Елементи стереотипної регуляції транскрипції ДНК in vitro фізіологічно активними речовинами

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії

УДК 571.1.01+577.21+615.5

02.00.10-біоорганічна хімія

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Елементи стереотипної регуляції транскрипції ДНК in vitro фізіологічно активними речовинами

Прокопенко В.В.

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Науковий керівник: член-кореспондент НАН України, доктор медичних наук, професор О.І. Луйк.

Науковий консультант: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник, Могилевич Сергій Євгенович, Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу медико-біологічних досліджень.

Офіційні опоненти:

- доктор хімічних наук, професор Ільченко Андрій Якович, Інститут органічної хімії НАН України, провідний науковий співробітник;

- доктор біологічних наук, старший науковий співробітник, Галкін Анатолій Павлович,

Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, завідувач відділу біоінженерії

Провідна організація: Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, відділ молекулярної біофізики.

Захист відбудеться "21" червня 2001 р. о 10 год. на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.220.01 в Інституті біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02094, Київ, вул. Мурманська, 1).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України (02004, Київ, вул. Мурманська, 1).

Автореферат розісланий "21" травня 2001 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.М. Федоряк.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Визначення провідної ролі аденілатциклазного каскаду та Cа-мобілізуючого каскаду поліфосфоінозитових ліпідів в біорегуляції найрізноманітніших клітинних функцій стало основою для визначення функціональної спільності ксенобіотиків, що подібним чином впливають на активність основних сигнальних систем. Ця подібність проявляється в наявності у різних в хімічному і фармакологічному відношенні ФАР стереотипного компонента в механізмах їх біорегуляторної дії.

Положення про наявність певних біорегуляторних стереотипів дії ФАР підтверджується експериментальними даними, отриманими в цілеспрямованих дослідженнях, що проводяться на базі відділу медико-біологічних досліджень ІБОНХ НАН України з кінця 80-х років на різноманітних модельних системах. В експериментах використовували об'єкти, для яких зв'язок біологічних функцій з відповідями основних сигнальних систем просліджується чітко і однозначно. Поряд з цим, зростає інтерес дослідників до вивчення впливу ФАР на обєкти, біологічні функції яких безпосередньо не повязані з відповідями основних сигнальних систем (біомембрани, деякі білки крові). Проте, ці обєкти можуть якісно по-різному реагувати на наявність речовин двох виділених класів.

Особливий інтерес викликає дослідження впливу ФАР на генну експресію, одну з центральних ролей в якій відіграє транскрипція. Регуляція транскрипції має складний багатоступінчастий характер з задіянням багатьох регуляторних білків. Більшість досліджень, присвячених вивченню впливу ФАР на транскрипцію обмежені виявленням інтеркаляторних властивостей різних лігандів, або спрямовані на визначення ролі тих або інших регуляторів білкової природи. Хоча не менш важливим, на наш погляд, є дослідження регуляторної дії ФАР безпосередньо на "головних учасників" транскрипції - ДНК, РНК та ДНК-залежну РНК-полімеразу.

З теоретичної і практичної точки зору, актуальним є вивчення як самої дії типових представників двох класів ФАР з протилежними біорегуляторними стереотипами на транскрипцію, так і зв'язку між цим впливом і структурою ФАР при створенні лікарських засобів, спрямованих на регуляцію генної експресії.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є розвитком досліджень по вивченню дії представників вихідних класів ієрархічної класифікації ФАР на функціональні елементи основних сигнальних систем та аналізу зв'язку структура-активність хімічних сполук.

Робота виконувалась згідно з тематикою відділу медико-біологічних досліджень ІБОНХ НАН України (теми №2.1.10.18(36)-9г та №2.1.10.18-99в, №№ держ. реєстрації 0195U025780 та №0199U003951).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягала у виявлені елементів біорегуляторної стереотипії у дії ФАР на процес транскрипції in vitro із застосуванням методів математичного моделювання.

Основні задачі дослідження:

Вивчити вплив специфічних агоністів та антагоністів зовнішньомембранних рецепторів на транскрипцію in vitro ДНК плазміди pGEM-3Zf(+) та послідовностей ДНК, що кодують ділянки рецепторів, відповідальні за зв'язування з лігандами.

Оцінити можливість завбачення здатності молекул активувати або блокувати рецептори методом k-найближчих сусідів в поєднанні з еволюційною стратегією.

