Дослідження динаміки мембранозв’язаних біоелектричних процесів ембріональних клітин з використанням комп’ютерного моделювання

Размещено на http://www.allbest.ru/

Львівський національний університет імені Івана Франка

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

03.00.02 - біофізика

Дослідження динаміки мембранозв'язаних біоелектричних процесів ембріональних клітин з використанням комп'ютерного моделювання

Дика Марія Василівна

Львів 2001

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Львівському національному університеті імені Івана Франка Науковий керівник: кандидат технічних наук, доцент Гумецький Роман Яремович, Львівський національний університет імені Івана Франка, доцент кафедри біофізики та математичних методів у біології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Горго Юрій Павлович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач лабораторії фізіологічної кібернетики і психофізіології

доктор біологічних наук, професор Лях Юрій Єремійович, Донецький медичний університет МОЗ України, завідувач кафедри медичної інформатики, біофізики з курсом медапаратури

Провідна установа: Харківський національний університет ім. В.Н. Каразіна Міністерства освіти і науки України

Захист відбудеться " 29 " березня 2001 р. о 15.30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради K 35.051.14 у Львівському національному університеті імені Івана Франка за адресою: 79005 Львів, вул. Грушевського,4, біологічний факультет, аудиторія № 333.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Львівського національного університету імені Івана Франка за адресою: 79005 Львів, вул. Драгоманова, 17.

Автореферат розісланий " 27 " лютого 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Санагурський Д.І.

1. Загальна характеристика роботи

електрофізіологічний зародковий запліднення мембрана

Актуальність теми. Вивчення закономірностей самоорганізації клітинних процесів на початкових етапах онтогенезу тварин вважається одною з важливих проблем сучасної біології. Серед багатьох характеристик розвитку особливої уваги заслуговують електрофізіологічні параметри клітинних мембран, які належать до інтегральних показників, що достатньо повно можуть відображати функціонування системи в цілому.

Сучасні біофізичні методи дозволяють одержати потрібні характеристики в динаміці, зокрема показано, що процеси, які проходять після запліднення яйцеклітини в період її синхронних дроблень, супроводжуються періодичними коливаннями трансмембранного потенціалу (ТМП) та інших біоелектричних показників на фоні характерних змін їх загального рівня ( Гойда, 1993).

Однак, незважаючи на велику базу експериментальних даних пояснення можливих механізмів часової зміни електрофізіологічних характеристик незбудливих клітин, до яких належать бластомери зародків тварин, на основі кількісних співвідношень здійснено тільки в частковому плані (Гумецький, 1995), а використання системного підходу і відповідного йому математичного моделювання в цій сфері тільки починається. Неповні також відомості про можливий механізм виникнення періодичних коливань біоелектричних показників, що синхронні з циклами клітинного поділу, та про достатньо повний математичний опис їх змін на початковому етапі розвитку ембріональних об'єктів.

В зв'язку з цим, поєднання в цілісну систему нагромаджених експериментальних результатів вивчення динаміки біоелектричних процесів із теоретичними положеннями мембранного електрогенезу є актуальним у з'ясуванні їх значимості в процесах клітинної проліферації та онтогенезу. Для опису і дослідження такої складної динамічної системи доцільним є використання методів математичного моделювання.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана в рамках наукових досліджень, які проводились на кафедрі біофізики та математичних методів у біології Львівського державного університету імені Івана Франка в 1995-1998 рр. як держбюджетна НДР за темою БФ-711Б “Дослідження динаміки біоелектричних параметрів мембран зародків тварин за різних умов інкубації з використанням комп'ютерного моделювання”, № держреєстрації 0196V023018 (здобувачем проведено дослідження динаміки аперіодичних і періодичних змін електрофізіологічних характеристик бластомерів зародка в'юна з використанням комп'ютерного моделювання).

Мета i задачі дослідження. В даній роботі ставилась мета промоделювати нестаціонарні мембранозв'язані процеси раннього ембріогенезу, що відображаються в динамічних змінах електрофізіологічних характеристик ембріональних клітин, на основі відомих теоретичних положень, виведених із них кількісних співвідношень, що описують закономірності мембранного транспорту та розподілу іонів i залежності між біоелектричними показниками (зокрема, між калієвою та натрієвою провідностями), та з використанням результатів експериментальних досліджень.

Об'єктом даного дослідження з застосуванням комп'ютерного моделювання була динаміка мембранозв'язаних процесів клітин зародка прісноводної риби в'юна (Misgurnus fossilis L.) протягом перших 7 годин його розвитку, а предметом дослідження - біоелектричні характеристики ембріональної клітини.

Для досягнення поставленої мети застосовано методику математичного моделювання електрофізіологічних процесів (в її комп'ютерній реалізації). Зокрема використовували: методи аналітичного опису модельованих зв'язків, впливів та залежностей між досліджуваними показниками за допомогою алгебраїчних і транцендентних функцій та диференціальних рівнянь; методи математичної статистики, зокрема нелінійної регресії; методи розв'язку систем диференціальних рівнянь, програмовані на мові BASIC та з пакету програм Mathcad.

