджень мають значення для оцінки особливості біологічної ефективності малих доз іонізуючого випромінювання, а саме РН 137Cs чи РВ сумісно із іонами ВМ. Встановлені закономірності спільної дії радіації та ВМ можуть бути використані для прогнозування реакції швидкопроліферуючих клітинних популяцій на сумісну дію радіації та ВМ.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено підбір та проаналізовано наукову літературу за темою роботи, самостійно виконано експерименти, проведено аналіз первинного матеріалу, сформульовані наукові положення і висновки роботи. Дисертант оволодів необхідними аналітичними та статистичними методами досліджень, брав участь у плануванні експериментальних робіт і підготовці матеріалів до друку.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації викладені та обговорені на II та III наукових конференціях молодих вчених "Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології", що проводились в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (Київ - 1999, 2000 рр.), науково-практичній конференції ІЯД НАН України (Київ - 1999 р.), International conference “Modern problems of radiobiolodgy, radioekolodgy and evolution” dedicated to centenary of N.W. Timofeeff-Ressovsky (Дубна, Росія - 2000 р.), International conference - Biorad-2001 “Biolodgical effects of low dose ionizing radiation and radioactive pollution on environment” (Сиктивкар, Росія - 2001 р.), науково-практичній конференції “Експериментальна радіобіологія” (до 15-ї річниці Чорнобильської катастрофи) Інституту експериментальної радіології НЦРМ АМН України (Київ - 2001 р.).

Публікації. За результатами експериментальних досліджень опубліковано 11 наукових праць, із них - 8 статей, 7 із яких у виданнях, рекомендованих ВАК України та 3 тези.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 144 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, аналітичного огляду літератури, власних досліджень з обговоренням, заключення та висновків. Текст ілюстровано 8 таблицями та 43 рисунками. Список використаної літератури містить 160 джерел, із них 101 вітчизняних та 59 зарубіжних.



ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Експериментальні дослідження виконані на асинхронній культурі клітин лінії L929, культивування яких здійснювали згідно із стандартними методами роботи з культуральними штамами [Адамс, 1983] на поживному середовищі RPMI-1640 із додаванням 10% ембріональної телячої сироватки та антибіотиків.

У першій серії експериментальних досліджень через 1 год після посадки клітин в культуральне середовище додавали водні розчини солей ВМ (CuCl2ґ2H2O, BaCl2, NiCl2, CrO3, (CH3COO)2Pbґ3H2O) у концентраціях (мкг/мл): CuCl2ґ 2H2O - 0,5; 1,0; 2,5 та 5,0; BaCl2 - 100,0; 200,0; 300,0; 400,0 та 500,0; NiCl2 - 0,025; 0,05; 0,1; 1,0; 10,0; 25,0 та 50,0; CrO3 - 0,25; 0,5; 2,5 та 5,0; (CH3COO)2Pbґ3H2O - 0,5; 2,5 та 5,0. У вибраному діапазоні концентрацій експериментально було встановлено ЕС50 вище названих металів для клітин лінії L929.

У другій серії експериментальних досліджень сумісно із солями ВМ до поживного середовища з клітинами додавали РН 137Cs у вигляді водного розчину CsCl питомою активністю 3,6 МБк/мл, яка при експозиції 1 год формувала поглинуту дозу іонізуючої радіації 1,0 Гр. Для дослідження впливу РН 137Cs на культуру клітин нами була розроблена дозиметрична модель опромінення клітин in vitro. Схему опромінення, що відповідає умовам експерименту, зображено на рис. 1. Контрольною слугувала серія аналогічних досліджень без використання ВМ (опромінений РН контроль). Залишкову активність клітин вимірювали на ДБГ - 01Н.

В третій серії експериментальних досліджень клітини опромінювали РВ у присутності в поживному середовищі солей ВМ. Опромінення культур клітин РВ здійснювали на установці РУМ-17 в дозах 0,1; 0,5 та 1,0 Гр за таких умов: потужність дози 0,1 та 0,25 Гр/хв, фільтри 0,5 мм Cu та 1,0 мм Al, сила струму 5мА, напруга 180 кВ. Контрольною слугувала серія аналогічних досліджень без використання ВМ (опромінений R-квантами контроль). Для порівняльного аналізу даних у додатковій серії досліджень клітини опромінювали g-квантами 137Cs на установці “ИГУР” у дозі 1,0 Гр. При опроміненні клітин РВ, РН та g-квантами 137Cs використали рівновеликі поглинуті дози.

