Ендогенний протеоліз гістонів та вміст малонового диальдегіду в хроматині клітинних ядер печінки та карциноми Герена щурів

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЧЕРНІВЕЦЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені Юрія Федьковича

УДК 616.006 577.7

ЕНДОГЕННИЙ ПРОТЕОЛІЗ ГІСТОНІВ ТА ВМІСТ МАЛОНОВОГО ДИАЛЬДЕГІДУ В ХРОМАТИНІ КЛІТИННИХ ЯДЕР ПЕЧІНКИ ТА КАРЦИНОМИ ГЕРЕНА ЩУРІВ

03.00.04 - біохімія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Григор'єва Олена Володимирівна

Чернівці 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича Міністерства освіти і науки України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор Марченко Михайло Маркович, Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, м. Чернівці, декан біологічного факультету.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Цудзевич Борис Олександрович, професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка, м. Київ.

доктор біологічних наук, професор Мислицький Валентин Францович, завідувач кафедри патологічної фізіології та біофізики Буковинської державної медичної академії, м. Чернівці

Провідна установа: Харківський національний університет імені В.Н. Каразіна, кафедра біохімії, м. Харків.

Захист відбудеться 05.12.2001р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 76.051.05 при Чернівецькому національному університеті імені Юрія Федьковича (58002, м. Чернівці, вул. Коцюбинського, 2).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Чернівецького національного університету імені Юрія Федьковича (58002, м. Чернівці, вул. Л. Українки, 23).

Автореферат розісланий 03.11.2001р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Копильчук Г.П.

Загальна характеристика роботи

онкозахворювання щур карцинома герен

Актуальність роботи. Вважають, що при розвитку онкозахворювання значну роль відіграють протеолітичні ферменти, які не тільки беруть участь у різних етапах багатоступінчастого процесу канцерогенезу, але і залучені до складного ланцюга взаємовідносин ракової клітини з навколишніми нормальними тканинами і різними регуляторними та захисними системами організму господаря (Локшина Л.А., 1991; Веремеенко К.Г. и соавт., 1986). Протеїнази характеризуються численністю біологічних ефектів і включені, ймовірно, як у порушення контролю росту і формування трансформованого фенотипу ракових клітин, так і в їхню інвазивну активність, здатність до міграції, процеси ангіогенезу (Ровенский Ю.А., 1998; Марченко М.М. і співавт., 1998). Функції окремих протеїназ у більшості з вказаних процесів ще не відомі і є предметом багатьох досліджень.

Сучасна наука робить акцент на генетичних передумовах злоякісної трансформації, проте мало уваги приділяється неспецифічним механізмам генної регуляції. У зв'язку з цим частковий обмежений протеоліз гістонів може бути одним з факторів, що впливає на структурно-функціональний стан хроматину. З іншого боку важливе значення у цій ланці регуляції матричних процесів надається перекисному окисленню ліпідів (ПОЛ) і його вторинному продукту - малоновому диальдегіду (МДА) (Михельсон В.М., 1992). Він має здатність контролювати поділ і транскрипційну активність хроматину через утворення зшивок типу ДНК-ДНК та ДНК-білок (Дмитриев Л.Ф., 1992). Разом з тим, інтенсивне ПОЛ супроводжується накопиченням дисульфідних груп, які є активаторами ряду ядерних протеїназ (Малахова Л.В. и соавт., 1988; Газиев Л.В. и соавт., 1987).

Результати дослідження ядерної протеолітичної активності і ПОЛ за дії ряду генотоксичних факторів (радіації, хімічних канцерогенів, різноманітних блокаторів матричних синтезів) дали можливість припустити існування взаємозв'язку між цими процесами (Газиев А.И. и соавт., 1987; Губский Ю.И. и соавт., 1989).

Отже, актуальним є вивчення та співставлення інтенсивності ендогенного ядерного протеолізу гістонів з динамікою вмісту МДА в хроматині та включенням мічених попередників у РНК та білки, що може стати відображенням структурно-функціонального стану хроматину клітин пухлини та печінки щурів в процесі розвитку онкозахворювання та за дії модуляторів ПОЛ.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась з 1998 до 2001 року на кафедрі біохімії і експериментальної екології Чернівецького національного університету імені Ю.Федьковича і є частиною наукової тематики кафедри ”Дослідження захисних систем організмів в нормі та вражених карциномою Герена при дії опромінення та різних видів хімічних агентів”, № держреєстрації 0197U014415, “Пошук, розробка та рекомендації комплексних природних радіопротекторних та протипухлинних засобів для корекції захисних систем організмів вражених низькими дозами радіації та при канцерогенезі”, № держреєстрації 01.00U005500.

Мета і завдання дослідження. Мета роботи полягала у з'ясуванні особливостей ендогенного протеолізу гістонів та динаміки вмісту МДА в хроматині клітинних ядер, а також включення мічених радіоактивних попередників у РНК і білки печінки та карциноми Герена щурів у процесі розвитку онкозахворювання та за дії модуляторів ПОЛ.