Оскільки за характером змін ТМП, іонних потоків та провідності мембрани припускається наявність в модельованому процесі щонайменше двох адитивних складових (перша з них відображає основний напрямок, тенденцію змін - їх часовий тренд, друга - відносно швидшу їх ритміку), динаміка початкового розвитку може бути описана як загальні зміни рівня поляризації мембрани, іонних потоків та провідностей, на які накладаються коливання, синхронні з циклами клітинного поділу. Виходячи з того, що об'єднання вказаних часткових моделей дає змогу відобразити цілісну динаміку мембранозв'язаних процесів, при виконанні роботи були поставлені наступні задачі:

1. На основі узагальнення наявного в сучасній електрофізіології математичного опису процесів електрогенезу (зокрема в збудливих клітинах), а також експериментальних даних, отриманих на зародках в'юна, промоделювати часовий тренд біоелектричних характеристик. Вирішення цієї задачі передбачало два етапи:

а) за математичним описом модельованих процесів визначити динаміку концентрацій іонів, іонних струмів та провідностей в залежності від рівня трансмембранного потенціалу, виміряного на ранніх етапах розвитку зародків в'юна для доповнення моделі невідомими рівняннями потенціалозалежності провідності;

б) визначити за цією моделлю динаміку результуючого рівня ТМП та інших біоелектричних показників лише за заданими концентраціями катіонів калію та натрію для початкового стану та спiвставити з наявними результатами досліджень in vivo.

2. Враховуючи взаємозалежність калієвої та натрієвої провідностей (що повинно бути характерно як для мембран збудливих клітин, так і для незбудливих), розробити окрему математичну модель коливної динаміки вказаних провідностей та інших залежних від них електрофізіологічних показників.

3. Об'єднати обидві вказані часткові моделі в цілісну систему, яка дозволила б відтворити аперіодичні і періодичні складові динаміки мембранозв'язаних процесів - зміни загального рівня та ритміку коливань основних біоелектричних показників, синхронну з циклами клітинних поділів на початкових стадіях розвитку ембріональних об'єктів.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведеної роботи дістали подальший розвиток функціональні моделі, а саме: модель часового тренду біоелектричних показників (Гумецький, 1995), що описує аперіодичні зміни перехідного періоду початкових дроблень та бластуляції зародків в'юна; та модель динаміки провідностей, що враховує взаємозалежність змін калієвої та натрієвої провідностей плазматичної мембрани (Антомонов, 1974).

Вперше одержано узагальнюючу математичну модель часової динаміки біоелектричних процесів, яка враховує взаємозалежність всіх електрофізіологічних показників і дозволяє системно вивчати мембранозв'язані процеси з моменту запліднення ооцита і протягом всього періоду початкових дроблень і бластуляції зародкових клітин. Ці результати мають фундаментальне значення і служать подальшим розвитком уявлень про динаміку і механізми аперіодичних та періодичних змін електрофізіологічних характеристик зародкових клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Запропоновані моделі та отримані при моделюванні результати мають практичне значення для вивчення тих малодоступних безпосередньому експериментальному дослідженню закономірностей та механізмів, які зумовлюють характерну динаміку мембранозв'язаних біоелектричних процесів протягом перших годин розвитку ембріонів.

Запропоновані підходи можуть використовуватись у наукових розробках, що присвячені проблемі регуляції раннього онтогенезу. Математичні моделі, зокрема в їх комп'ютерній реалізації, придатні для прогнозування змін електрофізіологічних характеристик ембріональних клітин при дії різних фізико-хімічних факторів.

Результати дослідження можуть бути використані також у навчальному процесі - при викладанні спецкурсів з біофізики, електрофізіології, біології розвитку, математичного моделювання біосистем та ін. у вищих навчальних закладах.

Особистий внесок здобувача. Згідно з поставленою метою і задачами автором особисто виконано модельні дослідження та отримано результати експериментів in model. Самостійним є вибір методів дослідження, проведення їх аналізу, формулювання основних висновків роботи, підготовка до друку публікацій за матеріалами дисертації. Спільно з науковим керівником проводилось планування основних напрямків досліджень, розробка моделей та обговорення одержаних результатів.

Апробація результатів дисертації. Основні наукові результати дисертаційної роботи щорічно доповідались на звітних наукових конференціях співробітників Львівського державного університету імені Івана Франка (1996-1999 рр.). Матеріали роботи були представлені на ІІ з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 29 червня - 3 липня 1998р.), на конференції з міжнародною участю “Фізика біологічних систем” (Київ, 6-11 вересня 1998).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті, три із них у фахових наукових виданнях, і двоє тез доповідей в матеріалах з'їздів та конференцій.

Структура і об'єм роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, висновків, додатків, а також списку використаних джерел (183 найменувань). Повний обсяг дисертації складає 144 сторінок, з них додаток займає 21 сторінку. Дисертаційна робота ілюстрована 35 рисунками.

2. Основний зміст роботи

У вступі обґрунтовано актуальність обраної теми, сформульована мета і задачі дослідження, наведена загальна характеристика дисертації.

Перший розділ присвячений огляду літератури за темою дисертаційної роботи. В ньому розглядаються електрофізіологічні характеристики мембран бластомерів зародка в'юна (Misgurnus fossilis L.). Розглянуто роль транспорту основних клітинних катіонів у формуванні рівня трансмембранного потенціалу (ТМП) у ранньому розвитку зародків тварин. Проаналізовано існуючі підходи до моделювання розподілу іонів між цитоплазмою та міжклітинним середовищем у їх зв'язку з трансмембранним потенціалом. Проведено короткий огляд моделей динаміки провідностей натрію та калію в збудливих мембранах.

