Экспрессия белка ТБГ3 Х-вируса шалота

Размещено на http://www.allbest.ru/

Московский государственный институт имени Михаила Васильевича Ломоносова

Факультет биоинженерии и биоинформатики

Курсовая работа

на тему: «Экспрессия белка ТБГ3 Х-вируса шалота»

Выполнила:

Студентка 3-го курса, 301 группы

Дворкина Дарья Алексеевна

Руководитель:

Соловьев А.Г.

Москва 2013

Содержание

Сокращения

1. Литературный обзор

1.1 Вирусы растений

1.2 Вирусы, кодирующие тройной блок генов

1.3 Экспрессия тройного блока генов

1.4 Род Allexivirus

1.5 X-вирус шалота

1.6 Неканоническая инициация трансляции белков вирусов растений

2. Практическая часть

Выводы

Список литературы

Сокращения

экспрессия белок вирус шалота

BYV - вирус желтухи свеклы

eEF - эукариотический фактор элонгации трансляции

eIF - фактор элонгации

eRF - эукариотические факторы терминации

LRS - ослабленное рибосомное сканирование (leaky ribosome scanning)

PABP - полиА-связывающий белок

psRNAv - positive-stranded RNA viruses

ShVX - Shallot Virus X

TMD - трансмембранный домен

TMV - вирус табачной мозаики

КБ - капсидные белки

ОРС - открытая рамка считывания

ПД - плазмодесмы

ППС - предельно-пропускная способность

ПТУГ - пострансляционное умолкание генов

сгРНК - субгеномная РНК

ТБ - транспортные белки

ТБГ - тройной блок генов

1. Литературный обзор

Вредоносность вирусных заболеваний проявляется главным образом в снижении урожайности растений и ухудшении качества продукции. Особый вред вирусы наносят при выращивании семенного и посадочного материала. Поражение вирусами отрицательно влияет на пищевую и кормовую ценность продукции, пригодность ее к промышленной переработке. Так, в клубнях картофеля, зараженных различными вирусами, содержание крахмала падает на 1,5-2,0 %, у сахарной свеклы на 1-2 % снижается сахаристость. Вирусы вызывают у растений стерильность и несовместимость, что отрицательно сказывается на работе селекционеров. У цветочных культур теряется декоративность, что наносит значительный экономический ущерб. Под действием вирусов снижаются сортовая чистота, холодостойкость, зимостойкость, всхожесть семян. В среднем размер убытков от развития вирусных болезней составляет примерно 20 % общего экономического ущерба, обусловленного деятельностью всех групп возбудителей болезней и вредителей сельскохозяйственных культур. По некоторым оценкам ежегодный мировой экономический ущерб, наносимый растительными вирусами, исчисляется порядком 6Ч10¹⁰ долларов США. (Cann A. J., Principles of Molecular Virology, 4^th edition, 2005).

Общий принцип жизненного цикла вирусов определяется их взаимодействием с организмом хозяина. А так как между растениями и позвоночными животными существует ряд существенных отличий (у растений присутствует клеточная стенка, отсутствует кровеносная система и т.д.), не удивительно, что между общей организацией вирусов растений и позвоночных есть существенные различия. Одним из важных направлений современной вирусологии является изучение молекулярной организации вирусного генома, механизмов распространения и репликации.

1.1 Вирусы растений

Вирусы - единственная группа организмов, чей генетический материал может быть представлен РНК. Вирусы, геном которых представлен одноцепочечной РНК, имеющей ту же полярность, что и клеточные мРНК, т. е. способные напрямую кодировать вирусные белки, называются вирусами с РНК-геномом положительной полярности(«positive-stranded RNA viruses», psRNAv). После попадания в клетку растения положительные РНК связываются с клеточными рибосомами, и происходит синтез вирусных белков, первым из которых является белок, обладающий РНК-зависимой РНК полимеразной активностью. Этот белок сначала синтезирует минус-копию геномной РНК, служащую матрицей для синтеза дочерних цепей геномной РНК, а также субгеномных РНК положительной полярнойсти, которые служат матрицами для трансляции других вирусных белков. (Acheson N. H. - Fundamentals of Molecular Virology (2nd ed.) - 2011)(см. далее).

Большое количество растительных вирусов являются psRNAv. Растительные вирусы проникают в клетки организма хозяина, как правило, через раневые отверстия или с участием насекомых-переносчиков. (Acheson N. H. - Fundamentals of Molecular Virology (2nd ed.) - 2011). Для распространения в другие части растения, вирусы кодируют так называемые транспортные белки (ТБ), которые изменяют пропускную способность плазмодесм, каналов, соединяющих цитоплазму соседних клеток (см. далее) и участвуют в транспортировке вирусного генома из одной клетки в другую.

Организация геномной РНК положительной полярности вирусов растений

Вирусы, у которых геном представлен РНК положительной полярности, часто имеют на 5'-конце кэп (m7G) и/или последовательности поли-А на 3'конце (McDonald SM. 2013), что характерно для мРНК эукариотичестких клеток, что делает возможным их трансляцию клеточными рибосомами.

Иногда, psRNAv не имеют кэп-структуры, а инициация трансляции происходит с помощью IRES элементов. Такая организация 5'-конца встречается у представителей семейства Picornaviridae, таких как poliovirus, rhinovirus и других (McDonald SM. 2013, Witwer C et. al. 2001).

