Размеры всех объектов, являющихся предметом изучения микробиологии, лежат далеко за пределами разрешающей способности человеческого глаза. Поэтому одним из главных методов исследования в области микробиологии является микроскопия. Основу микроскопических методов исследования составляют световая микроскопия со всеми ее разновидностями и электронная микроскопия. Выбор метода определяется целями, стоящими перед исследователем.

1.1 Иммерсионная световая микроскопия

Микроскопический метод исследования предусматривает наблюдение за живыми и убитыми микробами в окрашенном и неокрашенном состоянии.

Различают простые и сложные способы окраски. Первые основаны на применении какой-либо одной краски, например, метиленового синего или фуксина. Вторые предусматривают воздействие на один и тот же препарат двух и более красок. Сложные методы окраски позволяют обнаруживать в теле микробной клетки различные структурные элементы (капсулы, споры, включения), помогают дифференцировать сходные по величине и форме бактерии, принадлежащие к различным группам [1].

2.1 Микроскопия микроорганизмов в живом состоянии

Для изучения формы и выявления подвижности бактерии изучают в живом состоянии в препаратах раздавленной или висячей капли.

Раздавленная капля. На предметное стекло наносят каплю бульонной культуры. При обильном росте микробов культуру предварительно разводят стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Нанесенную на предметное стекло каплю раздавливают. Для этого покровное стекло ставят на ребро у края капли и опускают, постепенно вытесняя воздух, находящийся между предметным и покровным стеклами, чтобы избежать образования в ней пузырьков воздуха. В правильно приготовленном препарате раздавленной капли стекла плотно склеиваются и жидкость тончайшим слоем заполняет пространство между ними, не выступая за края покровного стекла.

Висячая капля. На середину необезжиренного покровного стекла наносят небольшую, с четкими краями каплю бульонной культуры. Каплю материала покрывают предметным стеклом с лункой, края которой предварительно смазывают вазелином. Предметное стекло с прилипшим к нему покровным стеклом перевертывают. Капля оказывается висячей в герметически закрытой влажной камере, из которой жидкость испаряется очень медленно и поэтому препарат долгое время остается пригодным для наблюдения [2].

Метод висячего агарового слоя. Для приготовления препаратов живых клеток типа «висячая капля» существует хорошее приспособление -- пластина из прозрачной пластмассы с высверленным в центре отверстием, имеющим диаметр около 1 см. Покровное стекло с висящей на нем каплей помещают над отверстием, а для того, чтобы стекло удерживалось на месте, на его край наносят каплю иммерсионного масла или воды. Подобным образом к стеклу можно прикрепить тонкий слой агара с растущей культурой или островками колоний, размазанных по стерильной находящейся рядом с ними поверхности. Образуемую отверстием камеру можно закрыть, прикрепив снизу покровное стекло.

Негативное окрашивание. Этот вид окрашивания дает возможность самыми простыми, а зачастую и самыми быстрыми способами получить информацию о преломляющих свет включениях, таких, как сера или гранулы поли-в-оксимасляной кислоты, и о спорах. При его осуществлении взятый петлей 7%-й водный нигрозин (или тушь, или конго красный) тщательно перемешивают с бактериальной суспензией на покровном стекле, размазывают смесь до образования тонкой пленки и высушивают на воздухе. Затем кладут покровное стекло на предметное пленкой вниз и фиксируют его положение одной-двумя каплями свечного воска. В приготовленных подобным образом препаратах, содержащих вместо заливки воздушный слой, бактерии не прокрашиваются и выделяются на темно-синем фоне ярким свечением. В дальнейшем они даже могут быть использованы в работах по изучению характера и степени разрушения клеток. Негативно окрашенные препараты не следует применять для измерения длины и ширины клеток, так как вокруг клеточной стенки может находиться капсула или слой слизи. Более того, отрицательно заряженные частицы коллоидного нигрозина не реагируют с клеточной поверхностью, поскольку при физиологических значениях рН последняя также заряжена отрицательно. При высыхании коллоидной пленки благодаря одинаковому заряду коллоидных частиц и бактерий черный край высыхающей пленки находится на относительно значительном, хотя и маленьком абсолютно расстоянии от истинной границы клетки. В результате видимый размер бактерии оказывается больше, чем действительный, даже если нет капсулы.