Другий розділ присвячений методиці математичного моделювання та експериментальному матеріалу. В ньому розглядається математичний опис залежностей між біоелектричними характеристиками мембранозв'язаних процесів, алгоритм моделювання та його комп'ютерна реалізація, а також використані для цього кількісні дані.

За вихідні дані були прийняті величини ТМП з моменту запліднення (-15 мВ) і до кінця періоду бластуляції (-50 мВ), коли ТМП виходить на відносно постійний рівень після 7 год. розвитку зародка (Гойда, 1993). Концентрації іонів натрію і калію в середовищі була постійною і становила відповідно - [Na+]о= 110 мМ, [K+]о= 1.4 мМ. При цьому концентрація іонів К+ в клітинах ембріонів змінюється в межах 70-110 мМ (Бериташвили, 1974), а концентрація іонів Na+ відповідно спадає. Розраховуючи сумарну концентрацію Na+ та K+ за різними значеннями ТМП і враховуючи вказані експериментальні дані, визначалась концентрація кожного типу іонів. Для обчислення динамічної складової ТМП (Ud) було застосовано ітераційний алгоритм для кожного із послідовних дискретних кроків часу.

В комп'ютерній реалізації моделі коливних змін мембранної провідності інтегрування диференціальних рівнянь здійснювалось за допомогою системи MathCAD 7.0. Це дозволило отримати динаміку провідностей K+ та Na+ та їх фазову траєкторію при заданих значеннях ТМП. Для розв'язку системи диференціальних рівнянь використано метод Рунге-Кутта четвертого порядку з фіксованим кроком інтегрування. Для моделювання динаміки провідності при певних змінах ТМП був застосований більш простий метод Ейлера, запрограмований на мові BASIC. В комп'ютерній реалізації повної моделі, де модель динаміки провідностей введена як підсистема в модель тренду мембранозв'язаних процесів, застосована програма розв'язку системи диференціальних рівнянь на мові BASIC, в якій допрограмовано рівняння взаємозалежності провідностей.

В третьому розділі досліджується запропонована модель динаміки мембранозв'язаних біоелектричних процесів раннього ембріогенезу, наведено результати дослідження in model та їх співставлення з експериментальними даними.

Математична модель динаміки мембранозв'язаних біоелектричних процесів раннього ембріогенезу відтворює закономірності мембранного транспорту та розподілу іонів калію та натрію в їх зв'язку з динамікою електрофізіологічних показників клітини, зокрема ТМП, із врахуванням потенціалозалежності та взаємозалежності натрієвої та калієвої мембранних провідностей.

Кінцеві рівняння моделюючих співвідношень, запропоновані для розрахунку динаміки мембранозв'язаних біоелектричних процесів і застосовані для дослідження раннього розвитку зародків в'юна, мають вигляд:

Запропонована модель описує динаміку активності іонної помпи IP, динаміку іонних струмів IK та INa, і мембранних провідностей gK, gNa для іонів K+ і Na+, динаміку їх внутрішньоклітинних концентрацій і залежні від них зміни рівноважних потенціалів EK, ENa та трансмембранного потенціалу U. Вона дозволяє системно вивчати мембранозв'язані процеси з моменту запліднення ооцита протягом всього періоду початкових дроблень і бластуляції. Зокрема, рівняння (1-13) становлять модель часового тренду біоелектричних показників, а рівняння (14-15) - модель взаємозалежності натрієвої і калієвої провідностей, які доповнюючи одна одну описують різні сторони єдиного процесу функціонування ембріональної клітини, що відображаються характерними змінами загального рівня електрофізіологічних показників та їх періодичними коливаннями, синхронними з циклами клітинного поділу.

Аналіз результатів моделювання загальних змін (часового тренду) біоелектричних показників. Дослідження аперіодичних динамічних змін загального рівня електрофізіологічних характеристик ембріональних клітин, що відбуваються після запліднення в період їх синхронних дроблень, проведено на основі системи моделюючих рівнянь (1-13). Остання була застосована для розрахунку часового тренду всіх мембранозв'язанних біоелектричних та концентраційних показників на протязі 7-годинного періоду початкових дроблень і бластуляції.

Протягом перших 5 годин після запліднення спостерігається певне зростання сумарної концентрації катіонів, що відповідає зростанню рівня ТМП. При цьому значне зростання [К+]i спадання [Na+]i всередині клітини, виходячи з прийнятої моделі, мусить супроводитися зростанням концентрації внутрішньоклітинних непроникаючих аніонів і видаленням з клітини іонів Cl-. Відповідно до змін концентрацій [K+]i та [Na+]i змінюються їх рівноважні потенціали: для К+ знижується до -110 мВ і для Na+ підвищується до +60 мВ.

Характер змін концентрації внутрішньоклітинних іонів Na+ визначає струм іонної помпи, який фактично є сумою струмів активного транспорту іонів натрію та калію, протилежних за напрямком. Розраховані за моделлю результуючі струми (дисбалансу активного і пасивного транспорту іонів) - калієвий, натрієвий та їх сумарний струм, приводять до вказаних вище змін концентрацій кожного з катіонів та їх сумарної концентрації. Всі ці струми існують лише підчас перехідного процесу в інтервалі 0-7 год. після запліднення.