Для досягнення поставленої мети ставились наступні завдання:

1. Вивчити в тканинах печінки та пухлини щурів-носіїв карциноми Герена в процесі розвитку онкозахворювання:

специфічність дії ядерних протеїназ;

зміни вмісту МДА в хроматині клітинних ядер;

включення 3[Н]-уридину в РНК;

включення 14[С]-лейцину в білки;

динаміку активності цитоплазматичних протеїназ.

2. Дослідити вплив фітопрепарату з трав Буковинської флори та кумаринового похідного урацилу на розвиток онкозахворювання та вище названі процеси.

Новизна роботи. Вперше показано:

роль різних груп ядерних протеїназ у забезпеченні ендогенного протеолізу гістонів в клітинах печінки та пухлини в процесі розвитку онкозахворювання та за дії ФПБФ і БКУ;

взаємозв'язок між інтенсивністю ендогенного ядерного протеолізу гістонів, вмістом у хроматині малонового диальдегіду та інтенсивністю включення радіоактивних попередників у РНК печінки та карциноми Герена щурів;

динаміку активності нейтральних та кислих цитоплазматичних протеїназ в клітинах печінки та карциноми Герена в процесі росту пухлини;

вплив модуляторів ПОЛ (фітопрепарату з трав Буковинської флори та кумаринового похідного урацилу) на досліджувані біохімічні показники, які регулюють функціональний стан хроматину клітин печінки та пухлини. Показано, що дія фітопрепарату проявляється у нормалізації вмісту МДА в хроматині клітинних ядер пухлини і печінки. Синтетичний агент викликає зміну специфічності ендогенного ядерного протеолізу гістонів, різке збільшення вмісту МДА в хроматині та пригнічення включення мічених попередників у РНК та білки як клітин печінки так і пухлини.

протипухлинну дію синтетичного засобу, яка проявлялась у редукції біомаси трансплантованої карциноми Герена у щурів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати та їх узагальнення доповнюють і поглиблюють існуючі дані про біохімічні процеси в ядрі що впливають на функціональний стан хроматину. Розширюють уявлення про особливості регуляції матричної активності злоякісних клітин.

Показаний протипухлинний ефект нового синтетичного агенту - кумаринового похідного урацилу, специфічний механізм дії якого пов'язаний із порушенням транскрипційних процесів.

Отримані дані підтверджують припущення про те, що динаміка активності цитоплазматичних протеїназ пухлинних клітин може бути використана у ролі прогностичного тесту розвитку онкозахворювання.

Результати наших досліджень можуть послужити теоретичною основою для розробки нових підходів у скринінгу сучасних протипухлинних препаратів.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку основних теоретичних і практичних положень роботи, проведено аналіз літературних джерел. Дисертантка оволоділа методами біохімічних досліджень і самостійно провела експериментальну частину роботи та обробку фактичного матеріалу з використанням статистичних методів.

Аналіз, обговорення та підготовка до друку матеріалів, що відображають основні результати дисертації проведено спільно з науковим керівником та доцентом кафедри біохімії та експериментальної екології Копильчук Г.П.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на міжнародній конференції “Проблеми сучасної екології” (Запоріжжя, 20-22 вересня 2000); міжнародній конференції “Biorad-2001. Biological effects of low dose ionizing radiation and radioactive pollution on environment” (Сыктывкар, 20-24 марта 2001); науковій конференції “Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в современной биохимии” (Харьков, 16-17 января 2001).; On the International Symposium “Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems” (Kyiv, 9-14 September, 2001).

Публікації. За матеріалами виконаної роботи опубліковано 6 статей і 4 тез доповідей і матеріалів конференцій.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, результатів досліджень та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел (230 найменувань). Робота викладена на 127 сторінках машинописного тексту, проілюстрована 8 таблицями і 14 рисунками.

Основний зміст роботи

Огляд літератури. В огляді літератури розкриваються питання структурно-функціонільної організації хроматину еукаріот, охарактеризовані особливості біології пухлинного росту, а також висвітлені сучасні погляди на лікування ракових захворювань.

Матеріали і методи дослідження. Дослідження проводили на білих безпородних щурах-самцях масою 100-130г. Трансплантацію тваринам карциноми Герена проводили методом підшкірного введення в область стегна 30% суспензії пухлинних клітин у фізіологічному розчині.

Через 6 днів пухлиноносіїв ділили на 3 групи: 1-ша - дослідний контроль (ДК) - щурі-носії карциноми Герена; 2-га - пухлиноносії, які отримували фітопрепарат з лікарських трав Буковинської флори; 3-тя - пухлиноносії, яким вводили кумаринове похідне урацилу. Препарати вводились per os протягом 14 днів. Фітопрепарат являє собою суміш екстрактів лікарських рослин місцевої флори (Сalendula officinalis L., Echinacea purpurea L., Gentiana lutea L., Scorzonera humilis L., Aconitum moldavicum L.) (Марченко М.М. і співавт., 1999; Марченко М.М. і співавт., 2000). Синтетичний агент, вводився тваринам у вигляді суспензії у фізіологічному розчині (Марченко М.М. і співавт., 2000; Ягодинец П.В. и соавт., 1996). Контролем вважали здорових тварин. Декапітацію проводили на 7-му, 14-ту, 21-шу добу після трансплантації карциноми під легким ефірним наркозом.