Через одну годину після опромінення клітин у присутності солей ВМ розчини відбирали, проби 6-ти разово відмивали чистим підігрітим до температури 37,0±0,3 0С поживним середовищем. В подальшому клітини культивували впродовж 5 діб. Оцінку показників життєздатності проводили кожну добу на препаратах, фіксованих 960 етанолом та пофарбованих гематоксилін-еозином. Контролем слугували інтактні клітини. Також були виконані дослідження по виявленню можливого вкладу аніонного залишку сполук ВМ в біологічний ефект. Для цього при культивуванні клітин були використані хлорид натрію та натрію ацетат в еквімолярних концентраціях. Життєздатність клітин аналізували за характером кривих їх росту, мітотичній активності на площі 0,1 мм2 препарату, додатково підраховували кількість гігантських багатоядерних клітин.

Експериментальні дані обробляли загальноприйнятими методами варіаційної статистики [Урбах, 1985] із вирахуванням середніх арифметичних величин (М), їх середньоквадратичного відхилення (d) і середньої квадратичної похибки (m). Для визначення достовірності відмінностей між середніми величинами використовували критерій Стьюдента (t). Результати вважали достовірними при р<0,05. Розрахунки проводили за допомогою ПЕОМ Pentium-II з використанням прикладних програм Microsoft Word, Microsoft Exel.

Вплив рентгенівського випромінювання на життєздатність клітин в культурі. Найбільш помітний ефект спостерігається після дії радіації в дозі 1,0 Гр. Значне пригнічення виживання (ВЖ) клітин на 1 та 2 доби культивування обумовлює зниження щільності клітинної популяції на 5-у добу культивування для даної групи до 69 % відносно інтактного контролю. Аналіз кривих росту клітин в культурі, опромінених в дозах 0,1 та 0,5 Гр, вказує на незначне зниження ВЖ клітин протягом 5 діб культивування. Достовірну різницю з контролем мають значення показника в останні терміни для культур, що опромінені в дозі 0,5 Гр.

Мітотична активність клітин в інтактному контролі характеризується збільшенням показника на 2-у добу із подальшим зменшенням до 5-ї доби культивування, що відповідає стаціонарній фазі росту культури, яка характеризується утворенням щільного моношару, виснаженням поживного середовища і накопиченням метаболітів клітин. Це обумовлює "контактне гальмування" росту та поділу клітин в культурі. Опромінення в дозі 0,1Гр стимулює поділ клітин на першу добу, який в подальшому зменшується до значень нижчих за контрольні. Максимум мітотичної активності клітин, що опромінені в дозах 0,5 та 1,0 Гр, проявляється на 2-гу та 3-ю доби, проте при подальшому культивуванні МІ у цих групах також різко зменшується.

На препаратах опромінених культур клітин мав місце підвищений рівень гігантських багатоядерних клітин у порівнянні з інтактним контролем. Вплив РВ в дозі 0,1 Гр призводить до значного підвищення кількості полікаріоцитів на першу добу культивування із подальшим зниженням, оскільки вони гинуть та елімінують з культури. Клітини, що опромінені в дозах 0,5 та 1,0 Гр, характеризуються більш високим рівнем поліплоїдії, що у декілька разів перевищує контрольні значення. Літературні дані вказують на те, що гігантські багатоядерні клітини для культури клітин лінії L929 є маркерами репродуктивної загибелі і їх кількість є важливим дозозалежним показником при дії іонізуючої радіації [Hopwood, 1979; Пелевина, 1985; Лавренчук, 1989].

Вплив радіонуклідів 137Cs на життєздатність клітин в культурі. При інкубації клітин з РН 137Cs за експозиції, що формує дозу 1,0 Гр, показник ВЖ є значно нижчим за контрольний: на 2-у добу - вдвічі; 3-ю - втричі, 5-у - на 12%, що вказує на значне пригнічення проліферативної активності клітин.

