Анализ качества стерилизующих агентов и их влияние на объекты микроразмножения в условиях invitro на примере земляники садовой (fragaria; ananassa (weston)

Размещено на http://www.allbest.ru

Объекты и методы исследования

Объектом исследования являлись стерильные верхушечные столоны (усы) Fragaria Ч ananassa Duch. (Rosaceae). Были выбраны одни из наиболее востребованных ремонтантных сортов в настоящее время -- «Вима-Рина» и «Елизавета II». Сорта отличаются хорошей зимостойкостью, качеством ягод, ярко выраженной ремонтантностью, ранним плодоношением и хорошей транспортабельностью.

Исследования по культивированию в условиях in vitro проводили в соответствии с методическими указаниями по культуре ткани и органов в селекции растений [7, с. 7--17].

У земляники материал для введения в культуру in vitro брали в конце сентября. У испытуемых сортов после отделения от материнского растения оставляли отрезки стебля, которые подвергали стерилизации различными дезинфицирующими агентами (табл. 1) [1, с. 8].

Таблица 1

Стерилизация исходного растительного материала

При введение в культуру, микроразмножении и укоренении использовали как безгормональную модифицированную среду Мурасиге-Скуга (МS), так и обогащенную фитогормонами (табл. 2) [3, с. 15]. Культивирование эксплантов осуществляли в световой комнате при длине дня 16 часов, освещенности 1--6000 люкс, температуре 25--270С в течение 3--4 недель. Перед высадкой в теплицу растения промывали в 1 %-ом растворе КМnО4. Растения высаживали в теплицу для адаптации: 100 % влажность, температура 35--45оС. Схема посадки -- 6х6 см [5, с. 181].

Таблица 2

Модифицированная питательная среда Мурасиге-Скуга для культивирования апикальных меристем земляники, рН 5,8

Обработка экспериментальных данных выполняли на основе методов математической статистики по Доспехову [3, с. 154].

Результаты исследований и их обсуждение

Проведенными исследованиями выявлено, что успех введения в культуру тканей определяется эффективностью стерилизации. Как показал сравнительный анализ действия различных стерилизующих агентов, использование хлорсодержащих веществ обеспечивало достаточную стерильность материала.

Среди изученных агентов пергидроль 10--12 % обладал наименьшим стерилизующим эффектом, в основном грибная инфицированность эксплантов составляла 98 %. Количество стерильных проростков не превышало 2 %.

Применение раствора пергидроля с концентрацией примерно 20 % обеспечивало больший стерилизующий эффект материала -- 60 %.

30 %-ый раствор дезэфекта показывает лучший результат при стерилизации объектов в течение 30 минут -- 35 %. После воздействия дезэфекта в течение 60 минут экспланты имели обширные площади повреждения.

Высокий стерилизующий эффект наблюдался так же после обработки материала 0,1 %-ым раствором хлоргексидина -- 90 %. При его применении общая зараженность растений составляла 10 %. Использование раствора оказывало положительное действие на жизнеспособность проростков.

Важным фактором, имеющим значение для успешного микроразмножения, является гормональный состав питательной среды и вид экспланта. Решающую роль в этом играют концентрации и сочетание фитогормонов.

Наблюдения показали, что асептические проростки земляники садовой через 7--10 дней после посадки на ростовые питательные среды начинали активно расти. На среде без гормонов растения были слаборазвитые, при этом формировался один развитый побег высотой 2,0--4,0 см, коэффициент размножения не превышал 1 (табл. 3).

Таблица 3

Влияние гормонального состава питательной среды на рост и развитие растений земляники

*б/г (к) -- безгормональная среда (контроль)

На средах № 1--4, дополненных БАП, гиббереллином, кинетином и НУК в различных сочетаниях и концентрациях наблюдался активный рост растений, их высота варьировала от 2 до 6 см. Количество побегов на 1 растение достигало трех, экспланты были сильно вытянутыми, поэтому коэффициент размножения был равен 2--4.

Отличительной особенностью было то, что на 4 среде с БАП и ГК растения характеризовались более высокой степенью развития, побеги были утолщенные, кустистые. Именно на этой среде коэффициент размножения равнялся 4.

На средах № 5, 6 содержащих БАП, ИМК/ИУК наблюдался интенсивный рост растений не только в высоту, но и хорошее развитие боковых побегов. При этом средняя высота растений составляла 2--6 см. Количество побегов на 1 растение составляло 3--6 штук, коэффициент размножения равнялся 5.