Более того, трансляция геномов Caliciviridae зависит от небольшого белка, кодируемого вирусом (VPg), который ковалентно связан с 5'-концом РНК и взаимодействует с белками клетки-хозяина, необходимыми для инициации синтеза белка (Goodfellow I et. al. 2005).

После заражения клетки хозяина с геномной вирусной РНК положительной полярности транслируется один белковый продукт, который может либо представлять собой РНК-зависимую РНК полимеразу, либо полипротеин, который котрансляционно и пострансляционно разрезается вирусными протеазами, давая зрелые вирусные белки. Одним из таких белков является РНК-зависимая РНК полимераза,(McDonald SM. 2013). Достаточно часто белки данной группы вирусов, обладающие полимеразной активностью, ассоциируются с мембранными внутриклеточными органеллами, захватывая и модифицируя участки мембран для формирования “репликационных капсул” (den Boon et. al. 2010). Так как молекула РНК положительной полярности является так же и функциональной мРНК, процессы транскрипции и трансляции вируса аналогичны, однако, часто с антигеномной РНК синтезируются, так называемые, субгеномные РНК (сгРНК), которые короче геномной РНК и 3'-котреминальны с ней. Молекулы сгРНК служат для экспрессии индивидуальных вирусных белков.

1.2 Вирусы, кодирующие тройной блок генов

Для транспорта из клетки в клетку вирусам растений необходимы специальные транспортные белки. Геномная и молекулярная организация широко варьирует у разных групп вирусов. Например, хорошо изученный вирус табачной мозаики (TMV) использует для своего транспорта один транспортный белок, представители рода Carmovirus кодируют два небольших транспортных белка, а желтый вирус свеклы (BYV) использует целых пять белков для транспорта (James et. al. 2011). Так же существуют вирусы, в геноме которых закодировано три транспортных белка в так называемом тройном блоке генов (ТБГ).

ТБГ представляет собой эволюционно консервативный модуль, состоящий из трех частично перекрывающихся открытых рамок считывания (ОРС). Белки, кодируемые ТБГ, были названы ТБГ1, ТБГ2 и ТБГ3, соответственно позициям их генов. Существует, по крайней мере, восемь родов таких вирусов, которые делятся на две большие группы в зависимости от строения транспортных белков: потекс-подобные и гордеи-подобные (Табл.1).

ТБГ1 обеих групп содержит НТФазно/хеликазный домен (Kalinina et al., 2002). При этом белок потекс-подобных вирусов почти целиком состоит из этого домена, в то время как гордеи-подобные вирусы имеют N-концевое удлинение (Morozov & Solovyev 2003, Verchot-Lubitz et al. 2010).

Таблица 1. Вирусы, кодирующие ТБГ

Potex-like viruses	Hordei-like viruses
Potexvirus Allexvirus Mandarivirus Carlavirus Foveavirus	Hordeivirus Pomovirus Pecluvirus

Итак, ТБГ1 обеих групп вирусов способен проявлять хеликазную активность. С помощью использования модельных РНК или ДНК субстратов было показано, что на двуцепочечных РНК хеликаза проявляет активность как в 3'-5' так и в 5'-3' направлениях и не способна расплетать дуплексы ДНК (Kalinina et al. 2002). За счет положительно заряженного N-концевого района белка ТБГ1 потекс-подобных вирусов может неспецифично связывать как одноцепочечную, так и двуцепочечную РНК (Liou et al. 2000, Morozov et al. 2003), таким образом формируя рибонуклеопротеиновые комплексы для перемещения между клетками. Для формирования таких комплексов ТБГ1 потекс-подобных вирусов необходимы белки оболочки (капсидные белки, КБ) (Lough et al. 2000).

Наконец, ТБГ1 выполняет роль супрессора пострансляционного умолкания генов (ПТУГ) (Bayne et al. 2005, Chiu et al. 2010).

Для ТБГ1 гордеи-подобных вирусов также была показана РНК-связывающая активность. Более того, было показано, что эти белки способны образовывать димеры и мультимеры, что, возможно, играет важную роль в образовании рибонуклеопротеиновых комплексов (Makarov et al. 2009).

ТБГ2 представляет собой мембранный белок, интегрированный в липидный бислой в U-форме, при чем, и N-, и С-концы находятся в цитоплазме (рис. 1) (Morozov et al. 2003, Zamyatnin et al. 2006, Chou et al. 2008, Lee еt al. 2010 ). Для него была показана РНК-связывающая активность. ТБГ2 связывает неспецифично как вирусную, так и невирусную РНК (Cowan et al. 2002, Tseng et al. 2009). Более того, для ТБГ2 обеих групп вирусов была показана способность увеличивать ППС клетки (Tamai and Meshi 2001, Haupt et al. 2005).

В отличие от достаточно консервативного ТБГ2, организация ТБГ3 сильно варьирует у разных вирусов. Это может говорить или о различной специализации этого белка или о его полифилии. Для потекс-подобных вирусов (роды Potexvirus, Carlavirus, Foveavirus, Allexivirus) было показано, что 6-13 kDa ТБГ3 содержит один гидрофобный фрагмент на N-конце, за которым следует достаточно консервативный участок CX₅GX₅C, заякоренный в мембране. (Verchot-Lubicz et al. 2010).