В растворах нигрозина могут появиться посторонние микроорганизмы; предотвратить это помогает небольшая добавка формальдегида, не ухудшающая свойств раствора [1].

2.2 Окрашенные препараты

Для изучения микроорганизмов в окрашенном виде на предметном стекле делают мазок, высушивают, фиксируют его и после этого окрашивают.

Приготовление мазков. Исследуемый материал распределяют тонким слоем по поверхности предметного хорошо обезжиренного стекла. Мазки готовят из культур микробов, патологического материала (мокрота, гной, моча, кровь и др.) и из органов трупов.

Техника приготовления мазков определяется характером исследуемого материала.

1. Приготовление мазков из микробных культур с жидкой питательной среды. Маленькую каплю исследуемой жидкости наносят бактериальной петлей на предметное стекло и круговыми движениями петли распределяют равномерным слоем в виде кружка диаметром в копеечную монету.

2. Приготовление мазка из культур с плотных питательных сред. На середину чистого, хорошо обезжиренного стекла наносят каплю водопроводной воды, в нее вносят бактериальную петлю с небольшим количеством исследуемой микробной культуры так, чтобы капля жидкости стала слегка мутноватой. После этого излишек микробного материала на петле сжигают в пламени горелки и приступают к приготовлению мазка по описанному выше способу.

3. Приготовление мазков из органов и тканей. Поверхность органа с целью обеззараживания прижигают накаленными браншами пинцета, делают по этому месту надрез и из глубины остроконечными ножницами вырезают небольшой кусочек ткани, который помещают между двумя предметными стеклами.

Высушивание и фиксирование мазков. Приготовленный на предметном стекле мазок высушивают на воздухе и после полного высыхания фиксируют. При фиксировании мазок закрепляется на поверхности предметного стекла, и поэтому при последующей окраске препарата микробные клетки не смываются. Кроме того, убитые микробные клетки окрашиваются лучше, чем живые.

Различают физический способ фиксации, в основу которого положено воздействие высокой температуры на микробную клетку, и химические способы, предусматривающие применение химических средств, вызывающих коагуляцию белков цитоплазмы.

Физический способ фиксации. Предметное стекло с препаратом берут пинцетом или I и II пальцами правой руки за ребра мазком кверху и плавным движением проводят 2--3 раза над верхней частью пламени горелки. Весь процесс фиксации должен занимать не более 2 с. Надежность фиксации проверяют следующим простым приемом: свободную от мазка поверхность предметного стекла прикладывают к тыльной поверхности левой кисти. При правильном фиксировании мазка стекло должно быть горячим, но не вызывать ощущения ожога.

Химический способ фиксации. Для фиксации мазков применяют также химические вещества и соединения (табл. 1). Предметное стекло с высушенным мазком погружают в склянку с фиксирующим веществом и затем высушивают на воздухе.

Таблица 1.

Окраска мазков красящей бумагой. На высушенный и фиксированный препарат наносят несколько капель воды, кладут окрашенные бумажки величиной 2X2 см. В течение всего времени прокрашивания бумага должна оставаться влажной и плотно прилегать к поверхности стекла. При подсыхании бумагу дополнительно смачивают водой. Продолжительность окрашивания мазка определяется методом окраски. По окончании окраски бумагу осторожно снимают пинцетом, а мазок промывают водопроводной водой и подсушивают на воздухе или фильтровальной бумагой.