Розрахована за відповідними струмами та потенціалами динаміка провідностей має вигляд спадаючих (при зростанні рівня ТМП) кривих, при цьому натрієва провідність, яка на початку була значно вищою від калієвої, спадає набагато швидше і стає меншою ніж калієва. Співвідношення провідностей за цей же час змінюється майже на порядок - аж до переважання після 4-х годин розвитку зародків калієвої провідності.

Результати розрахунку часових змін усіх складових ТМП, а саме дифузійної, електрогенної та додаткової динамічної складової ТМП, показані. Найістотніший вклад в рівень ТМП вносить дифузійна складова, що визначається концентраційними градієнтами, яка на 4 годину розвитку зародків в'юна становить -45 мВ, коли трансмембранний потенціал досягає -65 мВ. Електрогенна складова ТМП, що зумовлена роботою іонної помпи; змінюється в межах від -10 до -25 мВ, а додаткова динамічна складова, що зумовлена сумарною незрівноваженістю всіх струмів через мембрану - в межах від -6 до +3 мВ. Після 7 годин розвитку динаміка усіх складових і відповідно ТМП виходить на певний постійний рівень, а додаткова динамічна складова спадає до нуля. Це вказує на те, що перехідний процес закінчився і система вийшла на новий стаціонарний рівень.

Співставлення результатів дослідження in model з експериментальними даними. Для оцінки адекватності моделі результати моделювання порівнювали з наявними експериментальними даними про динаміку біоелектричних характеристик ембріональних об'єктів на початковому етапі їх розвитку.

Динаміка загального рівня мембранного потенціалу, відображена в описаній моделі, повністю тотожна часовому тренду експериментальних вимірів ТМП (Гойда, 1993), оскільки останні були взяті як вихідний матеріал для моделювання (в першій серії експериментів).

Першочерговим результатом, одержаним на основі моделі, є кількісна характеристика динаміки концентрацій іонів К+ і Na+ всередині клітини, яка також є у повній відповідності з відомими з літератури закономірностями їх зміни в період бластуляції (Slack et al., 1973; Бериташвили, 1974 ).

На динаміці концентрацій К+ і Na+ базуються відповідні зміни їх рівноважних потенціалів та результуючих струмів дисбалансу пасивного та активного транспорту іонів, що зумовлюють зміну концентрацій кожного з вказаних катіонів. Тому для іонних струмів непрямим доказом адекватності модельних результатів їх реальному часовому тренду є відповідність динаміки внутрішньоклітинних концентрацій К+ і Na+. Виходячи з цього можна стверджувати, що адекватність модельних змін всіх цих показників їх реальній динаміці не викликає сумніву.

Зміна концентрації Na+ в клітині впливає також на інтенсивність роботи іонної помпи, а одержана в моделі динамічна характеристика її електрогенного струму має загальний вигляд, аналогічний до описаних в літературі часових змін активності мембранної АТФази (Бериташвили, 1974): в незапліднених яйцеклітинах активність є низькою, а після запліднення підвищується i залишається на цьому рівні до стадії ранньої бластули; через 3-4 год після запліднення спостерігається різке зниження АТФазної активності, а з 5 год її швидке відновлення i поступове збільшення протягом наступних годин ембріонального розвитку. Зміна Na+,K+-ATPазної активностi, визначена in model як струм відповідної іонної помпи, розрахований для перших 7 год розвитку зародків, має подібну динаміку.

Визначена за допомогою моделі динаміка мембранної провідності для K+ і Na+ повністю підтверджується існуючими даними про її потенціалозалежність (Гойда, 1993). Незважаючи на те, що модель для кожного виду іонів оцінює тільки інтегральну провідність різних типів іонних каналів (залежних і незалежних від ТМП), вклад потенціалозалежних, особливо в натрієву провідність, надзвичайно чітко кількісно виражений.

Результати завершального комп'ютерного експерименту, проведеного з метою підтвердження можливості одержання адекватної динаміки рівня ТМП для початкового етапу розвитку зародка в'юна виключно розрахунковим шляхом за заданими початковими концентраціями внутрішньоклітинних іонів K+ і Na+ наведені. Співставлення 7-годинного тренду ТМП, визначеного in model, з реальною динамікою рівня ТМП, виміряного in vivo, вказує на відповідність процесів, відображених в моделі, мембранозв'язаним процесам, що відбуваються в ембріональних клітинах в період їх початкових дроблень (Гойда,1993), що підтверджує достатню повноту моделі щодо опису часового тренду біоелектричних показників зародкових клітин.

Співвідношення, які були виведені з теоретично обгрунтованих кількісних закономірностей (1-11), та на основі експериментальних даних (12-13) досить точно характеризують динаміку загальних змін електрофізіологічних показників мембрани, а також внутрішньоклітинних концентрацій основних для клітинного електрогенезу іонів. З точки зору відображення часового тренду цих змін можна вважати, що запропонована модель адекватна реальним процесам, які відбуваються на початковому етапі розвитку ембріональних об'єктів.

Дослідження коливної поведінки потенціалозалежних провідностей натрію та калію. Дослідження in model дало змогу враховувати вплив рівня ТМП і дослідити коливання мембранної провідності не тільки при фіксованому потенціалі, а й у випадку зміни рівня ТМП, відповідно до його реального тренду.

Модель відтворює періодичні коливання натрієвої та калієвої провідностей, які синхронні з циклами клітинного поділу, мають однакову частоту й зміщені по фазі. Амплітуда коливань калієвої провідності в 2- 3 рази більша від натрієвої. На протязі перших 6 годин після запліднення спостерігається деяке зростання середнього рівня калієвої провідності мембрани та чітко визначене спадання натрієвої провідності.