Провести пошук спільних структурних фрагментів молекул блокаторів та активаторів рецепторів електронно-топологічним методом.

Об'єктом дослідження є біорегуляторні стереотипи дії ФАР, що виявляться на різноманітних модельних системах.

Предмет дослідження - стереотип дії ФАР на процес транскрипції ДНК in vitro.

Наукова новизна одержаних результатів. Отримані дані, що свідчать про біорегуляторний вплив агоністів та антагоністів зовнішньомембранних рецепторів на процес транскрипції in vitro. Вперше показано збереження стереотипу в дії лігандів рецепторів на таку автономну і високоспецифічну систему, яка не входить до складу жодного каскаду клітинної сигналізації.

Показано, що такі біорегуляторні властивості речовин, як загальна активуюча або блокуюча спрямованість їх дії на сукупність адренорецепторів, m-холінорецепторів та рецепторів хемотактичних пептидів, визначаються досить загальними ознаками будови ФАР. Ці ознаки не можуть бути зведені до конкретного фармакофорного угрупування, як це має місце при встановленні зв'язку між структурою і виявом якогось більш певного виду активності, наприклад, блокади або активації якого-небудь одного конкретного типу рецептора. Найбільш загальні ознаки будови ФАР, об'єднаних лише за загальною спрямованістю дії, полягають у сполученнях множини більш певних структурних характеристик.

Створено ефективний комп'ютерний алгоритм, що базується на застосуванні методів k-найближчих сусідів та еволюційної стратегії, за яким можна розподіляти речовини на класи за типом їх впливу на рецептори (активатори та блокатори).

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати можуть бути використані, головним чином, в двох актуальних практичних напрямках. По-перше, при розробці принципово нової стратегії конструювання лікарських засобів (та інших ФАР), яка враховує існування стереотипних механізмів біорегуляції. Ця стратегія доповнює існуючу на сьогоднішній день методологію, спрямовану на отримання (за окремими ознаками хімічної будови) сполук з максимально специфічною фармакологічною дією. По-друге, результати роботи можуть бути корисними для таких важливих цілей фармакотерапії, як аналіз особливостей побічної дії лікарських засобів, більш ефективне використання відомих препаратів при лікуванні хвороб, що мають багатофакторне походження, і розробка нових схем терапії таких хвороб.

Особистий внесок здобувача. Порівняльне вивчення впливу ФАР на транскрипцію, вивчення впливу специфічних лігандів зовнішньомембранних рецепторів на транскрипцію фрагментів генів цих рецепторів, в тому числі створення плазмідних конструкцій, що несуть фрагменти генів адренорецепторів, та транскрипція фрагментів генів адренорецепторів проведені особисто дослідником. Порівняльна перевірка транскрипції in vitro як модельної системи для вивчення біорегуляторних стереотипів виконана спільно з співавторами публікацій за темою дисертації. Оцінка можливості завбачення здатності молекул активувати або блокувати рецептори методом k-найближчих сусідів в поєднанні з еволюційною стратегією та пошук спільних структурних фрагментів молекул блокаторів та активаторів рецепторів електронно-топологічним методом здійснювалися за безпосередньої участі здобувача.

Апробація результатів дисертації. Основні результати роботи були представлені на першій міжнародній конференції з сигнальної трансдукції (1st International Conference on Signal Transduction October 1998, Dubrovnik, Croatia); п'ятому світовому конгресі хіміків-теоретиків (5th World Congress Of Theoretically Oriented Chemists, WATOC'96 August 1999, London, UK), XIV науковій конференції з біоорганічної хімії та нафтохімії (Київ, березень 1999). Результати окремих етапів роботи доповідались і обговорювались на наукових семінарах відділу медико-біологічних досліджень Інституту біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України.

Публікації. Основні результати роботи викладено в 7 статтях та 2 тезах доповідей.

Структура та об'єм роботи. Дисертація складається з вступу, огляду літератури (1 розділ), опису методів досліджень (1 розділ), викладу та обговорення одержаних результатів (3 розділи), висновків та списку літератури, який включає 135 найменувань. Робота викладена на 134 сторінках машинописного тексту, ілюстрована 20 рисунками та 8 таблицями.

Результати досліджень та їх обговорення

1. Дослідження впливу ФАР на транскрипцію in vitro з застосуванням ДНК-залежної РНК-полімерази фага Т7

Наявність біорегуляторних стереотипів дії ФАР найчастіше визначається на модельних обєктах, інтегральні відповіді яких безпосередньо і однозначно повязані з балансом активностей двох основних сигнальних каскадів клітини.