Дія РН 137Cs також обумовлює низький рівень ВЖ клітин, на що вказують характерні зміни МІ та його низькі значення протягом 5-ти діб культивування. Причому, на 1-у добу мітотична активність опромінених клітин є такою ж, як і в контролі. Проте, на препаратах спостерігали значну кількість патологічних мітозів (трьохполюсні), які, на нашу думку, є джерелом утворення полікаріоцитів. В даному випадку привертає увагу величина ІГК на 1-у добу, що має значення у 10 разів більші від контрольного. З часом культивування їх кількість фазно змінюється.

Встановлено, що, як РВ, так і g-кванти 137Cs однонаправлено впливають на кінетику росту клітин. Для 2-ї доби характерним є зниження рівня ВЖ L929-клітин за радіогенних ушкоджень. У наступні доби відбувається відновлення рівня ВЖ, що обумовлює подальше збільшення клітинної популяції. Порівняльний аналіз даних показав, що на стадії стаціонарного росту за показником ВЖ клітин РН 137Cs є більш ефективними, ніж РВ, що, очевидно, спричинено b-компонентою при безпосередньому контакті клітин із РН.

Вплив важких металів на життєздатність клітин в культурі. Токсична дія нікелю проявляється вже при досить низьких концентраціях (0,025 мкг/мл), що спричиняє затримку клітин в лаг-фазі та пригнічення життєздатності клітин на 5-у добу культивування до 27% від інтактного контролю. Збільшення концентрації нікелю пропорційно знижує ВЖ клітин. Нікель у концентрації 25-50 мкг/мл призводить майже до повного пригнічення їх росту. Мітотична активність клітин в культурі проявляє коливальні зміни протягом 5 діб культивування, що може вказувати на синхронізацію їх поділу. На нашу думку та за даними [Sirover at all., 1976; Harnett at all., 1982; Строчкова и др., 1985], нікель пошкоджує систему синтезу ДНК, РНК, затримує клітини в S-фазі.

Концентрації хрому, які були досліджені в наших експериментах, по різному впливають на ВЖ клітин в культурі. CrO3 у концентрації 0,25 мкг/мл на перші 3 доби культивування стимулює проліферацію клітин; 0,5 мкг/мл - затримує ріст клітин на 1-у та 2-у доби, а наступна доба характеризується стимулюючим ефектом іонів хрому. В подальші терміни культивування відмічено пригнічення їх росту. Збільшення вмісту хрому в поживному середовищі до 2,5-5,0 мкг/мл різко знижує ВЖ клітин. Мітотична активність клітин при дії CrO3 значно пригнічена впродовж всього часу їх культивування. Тільки невеликі концентрації металу (0,25 та 0,5 мкг/мл) мають дещо підвищене значення МІ клітин відповідно на 3-ю та 5-у доби.

Оцінюючи кінетику росту клітин при дії хлориду барію, спостерігали пропорційне зниження ВЖ клітин зі збільшенням концентрації металу. Для всіх дослідних культур характерною є затримка росту та поділу клітин в ранні строки культивування (1-2 доби). В наступні доби крива ВЖ відображає період активізації процесів проліферації, що переходить на 5-у добу у стадію стаціонарного росту культури клітин. Пригнічення мітототичної активності клітин на перші доби культивування пояснює затримку росту та поділу клітин у ті ж терміни. На 3-ю добу МІ значно підвищується, що обумовлює перехід клітин у фазу інтенсивного росту. Клітини, що зазнали впливу найбільших концентрацій металу (400,0-500,0 мкг/мл), характеризуються найнижчим показником мітотичної активності, який поступово збільшується з часом культивування. При дослідженні впливу міді на виживання клітин в культурі, було виявлено, що CuCl2 в концентраціях 0,5-1,0 мкг/мл на перші доби культивування призводить до незначної затримки процесів проліферації клітин, а з 3-ї по 5-у доби стимулює їх ріст та поділ у порівнянні з контрольними культурами. Cu2+ в концентрації 0,5 мкг/мл на 5-у добу збільшує щільність клітинної популяції до 142 %, а при 1,0 мкг/мл - до 108 %. Збільшення вмісту цього металу в культуральному середовищі до 2,5-5,0 мкг/мл суттєво зменшує проліферативну активність клітин. При дії міді в концентрації 2,5 мкг/мл ВЖ клітин становить 71%, а при 5,0 мкг/мл - 49% відносно інтактного контролю. Затримка росту та поділу клітин в ранні строки культивування обумовлена пригніченням мітотичної активності клітин в культурі хлоридом міді. На 3-ю добу при дії найменших концентрацій (0,5-1,0 мкг/мл) значення МІ зростає. Збільшення вмісту CuCl2 до 2,5 мкг/мл зумовлює пригнічення мітотичної активності клітин впродовж всього періоду культивування.