ТБГ3 большинства гордеи-подобных вирусов длиннее, чем у потекс-подобных и содержат два гидрофобных участка: консервативную последовательность на N-конце, состояющую из гистидиновых и цистеиновых остатков, и центральный гидрофильный участок, в котором присутствует мотив YQDLN. Молекула белка ТБГ3 этой группы, как и молекула ТБГ2, интегрирована в мембрану в U-образной форме. (Morozov et al. 2003, Verchot-Lubicz et al. 2010).

ТБГ3 гордеи-подобных вирусов способны формировать высокомолекулярные комплексы и транспортировать их к периферии клеток (Shemyakina et al., 2011). Интересно, что этот транспорт не является COPII - зависимым. (Shemyakina et al., 2011; Schepetilnikov et al. 2008).

1.3 Экспрессия тройного блока генов

Белки ТБГ экспрессируются с помощью двух субгеномных РНК (сгРНК). Белок, кодируемый первым геном тройного блока (ТБГ1) синтезируется на матрице своей сгРНК1, а ТБГ2 и ТБГ3 - с сгРНК2 (рис. 1). Количество синтезированных белков ТБГ1, ТБГ2 и ТБГ3 находится в соотношении приблизительно 100:10:1 соответственно (Verchot-Lubicz et al. 2010). Экспрессия ТБГ3 происходит за счет механизма пропускающего рибосомного сканирования матрицы (leaky ribosome scanning, LRS).

Рис. 1. Организация и экспрессия ТБГ (Verchot-Lubicz.2010). Обозначения: gRNA - геномная РНК; sgRNA - субгеномная РНК

1.4 Род Allexivirus

Род Allexivrus принадлежит семейству Flexiviridae, которое также включает роды Capillovirus, Carlavirus, Citrivirus, Foveavirus, Potexvirus, Trichovirus, Vitivirus, и Mandarivirus. Впервые Allexivirus были зарегестрированы как новая таксономическая группа в 1992, после того, как полностью был описан геном Х вируса шалота (Shallot virus X, ShVX) (Desk Encyclopedia of PLANT AND FUNGAL VIROLOGY, 2010). Заболевания, связанные с вирусами рода Allexivirus как правило, проходят мягко и бессимптомно. Очень часто вирусы этого рода присутствуют в растениях в составе комплексов с другими неродственными вирусами, обладающими таким же кругом хозяев. Так как Allexivirus не вызывают серьезных заболеваний, ими почти не занимается фитовирусология, однако, эти вирусы интересны с точки зрения таксономии, структуры генома, и отношения между родами, видами и подвидами различных вирусов (Brian W.J. Mahy, Marc H.V. van Regenmortel, Desk Encyclopedia of PLANT AND FUNGAL VIROLOGY, 2010).

Вирионы Allexivirus представляют собой достаточно гибкие нитевидные частицы длиной около 800 нм и диаметром около 12 нм. Геном представлен одноцепочечной РНК положительной полярности размером около 9 кб, имеющей 3' поли-А хвост. Структура генома будет рассмотрена на примере типичного представителя этого рода - ShVX.

1.5 X-вирус шалота

Геном ShVX представлен одноцепочечной РНК, состоящей из 8890 нуклеотидов, не считая 3'-концевого поли-A (Kanyuka et al. 1992). Геном вируса содержит 6 ОРС, 3'- и 5'-концевые нетранслируемые области и некодирующие участки между 1 и 2, 3 и 4 а также между 4 и 5 ORF (Kanyuka et al., 1992) (рис. 2).

Длина 5'-концевого нетранслируемого участка составляет 98 нуклеотдидов, а 3'-концевого - 112 нуклеотидов, за которыми следует поли-А хвост.

ОРС1 кодирует 195К белок, содержащий 1718 аминокислотных остатков. Этот белок содержит три домена, гомологичных соответственно метилтрансферазе, хеликазе и РНК-полимеразе potex-, carla- и tymoviruses (Kanyuka et al., 1992). Таким образом, ORF1 кодирует вирус-специфичную РНК-репликазу, которая, согласно множественному выравниванию (Kanyuka et al., 1992), эволюционно близка к РНК-репликазе потексвирусов (рис. 3).

Рис. 2. Схема геномной РНК ShVX. Обозначения: ORF - открытая рамка трансляции, MT - метилтрансферазный домен, HEL - хеликазный домен, POL - полимеразный домен, Р1, P2, P3 - ТБГ1, ТБГ2 и ТБГ3 соответственно. СР - ген капсидного белка, Cys - ген цистеин-богатого белка.

Рис. 3. Множественное выравнивание трех доменов в составе продукта трансляции ОРС1

ОРС2 и ОРС3 белка ShVX перекрываются и кодируют два белка, гомологичных белкам ТБГ- ТБГ1 и ТБГ2 соответственно, характерных для carla- и potexvirus.

Интересно, что геном ShVX содержит последовательность между ОРС3 и ОРС4 (рис. 2), гомологичную ТБГ3 carla- и potex- вирусов (Kanyuka et al., 1992), однако, эта последовательность лишена стартового кодона AUG.

ОРС4 кодирует 42К белок, для которого не было найдено гомологов среди всех организмов, однако, он характерен для всех вирусов рода Allexivirus (Kanyuka et al. 1992, S. Sumi et al.1993, S. Sumi et al. 1999).

ОРС5 представляет собой последовательность, кодирующую КБ ShVX, родственный КБ вирусов родов Сarlavirus и Potexvirus (Kanyuka et al. 1992). Шестая открытая рамка трансляции кодирует цистеин-богатый белок. (Haylor et al., 1990; Levay & Zavriev, 1991).