Окраска растворами красителей. На высушенный и фиксированный препарат пипеткой наносят краситель в таком количестве, чтобы он покрывал весь мазок. При окраске мазков концентрированными растворами красителей (карболовый фуксин Циля, карболовый генциановый или кристаллический фиолетовый) окрашивание производят через фильтровальную бумагу, задерживающую частицы красителя: на фиксированный мазок кладут полоску фильтровальной бумаги и на нее наливают раствор красителя [2].

2.3 Сложные (дифференциальные) методы окраски мазков

Сложные методы окраски основаны на особенностях физико-химического строения микробной клетки. Сущность этих методов заключается в воздействии на мазок двух красящих веществ, из которых одно является главной (основной) краской, а другое -- дополнительной (контрастной). После воздействия первой краской мазок обесцвечивают и только после этого подвергают дополнительной окраске. В качестве обесцвечивающих веществ может быть применен целый ряд химических реагентов (кислоты, щелочи, спирт, ацетон и др.). Промывание мазка простой водой также является чисто механическим процессом обесцвечивания, но для этого необходимо продолжительное время; кроме того, обесцвечивание получается неполным. По отношению к обесцвечивающим веществам можно разбить микробов на группы легко и трудно обесцвечиваемых. Не все виды микробов одинаково относятся к обесцвечивающим реагентам; некоторые являются кислотоустойчивыми и спиртоустойчивыми, другие только кислотоустойчивыми. Наконец, некоторые, например, споры, энергично противостоят воздействию всех обесцвечивающих веществ и относятся к группе краскоустойчивых.

Сложные методы окраски имеют важное дифференциальнодиагностическое значение для характеристики изучаемого микроба.

2.3.1 Окраска по Граму

Окраска бактерий по грамму - метод дифференциальной окраски клеток прокариот, разработанный датским микробиологом Х.Грамом в 1884 году. Он заключается в последовательной обработке мазка клеток основными красителями (кристаллическим фиолетовым) и йодом с последующим отмыванием его в этаноле или ацетоне. В зависимости от свойств клеточной стенки бактерий красители могут удерживаться ими в разной степени. Бактерии, сохраняющие окраску после обработки растворителями, получили название грамположительных (Гр+), а обесцвечивающиеся - грамотрицательных (Гр-) [6].

Техника окраски. На фиксированный жаром мазок кладут полоску фильтровальной бумаги величиной немного короче и уже предметного стекла, наливают на нее достаточное количество раствора кристаллвиолета, карболового или же анилинового раствора генцианвиолета, на 1--2 минуты. Затем краску сливают, удаляют полоску фильтровальной бумаги и, не смывая водой, наливают на мазок раствор Люголя на 1--2 минуты. Раствор сливают и обесцвечивают препарат в 96° спирте в течение 30--60 секунд, промывают водой и окрашивают дополнительно фуксином Пфейффера (или разведенным сафранином, нейтральротом или везувином) в течение 2 минут. Затем краску смывают водой, а мазок высушивают чистой фильтровальной бумагой.

Микроскопическая картина: при правильной окраске мазков по Граму грамположительные микробы будут окрашены в темно-фиолетовый цвет, а грамотрицательные -- в цвет дополнительной краски (например, в розовый цвет фуксина Пфейффера) [1].

В настоящее время более широкое применение в практике бактериологических исследований находит видоизмененный способ окраски Грама по Синеву.

Основной краситель в виде раствора заменяют фильтровальной бумагой, пропитанной 1%-м спиртовым раствором кристаллического фиолетового. На препарат помещают красящую бумажку и наносят на нее 2--3 капли воды. Окрашивание идет в течение 1--2 мин. Затем бумажки снимают и дальнейшую окраску препарата ведут общепринятым способом [2].

2.3.2 Выявление кислотоустойчивости

Кислотоустойчивость -- свойство, характерное для некоторых микобактерий (нокардий). Оно заключается в сохранении окраски клетками этих бактерий при обработке их кислотой. Кислотоустойчивость обусловлена особенностями химического состава клеточной стенки вышеупомянутых бактерий: высоким содержанием в ней сложных, липидов и, в частности, наличием миколовых кислот.