Поряд з цим, останнім часом з'являються дані про стереотипну біорегуляторну дію ФАР на об'єкти, для яких зв'язок біологічних функцій з відповідями основних сигнальних систем неоднозначний, або взагалі досі не встановлений (конформаційні та фізико-хімічні параметри біомембран, конформаційні параметри молекули альбуміну сироватки людини). Між тим, навіть ці моделі у багатьох випадках якісно по-різному розпізнають речовини двох виділених класів.

Як одну з таких модельних систем ми використали транскрипцію in vitro, що базується на застосуванні вірусної ДНК-залежної РНК-полімерази фага Т7. Система транскрипції in vitro як надмолекулярний біооб'єкт викликає особливий інтерес, оскільки вона моделює один із ключових процесів, що відбуваються на рівні генома.

Вивчення впливу ФАР на транскрипцію плазміди pGEM-3Zf (+)

З метою виявлення біорегуляторних стереотипів ФАР на високочутливій моделі, яка явно не містить елементів сигнальних каскадів, був оцінений вплив агоністів та антагоністів деяких зовнішньомембранних рецепторів на процес транскрипції in vitro. Вибір саме цих ФАР зумовлений тим, що ці сполуки мають дуже високу активність на специфічних мішенях. Експерименти по вивченню впливу ФАР на транскрипцію in vitro проводилися по відомих методиках з деякими модифікаціями. Як ДНК-матрицю використовували плазміду pGEM-3Zf (+), що містить промотор Т7.

Проведено вивчення стереотипії дії двох груп ФАР (рис.1). Результати вивчення впливу досліджуваних речовин на процес транскрипції in vitro наведені в табл. 1.

Таблиця 1

Вплив досліджуваних ФАР на транскрипцію in vitro

Препарат	Концентрація, моль/л	Активність ферменту* ( % до контролю)**
+І/-ІІ
Празозин	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 814 624
Йохімбін	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 857 557
Атропін	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 100 646
Ізадрин	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 100 100
Клонідин	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 100 1205
-І/+ІІ
Обзидан	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 100 707
Мезатон	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 100 1084
Карбахол	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 100 1186
fMLP	1*10-6 1*10-5 1*10-4	100 1154 1217

*Активність Т7 РНК-полімерази в досліді визначали по включенню уридин-5'-трифосфатів в кислотонерозчинний продукт. За 30 хв. при 37⁰С 1 од. ферменту включала 210±пмоль уридин-5'-трифосфатів.

**Значення "100" означає відсутність статистично достовірного впливу; інші показники вірогідно (0,05>P>0,001) відрізняються від контролю

Речовини групи +І/-ІІ у концентрації 1*10-4 моль/л діють на транскрипцію наступним чином. Атропін інгібує транскрипцію на 36%, празозин на 38% і йохімбін на 45%. В концентрації 1*10-5 моль/л вірогідно пригнічують транскрипцію тільки празозин (на 19%) і йохімбін (на 15%). Ізадрин не проявив впливу на транскрипцію. Клонідин у концентрації 1*10-4 моль/л вірогідно активував транскрипцію на 20%.

У групі речовин класу -І/+ІІ мезатон, карбахол і fMLP вірогідно активують РНК-полімеразну реакцію на 8-21%. Активуючий вплив fMLP (на 15%) виявляється і при концентрації 1*10-5 моль/л. Обзидан на 30% пригнічує транскрипцію у концентрації 1*10-4 моль/л.

Взагалі, можна сказати, що використана модельна система показала неповне розділення речовин за стереотипом дії на елементи трансдукуючих сигнальних каскадів на першому рівні ієрархічної класифікації ФАР. Але якщо розглядати другий рівень зазначеної класифікації (рис.2), на якому речовини діляться по типу дії на рецептори основних сигнальних систем клітин (блокатори та активатори), виявлений в транскрипції in vitro вплив демонструє повне розділення. Всі антагоністи з числа досліджуваних речовин (обзидан, празозин, йохімбін і атропін), в достатньо низьких концентраціях (від 1*10-5 до 1*10-4 моль/л) пригнічують транскрипцію. У групі агоністів рецепторів жодна ФАР не інгібувала транскрипцію. Навпаки, у концентрації 1*10-4 моль/л мезатон, клонідин, карбахол, а fMLP і в концентрації 1*10-5 моль/л, вірогідно активують реакцію.