1.6 Неканоническая инициация трансляции белков вирусов растений

Трансляцию вирусных РНК осуществляют клеточные рибосомы. Ниже будут рассмотрены некоторые механизмы неканонической трансляции, а. именно - инициации трансляции, характерные для ТБГ-содержащих вирусов. Но, прежде чем рассматривать отклонения от канонического пути, рассмотрим стандартные взаимодействия рибосомы с мРНК и факторами инициации трансляции в эукариотических клетках.

Описание механизма канонической инициации трансляции эукариот

Большинство клеточных мРНК содержит 5'кэп (m⁷G) и 3' поли-А хвост. Трансляция может быть разделена на четыре основных стадии, среди которых инициация, элонгация, терминация и рециклизация рибосом (H.Lodish et al. 2003).

Инициация начинается с узнавания 5' кэпа фактором инициации (eukaryotic ilongation factor, eIF) 4E, связывающим eIF4G, который, в свою очередь, несет eIF4A, eIF4B и поли-А-связывающий белок (poly(A) binding protein, PABP). PABP, благодаря связыванию с 3'лиА хвостом способствует рециклизации. Образовавшийся комплекс связывает 40S (малую) субъеденицу рибосомы в комплексе с eIF3, eIF1, eIF1A, eIF5 и eIF2-Met-tRNAi-GTP. Такой образовавшийся на 5' конце достаточно массивный комплекс начинает сканирование мРНК до того, как встретит первый AUG кодон. Сканирование обеспечивается хеликазой eIF4A и ее кофактором eIF4B, которые расплетают вторичную структуру 5”некодируемой области мРНК. eIF1 и eIF1A обеспечивают узнавание стартового кодона и его окружения. Как только AUG найден, eIF5 обеспечивает гидролиз GTP, Met-tRNAi оказывается в P сайте 40S рибосомной субъединицы, уходят eIF1, eIF2-GTP, eIF5. eIF5B и гидролиз GTP обеспечивают присоединение большой (80S) субъединицы рибосомы и тут же отсоединяются от комплекса. Трансляция переходит в фазу элонгации, и, вскоре после этого, отщепляются eIF3 и eIF4G. Процесс инициации трансляции был описан в большом количестве литературы, в частности, - Jackson et al. (2010), Andrew and Brierley (2012).

Во время элонгаци следующие триплеты распознаются в рибосомном А-сайте благодаря соответствующим тРНК, доставляемыми в А-сайт с помощью эукариотического фактора элонгации трансляции eEF1A. Как только кодон узнается правильной РНК, формируется пептидная связь (транспортировка растущей полипептидной цепочки из Р-сайта в А-сайт и присоединение ее к новой аминокислоте). Далее транслокация, катализируемая eEF2 перемещает деацелированную тРНК из А-сайта в Е-сайт, где происхоит отщепление последней от рибосомы, пептидил тРНК из А-сайта в Р-сайт, что так же способствует передвижению мРНК внутри рибосомы. Наконец, происходит открытие А-сайта для новой аминоацил-тРНК. Элонгация продолжается вплоть до достижения терминальных кодонов (в большинстве случаев это - UAG, UGA и UAA). (H.Lodish et al. Molecular Cell Biology, 2003).

Терминирующие кодоны узнаются эукариотическим фактором терминации (eukaryotic release factor, eRF) eRF1, который, совместно с eRF3 и GTP, терминирует трансляцию, отщепляет синтезированный белок от рибосомы. Рибосома снова разваливается на большую и малую субъединицы за счет гидролиза ATP, что управляется eIF3, eIF1 и eIF1, которые остаются ассоциированными с 40S субъединицей (H.Lodish et al. Molecular Cell Biology, 2003).

В большинстве случаев вирусные РНК, как и клеточные мРНК, являются функционально моноцистронными, т. е. могут служить матрицей для трансляции только 5'-проксимального гена. В то же время, вирусам чаще всего необходимо синтезировать несколько белков, необходимых для их репликативного цикла. Иногда это обеспечивается за счет продукции моноцистронных сгРНК, как, например в случае вирусов рода Closterovirus, или использования сегметированного генома, большая часть которых моноцистронна (н-р orthomyxoviruses). Другая распространенная стратегия - кодирование длинных полипептидов, которые вирусными или клеточными протеазами разрезаются на несколько функциональных белков (н-р faviviruses). Помимо этого, вирусы используют механизмы неканонической инициации трансляции, которые обеспечивают возможность синтеза нескольких белков с одной мРНК, что позволяет вирусам сильно сократить объемы своего генома с помощью, например, использования перекрывающихся ОРС (Andrew and Brierley 2012).