Аналізуючи результати експериментальних досліджень впливу свинцю на ВЖ клітин відмітимо, що інгібуюча дія ацетату свинцю проявляється вже при досить низьких його концентраціях (рис. 3.). Так, (CH3COO)2Pb у концентрації 0,5 мкг/мл на 6-у добу культивування викликає загибель 43% клітин відносно інтактного контролю. Зі збільшенням концентрацій до 2,5 мкг/мл та 5,0 мкг/мл, показник ВЖ відповідно зменшується до 45% та 38%. Спостерігається затримка клітин у лаг-фазі до 4-ї доби і тільки з 5-ї помітне деяке підвищення проліферативної активності. ВЖ клітин в моношарових культурах на 6-у добу культивування характеризується оберненопропорційною залежністю від збільшення концентрації ацетату свинцю в культуральному середовищі. Потрібно відмітити синхронізацію поділу клітин в культурі при дії іонів свинцю, що може вказувати на затримку клітинного циклу у певній фазі. Є дані [Costa at all., 1982], які вказують, що обробка клітин сполукою PbSO4 зупиняє клітинний цикл у фазі S (синтезу ДНК). Крім того, дослідження точності синтезу ДНК in vitro показали, що свинець підвищує помилкове включення некомплементарних основ [Sirover at all., 1976; Zakour at all., 1981].

Крім проліферативної активності у контрольних та дослідних культурах було проаналізовано число гігантських багатоядерних клітин. Як відомо, утворення полікаріоцитів є неспецифічною реакцією популяції клітин лінії L929 на деякі чинники хімічної та фізичної природи [Venverloo at all., 1984; Лавренчук, 1986]. Їх число залежить від величини діючого агента. У роботі [Довгалюк, 1998] було відмічено, що при дії іонів нікелю, свинцю, кадмію, алюмінію, міді та цинку зі збільшенням концентрації металу зростає кількість двоядерних клітин.

В наших дослідженнях спостерігалась дозозалежність ефекту - із підвищенням вмісту досліджуваних металів у поживному середовищі в популяції збільшувалась кількість аномальних клітин. Найбільшу кількість полікаріоцитів спостерігали при дії нікелю в концентраціях 25,0 і 50,0 мкг/мл; хрому - 5,0 мкг/мл; міді - 5,0 мкг/мл.

Нами визначені середньоефективні концентрації досліджуваних металів за показниками експериментальних залежностей "доза - відповідь". Ефективною концентрацією (ЕС50) вважали ту, за якої спостерігали загибель 50% клітин в моношарових культурах. На основі ЕС50 було побудовано ряд цитотоксичності металів, який має вигляд (у мкг/мл): Cr (2,3) > Pb (2,5) > Cu (3,8) > Ni (12,6) > Ba (349,0), що узгоджується з даними [Довгалюк і ін., 1998], згідно з якими, комплексоутворююча сила зв'язування іонів важких металів з О-, N- та S-лігандами визначає їх цитотоксичність: Pb > Cu > Cd > Co > Ni > Zn > Mn.

Сумісна дія радіації та важких металів на життєздатність клітин в культурі. Оцінюючи життєздатність клітин in vitro в умовах сумісної дії радіонуклідів 137Cs в дозі 1,0 Гр та іонів важких металів у ЕС50 показано, що такий поєднаний вплив пригнічує ріст клітинної популяції в моношарі і призводять до істотного зниження їх ВЖ відносно інтактного контролю в усі терміни культивування.