Наибольшее распространение получил способ выявления кислотоустойчивости по Цилю -- Нильсену. На обезжиренном предметном стекле готовят два мазка: исследуемых клеток и клеток кислотоустойчивых микобактерий. Препарат высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. На мазки помещают «фильтровальную бумагу, заливают препарат карболовым фуксином Циля и затем 2--3 раза подогревают его до появления паров, держа стекло высоко над пламенем горелки. За появлением паров наблюдают, глядя на мазок сбоку, и при их появлении тотчас отставляют препарат в сторону. После этого препарату дают остыть, снимают фильтровальную бумагу, сливают краситель и мазок промывают водой. Затем препарат обесцвечивают 5%-ным раствором H₂SO₄. Для этого предметное стекло погружают 2--3 раза в стакан с кислотой, не задерживая его в ней. Препарат вновь тщательно промывают водой и докрашивают 3--5 мин метиленовым синим по Леффлеру. Краску сливают, препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной системой. При строгом соблюдении режима окраски кислотоустойчивые клетки приобретают красный цвет, тогда как некислотоустойчивые клетки -- синий. Кислотоустойчивость можно определить у клеток любого возраста [3].

2.3.3 Окраска спор

Неокрашенные споры живых бактерий имеют при наблюдении в обычный микроскоп черное обрамление и ярко светятся в плоскости, находящейся немного выше положения истинного фокуса. Не следует считать, однако, что любая сильно преломляющая свет структура внутри бактерии -- это эндоспора, особенно если отсутствует информация о теплоустойчивости.

Прямой тест на присутствие эндоспор возможен благодаря явлению, которое наблюдается во многих эндоспорах после погружения в окислитель в кислой среде (например, 0,1% КМn0₄ в 0,3н HNOз или 0,3н НСl). При этом оболочка споры теряет целостность, а часть ее протоплазмы, теперь легко окрашиваемая основными красителями, выпячивается наружу через образовавшуюся брешь. Этот тест удобно проводить, помещая высушенную на покровном стекле пленку спор на 10--20 минут в раствор окислителя; «лопнувшие» споры видны без окраски, хотя последняя делает их более легко различимыми.

Имеется несколько удовлетворительных методов для окрашивания эндоспор в бактериях. При использовании простейшего из них -- негативного окрашивания -- получают нефиксированные препараты, материал которых имеет негативный вид. Для осуществления метода взятый петлей 7%-й водный нигрозин смешивают на покровном стекле с набранной петлей культурой, смесь распределяют в виде тонкой пленки и высушивают на воздухе. Покровное стекло переворачивают пленкой вниз, помещают на предметное стекло и закрепляют в нескольких местах свечным воском. Эндоспоры выглядят, как сильно преломляющие свет сферические или эллипсоидальные образования, находящиеся как внутри, так и за пределами клеток бактерий.

Метод окрашивания эндоспор по Дорнеру

1. Образец, фиксированный нагреванием на предметном стекле, высушивают на воздухе и покрывают квадратным кусочком фильтровальной бумаги или салфетки, подогнанным по размеру стекла.

2. Насыщают бумагу раствором карболового фуксина и выпаривают его 5--10 минут, как описано выше, поддерживая влажное состояние добавлением красителя по мере испарения. Выпаривать можно и по-другому, помещая стекла на штатив, находящийся над емкостью с кипящей водой.

3. Удаляют промокательную бумагу и обесцвечивают мазок смесью кислоты и спирта в течение 1 минуты. Промывают водопроводной водой и подсушивают промокательной бумагой.

4. Высушивают тонкий, нанесенный на предметное стекло слой водного насыщенного раствора нигрозина и просматривают стекло в микроскоп (раствор нигрозина готовят следующим образом: смесь 10 г нигрозина и 100 мл дистиллированной воды погружают на 30 минут в кипящую воду, охлаждают и для лучшего хранения добавляют 0,5 мл формалина; перед использованием смесь фильтруют).