Описані закономірності виявлені в експериментах із застосуванням як матриці неспецифічної плазмідної ДНК. Враховуючи, що більшість досліджуваних ФАР є агоністами та антагоністами зовнішньомембранних рецепторів, можна очікувати більш виражених ефектів в разі застосування як матриці нуклеотидних послідовностей, кодуючих деякі ділянки відповідних рецепторів.

Вивчення впливу специфічних лігандів зовнішньомембранних рецепторів на транскрипцію фрагментів генів цих рецепторів

Кількісний аналіз залежності здатності рецепторів зв'язувати різноманітні ліганди від подібності і відмінності ряду фізико-хімічних властивостей їх амінокислотних послідовностей показав, що ділянки зв'язування антагоністів локалізовані, в основному, в третьому та сьомому трансмембранних доменах, що співпадає з літературними джерелами. В той же час існують дані, які показують, що найбільш ймовірні місця зв'язування агоністів цих рецепторів розташовані в четвертій, п'ятій та шостій трансмембранних спіралях. Кодуючі послідовності генів рецепторів основних сигнальних систем клітин дуже консервативні і мають значну подібність, а найбільше унікальних послідовностей знаходиться саме в областях зв'язування ліганду. Враховуючи все вище наведене, як специфічні матриці були вибрані фрагменти генів ?1В- та ?1-адренорецепторів щура, що кодують третій та четвертий трансмембранні домени (місця зв'язування антагоністів та агоністів, відповідно).

Перед проведенням експериментів з визначення впливу ФАР на транскрипцію специфічних фрагментів ДНК була здійснена попередня робота по створенню штучного носія заданої послідовності. Із застосуванням полімеразної ланцюгової реакції були отримані послідовності, що кодують третю та четверту трансмембранні спіралі 1В- та 1-адренорецепторів щура. Ці фрагменти клонували в полілінкерній області плазміди pSK+ під управлінням промотору Т7. Гібридні плазміди використовували в подальшій транскрипції.

В експериментах по вивченню впливу ФАР на транскрипцію in vitro фрагментів послідовностей ДНК, що кодують ділянки зв'язування зовнішньомембранних рецепторів, проведено порівняльне вивчення ряду речовин (рис. 1). З числа блокаторів досліджені обзидан (антагоніст -адренорецепторів) та празозин (антагоніст 1-адренорецепторів), з числа активаторів - ізадрин (агоніст -адренорецепторів) та мезатон (агоніст 1-адренорецепторів).

Результати, наведені в табл. 2, свідчать, що застосування як матриці в РНК-полімеразній реакції послідовностей ДНК, що кодують різні ділянки адренорецепторів, не привело до зміни спрямованості впливу ФАР на цю реакцію у порівнянні із застосуванням як матриці плазмідної ДНК. Обзидан і празозин, незалежно від послідовності ДНК, в концентрації 1*10-4 моль/л пригнічують транскрипцію (на 26-35 та 35-41% відповідно). Серед активаторів спостерігається або відсутність впливу (у випадку ізадрину), або невелика (на 6-13%) активація під впливом мезатона.

Отримані дані не підтверджують наявність специфічних місць зв'язування лігандів рецепторів на фрагментах кодуючої послідовності генів цих рецепторів. Незалежно від послідовності ДНК-матриці процес транскрипції приблизно однаково реагував на антагоністи (пригнічення полімеризації або відсутність впливу) та агоністи (підсилення транскрипції або відсутність впливу), тобто не виявлено специфічного підсилення або пригнічення впливу на синтез РНК, що кодує ділянки "своїх" рецепторів. Можливо, місце зв'язування ФАР формується на комплексі ДНК - РНК-полімераза, або розташоване на самому ферменті. Незалежно від цих припущень, найголовнішим встановленим фактом є те, що процес транскрипції регулюється досліджуваними ФАР із збереженням біорегуляторного стереотипу дії останніх.