Найбільше пригнічення росту та поділу клітин на 2-у добу їх культивування спостерігали при сумісній дії Ni2+ і 137Cs, а також Pb2+ і 137Cs. Комбінація Ba2+ з 137Cs та Cu2+ з 137Cs призводить до 57% загибелі клітин на 5-у добу, що вказує на підсилення цитотоксичної дії металів у поєднанні із радіонуклідами. За тестом величини ВЖ клітин в культурі побудовано наступний ряд: Ni2+ +137Cs < Pb2++137Cs < Cu2++137Cs < Ba2++137Cs < Cr2++137Cs < 137Cs. Порівнюючи його з рядом, який був встановлений за ЕС50, слід відмітити, що на тих же самих позиціях в ряду залишились свинець, мідь та барій, в той час, як нікель та хром змінили своє місце.

При сумісній дії 137Cs та іонів важких металів для більшості вивчених комбінацій МІ є нижчим, ніж в контролі, що частково пояснює низький рівень ВЖ в дослідних культурах (рис. 5.). Тільки при спільній дії радіонуклідів 137Cs та іонів свинцю на 2-у добу культивування цей показник перевищує контрольні значення. Проте, при подальшому культивуванні МІ у цій групі різко зменшується і на 5-у добу має найменше значення.

При спільній дії Pb2+ і 137Cs показано значний рівень гігантських багатоядерних клітин, максимальна кількість яких утворюється на 3-ю добу, що є наслідком патологічних мітозів 2-ї та 3-ї доби культивування. Інші дослідні групи також характеризуються підвищеним рівнем полікаріоцитів в популяції клітин.

В роботі вивчали здатність клітин акумулювати радіонукліди 137Cs в присутності іонів барію, нікелю, хрому, міді та свинцю. Дозиметричні виміри відмитих від радіонуклідів клітин вказують на накопичення 137Cs в клітинах. Найбільші показники адсорбції та поглинання клітинами 137Cs спостерігали у комбінації радіонукліду з Ba2+, Ni2+ та Cr6+, тобто вони сприяють адсорбції на мембрані клітин та (або) проникненню в їх цитоплазму 137Cs, а Cu2+ та Pb2+, навпаки, блокують ці процеси. Отримані результати свідчать про ведучу роль тих чи інших іонів металів у процесах проникнення радіонуклідів до клітин і відповідно збільшення чи зниження поглинутих доз у присутності іонів різних металів.У наступній серії експериментів сумісно із іонами важких металів у ЕС50 використовували зовнішнє опромінення клітин рентгенівськими променями в дозах 0,1; 0,5 та 1,0 Гр.

Дія іонів Ni2+ і Cr6+ на 2-у добу та Ni2+, Cr6+ і Cu2+ на 5-у добу культивування у поєднанні з РВ характеризується значно більшим пригніченням ВЖ клітин, ніж при сумісній дії інших металів з випромінюванням (рис. 7, а,б). Мітотична активність клітин (рис. 7, в) є пригніченою на 2-у добу культивування, що в свою чергу позначається на рівні ВЖ клітинної популяції. Рівень полікаріоцитів у культурах, що були опромінені в дозах 0,1 і 0,5 Гр, в декілька разів перевищує контрольні значення. Найбільша кількість гігантських багатоядерних клітин утворюється на 3-добу.

Спільна дія хрому ( 2,5 мкг/мл) із рентгенівським випромінюванням (0,1 Гр) призводить до протилежних ефектів, ніж вплив нікелю в тій же комбінації. На 2-у добу культивування спостерігається стимуляція проліферативної активності клітин в культурі. На 2-у добу клітини, що зазнали сумісного впливу хрому та рентгенівських променів в дозах 0,1 та 0,5 Гр, мають найвищі показники МІ, який знижується по мірі ущільнення моношару. Відмітимо, що окрема дія іонів хрому на життєздатність клітин в культурі характеризується стимуляцією проліферативних процесів тільки в концентрації 0,25 мкг/мл, в той час як підвищення вмісту CrO3 в поживному середовищі до 2,5-5,0 мкг/мл пригнічує ВЖ клітин в культурі.