Вегетативные клетки бесцветны, эндоспоры окрашены в красный цвет, а фон -- в черный.

В модифицированном методе Дорнера смешивают в пробирке водную суспензию бактерий с равным объемом карболового фуксина. Пробирки опускают на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем набранный петлей 7%-й водный нигрозин смешивают на покровном стекле с небольшим количеством (одна петля) подвергшейся нагреванию суспензии бактерий; после подсушивания на воздухе образуется тонкий мазок. Результаты получают те же, что указаны выше, но методика менее трудоемкая.

Метод окраски эндоспор по Шефферу-Фултону

В этом методе вместо карболового фуксина применяется 0,5%-ный водный малахитовый зеленый. Образец высушивают на воздухе на предметном стекле, фиксируют нагреванием, покрывают промокательной бумагой или бумажной салфеткой, пропитанной до насыщения красителем, и помещают на 5 минут над кипящей водой. Стекло промывают водопроводной водой, и мазок дополнительно окрашивают 30 секунд сафранином, как при окраске по Граму. Затем вновь промывают и подсушивают мазок промокательной бумагой. Эндоспоры окрашиваются в ярко-зеленый цвет, а вегетативные клетки -- в красно-коричневый [5].

Метод Виртца в модификации Саватеева

К насыщенному водному раствору (около 5%) малахитовой зелени добавляют 5% глицерина, пропитывают смесью полоски фильтровальной бумаги и высушивают их (лучше при 50°С). Затем готовят 0,5%-й водный раствор сафранина, которым смачивают другие полоски фильтровальной бумаги, и высушивают. Сохраняют окрашенные бумажки в закрытых банках в защищенном от солнечного света месте.

Техника окраски. На фиксированный над пламенем мазок наносят 2--3 капли дистиллированной воды и накладывают полоску бумаги, окрашенной малахитовой зеленью. Препарат нагревают над пламенем до появления паров (3--4 раза), приблизительно в течение минуты. При испарении добавляется вода. После остывания препарата смывают краску с бумажкой струей водопроводной воды (30 секунд), и тотчас же на мокрую поверхность препарата кладут бумажку, окрашенную сафранином. Если необходимо, добавляют несколько капель воды. Через 30--40 секунд мазок промывают водой, высушивают и микроскопируют.

Микроскопическая картина: свободно лежащие споры -- зеленовато-голубого цвета, споры внутри микробных клеток -- темно-зеленые, вегетативные формы микробов -- красные.

Модификация Шеффер и Фултона

1. На фиксированный в пламени мазок наливают насыщенный (5%) водный раствор малахитовой зелени на 3 0--60 секунд с подогреванием до появления паров (3--4 раза).

2. Краску смывают текущей водой 30--40 секунд.

3. Наливают 0,5% водный раствор сафранина приблизительно на 30 секунд.

4. Промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу.

Микроскопическая картина: споры -- зеленые, вегетативные формы -- красные [1].

Метод Циля-Нильсена в модификации Мюллера

До фиксации мазка на пламени препарат готовят обычным способом. Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат наносят 5 %-й раствор хромовой кислоты. Через 5--10 мин кислоту смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги, обильно смачивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Так в течение 7 мин. При этом важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой.

В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются. Далее обесцвечивают цитоплазму клеток, обрабатывая препарат 1 %-м раствором соляной или серной кислоты 15--30 секунд. При приготовлении препарата спор Bacillus mycoides или В. mesentericus рекомендуется обесцвечивать цитоплазму 16--18 с. При превышении этого времени может обесцветиться и спора.

Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим 2 мин. Если все операции проделаны правильно, окраска получается контрастной, и споры ярко-красного цвета будут четко выделяться на голубом фоне цитоплазмы.

Метод Пешкова

На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до кипения и кипятят 15--20 секунд, держа над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5 %-м водным раствором нейтрального красного. Снова промывают, подсушивают и исследуют препарат с масляной иммерсией объектива. Споры получаются голубые или синие, цитоплазма - розовая.