Таблиця 2. Вплив ФАР на транскрипцію in vitro фрагментів, кодуючих трансмембранні домени рецепторів основних сигнальних систем клітин

Клон	Кодуюча послідовність	Препарат	Концентрація моль/л	Активність РНК-полімерази* (% до контролю)**
pSKб1В12 pSKб1В23	Послідовність III домену б1В- адренорецептора	Обзидан	110-6 110-5 110-4	100 100 746
		Празозин	110-6 110-5 110-4	100 786 655
		Ізадрин	110-6 110-5 110-4	100 100 100
		Мезатон	110-6 110-5 110-4	100 100 1096
pSKб1В37 pSKб1В39	Послідовність IV домену б1В- адренорецептора	Обзидан	110-6 110-5 110-4	100 100 714
		Празозин	110-6 110-5 110-4	100 845 604
		Ізадрин	110-6 110-5 110-4	100 100 100
		Мезатон	110-6 110-5 110-4	100 100 1126
pSKб1В61 pSKб1В71	Послідовність III та IV доменів б1В- адренорецептора	Обзидан	110-6 110-5 110-4	100 100 747
		Празозин	110-6 110-5 110-4	100 836 604
		Ізадрин	110-6 110-5 110-4	100 100 100
		Мезатон	110-6 110-5 110-4	100 100 1095
PSK в12 PSK в116	Послідовність III домену в1- адренорецептора	Обзидан	110-6 110-5 110-4	100 100 666
		Празозин	110-6 110-5 110-4	100 845 605
		Ізадрин	110-6 110-5 110-4	100 100 100
		Мезатон	110-6 110-5 110-4	100 100 1116
pSK в1234 pSK в138	Послідовність IV домену в1- адренорецептора	Обзидан	110-6 110-5 110-4	100 100 736
		Празозин	110-6 110-5 110-4	100 775 604
		Ізадрин	110-6 110-5 110-4	100 100 100
		Мезатон	110-6 110-5 110-4	100 100 1064
PSK в167 PSK в173	Послідовність III та IV доменів в1- адренорецептора	Обзидан	110-6 110-5 110-4	100 100 657
		Празозин	110-6 110-5 110-4	100 834 594
		Ізадрин	110-6 110-5 110-4	100 100 100
		Мезатон	110-6 110-5 110-4	100 100 1135

*Активність Т7 РНК-полімерази в досліді визначали по включенню уридин-5'-трифосфатів в кислотонерозчинний продукт. За 30 хв при 37⁰С 1 од. ферменту включала 210±пмоль уридин-5'-трифосфатів.

**Значення "100" означає відсутність статистично достовірного впливу; інші показники вірогідно (0,05>P>0,001) відрізняються від контролю

2. Завбачення здатності молекул активувати або блокувати рецептори методом k-найближчих сусідів в поєднані з еволюційною стратегією

Виявлені на моделі транскрипції in vitro спільні властивості у групах ФАР, що мають активуючу чи блокуючу загальну спрямованість дії на різні рецептори, скоріш за все, зумовлені наявністю спільних рис хімічної будови речовин у межах кожної з цих двох груп. Таке припущення може бути перевірене різними за своєю ідеологією підходами. Зокрема, на наступному етапі роботи будову та інші фізико-хімічні властивості молекул ми закодували великою кількістю індексів, з яких частина має конкретний фізичний зміст, а інші мають переважно формальний характер. Далі такі індекси проаналізували методами штучного інтелекту.

Для моделювання сполук навчального набору використовувалися дві програми молекулярного моделювання. Це програма молекулярної механіки PCModel фірми Sirena та пакет квантово-хімічних програм MOPAC. За допомогою першої програми задавалася початкова геометрія молекул активаторів і блокаторів, з подальшою повною оптимізацією геометрії за допомогою напівемпіричного квантово-хімічного методу АМ1 з пакета програм МОРАС. Ці дані стали головними елементами для кодування хімічних будов топологічними індексами. В результаті повної оптимізації геометрії кожної з 253 сполук початкової відбірки для навчання, а також для 9 молекул тестового набору були розраховані матриці зв'язності та розподілу густини зарядів.

Топологічні індекси являють собою числа, що описують структуру молекули. Вони утворюються шляхом перетворення хімічного графа (математичний аналог хімічної формули) в число за певним алгоритмом. Кожна з сполук була закодована 277 топологічними індексами. Ті індекси, що мали вирішальне значення для нашої роботи, будуть розшифровані нижче.