Кінетика росту культури, що зазнала впливу ЕС50 барію в умовах опромінення в дозі 0,1 Гр характеризується рівномірним збільшенням щільності клітинної популяції на кожну добу культивування, але проліферативна активність клітин залишається пригніченою: на 5-у добу кількість клітин в моношарі є на 32% меншою, ніж в інтактному контролі. Концентрація барію, що є більшою за ЕС50 значно посилює радіогенні зміни в культурі. В перші 2-і доби спостерігалася затримка росту та поділу клітин. Збільшення дози РВ посилювало процеси пригнічення проліферативної активності клітин. Відмітимо, що опромінення за умов одночасної дії на клітини іонів барію в концентраціях ЕС50 призводить до збільшення кількості полікаріоцитів в культурі у порівнянні з контрольними та опроміненими зразками. Життєздатність клітин в умовах сумісної дії РВ у дозах 0,1 і 0,5 Гр та іонів міді вказує на відсутність достовірних змін в культурі від опромінених клітин за показником ВЖ. Збільшення дози випромінювання до 1,0 Гр призводило до значної загибелі клітин на 4-5-у доби культивування. Мітотична активність дослідних клітин більш суттєво пригнічена на 2-у добу - той час, коли спостерігається найвища активність поділу в контрольних культурах. ІГК при всіх комбінаціях є дещо підвищеним і знаходиться на тому ж рівні, що і в опромінених культурах.

Дія іонів свинцю (2,5 мкг/мл) у сукупності із РВ (0,1 і 0,5 Гр) не призводила до достовірних змін показників ВЖ клітин у порівнянні із опроміненими культурами. МІ на 2-у добу у дослідних культурах має нижчі значення від контрольних, але на 3-ю добу картина протилежно змінювалася. В наступні доби у всіх культурах МІ знижувався. В роботі установлено, що рівень гігантських клітин в дослідних культурах є підвищеним. Найбільша їх кількість утворюється у популяції клітин, що зазнала сумісного впливу опромінення в дозі 0,5 Гр та іонів свинцю.

Під величиною Кс ми розуміємо відношення ефекту при сумісній дії чинників до суми ефектів від дії кожного із них окремо. Установлено, що РВ та РН із ВМ викликають, як правило, антагоністичні ефекти, причому Кс є вищим при використанні 137Cs, ніж R-квантів. Останнє свідчить про більшу біологічну ефективність РН у порівнянні із РВ, очевидно, за рахунок b-компоненти випромінювання при безпосередньому контакті 137Cs із клітинами. Водночас, за іншим показником - утворення полікаріоцитів, як маркера репродуктивної загибелі клітин сумація ефектів при різних дозах та концентраціях чинників і термінів культивування може проявляти як антагоністичну, так і адитивну чи синергічну залежність.



ВИСНОВКИ

Сумісний вплив радіонуклідів 137Cs чи рентгенівського випромінювання та важких металів на клітини лінії L929 в культурі викликає зміни показників їх життєздатності, які виражаються у характерній різнонаправленій сумації ефектів від дії кожного із чинників і залежать від природи агента, дози (концентрації) та часу,що минув після експозиції.

Установлено, що поглинута доза рентгенівського випромінювання 0,1 Гр не призводить до помітних змін показників життєздатності ізольованих клітин лінії L929. Збільшення її величини до 1,0 Гр викликає дозозалежне пригнічення мітотичної активності, виживання клітин та підвищення рівня поліплоїдії.

Порівняльний аналіз впливу різних видів випромінювань на клітини за різних дозових навантажень дозволив виявити збільшення біологічної ефективності радіаційних чинників у послідовності: g-кванти 137Cs (зовнішнє опромінення) < рентгенівські промені (зовнішнє опромінення) < радіонукліди 137Cs (зовнішнє і внутрішнє опромінення).

Показано, що кінетика росту клітин в моношарових культурах у залежності від концентрації іонів важких металів має вигляд спадаючої експоненти. Визначені середньоефективні дози металів, які за інтенсивністю порушень показників життєздатності клітин збільшуються у ряду (у мкг/мл): Cr6+(2,3), Pb2+(2,5), Cu2+(3,8), Ni2+(12,6) та Ba2+(349,0).

Установлено, що рентгенівські промені та радіонукліди 137Cs (у рівновеликих дозах 1,0 Гр) із важкими металами (Cr, Pb, Cu, Ni та Ba) у ЕС50 викликають антагоністичні ефекти за показниками загибелі клітин на 1-5 доби їх культивування, причому коефіцієнти сумації є істотно вищими при використанні 137Cs, ніж R-квантів. Останнє свідчить про більшу біологічну ефективність радіонуклідів у порівнянні із рентгенівським випромінюванням, очевидно, за рахунок b-компоненти при контакті 137Cs із клітинами, що є важливим при тлумаченні величини ефектів, детермінованих зовнішнім та внутрішнім опроміненням.