Для исследования спор хорошими объектами могут служить культуры Bacillus mesentericus и В. mycoides в возрасте четырех суток.

Реактивы для окрашивания спор бактерий:

1. Карболовый фуксин Циля

2. Метиленовый синий Леффлера

3. Метиленовый синий, насыщенный водный раствор: 2 г красителя и 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5 %-й раствор.

5. Соляная (или серная) кислота, 1 %-й раствор [4].

Способ Ауески

На приготовленный, высушенный на воздухе (нефиксированный) мазок наливают 1--2% водный раствор соляной кислоты и подогревают на пламени до появления паров (3--4 раза). Затем препарат промывают водой, высушивают через фильтровальную бумагу, фиксируют на пламени и окрашивают карболовым раствором фуксина при нагревании (до появления паров) в течение 3--5 минут. Потом препарат обесцвечивают 5% водным раствором серной кислоты в течение нескольких секунд (до бледно-розовой окраски), промывают водой и дополнительно окрашивают леффлеровской метиленовой синькой или 1% водным раствором малахитовой зелени в течение 2 минут. Краску смывают водой, мазок высушивают.

Микроскопическая картина; споры -- красные, вегетативные формы -- синие (или зеленые).

Способ Клейна

1. готовят в пробирке густую эмульсию путем смыва исследуемой культуры физиологическим раствором,

2. к эмульсии прибавляют равное количество карболового раствора фуксина,

3. пробирку со смесью нагревают на пламени до появления паров в течение 5 минут;

4. из прогретой смеси приготовляют мазок, высушивают его и фиксируют;

5. обесцвечивают 1% водным раствором серной кислоты в течение 5-10 секунд;

6. промывают водой; подсушивают;

7. окрашивают Леффлеровской синькой на протяжении 1-3 минут;

8. смывают водой и мазок обсушивают.

Микроскопическая картина: споры -- красные, вегетативные формы -- синие. Недостаток способа -- значительный расход краски (фуксина) [1].

2.3.4 Цитоплазматические включения

У многих бактерий, выращиваемых в определенных условиях, в результате обменных процессов в цитоплазме образуются отложения, которые называют включениями. Среди них -- отложения жира, поли-в-оксимасляной кислоты, полифосфата, крахмалоподобных полисахаридов, серы и различных кристаллов. Некоторые из них представляют собой полимеризованные ненужные продукты, а другие можно отнести к запасам питательных веществ. Для выявления этих включений, которые к тому же преломляют свет, применяется несколько методик окраски.

Окрашивание полифосфата

Включения, состоящие из неразветвленных структур с элементным составом, выявляют следующим образом:

1. Мазок на предметном стекле фиксируют нагреванием.

2. Окрашивают его в течение 10--30 секунд в растворе метиленового синего по Леффлеру, или в 1%-м толуидиновом синем.

3. Отмывают краситель водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

При окраске метиленовым синим гранулы полифосфата выглядят шариками, имеющими цвет от синего до фиолетового, а вся остальная цитоплазма окрашивается в светло-голубой цвет. Толуидиновый синий окрашивает метахроматически, и гранулы имеют красный цвет на фоне голубой цитоплазмы [1].

Окраска зерен волютина

Зерна волютина (запасные вещества полифосфатной природы) можно обнаружить в клетках многих микроорганизмов.

В неокрашенном состоянии крупные зерна волютина выделяются от остальной плазмы большей светопреломляемостью. Однако лучше наличие зерен волютина определяется в окрашенных препаратах. Для обнаружения зерен волютина применяется окраска метиловой синью по Леффлеру. Зерна волютина при этом окрашиваются в сине - фиолетовый цвет, а протоплазма - в голубой.

Окраска зерен волютина по Нейссеру.

Методика окрашивания:

1. Фиксированный на пламени горелки мазок окрашивают 1--2 мин. синькой Нейссера.