Ослабленное рибосомное сканирование (leaky ribosome scanning)

В сканирующей модели инициации, 40S субъединица рибосомы связывается недалеко от 5'-кэпа и линейно сканирует рибосому до достижения первого стартового AUG кодона (Kozak 2002, Andrew and Brierley 2012). Однако в некоторых условиях значительная часть сканирующих рибосом не начинают трансляцию с первого встреченного AUG, но продолжают сканировать мРНК. Этот процесс был назван ослабленное рибосомное сканирование (leaky ribosome scanning, LRS). Он позволяет транслировать с одной матрицы как различные N-концевые изоформы одного белка (при расположении альтернативных стартовых кодонов в одной рамке считывания), так и различные белки с перекрывающихся ОРС (альтернативные участки инициации в разных рамках считывания) или даже различные белки, чьи ОРС не перекрываются. В некоторых случаях альтернативные рамки трансляции сопряжены с использованием неканонических альтернативных стартовых кодонов (см. далее) в сильном окружении, в то время как первый AUG кодон находится в слабом окружении (Turina et al.2000, Andrew and Brierley 2012). Эффективность инициации на потенциальном инициаторном кодоне сильно зависит от нуклеотидов, его окружающих. Как было показано Kozak (1986) для клеток млекопитающих, оптимальный контекст включает гуанин в +4 позиции относительно предположительного начала трансляции и пурин в -3 позиции. Такой контекст содержит небольшие вариации и был обнаружен в различных таксономических группах животных, растений и грибов (Nakagawa et al. 2008). Если же контекст первого AUG кодона не является оптимальным, вероятность LRS увеличивается.

Кроме субоптимального контекста стартового кодона множество других механизмов также могут способствовать LRS. Если, например, первый стартовый кодон расположен очень близко к 5' концу транскрипта, то его узнавания часто не происходит. Это приводит к уменьшению 5'некодирующих областей до 30 или даже 12 нуклеотидов (Andrew and Brierley, 2012).

Инициации трансляции с альтернативного кодона

Синтез всех полипептидных цепочек у прокариот и эукариот начинается с метионина. В большинстве мРНК стартовыv кодоном служит триплет AUG. (H.Lodish et al. 2003). Однако не всегда необходимо наличие AUG для начала трансляции. Некоторые другие кодоны могут так же распознаться Met-tRNAi в некоторых условиях. Было показано, что кодоны CUG, GUG, ACG, AUU, AUA, AUC и UUG способны обеспечивать достаточный уровень трансляции (2-30%), причем CUG является самым эффективным среди них (Touriol et al. 2003).

2. Практическая часть

Для транспорта из клетки в клетку вирусы используют специальные белки, называемые транспортными. Одним из примеров могут служить белки, закодированные в ТБГ - ТБГ1, ТБГ2, ТБГ3. Было показано, что все три белка необходимы для вирусного транспорта. Интересно, что ShVX, так же как и другие известные представители рода Аllexivirus, не имеет ОРС для ТБГ3, но последовательность, гомологичная ТБГ3 других вирусов, правда, лишенная стартового AUG кодона, была обнаружена (Kanyuka et al. 1992). Так как ранее не было получено других представителей РНК-вирусов, которые осуществляют межклеточный транспорт с помощью только ТБГ1 и ТБГ2, появилась необходимость проверить возможность экспрессии ТБГ3-гомолога аллексивирусов.

Цель работы

Изучить возможность экспрессии ТБГ3 у ShVX.

Материалы и методы

Анализ последовательностей

Множественные выравнивания были построены программой ClustalW2 на веб-сервере Европейского Института Биоинформатики (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/). Программа GeneDoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc/) была использована для визуализации полученных выравниваний.

Аббревиатуры названий вирусов и accession numbers последовательностей, использованных в анализе.

Аббревиатуры приведены в алфавитном порядке. Acession numbers приведены по данным GeneBank.

AltMV, Alternanthera mosaic virus [NC_007731].

ApLV, Apricot latent virus [NC_014821].

ASPV, Apple stem pitting virus [NC_003462].

BaMV, Bamboo mosaic virus [NC_001642].

BVE, Blackberry virus E [NC_015706].

BVX, Botrytis virus X [NC_005132].

CLBV, Citrus leaf blotch virus [NC_003877].

CLV, Carnation latent virus [X52627].

CVB, Chrysanthemum virus B [NC_009087].

CVX, Cactus virus X [NC_002815].

CYMV, Clover yellow mosaic virus [NC_001753].

DVS, Daphne virus S [NC_008020].

FoxMV, Foxtail mosaic virus [NC_001483].

GarV-A, Garlic virus A [NC_003375].

GarV-B, Garlic virus B [AB010301].

GarV-C, Garlic virus C [NC_003376].

GarV-D, Garlic virus D [AB010303].

GarV-E, Garlic virus E [NC_004012].

GarV-X, Garlic virus X [AJ292229].

GLV, Garlic latent virus [NC_003557].

GMBMV, Garlic mite-borne mosaic virus [D49443].

HelVS, Helenium virus S [D10454].

HpMV, Hop mosaic virus [NC_010538].

ICRSV, Indian citrus ringspot virus [NC_003093]

LoVX, Lolium latent virus [NC_010434].

LSV, Lily symptomless virus [NC_005138].

LVX, Lily virus X [NC_007192].

MVX, Mint virus X [NC_006948].

PapMV, Papaya mosaic virus [NC_001748].

PCMV, Peach chlorotic mottle virus [NC_009892].

PepMV, Pepino mosaic virus [NC_004067].

PhVS, Phlox virus S [NC_009383].

PlAMV, Plantago asiatica mosaic virus [NC_003849].

PVM, Potato virus M [NC_001361].

PVS, Potato virus S [NC_007289].

PVX, Potato virus X [NC_011620].

ShVX-Dindugal, Shallot virus X strain Dindugal [GQ268322].

ShVX-NZ, Shallot virus X New Zealand strain [EU835197].

TVX, Tulip virus X [NC_004322].

WAMV, White ash mosaic virus [NC_011533, GU906791].