Ядра з гомогенату тканин печінки і пухлини виділяли із застосуванням неіонного детергенту тритону Х-100 у 0,25М STMK (Горюхина О.А. и соавт., 1979). Чистоту ядер контролювали мікроскопічно.

Суспензію ядер використовували для екстракції ядерних білків (Збарский И.Б., 1988; Чихиржина Г.И. и соавт., 1976). Для визначення специфічності ядерних протеїназ використовували ядра, виділені з печінки здорових щурів і пухлини на 14-ту добу її росту. Протеолітичну активність ядерних білків визначали, реєструючи вміст розчинних у 13%-ній трихлороцтовій кислоті продуктів гідролізу білків-субстратів після інкубації дослідної проби з їх водним розчином (Протас А.Ф. и соавт., 1985).

Для вивчення протеолізу окремих груп гістонів печінки і пухлини суспензії ядер інкубували при 37оС протягом години. Реакцію зупиняли додаванням 5н Н2SO4 до кінцевої концентрації 0,25 н. Кислотні екстракти відокремлювали центрифугуванням при 10000g. Осадження кислоторозчинних білків проводили додаванням до супернатанту 4 об'ємів 95% етилового спирту. Електрофоретичний аналіз гістонів проводили в блоці 20% поліакриламідного гелю з використанням SDS за методом Леммлі (Laemmli U.K., 1970).

Аналіз електрофореграм проводили за допомогою обладнання та програмного забезпечення фірми BIO-RAD (США).

Хроматин виділяли за Уманським (Уманский С.Р. и соавт., 1975).

Визначення кількості МДА проводили з використанням ТБК (Стальная И.Д. и соавт., 1977).

Протеолітичну активність нейтральних протеїназ постнуклеарної фракції клітин печінки та карциноми Герена проводили за модифікованим методом Ансона (ГОСТ 20264.2-74., 1983).

Протеолітичну активність кислих протеїназ визначали за методом Баррета-Хітта (Баррет А.Д. и соавт., 1980).

Концентрацію білка визначали за методом Лоурі (Lowry O.H. et all, 1951).

Виділення РНК в дослідних тканинах проводили за методикою Мармура, що базується на методі Шмідта і Тангаузера (Мешкова Н.П., 1979).

Визначення вмісту РНК проводили за спектрофотометричним методом у модифікації Спіріна А.С. (Мешкова Н.П., 1979).

Рівень біосинтезу визначали за питомою радіоактивністю. Загальна радіоактивність в дослідних пробах була виміряна рідинно-сцинтиляційним методом (Остерман М.А., 1983).

Вірогідність різниці між групами тварин оцінювали з використанням критерію Стьюдента. Коефіцієнт кореляції вираховували за (Рыбин И.А., 1966). Інтенсивність ендогенного ядерного гідролізу гістонів розраховували, приймаючи за 100% кількість гістонових білків, що не піддались протеолізу в контрольної групи тварин.

Результати дослідження та їх обговорення

У відповідь на розвиток карциноми Герена активність хроматинозв'язаних протеїназ в печінці щурів-пухлиноносіїв на 7-у добу з часу прищеплення пухлини знижувалась в 1,2 рази порівняно з нормою, залишаючись на такому рівні впродовж подальшого експерименту (рис. 1).

Електрофоретичний аналіз окремих фракцій гістонів печінки показав (рис. 2), що в здорових тварин частковому ендогенному протеолізу підлягали лінкерні гістони, особливо субфракція Н1о, та коровий гістон - Н3. Поява на електрофореграмі смуг в зоні між Н2А і Н4, а також підвищення інтенсивності забарвлення білкових смуг, що відповідають гістону Н4, очевидно, пов'язані з акумуляцією тут продуктів гідролізу вище зазначених білків, а поява смуги перед Н4 не виключає можливості протеолізу і цієї фракції.

Електрофоретичний профіль гістонових білків ізольованих ядер печінки хворих щурів не виявляв якісних змін у порівнянні зі здоровими тваринами. Відносний вміст гістону Н1 підвищувався в 1,8 рази, знижувалась інтенсивність забарвлення смуг в області між Н2А та Н4. Процентний вміст гістону Н4 максимально наближався до значень на електрофоретичному треку маркерів. Всі наведені вище факти свідчать про зниження рівня гідролізу лінкерної фракції у ядрах печінки пухлиноносіїв. Картина електрофоретичного розподілу гістонів ядер печінки пухлиноносіїв не змінювалась в процесі розвитку онкозахворювання.

В пухлині проходив активніший протеоліз лінкерного гістону (рис. 4), ніж в печінці, про що свідчило зниження відносного вмісту цієї фракції приблизно в 2 рази порівняно з контролем та поява на електрофореграмі нової смуги, що відповідає білку, важчому за Н3. Можливо, в ядрах пухлинних клітин активувалася інша, ніж в печінці, протеїназа, специфічна до Н1.