2. Синьку сливают, на препарат наносят несколько капель раствора Люголя на 1 мин.

3. Мазок промывают водой, подсушивают фильтровальной бумагой.

4. Докрашивают в течение 2 мин. раствором хризоидина или 1--3 мин. раствором везувина.

5. Промывают водой, подсушивают и микроскопируют [8].

При окраске по способу Нейссера зерна волютина окрашиваются в синий или темно - коричневый цвет, а протоплазма - в светло - коричневый.

Окраска по способу Омелянского

Методика окрашивания:

1. на фиксированный мазок наливают карболовый фуксин Циля на 30 секунд;

2. после этого краску сливают, препарат промывают водой и обесцвечивают в течение 30--40 секунд 1% раствором серной кислоты;

3. затем кислоту сливают, препарат промывают водой и докрашивают метиловым синим в разведении 1:40 в течение 30 секунд;

4. после промывки водой препарат высушивают и микроскопируют.

Зерна волютина при этом способе окраски окрашиваются в сиренево - красный цвет и хорошо видны на фоне синей цитоплазмы [7].

Окрашивание полисахаридов с использованием реактива Шиффа

Этим методом выявляют гликогеноподобные вещества.

1. Мазок суспензии на предметном стекле фиксируют нагреванием.

2. На 5 минут на стекло наносят раствор перйодата [20 мл 4%-ной йодной кислоты в воде, 10 мл 0,2М водного ацетата натрия и 70 мл 95%-ного этанола].

3. Отмывают стекло 70%-ным этанолом.

4. На 5 минут наносят на предметное стекло восстанавливающий раствор, содержащий 300 мл этанола, 5 мл 2Н соляной кислоты, 10 г йодистого калия, 5 г тиосульфата натрия (пятиводного), 200 мл дистиллированной воды. Восстанавливающий раствор готовят следующим образом: к раствору йодистого калия и тиосульфата натрия в дистиллированной воде сначала приливают этанол, а затем соляную кислоту. Смесь перемешивают и оставляют на некоторое время для выпадения в осадок серы, после чего собирают надосадочную жидкость.

5. Отмывают стекло 70%-ным (вес/объем) этанолом.

6. Окрашивают препарат реактивом Шиффа в течение 15--45 минут (точное время следует определить экспериментально). Реактив Шиффа готовят следующим образом: 2 г основного фуксина растворяют в 400 мл кипящей дистиллированной воды, охлаждают до 50°С и фильтруют через фильтровальную бумагу. Добавляют к фильтрату 10 мл 2Н соляной кислоты и 4 г метабисульфита калия. Сосуд плотно закупоривают и оставляют на 12 ч в холодном темном месте. Добавляют такое количество 2Н соляной кислоты (10мл), чтобы при высыхании на предметном стекле реактив не давал розового налета. Реактив Шиффа хранят в темноте.

7. Несколько раз отмывают стекло раствором, состоящим из 2 г метабисульфита калия и 5 мл концентрированной соляной кислоты в 500 мл дистиллированной воды.

8. Отмывают препарат водопроводной водой и дополнительно окрашивают

0,002%-ным водным раствором малахитового зеленого в течение 2--5 секунд.

9. Отмывают препарат водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

Полисахариды окрашиваются в красный цвет, все остальные компоненты цитоплазмы -- в зеленый.

Метод окраски полисахаридов альциановым синим

Для выявления полисахаридов можно также использовать альциановый синий. Обычно применяют 1%-й раствор альцианового синего в 95%-ном этаноле, а в качестве дополнительного красителя используют карболовый фуксин. Последовательность операций такова:

1. Мазок препарата на предметном стекле фиксируют нагреванием.

2. Окрашивают мазок в течение 1 минуты разведенным в 9 раз (в воде) аль- циановым синим.

3. Отмывают препарат водопроводной водой и высушивают.

4. Дополнительно очень быстро окрашивают препарат карболовым фуксином и сразу же отмывают водопроводной водой. Высушивают мазок на воздухе и смотрят в микроскоп.