Для пошуку індексів, які описують активність двох класів сполук найкращим чином, ми використовували процедуру, яка поєднує метод k-найближчих сусідів з еволюційною стратегією. Саме таке поєднання було успішно використано раніше для пошуку загальних рис імуномодуляторів пептидної природи, інгібіторів 5-ліпоксигенази, інгібіторів альдегіддегідрогенази, а також сполук, які певним чином діють на сигнальні системи клітини.

Ми навчили комп'ютерну систему розподіляти речовини на класи за типом їх впливу на адрено- та холінорецептори. Для навчання використовувався банк даних, який складався з 253 сполук відомого типу. В результаті роботи навчального алгоритму було отримано 14 наборів індексів, які описують активність сполук відбірки для навчання з достатньо високим відсотком 93,28%. Тобто 236 з 253 сполук були класифіковані вірно. В кожному випадку, кількість параметрів не перевищувала 9. Знайдені набори параметрів, їх кількість і порядкові номери подані в таблиці 3.

Нижче наведений більш детальний опис відібраних індексів.

Індекс 2 - індекс Вінера, розрахований з використанням модифікованої матриці відстаней D'(G):

Індекс 4 - аналог індексу Балабана

,

розрахований з використанням модифікованої матриці відстаней D'(G):

та ,

де Ne і Nv - відповідно кількість ребер та вершин у хімічному графі.

Таблиця 3

Набори індексів, що мають високу прогнозуючу здатність активності сполук

Індекс 19 - логарифм суми коефіцієнтів характеристичного полінома матриці D'(G).

Індекс 41 - індекс молекулярної форми 1-го порядку:

де А - кількість атомів, а P - кількість шляхів довжини 1 (зв'язків) в молекулі.

Індекс 94 - найбільше власне значення матриці D'(G) нормоване на кількість атомів в молекулі, щоб зменшити залежність індексів від розмірів молекул

Індекс 97 - логарифм суми коефіцієнтів характеристичного полінома матриці A'(G), нормований на кількість атомів в молекулі, щоб зменшити залежність індексів від розмірів молекул

Індекс 124 - сольватаційний топологічний індекс 1-го порядку з врахуванням атомів водню, нормований на кількість атомів в молекулі:

Індекс 131 - загальний топологічний індекс нормований на кількість атомів в молекулі:

,

де A - кількість атомів в молекулі, а tij визначається формулою:

,

де - валентне дельта вершин, що лежать на шляху від i до j, з вершинами i та j включно. nij - число таких вершин. Сума по всіх шляхах, що ведуть від i до j.

Індекси 157, 160, 162, 181, 188

Функції диссиметрії та інші параметри, розраховані з використанням тензора інерції та його аналогів (з іншими параметрами атомів). Ці параметри розраховуються для всіх атомів.

Індекс 157 - найбільше власне значення тензора E1, Розрахунки проводять включаючи атоми водню і всі атоми характеризуються їхньою масою

Індекс 160 - Аналогічно до 157 E1 / E2

Індекс 162 - Аналогічно 157 E2 / E3

Індекс 181 - E1 / E3 розрахований для всіх атомів, включаючи атоми водню, але всім атомам присвоєно значення 1 і розглядається лише їх просторове розташування.

Індекс 188 - друге по величині власне значення тензора E2. Атоми характеризуються їхньою масою без урахування атомів водню.

Індекс 222 - Кількість атомів кисню, зв'язаних простими зв'язками.

Індекс 235 - Кількість атомів кремнію.

Індекс 241 - Кількість атомів фосфору.

Індекс 244 - Кількість енольних атомів водню.

Індекс 246 - Кількість карбоній-іонів (С+).

Індекс 249 - Кількість атомів свинцю.

Індекс 251 - Кількість атомів телуру.

Аналізуючи дані таблиці знайдених наборів індексів слід відзначити, що внесок того чи іншого параметра у загальну прогнозуючу здатність комп'ютерної експертної системи неоднаковий. Так, параметри, які входять у більшість з 14 наборів, треба вважати основними, і саме навколо них будується весь прогнозуючий алгоритм. Це індекси 4, 41, 157, 162, 181, 222, та 244.

При перевірці отриманих наборів на тестовій відбірці (структури сполук наведені на рис.1), 8 з 9 сполук були класифіковані вірно. Неправильно була передбачена активність лише пептидного імуномодулятора fMLP. Такий недолік цілком припустимий, тому що серед речовин, які увійшли у відбірку для навчання, взагалі не було пептидних сполук, і тому при прогнозуванні їх вплив може трактуватися неоднозначно. Що стосується інших 8 речовин, то для всіх них теоретичні розрахунки підтвердили експериментальні дані. Це свідчить про те, що нами отримана достатньо ефективна комп'ютерна система, яка може розподіляти речовини на класи за типом їх впливу на адрено- та холінорецептори.