Следовательно, с одного введенного на питательную среду проростка можно получить до пяти хорошо развитых растений.

На основе полученных данных можно сделать вывод, что добавление в питательную среду БАП 0,5 мг/л и ИМК (ИУК) 0,1 мг/л обеспечивает наиболее высокий выход хорошо развитых растений с одного введенного экспланта. Соответственно наиболее продуктивно использовать среды № 5, 6 для ускоренного микроразмножения земляники в культуре in vitro.

Полученный и размноженный в культуре in vitro селекционный материал необходимо укоренить для дальнейшего его использования в селекционном процессе. Укоренение образовавшихся в культуре in vitro растений связано с индуцированием адвентивных корней, которое достигается изменением гормонального состава питательной среды.

Проведенные исследования на землянике показали, что стимулирующее влияние на корнеобразование оказывала нафтилуксуская кислота в концентрации 0,5 мг/л. Количество укоренившихся эксплантов составляло 30 %. Среднее число корней было равно 1--2 штук, размер составлял 1--2 см. Высота растений колебалась от 2 до 4 см. Было отмечено, что увеличение концентрации НУК до 1,0 мг/л в питательной среде активизирует рост надземной части растений после образования корней, однако выход укоренившихся проростков равнялся 15 %. Максимальное образование корней (42 %) вызывала НУК в количестве 1,5 мг/л, среднее число корней было равно 2--3 штук, размер составлял 2--3 см. Высота растений колебалась от 3 до 5 см (табл. 4).

Таблица 4

Влияние физиологически активных веществ на ризогенез клонов земляники

*б/г (к) -- безгормональная среда (контроль)

Однако еще большее увеличение содержания гормона в среде (НУК 2,0 мг/л) оказывало негативное влияние на рост и развитие эксплантов, образования корней снизилось до 2 %. Добавление в питательную среду других гормонов и их сочетаний желаемых результатов не оказало. На контроле укорененных регенерантов не наблюдалось.

Выводы

Оптимальным стерилизующим агентом для обеспечения стерильности и сохранения высокой жизнеспособности вводимого материала является раствор хлоргексидина в концентрации 0,1 %.

Добавление в питательную среду БАП 0,5 мг/л и ИМК (ИУК) 0,1 мг/л обеспечивает наиболее высокий выход хорошо развитых растений с одного введенного экспланта, что дает возможность использовать для ускоренного микроразмножения земляники в культуреin vitro.

Максимальное образование корней (42 %) вызывала НУК в количестве 1,5 мг/л, среднее число корней было равно 2--3 штук, размер составлял 2--3 см. Высота растений колебалась от 3 до 5 см.

В настоящее время оба ремонтантных сорта -- «Вима-Рина» и «Елизавета II» выделены нами как наиболее перспективные сорта для дальнейшего клонального микроразмножения. Клоны, полученные от них, сейчас находятся на доращивании на питательных средах и в дальнейшем будут использоваться как маточники для получения оздоровленного материала.

Список литературы

Бутенко Р.Г. Биология клеток высших растений in vitro и биотехнологии на их основе: учеб. Пособие. М.: ФБК-ПРЕСС, 199. 160 с.

Высоцкий В.А. Биотехнологические методы в системе производства оздоровленного посадочного материала и селекции плодовых и ягодных растений: дисс…. д. с.-х. наук. М: 1998. 321 с.

Доспехов Б.А. Методика полевого опыта (с основами статистической обработки результатов исследований). 5-е изд., доп. и перераб. М.: Агропромиздат, 1985. 351 с. земляника гормональный питательный

Инновационные технологии возделывания земляники садовой: науч.-практ. изд. М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2010. 88 с.

Калинин Ф.Л., Кушнир Г.П., Сарнацкая В.В. Технология микроклонального размножения растений. Киев: Наукова думка, 1992. 232 с.

Катаева Н.В., Бутенко Р.Г. Клональное микроразмножение растений. М.: Наука, 1983. 95 с.

Основы биотехнологии растений. Культура клеток и тканей: Учебное пособие / Составители: Сорокина И.К., Старичкова Н.И., Решетникова Т.Б., Гринь Н.А. М.: 2002, 45 с.

Размещено на Allbest.ru