WClMV, White clover mosaic virus [NC_003820].

Получение конструкций

В ходе работы были сконструированы две конструкции, включающие участок генома ShVX, несущий последовательности ТБГ2 и ТБГ3 под контролем сильного растительного 35S-промотора:

Таблица 2. Праймеры. Жирным шрифтом выделены сайты рестрикции

Праймеры, использованные для получения конструкций
35S-р2/р3-3HA	+:GCCTCGAGACACAACATTGGAGTTACCACA -: GCGGATCCATATGGAAGGTTGTGACAATCACC
35S-р2/Др3-3HA	Внешние: аналогично предыдущей конструкции Внутренние: +: GGATCATCACCAACAAGCCATT -: AATGGCTTGTTGGTGATGATCCTGTTTTAGGT

Эти конструкции были клонированы в составе бинарного вектора pLH. В обоих вариантах предположительный ген ТБГ3 был слит в одной рамке трансляции с эпитопом вируса гриппа (triple hemagglutinine tag, 3HA). Первая конструкция содержит нативную ТБГ2/ТБГ3 последовательность, а вторая несет точечную мутацию предположительного (см. далее) инициаторного кодона CUG в CAG. Мутация вносилась с помощью перекрывающегося ПЦР (рис. 4, табл. 2).

Параметры ПЦР: температура плавления - 95^?С, температура отжига - 60^?С, температура элонгации - 72^?С. Колонии, несущие плазмиду pLH, имели устойчивость к стептомицину и спектиномицину.



Рис. 4. Схема внесения мутации с помощью двух последовательных ПЦР

Вестерн блоттинг

После выделения пламидной ДНК из E. сoli была проведена трансормация клеток Agrobacterium tumefaciens, а затем агроинфильтрация по стандартным методикам. Культурами агробактерий, несущими рекомбинантные плазмиды, были инфильтрированы листья растений Nicotiana benthamiana. Отбор проб проводился на третий день после инфильтрации. Вестерн-блоттинг делался с мышиными антителами к 3HA.

Полуколичественный ПЦР

Выделение РНК из препаратов листа проводился с помощью горячего фенола.

Полуколичественный ПЦР делался

А) С праймерами к ТБГ3 для определения количества мРНК, кодирующей ТБГ2/ТБГ3 последовательность

Б) С праймерами к eEF1 для определения среднего количества тотальной РНК.

Результаты

Чтобы определить характеристические особенности потенциально транслирующегося ТБГ3 белка алексивирусов, было построено множественное выравнивание, содержащее всех представителей алексивирусов, чей геном уже секвенирован. Гомологи ТБГ3 алексивирусов показали довольно высокую степень родства друг с другом, когда расстояния и отдаленное родство с представителями других родов (рис. 5). В частности, в потенциально транслируемом белке была найдена консервативный мотив (CX₅GX₅C), характерный для ТБГ3 белков потексвирусов, и один гидрофобный трансмембранный участок перед ним (TMD), что также характерно для потексвирусов. Консервативность ТБГ3-кодирующей последовательности во всех алексивирусах говорит о возможности экспрессии белка ТБГ3. Было предложено, что эта экспрессия начинается с неканонического стартового кодона.

Рис. 5. Множественное выравнивание ТБГ3 аминокислотных последовательностей

Плюсами обозначены участки консервативных остатков, характерных для потексвирусов. TMD - трансмембранный домен, звездочкой обозначен инвариантный консервативный лейцин.

Если трансляция начинается с неканонического стартового кодона, логично предположить, что этот кодон будет консервативен у всех алексивирусов, включая его позицию и окружение. Действительно, более детальное изучение выровненных последователньостей выявило присутствие инвариантного Leu остатка, закодированного во всех случаях кодоном CUG, который, как известно (см. выше), является самым эффективным из возможных неканонических инициаторных кодонов. Интересно, что у всех алексивирусов этот CUG был найден в оптимальном окружении для инициации трансляции (AXXCUGG), в то время как AUG кодон ТБГ2 нахоится в слабом окружении (C/UXXAUGA) (рис. 6)

Рис. 6. Окружение инициаторных кодонов

Наконец, не было найдено ни одного AUG кодона между инициатором ТБГ2 и предположительным стартовым CUG-кодоном ТБГ3. Эти данные поддерживают гипотезу об инициации экспрессии ТБГ3 с CUG кодона с помощью механизма LRS.

Для экспериментальной проверки этого предположения были сконструированы две конструкции, включающие участок генома ShVX, несущий последовательности ТБГ2 и ТБГ3 под контролем сильного растительного 35S-промотора. Эти конструкции были клонированы в составе бинарного вектора pLH. В обоих вариантах предположительный ген ТБГ3 был слит в одной рамке трансляции с эпитопом вируса гриппа (triple hemagglutinine tag, 3HA). Первая конструкция содержит нативную ТБГ2/ТБГ3 последовательность, а вторая несет точечную мутацию предположительного инициаторного кодона CUG в CAG. Вестерн блоттинг показал, что экспрессия белка ТБГ3 происходит только в случае нативной последователньости ТБГ2/ТБГ3. Мутация же CUG кодона приводит к полному блокированию синтеза ТБГ3. В то же время полуколичественный ПЦР выявил сходный уровень мРНК, служащих матрицей для трансляции ТБГ2 и ТБГ3. Это говорит о том, что мутация CUG кодона влияет на инициацию трансляции ТБГ3, но не на стабильность мРНК (рис. 7).