В ядрах карциноми відбувавcя посилений протеоліз корового гістону Н2А, що пов'язують із дестабілізацією структури самої нуклеосоми (Тюленев В.И. и соавт., 1991).

Отже, наведені результати свідчать, що в ядрах неопластично трансформованих клітин відбувається значна дестабілізація хроматину, що, ймовірно, призводить до дисбалансу в регуляції його функціональної активності.

Застосування модуляторів вільнорадикальних процесів хроматину змінювало загальну активність хроматинозв'язаних протеїназ та протеоліз окремих груп гістонів як в печінці, так і в пухлині (рис.3).

В результаті дії фітопрепарату картина перерозподілу гістонових фракцій ізольованих ядер печінки пухлиноносіїв була максимально наближеною до контролю. Зовсім по-іншому проявлялася дія природного модулятора в пухлині. Результатом його впливу було зниження активності хроматинозв'язаних протеїназ щодо сумарних гістонів (рис. 3). Водночас посилювався протеоліз окремих фракцій: повністю деградував Н1, підвищувався гідроліз гістонів Н3 та Н2А. Можливо, інтенсифікація протеолізу гістонів пухлини за дії фітопрепарату відбуваються за рахунок активації протеїназ, що не належать до групи хроматинозв'язаних.

Отже, фітопрепарат поглиблював деструктивні процеси в хроматині клітин пухлини, нормалізуючи ендогенний ядерний протеоліз в печінці хворих тварин.

Хімічний агент викликав повний дисбаланс молекулярної організації хроматину в ядрах клітин карциноми та печінки пухлиноносіїв.

Результатом дії синтетичного препарату в печінці хворих щурів було підвищення рівня активності гістоноспецифічних протеїназ приблизно в 2,5 рази через 6 діб після його введення (рис. 1). Спостерігалась активація протеолітичних ферментів, специфічних до окремих фракцій (рис. 2): відбувалась повна деградація фракції Н1, причому частина продуктів її гідролізу накопичувалася у вигляді нової білкової смуги. Зменшувався відносний вміст гістонів Н3 та Н2А.

В пухлині інтенсивність протеолізу окремих фракцій гістонів під впливом кумаринового похідного урацилу була вища (рис. 4): повністю зникли білки лінкерної фракції, і з'явились нові білкові смуги в зоні між Н1 та Н3. Відбувався посилений протеоліз всіх корових гістонів.

Отже, в ядрах пухлинних клітин хімічний модулятор викликав значне підвищення активності протеолітичних ферментів, специфічних до гістонових фракцій на фоні зниження рівня гідролізу сумарних гістонів хроматинозв'язаними протеїназами (рис. 3), що, імовірно, відбувалося за рахунок активації ядерних ендогенних протеїназ, не асоційованих з хроматином.

Вміст МДА в хроматині клітин карциноми Герена та печінки щурів-пухлиноносіїв в процесі росту пухлини та при використанні модифікуючих ПОЛ агентів. Нами було показано, що трансплантація карциноми Герена викликає зниження вмісту МДА в хроматині клітин печінки щурів (рис. 5).

Ріст пухлини впродовж 21-єї доби супроводжується зростанням досліджуваного показника і на кінцевому етапі експерименту перевищує контрольні значення на 27%, що може свідчити про підсилення прооксидантного впливу новоутворення на організм пухлиноносія.

Введення фітопрепарату, супроводжується підвищенням вмісту МДА в хроматині цього органу на 14-у добу експерименту і зниженням рівня МДА в 2,5 рази на 21-шу порівняно з групою хворих тварин, що не отримували препарату.

При введенні пухлиноносіям синтетичного препарату відмічене накопичення МДА в хроматині клітин печінки, яке призводить до подвоєння кількості цієї сполуки на кінцевому етапі експерименту порівняно з групою дослідного контролю.

процеси накопичення МДА в тканинах печінки і пухлини різноспрямовані (рис. 5, 6). При вивченні вмісту МДА в хроматині трансформованої тканини спостерігається тенденція до зниження цього показника впродовж досліджуваного періоду.

Природний препарат, що викликає незначне зростання кількості МДА на 14-у добу після трансплантації карциноми, подвоює її на 21-шу порівняно з групою дослідного контролю. При застосуванні хіміопрепарату вже через 7 діб вміст МДА зростає в 3 рази.

Для того, щоб оцінити протипухлинні властивості застосованих нами модуляторів ПОЛ нами були проведені визначення коефіцієнтів мас печінки та пухлини щурів-носіїв карциноми Герена за дії цих агентів. Виявилось, що ріст в організмі щура карциноми Герена протягом 21-єї доби з моменту її трансплантації супроводжується зменшенням маси печінки: наприкінці експерименту печінка втрачала до 20% своєї маси (рис. 7).