Сумація ефектів сумісної дії R-квантів чи радіонуклідів 137Cs та важких металів за показником утворення полікаріоцитів, як маркера репродуктивної загибелі клітин, при різних дозах та концентраціях чинників і термінів культивування може проявляти як антагоністичну так і адитивну чи синергічну залежність.



СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дудченко Т.М., Лавренчук Г.Й., Набока М.В., Серкіз Я.І., Чеботарьов Є.Ю. Цитотоксичний вплив важких металів на культуру L-клітин // Цитологія і генетика. -2000. - Т.34, №3. - С. 55-61.

2. Дудченко Т.М., Лавренчук Г.Й., Серкіз Я.І. Життєздатність клітин in vitro під впливом радіонуклідів 137Cs у комбінації з важкими металами // Науковий вісник Чернівецького університету. Серія біологія. - 2000. - №3. - С. 111-115.

3. Ряполова І.Ю., Серкіз Я.І., Цудзевич Б.О., Лавренчук Г.Й., Дудченко Т.М. Динаміка та дозові залежності кількості поліамінвмісних клітин за променевого ураження // Вісник Київського національного університету. Серія біологія. - 2000. - Вип.31. - С. 48-50.

4. Зінченко В.А., Клюшин Д.А., Барабой В.А., Петунін Ю.І., Ганіна К.П., Лавренчук Г.Й., Дудченко Т.М. Аналіз цитологічних показників радіорезистентності в пухлинних клітинах // Экспериментальная онкология. - 2000. - Т. 22, №3. - С. 160-161.

5. Дудченко Т.М., Лавренчук Г.Й. , Серкіз Я.І., Зінченко В.А. Життєздатність клітин у культурі при спільній дії важких металів та радіації // Биополимеры и клетка. - 2000. -Т.16, № 5. - С. 409-412.

6. Лавренчук Г.И., Серкиз Я.И., Рябченко Н.Н., Дудченко Т.Н. Модифицирующее действие низкоинтенсивного электромагнитного излучения на облученные клетки // Радиационная биология. Радиоэкология. - 2001. - Т. 41, №1. - С. 73-77.

7. Набока М.В., Лавренчук Г.И. , Шестопалов В.М., Серкиз Я.И., Трахтенберг И.М., Дудченко Т.М. Информационная модель совместного действия цезия-137 и тяжелых металлов in vitro // Гигиена населенных мест. - Киев: УНГЦ МЗУ. - 2000. - Вып. 37. - С. 595-603.

8. Дудченко Т.М., Лавренчук Г.Й., Серкіз Я.І. Вплив комбінованої дії 137Cs та важких металів на показники життєздатності L929-клітин у культурі // Збірник наукових праць Інституту ядерних досліджень. - 2001. - №2(4). - С. 150-155.

9. Lavrenchuk G.I., Serkiz Ya.I., Dudchenko T.M., Ryapolova I.Yu. Radiogenic effects of low doses on posterities of irradiated cels // International conference "Modern problem of Radiobiolodgy, Radiobiolodgy and Evolution" dedicated to centenary of N. W. Timofeeff-Ressovsky, sept. 6-9, 2000. - Dubna: Joint Institute for Nuklear Research. - 2000. - P.186.

10. Лавренчук Г.И., Серкиз Я.И., Рябченко Н.Н., Дудченко Т.Н. Влияние электромагнитного излучения мм-диапазона на клетки in vitro, облученные нейтронами и гамма-квантами Cs-137 // Международная конференция - Биорад-2001 “Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды”, 20-24 марта, 2001. - Сыктывкар: Институт биологии республики Коми РФ. - 2001. - С. 20.

11. Лавренчук Г.И., Серкиз Я.И., Дудченко Т.Н., Ряполова И.Ю. Радиогенные эффекты у потомков облученных клеток // Международная конференция - Биорад-2001 “Биологические эффекты малых доз ионизирующей радиации и радиоактивное загрязнение среды”, 20-24 марта, 2001. - Сыктывкар: Институт биологии республики Коми РФ. - 2001. - С. 213-214.

Размещено на Allbest.ru

...