Рис.7. Вестерн блоттинг и полуколичественный ПЦР. Вестерн блоттинг проводился с использованием мышиных антител к 3HA. Gel loading - электрофорез в полиакриламидном геле тотальных препаратов листьев, окрашенный Кумасси. Полуколичественный ПЦР - 22 цикла

Выводы

Полученные в нашей лаборатории данные доказывают, что гомологичная ТБГ3 последовательность ShVX является экспрессируемым геном, чья экспрессия осуществляется с помощью неканонического стартового кодона CUG. Возможно, эта экспрессия происходит по механизму LRS, однако, это предположение нуждается в дальнейших экспериментальных подтверждениях.

Учитывая, что альтернативные инициаторные кодоны всегда менее эффективны, чем AUG, замена AUG на CUG в алексивирусах, возможно служит для уменьшения уровня экспрессии ТБГ3. Известно, что ТБГ3 во всех ТБГ-кодирующих вирусах экспрессируется на очень низком уровне (Morozov and Solovyev, 2003), и дальнейшее уменьшение уровня его экспрессии может быть полезным адаптивным признаком, например, позволяющим вирусу адаптироваться к определенным видам растений-хозяев.

Список литературы

1. Acheson N. H. - Fundamentals of Molecular Virology (2nd ed.) - 2011

2. Andrew E. Firth and Ian Brierley (2012) Non-canonical translation in RNA viruses, Journal of General Virology , 93, 1385-1409

3. Bayne, E. H., Rakitina, D. V., Morozov, S. Y., and Baulcombe, D. C. 2005. Cell-to-cell movement of potato potexvirus X is dependent on suppression of RNA silencing. Plant J. 44:471-482.

4. Brian W.J. Mahy, Marc H.V. van Regenmortel, Desk Encyclopedia of PLANT AND FUNGAL VIROLOGY, 2010

5. Cann A. J., Principles of Molecular Virology, 4th edition, 2005

6. Chiu MH, Chen IH, Baulcombe DC, Tsai CH.(2010) The silencing suppressor P25 of Potato virus X interacts with Argonaute1 and mediates its degradation through the proteasome pathway. Mol Plant Pathol.;11(5):641-9.

7. Chu PW, Westaway E. Replication strategy of kunjin virus: evidence for recycling role of replicative form RNA as template in semiconservative and asymmetric replication. Virology 1985, 140:68-79

8. Cumakov IM, Lipskaya GY, Agol VI. Comparative studies on the genomes of some picornaviruses: denaturation mapping of replicative form RNA and electron microscopy of heteroduplex RNA. Virology 1979, 92:259-270.

9. den Boon JA, Diaz A, Ahlquist P. Cytoplasmic viral replication complexes. Cell Host Microbe 2010, 8:77-85.

10. Goodfellow I, Chaudhry Y, Gioldasi I, Gerondopoulos A, Natoni A, Labrie L, Laliberte JF, Roberts L. Calicivirus translation initiation requires an interaction between VPg and eIF4E.EMBO Rep2005, 6:968-972

11. H. T., Chou, Y. L., Tseng, Y. H. Lin, Y. H., Lin, T. M., Lin, N. S., Hsu, Y. H., and Chang, B. Y. 2008. Topological properties of the triple gene block protein 2 of Bamboo mosaic virus. Virology 379:1-9

12. H.Lodish; A.Berk; P.Matsudaira; C.A.Kaiser; M.Krieger; M.P.Scott; S.L.Zipursky; J.E.Darnell Molecular Cell Biology (5th Edition) W.H. Freeman & Company; 2003

13. Haupt, S., Cowan, G. H., Ziegler, A., Roberts, A. G., Oparka, K. J., and Torrance, L. 2005. Two plant-viral movement proteins traffic in the endocytic recycling pathway. Plant Cell 17:164-181.

14. Haylor MT, Brunt AA, Coutts RH. Conservation of the 3' terminal nucleotide sequence in five caflaviruscs.1990 Nucleic Acids Research 18, 6127.

15. Howard, A. R., Heppler, M. L., Ju, H.-J., Krishnamurthy, K., Payton, M. E. & Verchot-Lubicz, J. (2004). Potato virus X TGBp1 induces plasmodesmata gating and moves between cells in several host species whereas CP moves only in N. benthamiana leaves. Virology 328, 185-197.

16. Jackson, R. J., Hellen, C. U. & Pestova, T. V. (2010). The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol 11, 113-127.

17. Jackson, R. J., Hellen, C. U. & Pestova, T. V. (2012). Termination and post-termination events in eukaryotic translation. Adv Protein Chem Struct Biol 86, 45-93.

18. James E. Schoelza, Phillip A. Harriesb and Richard S. Nelsonc,Intracellular Transport of Plant Viruses: Finding the Door out of the Cell, Molecular Plant V4, №5, 2011, pages 813-831

19. K.V. Kanyuka, V.K. Vishnichenko, K.E. Levay, D.Yu. Kondrikov, E.V. Ryabov, S.K. Zavriev, Nucleotide sequence of shallot virus X RNA reveals a 5' proximal cistron closely related to those of potexviruses and a unique arrangement of the 3t-proximal cistronsJ. Gen. Virol. 73, 2553-2560 (1992)

20. Kalinina, N. O., Rakitina, D. V., Solovyev, A. G., Schiemann, J. & Morozov, S. Yu. (2002). RNA helicase activity of the plant virus movement proteins encoded by the first gene of the triple gene block. Virology 296, 321-329.