Вивчення впливу досліджуваних нами модуляторів ПОЛ показало, що обидва препарати виявляють виражену протипухлинну дію (рис. 8). Однак, морфологічні показники печінки при цьому вказують на значні відмінності у характері дії цих засобів. Так, дія фітопрепарату відзначалась помірним гальмівним впливом на ріст новоутворення і нормалізацією коефіцієнтів мас печінки вже через 7 днів після початку введення тваринам фітопрепарату. Щодо дії синтетичного модулятору ПОЛ (рис. 8) слід відмітити, що він виявив набагато ефективнішу редукуючу дію на розміри карциноми Герена у щурів. Протягом усього часу застосування даного препарату достовірного зростання маси пухлини ми не спостерігали. На 21-шу добу в окремих випадках нами зафіксована повна редукція пухлин. Однак, така значна протипухлинна активність суттєво позначилась на масі печінки пухлиноносіїв - нами зафіксоване достовірне зростання коефіцієнтів мас цього органу.

Включення радіоактивних попередників у біополімери печінки та пухлини щурів-носіїв карциноми Герена в процесі розвитку онкозахворювання та за дії модифікуючих ПОЛ агентів.

Наші дослідження показали (табл. 1, 2), що в клітинах печінки щурів з 1-ої до 7-ої доби після трансплантації карциноми Герена пропорційно збільшується включення радіоактивних попередників у РНК та білки.

Розвиток онкозахворювання характеризується пригніченням синтезу РНК і по відношенню до цього показника, прогресуючим падінням швидкості включення мічених попередників у білки печінки - на 14-ту добу на 47% порівняно з 7-ою добою експерименту, на 21-шу - на 54% порівняно з 14-ою добою.

Застосування фітопрепарату з трав Буковинської флори сприяло активації синтезу РНК у клітинах печінки в 2 рази порівняно з дослідним контролем (табл. 1).

Дія фітопрепарату приводить до підвищення включення 14[С]-лейцину у білки порівняно з дослідним контролем: протягом перших 7 діб інтенсивність підвищується на 82%, а на кінцевому етапі експерименту (21-ша доба) - на 40%.

Семиденне застосування протипухлинного агенту синтетичного походження призводить до зниження інтенсивності включення 3[Н]-уридину в РНК печінки у 2 рази.

За дії кумаринового похідного урацилу включення 14[С]-лейцину у білки печінки також знижується. На 14-ту добу зафіксоване зниження показника на 29%, на 21-шу - на 41% порівняно з групою дослідного контролю.

Отже, динаміка досліджених нами біохімічних і морфологічних показників свідчить про токсичність для печінки щурів застосованого у ролі модифікуючого ПОЛ і протипухлинного засобу хімічного препарату.

Дослідження інтенсивності включення радіоактивних попередників у РНК пухлинної тканини показало, що період росту пухлини з 7-ої до 14-ої доби після трансплантації характеризується зниженням синтезу РНК на 35% (табл. 2). На наступному етапі експерименту змін у рівні досліджуваного показника виявлено не було. Включення мічених попередників у білки карциноми Герена (табл. 2) пригнічується в процесі росту пухлини.

Протипухлинна дія рослинного препарату не відображалась на синтезі РНК та білка в клітинах карциноми Герена. Отже, ми припускаємо, що протипухлинна дія фітопрепарату базується на його цитостатичному ефекті за рахунок присутніх у його складі рослинних алкалоїдів, які є антиметотиками. У цьому разі синтетичні процеси пухлинних клітин змінюватись не будуть, однак значна кількість цих клітин буде зруйнована на стадії мітозу.

Хімічний агент в пухлинних клітинах пригнічував як синтез РНК (14-та доба - на 37% від дослідного контролю, 21-ша доба - на 67% від дослідного контролю у відповідний період експерименту) так і синтез білка (на 38% і 60% відповідно). Такі дані вказують на те, що хіміопрепарат діє на рівні регуляції транскрипції.

Аналіз даних наукової літератури (Мозжухина Т.Г. и соавт., 1996; Протас А.Ф., 1995) та результатів наших досліджень вказує на наявність певного зв'язку між активністю ядерних протеїназ, накопиченням МДА в хроматині та інтенсивністю включення мічених попередників у РНК досліджуваних тканин. Проведений нами кореляційний аналіз (табл. 3) показав, що найтісніший зворотній зв'язок існує між інтенсивністю гідролізу гістонів і накопиченням МДА в хроматині клітин печінки і, особливо, карциноми Герена.

Вагомий вплив на інтенсивність включення мітки у РНК має вміст МДА. Необхідно відмітити, що коефіцієнт кореляції вказує на те, що в печінці між цими показниками існує зворотній опосередкований зв'язок, у той час як в пухлині - прямий.

Увагу привертає зв'язок між інтенсивністю включення мітки у РНК та інтенсивністю гідролізу гістонів. Кореляційний аналіз показав, що в печінці такий зв'язок відсутній, тоді як в пухлині він прямий.

Отже, наші дані показують що між процесами ендогенного ядерного протеолізу гістонів і вмістом МДА в хроматині існує зворотній тісний зв'язок в клітинах досліджуваних тканин. Включення мічених радіоактивних попередників у РНК в більшій мірі пов'язане з вмістом МДА в хроматині, ніж з інтенсивністю ендогенного ядерного протеолізу гістонів в клітинах печінки. Вагомість впливу обох факторів на інтенсивність включення мічених попередників у РНК ракових клітин приблизно однакова.