Дослідження динаміки взаємозалежності між провідностями доповнює фазова траєкторія, яка чітко відображає циклічність коливань кожної провідності при одночасній зміні їх середнього рівня.

Аналіз повної динаміки біоелектричних показників мембран зародкових клітин у їх співставленні з експериментальними даними. Результати останньої серії експериментів з комп'ютерного моделювання були спрямовані на перевірку функціонування моделі коливної динаміки мембранної провідності в складі комплексної моделі, яка враховує всі зв'язки між біоелектричними показниками, в тому числі і між калієвою і натрієвою провідностями, у вигляді відповідної системи рівнянь (1-15) і дозволяє якісно та кількісно відтворити аперіодичні та періодичні динамічні зміни електрофізіологічних характеристик ембріональних клітин, а саме коливання на фоні тренду їх рівня, адекватні до реальних даних, що реєструються на зародках в'юна в початковий період ембріогенезу (Гойда, 1993).

Для оцінки відображальної здатності повної моделі результати моделювання порівнювали з наявними експериментальними даними про динаміку біоелектричних характеристик ембріональних об'єктів (Квавилашвили, 1971; Бериташвили, 1974; Божкова, 1987; Ротт, 1987; Медина, 1988; Гойда, 1993).

Одержана на основі моделі кількісна характеристика динаміки концентрацій іонів К+ і Na+ всередині клітини, як було показано вище, є у повній відповідності з відомими з літератури закономірностями їх зміни в період раннього розвитку зародка в'юна (Slack et al., 1973; Бериташвили, 1974). Слід відзначити, що і в результатах моделювання, і в експериментальних даних практично відсутні коливні зміни концентрацій, що синхронні з циклами клітинного поділу, оскільки відносна зміна концентрацій, як інтегрального показника щодо струмів, дуже незначна.

Динаміка трансмембранного потенціалу ембріональних клітин на початковому етапі їх розвитку, відтворена описаною моделлю, відповідає експериментальним даним 6-годинної реєстрації ТМП зародків в'юна (без перивітелінових оболонок), що вказує на відповідність електрогенних та автоколивних процесів, відображених в моделі, процесам, що відбуваються в ембріональних клітинах в період їх початкових дроблень та бластуляції.

Проведено також співставлення результатів моделювання динаміки сумарного іонного струму і сумарної провідності мембрани з експериментально визначеними їх змінами. В обох випадках спостерігаються синхронні зміни двох вказаних показників, що співпадають по фазі (максимальні значення провідності відповідають за часом максимальним значенням іонного струму), як в експерименті in model, так і в експерименті in vivo (Гойда, 1993). З розвитком зародка спостерігається тенденція до поступового збільшення сумарного струму і сумарної провідності. Більш виражене зростання обох показників in vivo пояснюється певним збільшенням (в результаті клітинних поділів) загальної площі мембрани, що не враховувалось in model, оскільки визначалась провідність на одиницю площі мембрани.

Проведено також співставлення результатів моделювання з експериментально визначеними змінами вхідного опору мембрани Rвх в період бластуляції (Квавилашвили, 1971). Для цього були використані дані про те, що утворення в процесі клітинного поділу нової мембрани пов'язано із збільшенням її іонної проникності, тобто зменшенням оберненої до провідності величини вхідного опору як глобальної характеристики всієї клітинної мембрани. Спадання загального рівня вхідного опору мембрани та зростання провідності in model відповідає росту абсолютних значень ТМП. В більшості випадків максимальні значення іонної провідності in model і мінімальні значення вхідного опору, отримані експериментально, відповідали в часі максимальним значенням ТМП.

Результати досліджень проведених in model дозволяють стверджувати, що моделююча система співвідношень (1-15), в яких були враховані теоретично обгрунтовані кількісні закономірності, є достатньо повною для якісної характеристики динаміки загальних та періодичних змін електрофізіологічних показників мембрани, а також динаміки внутрішньоклітинних концентрацій основних іонів. При відповідно визначених параметрах моделі вона дозволяє досить точно відтворити й кількісні характеристики часових змін досліджуваних біоелектричних показників. З точки зору відображення повної динаміки цих змін можна вважати, що запропонована модель адекватна реальним процесам, які відбуваються на початковому етапі розвитку ембріональних об'єктів.

Четвертий розділ присвячено обговоренню одержаних результатів. Розглянена вище модель динаміки мембранозв'язаних біоелектричних процесів раннього ембріогенезу отримана завдяки врахуванню достатньо повного комплексу функціональних взаємозв'язків між характеристиками досліджуваної системи. Математично вона описується системою 15 рівнянь і враховує залежності між такими показниками як: трансмембранний потенціал, рівноважні потенціали, струми активного і пасивного транспорту електрогенних іонів та струм помпи, швидкість зміни внутрішньоклітинних концентрацій Na+ і K+, потенціалозалежність провідності для вказаних іонів, швидкість її зміни та ін. В нашому випадку значною мірою розшифровується зміст досліджуваної “чорної скриньки”, оскільки вона стає системою з повним описом її атрибутів (через елементи, їх функції та зв'язки). Схема причинно-наслідкових зв'язків між змінами вказаних показників показана, який дозволяє уявити собі основні контури функціональних залежностей, незважаючи на складність модельованої системи.