Полисахариды окрашиваются в голубой цвет, а другие составляющие цитоплазму компоненты -- в красный [1].

Окраска гликогена

Гликоген - углевод, животный крахмал. Часто он накапливается в клетках дрожжей, бацилл. Для обогащения дрожжевых клеток гликогеном их выращивают на солодовой среде.

На чистое предметное стекло наносят небольшую каплю суспензии микроорганизма и к ней добавляют такую же каплю раствора йода в йодиде калия (7 г йода и 20 г йодида калия на 100--300 мл дистиллированной воды). Сверху помещают покровное стекло, избыток жидкости удаляют фильтровальной бумагой. Препарат просматривают с масляной иммерсией.

Включения гликогена хорошо исследовать в одно- двухсуточных культурах Saccharomyces cerevisiae и Bacillus mycoides.

Окраска гранулезы

Гранулеза - углевод, крахмалоподобное вещество. В больших количествах накапливается в клетках маслянокислых бактерий - Clostridium butyricum перед спорообразованием.

В небольшую каплю суспензии маслянокислых бактерий добавляют такую же каплю раствора Люголя, накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и просматривают с масляной иммерсией.

Объектом исследования может служить накопительная культура маслянокислых бактерий. Ее получают таким образом: за трое - четверо суток до занятий в пробирки помещают мелко нарезанный неочищенный картофель (1/3 пробирки), на кончике ножа вносят мел и доливают доверху водопроводной водой. Пробирки помещают на водяную баню и при 70 °С нагревают 10 мин, затем охлаждают и ставят в термостат при 30 °С.

Для приготовления препарата маслянокислых бактерий берут пипеткой каплю суспензии из придонного слоя.

Окраска жира

Жир содержится в клетках практически всех видов микроорганизмов; особенно много его накапливается при старении культуры.

На предметное стекло наносят небольшую каплю 40 %-го раствора формалина. Петлей вносят в нее культуру микроба. Формалин убивает клетку и разрыхляет оболочку. Через 5 мин в эту же каплю добавляют небольшую каплю метиленового синего, а спустя 10 мин каплю судана III - индикатора жироподобных веществ, растворимого в жире. Образовавшуюся общую каплю накрывают покровным стеклом, удаляют избыток жидкости фильтровальной бумагой и микроскопируют с иммерсией. Цитоплазма клеток окрашивается в синий цвет, включения жира - в розово-оранжевый.

Объекты для исследования - старые культуры дрожжей, Bacillus mycoides, В, megaterium [4].

Окрашивание поли-в-оксимасляной кислоты

Для выявления цитоплазматических включений в бактериях используют следующий метод:

1. Фиксированную нагреванием бактериальную пленку образца на предметном стекле погружают в раствор 0,3%-ного судана черного В, приготовленного на этиленгликоле. Фильтруют и окрашивают в течение 5--15 мин.

2. Краситель сливают и препарат высушивают на воздухе, положив предметное стекло на промокательную бумагу.

3. Несколько раз погружают и промывают предметное стекло в ксилоле, а затем подсушивают впитывающим ксилол материалом.

4. Дополнительно окрашивают препарат в течение 5--10 с 0,5%-ным водным сафранином.

5. Промывают предметное стекло водопроводной водой, подсушивают и смотрят в микроскоп.

Включения поли-в-оксимасляной кислоты выглядят как черно-синие капельки, в то время как цитоплазма окрашивается в розовый цвет [5].

12. Прокариоты [Режим доступа]: http://do.gendocs.ru/docs/index-184275.html. [Дата доступа]: 15.12.2013.

17. Гусев, М.В. Микробиология / М.В. Гусев, Л.А. Минеева. // - 4-е изд. - М.: Академия, 2003. - 464 с.

18. Лысак, В.В. Микробиология: учебное пособие / В.В. Лысак.// - Минск: БГУ, 2007. - 430 с.