Активність цитоплазматичних протеїназ печінки та пухлини щурів-носіїв карциноми Герена в процесі розвитку онкозахворювання та за дії модифікуючих ПОЛ агентів. Наші дослідження показали, що постнуклеарна фракція клітин печінки володіє протеолітичною активністю як при нейтральних, так і при кислих значеннях рН (рис. 9, 10). Показано, що в групі пухлиноносіїв активність нейтральних цитоплазматичних протеїназ печінки зростає впродовж усього досліджуваного періоду. Застосування модуляторів ПОЛ приводить до зниження активності нейтральних протеїназ в печінці хворих щурів.

Активність кислих протеолітичних ферментів зростає протягом усього досліджуваного періоду (рис. 10). Застосування лікувального засобу з трав місцевої флори приводить до зниження їх активності на 14-ту і зростання на 21-шу добу експерименту. Отже, природний препарат докорінно не впливає на характер зміни активності кислих протеїназ, а лише знижує темпи її зростання.

Синтетичний агент призводить до різкого зниження активності кислих протеолітичних ферментів. Жоден із застосованих лікувальних засобів впродовж досліджуваного періоду не приводить показник активності кислих цитоплазматичних протеїназ печінки до рівня здорових тварин.

Аналіз динаміки змін активності протеолітичних ферментів печінки при застосуванні лікувальних засобів свідчить про м'якшу, поблажливу дію природного засобу порівняно з хімічним.

В пухлинній тканині зростання активності нейтральних та кислих протеїназ супроводжує весь періоду росту карциноми Герена (рис. 11, 12). Застосування у нашому експерименті лікувальних засобів викликало зниження активності досліджуваних ферментів (рис. 11). Отримані дані щодо активності кислих протеїназ (рис. 12) за дії препаратів вказують на те, що вони є значно чутливішими до дії застосованих лікувальних засобів.

Відмічені зміни ферментативної активності, які корелюють з морфологічними показниками печінки та прогресією пухлини, можуть використовуватися як допоміжні біохімічні параметри при підборі нових лікувальних засобів і вивченні їхнього впливу на організм.

Висновки

1. Між вмістом МДА в хроматині клітин карциноми Герена і печінки щурів та інтенсивністю ендогенного ядерного протеолізу гістонів цих тканин існує зворотній зв'язок. Включення радіоактивних попередників у РНК печінки пов'язане з вмістом МДА в хроматині (r=-0,5577) клітин цього органу. Значення вмісту МДА в хроматині та інтенсивності ендогенного ядерного протеолізу гістонів для включення мічених попередників у РНК пухлини однакове.

2. Ріст трансплантованої карциноми Герена в організмі щура відбувається на фоні зниження гістоноспецифічної протеолітичної активності в клітинних ядрах печінки і не призводить до зміни специфічності гідролізу окремих фракцій гістонів як в печінці так і в пухлині.

3. Вміст МДА в хроматині клітин печінки в процесі росту новоутворення у щурів-носіїв карциноми Герена зростає.

4. В процесі росту пухлини спостерігається активація нейтральних і пригнічення активності кислих цитоплазматичних протеїназ печінки; в процесі росту карциноми Герена активність кислих цитоплазматичних протеїназ ракових клітини знижується.

5. Фітопрепарат з трав Буковинської флори справляє фізіологічну стимулюючу дію на протеолітичні процеси в ядрі та цитоплазмі печінки хворих тварин, нормалізує рівень МДА в хроматині, викликає інтенсифікацію включення мічених попередників у РНК та білки клітин печінки. Фітопрепарат призводить до пригнічення росту карциноми Герена, викликає в цій тканині активацію гістоноспецифічних ядерних ферментів, пригнічує активність цитоплазматичних протеїназ, підвищує вміст МДА в хроматині.

6. Кумаринове похідне урацилу викликає в печінці та пухлині щурів-носіїв карциноми Герена активацію та зміну специфічності ендогенного ядерного протеолізу гістонів, накопичення МДА в хроматині цих тканин, пригнічує активність цитоплазматичних протеїназ та знижує включення мічених попередників у РНК та білки.

Список опублікованих праць за темою дисертації

1. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Григор'єва О.В Активність цитоплазматичних протеаз пухлинної тканини щурів з трансплантованою карциномою Герена за дії лікувальних засобів різної природи // Доповіді Національної академії наук України. 2000. №3. С. 192-194.

2. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Григор'єва О.В. Активність цитоплазматичних протеїназ клітин печінки щурів з трансплантованою карциномою Герена в процесі росту пухлини та за дії лікувальних засобів // Український біохімічний журнал. 2000. №3. С. 15-19.

3. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Григор'єва О.В. Біохімічні аспекти вивчення злоякісних пухлин // Науковий вісник ЧДУ. 1998. С. 26-39.

4. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Григор'єва О.В., Худа Л.В., Васіна Л.М., Николюк І.Д. Окислювальна деструкція та її біологічна противага // Науковий вісник ЧДУ. 2000. В. 77. С. 3-11.

5. Копильчук Г.П., Марченко М.М., Григор'єва О.В. Динаміка зміни протеолітичної активності постнуклеарної фракції клітин пухлинної тканини та печінки щурів з карциномою Герена // Науковий вісник УжДУ. 2000. Вип.8. С. 123-126.

6. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Григор'єва О.В. Вміст МДА в хроматині клітин карциноми Герена та печінки щурів у процесі росту пухлини // Доповіді Національної академії наук України. 2001. №6. С. 168-172.

7. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Худа Л.В., Григор'єва О.В. Вміст МДА та продуктів окислювальної модифікації білків в хроматині клітин печінки щурів-пухлиноносіїв за дії хронічного опромінення // Тези доп. Міжнар. конф. “Проблеми сучасної екології”, Запоріжжя, 2000. С. 79.

8. Влияние малых доз рентгеновского излучения на активность ядерных протеиназ клеток карциномы Герена у крыс // Тезисы докл. междунар. конфер. “Biorad-2001. Biological effects of low dose ionizing radiation and radioactive pollution on environment”, Сыктывкар, 2001. С. 219-221.

9. Марченко М.М., Копильчук Г.П., Григор'єва О.В. Специфічність ядерних протеїназ клітин карциноми Герена в щурів // Тез. докл. научной конфер. “Научное наследие академика И.Н. Буланкина и его развитие в современной биохимии”, Харьков, 2001. С. 49-50.

10. Kopilchuk G.P., Grigorieva H.L. The insertion of radioactive precursors in RNA and proteins of tumour of rats-carriers of Heren's carcinoma // Abstracts of International Symposium “Intracellular Signaling in Plant and Animal Systems”, Kyiv, 2001. P. 45.

Анотація

Григор'єва О.В. Ендогенний протеоліз гістонів та вміст малонового диальдегіду в хроматині клітинних ядер печінки та карциноми Герена щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Чернівецький національний університет імені Юрія Федьковича, Чернівці, 2001р.

Дослідження присвячене вивченню особливостей ендогенного ядерного протеолізу гістонів та динаміки вмісту МДА в хроматині клітинних ядер печінки та пухлини, а також впливу цих показників на активність хроматину через включення мічених попередників у РНК і білки печінки та карциноми Герена щурів у процесі розвитку онкозахворювання та за дії модуляторів ПОЛ.

У результаті досліджень встановлено, що ріст трансплантованої карциноми Герена у щурів відбувається на фоні зниження гістоноспецифічної активності в клітинних ядрах печінки та пухлини і не призводить до зміни специфічності гідролізу окремих фракцій гістонів цих тканин.

Показано, що вміст МДА в хроматині клітин печінки в процесі росту новоутворення зростає, а в хроматині пухлини не змінюється.

Виявлено, що між вмістом МДА в хроматині клітин карциноми Герена і печінки щурів та інтенсивністю ендогенного ядерного протеолізу гістонів цих тканин існує зворотній зв'язок. Включення радіоактивних попередників у РНК печінки в більшій мірі пов'язане з вмістом МДА в хроматині ніж з інтенсивністю ендогенного ядерного протеолізу гістонів. Значення обох досліджуваних показників на включення мічених попередників у РНК пухлини однакове.

В процесі росту пухлини спостерігається активація нейтральних і пригнічення активності кислих цитоплазматичних протеїназ печінки; в процесі росту карциноми Герена активність нейтральних цитоплазматичних протеїназ ракових клітини не змінюється, а кислих - знижується.

Фітопрепарат з трав Буковинської флори справляє фізіологічну стимулюючу дію на протеолітичні процеси в ядрі та цитоплазмі печінки хворих тварин, нормалізує рівень МДА в хроматині, викликає інтенсифікацію включення мічених попередників у РНК та білки клітин печінки. Фітопрепарат призводить до пригнічення росту карциноми Герена, викликає в цій тканині активацію гістоноспецифічних ядерних ферментів, пригнічує активність цитоплазматичних протеїназ, підвищує вміст МДА, не впливає на інтенсивність включення радіоактивних попередників у РНК та білки.

Кумаринове похідне урацилу викликає в печінці та пухлині щурів-носіїв карциноми Герена активацію та зміну специфічності ендогенного ядерного протеолізу гістонів, накопичення МДА в хроматині цих тканин, пригнічує активність цитоплазматичних протеїназ та знижує включення мічених попередників у РНК та білки.

Ключові слова: гістони, ядерні протеїнази, малоновий диальдегід, цитоплазматичні протеїнази, функціональний стан хроматину, онкогенез.

Аннотация

Григорьева Е.В. Эндогенный протеолиз гистонов и содержание малонового диальдегида в хроматине клеточных ядер печени и карциномы Герена крыс.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.04 - биохимия. - Черновицкий национальный университет имени Ю. Федьковича, Черновцы, 2001г.

Исследование посвящено изучению особенностей эндогенного ядерного протеолиза гистонов и динамики содержания МДА в хроматине клеточных ядер печени и опухоли, а также влиянию этих показателей на активность хроматина посредством включения меченых посредников в РНК и белки печени и карциномы Герена крыс в процессе развития онкозаболевания и при действии модуляторов ПОЛ.