Зміни провідності мембрани для K+ і Na+ приводить до зміни іонних струмів, останні змінюють концентрацію електрогенних іонів, що визначає (як один з факторів) значення трансмембранного потенціалу. Динаміка іонного струму пасивного транспорту залежить від різниці ТМП і відповідного рівноважного потенціалу, який визначається мембранним градієнтом концентрацій певного іона. Динаміка іонного струму активного транспорту також залежить від внутрішньоклітинної концентрації іонів Na+ та зовнішньоклітинної концентрації K+. Таким чином, провідність мембрани впливає на мембранний потенціал, але не безпосередньо, а через зміни іонних струмів і, як наслідок, концентрацій основних іонів. В свою чергу, між провідностями і ТМП існує зворотній зв'язок, що реалізується як потенціалозалежність кожної з них.

У наведеній вище схемі простежується декілька контурів прямого і зворотного зв'язку, крім відтвореної в частковій моделі взаємозалежності між калієвою та натрієвою провідностями. Їх математичний опис можна вважати засобом феноменологічного відображення механізмів як внутрішньої саморегуляції, так і генерації автоколивань в цілісній динамічній системі. На базі останньої можна системно - глибше і повніше дослідити вказані механізми та їх прояви в живих системах, серед яких і взаємозв'язок між електричними мембранозв'язаними коливними процесами та ритмом дроблення бластомерів у ранньому ембріогенезі риб.

Вплив рівня провідності на напрям зміни ТМП, протилежний за характером до вказаної потенціалозалежності провідності, можна розглядати як керуючий фактор в динаміці мембранозв'язаних процесів. Відомий з літератури прямий зв'язок між (Hagiwara, Jaffe, 1979) початковими змінами провідності, зокрема gNa, що спричиняють зміни іонних струмів, концентрацій, активності іонної помпи, і рівнем ТМП, можна вважати пусковим фактором в динаміці мембранозв'заних процесів, а зворотній вплив рівня ТМП на провідність - як фактор, що приводить до стабілізації цих показників, тобто вгасання перехідного процесу.

За допомогою статистичних методів, зокрема - нелінійної регресії, аналітично визначено потенціалозалежний характер калієвої та натрієвої провідностей. Незважаючи на те, що для ембріональних клітин в літературі немає конкретних даних про потенціалозалежні іонні канали для натрію та калію, за модельними результатами можна стверджувати про їх існування в мембранах бластомерів зародка в'юна. Відзначимо, що нелінійні вольтамперні характеристики мембрани ембріона в'юна (Гойда, 1993) також дозволяють стверджувати про потенціалозалежність провідності.

Узагальнюючи наведені вище результати, одержані для періоду динамічних змін електрофізіологічних характеристик початкового розвитку зародкової клітини, можна вважати, що, на відміну від стаціонарного стану, для динамічного режиму мембранозв'язаних процесів характерна:

незрівноваженість вхідних і вихідних іонних потоків через клітинну мембрану, наслідком якої є результуючий струм перехідного процесу;

часові зміни сумарної концентрації основних електрогенних катіонів у клітині, напрям якої залежить від напрямку струму перехідного процесу, що зумовлює вказані зміни;

певне відхилення від характерної для стаціонарного стану залежності між сумарною концентрацією катіонів в клітині і рівнем ТМП, яка пов'язана зі струмом перехідного процесу (при фіксованому z), що відображає наявність додаткової складової ТМП (поряд з складовими, пов'язаними з концентраційними градієнтами та електрогенністю іонної помпи);

дещо відмінна провідність “динамічної” мембрани в порівнянні до стаціонарного стану з тією ж величиною ТМП, при цьому пониженому рівню провідності відповідає режим зростання ТМП (за абсолютною величиною) і навпаки.

Отже, динамічний рівень результуючих іонних потоків, а також ТМП в цілому визначається складовими, які завжди мають місце, і складовою перехідного процесу. Останній характеризується змінами концентрацій основних електрогенних іонів у клітині, нестаціонарністю ТМП та потенціалозалежної мембранної провідності.

Щодо запропонованої моделі динаміки провідностей (яка описується системою з двох диференціальних рівнянь і враховує взаємозалежність провідностей та їх залежність від ТМП), то її можна вважати теоретичним узагальненням математичного опису провідності збудливих мембран аксона (Антомонов, 1974), оскільки вона придатна для різних мембран, в тому числі і для бластомерів зародків, при відповідних значеннях параметрів узагальнюючих рівнянь.

В цілому весь комплекс розглянутих вище біоелектричних показників дозволяє досить повно кількісно описати та моделювати часові зміни в структурно-функціональних системах плазматичної мембрани, а одержані результати в співставленні з експериментальними даними підтверджують адекватність розробленої моделі певним реальним процесам на початковому етапі розвитку ембріональних об'єктів (Квавилашвили, 1971; Божкова, 1986; Ротт, 1987; Гойда, 1993).

Однак модель створюється не стільки для оцінки адекватності модельних результатів експериментальним даним, скільки для глибшого розуміння певних процесів, для перевірки гіпотез чи відкриття нових властивостей або закономірностей, характерних для досліджуваного об'єкту. Якісна оцінка одержаних результатів моделювання вказує на значну біологічну змістовність створеної моделі, її достатню повноту і відповідність реальним процесам. Сам факт втілення вказаних вимог повністю і в завершеній математичній формі в змістовну модель (і дієздатну її комп'ютерну реалізацію) є вагомим теоретичним і практичним результатом, оскільки йдеться про складну систему. Модель також дозволяє повніше описати певні специфічні закономірності функціонування мембрани бластомерів зародка в'юна, до яких можна віднести, наприклад, потенціалозалежність іонних каналів для натрію та калію.