21. Kozak, M. (1986). Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell 44, 283-292.

22. Kozak, M. (2002). Pushing the limits of the scanning mechanism for initiation of translation. Gene 299, 1-34.

23. Liou, D. Y., Hsu, Y. H., Wung, C. H., Lin, N. S. & Chang, B. Y. (2000).Functional analyses and identification of two arginine residues essential to the ATP-utilizing activity of the triple gene block protein 1 of bamboo mosaic potexvirus. Virology 277, 336-344.

24. Lough, T. J., Netzler, N. E., Emerson, S. J., Sutherland, P., Carr, F.,Beck, D. L., Lucas, W. J. & Forster, R. L. S. (2000). Cell-to-cell movement of potexviruses: evidence for a ribonucleoprotein complex involving the coat protein and first triple gene block protein. Mol Plant Microbe Interact 13, 962-974.

25. Makarov, V., Rybakova, E., Efimov, A., Dobrov, E., Serebryakova, M., Solovyev, A., Yaminsky, I., Taliansky, M., Morozov, S., and Kalinina, N. 2009. Domain organization of the N-terminal portion of hordeivirus movement protein TGBp1. J. Gen. Virol. 90:3022-3032.

26. McDonald SM, RNA synthetic mechanisms employed by diverse families of RNA viruses.Wiley Interdiscip Rev RNA, 2013

27. Morozov, S. Y., and Solovyev, A. G. 2003. Triple gene block: Modular design of a multifunctional machine for plant virus movement. J. Gen. Virol. 84:1351-1366.

28. S. Sumi, T. Matsumi, T. Tsuneyoshi,Complete nucleotide sequences of garlic viruses A and C, members of the newly ratified genus Allexivirus. Arch. Virol. 144, 1819-1826 (1999)

29. S. Sumi, T. Tsuneyoshi, H. Furutani Novel rod-shaped viruses isolated from garlic, Allium sativum, possessing a unique genome organization., J. Gen. Virol. 74, 1879-1885 (1993)

30. Schepetilnikov, M. V., Solovyev, A. G., Gorshkova, E. N., Schiemann, J., Prokhnevsky, A. I., Dolja, V. V., and Morozov, S. Y. 2008. Intracellular targeting of a hordeiviral membrane-spanning movement protein: Sequence requirements and involvement of an unconventional mechanism. J. Virol. 82:1284-1293.

31. Shemyakina, E.A., Erokhina, T.N., Gorshkova, E.N., Schiemann, J., Solovyev, A.G. and Morozov, S.Yu. (2011). Formation of protein complexes containing plant virus movement protein TGBp3 is necessary for its intracellular trafficking. Biochimie 93, 742-748.

32. Shu-Chuan Lee, Chih-Hang Wu and Chao-Wen Wang. (2010) Traffic of a Viral Movement Protein Complex to the Highly Curved Tubules of the Cortical Endoplasmic Reticulum. Traffic 11: 912-930

33. Tamai, A., and Meshi, T. 2001. Cell-to-cell movement of Potato virus X: The role of p12 and p8 encoded by the second and third open reading frames of the triple gene block. Mol. Plant-Microbe Interact. 14:1158-1167.

34. Touriol, C., Bornes, S., Bonnal, S., Audigier, S., Prats, H., Prats, A. C. & Vagner, S. (2003). Generation of protein isoform diversity by alternative initiation of translation at non-AUG codons. Biol Cell 95, 169-178.

35. Tseng YH, Hsu HT, Chou YL, Hu CC, Lin NS, Hsu YH, Chang BY. The two conserved cysteine residues of the triple gene block protein 2 are critical for both cell-to-cell and systemic movement of Bamboo mosaic virus.Mol Plant Microbe Interact. 2009 Nov;22(11):1379-88.

36. Turina, M., Desvoyes, B. & Scholthof, K. B. (2000). A gene cluster encoded by panicum mosaic virus is associated with virus movement. Virology 266, 120-128.

37. Verchot-Lubicz J, Torrance L, Solovyev AG, Morozov SY, Jackson AO, Gilmer D (2010) Varied movement strategies employed by triple gene block-encoding viruses. Mol Plant-Microbe Interact 23: 1231-1247

38. Verchot-Lubicz, J., Ye, C.-M., and Bamunusinghe, D. 2007. Molecular biology of potexviruses: Recent advances. J. Gen. Virol. 88:1643-1655.

39. Wells, S. E., Hillner, P. E., Vale, R. D. & Sachs, A. B. (1998). Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Mol Cell 2, 135-140.

40. Westaway EG. Flavivirus replication strategy. Adv Virus Res 1987, 33:45-90.

41. Witwer C, Rauscher S, Hofacker IL, Stadler PF. Conserved RNA secondary structures in picornaviridae genomes. Nucleic Acids Res 2001, 29:5079-5089

42. Zamyatnin Jr., A.A., Solovyev, A.G., Bozhkov, P.V., Valkonen, J.P., Morozov, S. Yu, Savenkov, E.I., 2006. Assessment of the integral membrane protein topology in living cells. Plant J. 46, 145-154.

43. Zavriev SK, Kanyuka KV, Levay KE. The genome organization of potato virus M RNA.1991 Journal of General Virology 72, 9-14.

Размещено на Allbest.ru

...