В результате изучения установлено, что рост трансплантированной карциномы Герена у крыс происходит на фоне снижения гистоноспецифической активности в клеточных ядрах печени и опухоли и не приводит к изменению специфичности гидролиза отдельных фракций этих тканей. В интактных ядрах печени гидролизу поддаются гистоны Н1 и Н3, тогда как в опухоли - Н1, Н3 и Н2А.

Показано, что содержание МДА в хроматине клеток печени в процессе роста новообразования возрастает, а в хроматине опухоли не изменяется.

Выявлено, что между содержанием МДА в хроматине клеток карциномы Герена и печени крыс и интенсивностью эндогенного ядерного протеолиза гистонов этих тканей существует обратная связь. Включение радиоактивных предшественников в РНК печени в большей мере связано с содержанием МДА в хроматине, чем с интенсивностью эндогенного ядерного протеолиза гистонов. Значение обоих исследованных показателей на включение меченых предшественников в РНК опухоли одинаковое.

В процессе роста опухоли наблюдается активация нейтральных протеиназ и угнетение кислых цитоплазматических протеиназ печени; в раковых клетках активность нейтральных цитоплазматических протеиназ не изменяется, а кислых - снижается.

Фитопрепарат из трав Буковинской флоры оказывает физиологическое стимулирующее действие на протеолитические процессы в ядре и цитоплазме печени пораженных животных, нормализует уровень МДА в хроматине, вызывает интенсификацию включения меченых предшественников в РНК и белки клеток печени. Фитопрепарат приводит к угнетению роста карциномы Герена, вызывает в этой ткани активацию гистоноспецифических ядерных протеиназ, угнетает активность цитоплазматических протеиназ, повышает содержание МДА в хроматине, не влияет на включение радиоактивных предшественников в РНК и белки.

Кумариновое производное урацила вызывает в печени и опухоли крыс-носителей карциномы Герена активацию и изменение специфичности эндогенного ядерного протеолиза гистонов, накопление МДА в хроматине этих тканей, угнетает активность цитоплазматических протеиназ и снижает интенсивность включения радиоактивных предшественников в РНК и белки.

Ключевые слова: гистоны, ядерные протеиназы, малоновый диальдегид, цитоплазматические протеиназы, функциональное состояние хроматина, онкогенез.

The summary

Grigorieva H.V. Endogenous proteolysis of the histones and MDA content in chromatin of liver cell nuclei and Heren`s carcinoma of the rats.- The manuscript.

Thesis submitted for a candidate's degree in biological sciences on in speciality 03.00.04 - biochemistry. - Chernovtsi national university of a name of Y. Fedkovich, Chernovtsi, 2001y.

The research explores the features of the histones nuclear endogenous proteolysis and the dynamics of the MDA contents in chromatin of cell nuclei in liver and tumor as well as the influence of these parameters on the activity of chromatin by means of the inclusion of the radioactive precursors in RNA and proteins of liver and tumor in rats-carriers of Heren's carcinoma during the development of tumor-disease and under the action of POL modulators.

As a result of the study it is established that the growth of the transplanted Heren's carcinoma in rats occurs on the background of decrease in histone-specific activity in cell nuclei of liver and tumor and does not result in the change of the specificity of hydrolysis of separate fractions of these tissues. In liver intacted nuclei Н1 and Н3 histones are hydrolyzed, whereas in tumor - Н1, Н3 and Н2А.

It is shown that the MDA contents in liver chromatin increases with tumor growth and does not reveal any change in tumor chromatin.

I is revealed that there is a feedback between the MDA contents in chromatin of both Heren's carcinoma cells and liver cells in rats and the intensity of endogenous nuclear proteolysis of histones of these tissues. The inclusion of the radioactive predecessors in liver RNA is connected rather with the MDA contents in chromatin than with intensity of endogenous nuclear proteolysis of histones. The meaning of both investigated parameters on the inclusion of the radioactive predecessors in tumor RNA is identical.

During the tumor growth the activation neutral proteases and the oppression of liver acidic cytoplasm proteases are observed; in tumor tissues the activity of neutral cytoplasm proteases does not change, while that of acidic is reduced.

Phitopreparation from grass of Bucovinian flora renders physiological stimulating action on proteolytic processes in the liver nucleus and cytoplasm of the affected animals, normalizes the MDA level in chromatin, causes the intensification of inclusion of the radioactive predecessors in RNA and proteins of liver cells. Phitopreparation results in the oppression of Heren's carcinoma growth, causes in this tissues activation of histone-specific nuclear proteases, oppresses the activity of cytoplasm proteases, raises the MDA contents in chromatin, does not influence the inclusion of the radioactive predecessors in RNA and proteins.

Cumarin derivative of uracil causes in the liver and tumor of rats-carriers of Heren's carcinoma the activation and change of specificity of endogenous nuclear proteolysis of histones, the accumulation of MDA in chromatin of these tissues, oppresses activity of cytoplasm proteases and reduces the intensity of the radioactive predecessors inclusion in RNA and proteins.

Key words: histones, nuclear proteases, malonil dialdegid, cytoplasm proteases, chromatin functional condition, oncogenes.

Размещено на Allbest.ru

...