З методологічної точки зору, одержані результати підтверджують перспективність використання сучасних інформаційних технологій, таких як комп'ютерне моделювання, в дослідженні складних біологічних феноменів, до яких відносять і динаміку мембранозв'язаних процесів.

Висновки

За результатами математичного моделювання динаміки мембранозв'язаних процесів на початковому етапі ембріогенезу холоднокровних тварин (проведеного з використанням даних експериментальних досліджень зародків в'юна Misgurnus fossilis L.) можна зробити такі висновки:

1. Запропоновано модель динаміки мембранозв'язаних процесів, яка відтворює загальні зміни (часовий тренд) та періодичні коливання електрофізіологічних показників плазматичної мембрани зародків, а також зміни внутрішньоклітинної концентрації основних електрогенних іонів в період початкових дроблень і бластуляції.

2. На основі експериментальних даних про часові зміни рівня ТМП визначено динаміку мембранної провідності для іонів K+ і Na+ та її залежність від трансмембранного потенціалу. В результаті модель доповнено S-подібними функціями, що описують потенціалозалежність провідності, з визначеними параметрами для зародків в'юна.

3. Досліджено модельну динаміку загальних змін електрофізіологічних характеристик мембрани, а також внутрішньоклітинних концентрацій основних електрогенних іонів. З точки зору відображення часового тренду цих змін запропонована модель адекватна експериментальним даним, які одержані для початкового етапу розвитку ембріональних клітин.

4. Запропоновано модель динаміки провідностей, яка враховує взаємозалежність між змінами калієвої та натрієвої провідності плазматичної мембрани та їх потенціалозалежність і відтворює періодичні коливання провідності, синхронні з циклами клітинного поділу.

5. На основі розроблених алгоритмів здійснено комп'ютерне моделювання всього комплексу аперіодичних і періодичних часових змін мембранозв'язаних електрофізіологічних характеристик для початкового етапу розвитку зародків в'юна. При цьому динаміка всіх біоелектричних показників та внутрішньоклітинних концентрацій основних електрогенних катіонів визначається лише за заданими для початкового стану концентраціями цих катіонів (в клітинах та в середовищі інкубації) для даного об'єкту дослідження.

6. Отримані результати в співставленні з експериментальними даними підтверджують достатню повноту розробленої математичної моделі та її адекватність певним реальним процесам на початковому етапі розвитку ембріональних об'єктів, а також припущення про те, що коливання електрофізіологічних характеристик мембрани зумовлені динамікою її калієвої та натрієвої провідностей.

Список опублікованих автором праць за темою дисертації

Гумецький Р.Я., Дика М.В. Часовий тренд іонної провідності плазматичної мембрани в ранньому ембріогенезі в'юна (Misgurnus fossilis L.) // Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії та сільського господарства: Кн. наук.праць. - Львів, 1997.- Кн. 3. - С. 52-54.

Гумецький Р.Я., Дика М.В. Динаміка активного та пасивного транспорту Na+ та K+ через плазматичну мембрану зародків в'юна // Актуальні проблеми медицини, біології, ветеринарії та сільського господарства: Кн. наук.праць. - Львів, 1998.- Кн. 4. - С. 190-192.

Гойда О.А., Гумецький Р.Я., Дика М.В. Результати моделювання часового тренду мембранозв'язаних біоелектричних процесів в ранньому ембріогенезі в'юна // Проблеми патології в експерименті та клініці: Зб. наук. праць. - Львів: Світ, 1998.- т. ХIХ..-С. 96-101.

Гумецький Р.Я., Дика М.В. Модель динаміки мембранних провідностей Na+ та K+ в ранньому ембріогенезі в'юна. // Вісник Львівського університету. Серія біологічна.- Львів, 2000.- Вип. 25. - С. 8-10.

Гумецький Р.Я., Дика М.В. Модель динаміки мембранних біоелектричних процесів в ранньому ембріогенезі в'юна // Тези доп. ІІ з'їзду Українського біофізичного товариства (29 червня - 3 липня 1998).-Харків, 1998.-С.70.

R.Y. Gumetskyi, M.V. Dyka. Modeling of membrane bioelectrical processes dynamics in the early embryogenesis of Misgurnus fossilis // Thesis of the Conference on Physics of Biological Systems (with international participation) (6-11 September, 1998).- Kyiv, 1998.-1c.

Анотація

Дика М. В. Дослідження динаміки мембранозв'язаних біоелектричних процесів ембріональних клітин з використанням комп'ютерного моделювання. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. Львівський національний університет імені Івана Франка, Львів, 2000.

Дослідження динамічних змін електрофізіологічних характеристик зародкових клітин в'юна, що відбуваються після запліднення в період їх синхронних дроблень, проводились на основі часткових моделей (динаміки їх аперіодичного тренду та коливної динаміки провідностей), а також на основі комплексної (об'єднаної) моделі динаміки біоелектричних процесів. Остання відтворює закономірності мембранного транспорту та розподілу електрогенних іонів калію та натрію у їх зв'язку з динамікою біоелектричних показників мембран.

За допомогою комп'ютерного моделювання досліджено динаміку загальних змін електрофізіологічних показників мембрани, а також внутрішньоклітинних концентрацій основних електрогенних іонів. З точки зору відображення часового тренду цих змін запропонована модель адекватна експериментальним даним, які одержані для початкового етапу розвитку ембріональних клітин. Запропоновано також модель динаміки провідностей, яка враховує взаємозалежність між змінами калієвої та натрієвої провідності плазматичної мембрани та їх потенціалозалежність і відтворює періодичні коливання провідності, синхронні з циклами клітинного поділу.

Змодельовано повну картину часових змін основних мембранозв'язаних показників для початкового етапу розвитку зародків в'юна. Отримані результати в співставленні з експериментальними даними підтверджують достатню повноту розробленої математичної моделі та її адекватність певним реальним процесам на початковому етапі розвитку ембріональних об'єктів.

Ключові слова: плазматична мембрана, біоелектричні параметри, часова динаміка, математична модель

Аннотация

Дыка М. В. Исследование динамики мембраносвязанных биоэлектрических процессов эмбриональных клеток с использованием компьютерного моделирования. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. Львовский национальный университет имени Ивана Франка, Львов, 2000.

Мембраносвязанные биоэлектрические процессы, проходящие после оплодотворения яйцеклетки вьюна Misgurnus fossilis L., в период синхронных делений, сопровождаются периодическими колебаниями биоэлектрических показателей на фоне изменений их общего уровня.

Исследования динамических изменений электрофизиологических характеристик зародышевых клеток проводились на частных моделях (динамики их апериодического тренда и колебательной динамики мембранной проводимости), а также на базе комплексной (объединенной) модели динамики биоэлектрических процессов. Последняя отражает закономерности мембранного транспорта и распределения ионов калия и натрия в их связи с динамикой биоэлектрических показателей мембран, в частности, трансмембранного потенциала (ТМП). Математическое описание динамики этих процессов базируется на электрохимической асимметрии, которая поддерживается потоками пассивного и активного транспорта ионов, и отображает изменение уровня поляризации мембраны, ионных потоков и концентраций, на которые накладываются колебания, синхронные клеточным делениям.

Полная модель представлена системой из 15 уравнений (в том числе 4 дифференциальных): уравнение результирующего потенциала мембраны, потенциалзависимости проводимости, пассивных и активных ионных токов и зависимые от них изменения внутриклеточных концентраций основных ионов. Модель также учитывает взаимозависимость натриевой и калиевой ионной проводимости, что обуславливает появление составляющих колебательного характера в этих и других показателях.

С помощью компьютерного моделирования исследована динамика общих изменений электрофизиологических показателей мембраны, а также внутриклеточных концентраций основных ионов. С точки зрения отображения временного тренда этих изменений, предложенная модель адекватна экспериментальным данным, полученным для начального этапа развития эмбриональных клеток. Предложена также модель динамики проводимости плазматической мембраны, которая учитывает взаимозависимость между изменениями калиевой и натриевой проводимостей и их потенциалозависимость, воспроизводит их периодические колебания, синхронные с циклами клеточных делений.

Смоделировано полную картину временных изменений основных мембраносвязанных показателей для начального этапа развития зародышей вьюна. Динамика всех биоэлектрических показателей и внутриклеточных концентраций основных катионов, определена лишь за заданными начальными концентрациями этих катионов (при известных параметрах для объекта моделирования). Полученные результаты в сравнении с экспериментальными данными подтверждают достаточную полноту разработанной математической модели и ее адекватность реальным процессам на начальном этапе развития эмбриональных объектов.

Ключевые слова: плазматическая мембрана, биоэлектрические параметры, временная динамика, математическая модель

Annotation

Dyka М. V. Research of membrane-related bioelectrical processes dynamics in embryo cells using computer modeling. - Manuscript.

Thesis for Ph.D. science degree by speciality 03.00.02 -biophysics. Ivan Franko National University of Lviv, Lviv, 2000.

The research of dynamic changes in electrophysiological characteristics of loach cells embryo which pass after fertilization during synchronous cell divisions, were carried out on individual models (for dynamics of aperiodic trend and for oscillatory dynamics of membrane conductance) and also on the basis of the complex model for bioelectrical processes dynamics. The last one reflects regularity of membrane transport and the distribution of electrogenic potassium and sodium ions in connection with the changes of membrane bioelectrical parameters.

With the help of computer modeling the dynamics of general changes of membrane electrophysiological parameters and also intracellular concentration of basic electrogenic ions is investigated. From the point of view of reflecting the temporary trend in these changes, the model offered is adequate to the experimental data received in the initial stage of embryo cells development. The model for dynamics of membrane conductance which takes into account interdependence between the changes of potassium and sodium conductances is offered also. It also notifies their voltage dependence and displays their periodic fluctuations, synchronous with cycles of cell divisions.

It has simulated a complete picture of temporary changes of basic membrane-related parameters in the initial stage of loach embryo development. The dynamics of all bioelectrical parameters and intracellular concentrations of basic electrogenic cations is determined only using the given initial concentration of these cations under known parametric coefficients for object of modeling. The received results in comparison with experimental data confirm adequacy of the developed mathematical model to real processes on the initial stage of embryonic objects development.

Key words: plasmatic membrane, bioelectrical parameters, temporary dynamics, mathematical model

Размещено на Allbest.ru