3. Пошук спільних структурних фрагментів молекул блокаторів та активаторів рецепторів електронно-топологічним методом (ЕТМ)

Виходячи з експериментальних даних та припущення, що схожість біологічної дії речовин обумовлена загальними рисами їх хімічної будови, у дослідженнях, яким присвячений цей розділ роботи, ми спробували виявити більш або менш детерміноване спільне для всіх молекул тієї чи іншої категорії фармакофорне угрупування атомів з характерними зарядами та взаємним розташуванням у просторі.

Як правило, фармакофори, тобто конкретні хімічні угрупування, що обумовлюють фармакологічну дію лікарських речовин, визначають непрямим методом на основі даних про речовини, які мають досліджувану активність, у порівнянні зі сполуками, що такої активності не мають. У нашому конкретному випадку мова йде про агоністи рецепторів, їх антагоністи та неактивні щодо даних біосубстратів речовини.

Хімічні структури при визначенні фармакофорів представляють у вигляді дескрипторних центрів (ДЦ), що відповідають частинам фармакофора, здатним взаємодіяти з рецептором, та матриці відстаней, яка описує взаємне розташування ДЦ. Відстані можуть вимірюватися як в топологічних (кількість звязків), так і в геометричних одиницях (ангстремах).

В нашій роботі для визначення фармакофорів був застосований ЕТМ, вперше розроблений Дімогло. Цей метод (в найпростішому варіанті) розглядає молекулу як матрицю, діагональними елементами якої є заряди атомів, а недіагональними - відстані між атомами. Застосування способу знаходження спільних фрагментів як клік графа сумісності і використання для цього одного з найкращих алгоритмів такого типу дозволило прискорити розрахунки і розглядати значно більший обсяг даних.

Загальна схема методу така:

- квантово-хімічні розрахунки структур і вибір конформацій;

- вибір контрольної молекули, з якою будуть порівнюватися всі інші молекули. Це або найактивніша молекула, або молекула з найбільш дослідженими конформаціями. У нашому випадку при невеликих вибірках, що складаються тільки з найбільш характерних антагоністів і агоністів рецепторів, кожна з молекул, що досліджується, послідовно приймалася як контрольна;

- попарне порівняння усіх молекул з контрольною і виділення спільних фрагментів з використанням пошуку клік графа сумісності; фрагменти заносяться в базу даних і по них набирається попередня статистика;

- перевірка менших фрагментів на входження в більші; проводиться також за допомогою графа сумісності. В результаті набирається повна статистика по фрагментах; після цього їх можна оцінювати за певними статистичними критеріями;

- статистична оцінка параметрів та вибір серед них статистично достовірних.

Квантово-хімічні розрахунки та вибір конформацій є одною з основних передумов застосування електронно-топологічного методу і одночасно одною з найскладніших його частин. Як правило, вибираються відомі конформації, або конформації, що відповідають енергетичному мінімуму. Загалом, чим жорсткіші структури, тим достовірніші результати, отримані за допомогою ЕТМ.

Ключовим у роботі алгоритму є третій етап. Він включає побудову графа сумісності кожної із молекул з контрольною молекулою, а також пошук його клік.

Після виділення усіх клік (спільних елементів структури двох молекул) проводилося їх порівняння між собою з метою відкидання фрагментів, що повторюють уже існуючі.

Для оцінки статистичної значимості фармакофорів застосовували два критерії: байесівська оцінка імовірності того, що сполука, яка має даний фрагмент, буде відноситись до класу сполук Ak та коефіцієнт кореляції якісних ознак Юла.

Статистичну значимість знайденої кореляції визначали після обчислення величини t критерію Ст'юдента. Обчислені значення порівнюють з наведеними в статистичних таблицях для певних рівнів значимості . Якщо обчисленні значення критерію Ст'юдента більші за табличні, то звязок досліджуваної ознаки з приналежністю речовини до певного класу значимий на заданому рівні значимості. В нашій роботі використовувалося значення t = 2.0, що відповідає рівню значимості 0,975 для 60 ступенів свободи. Дані, отримані ЕТМ, наведені в табл. 4.

Таблиця 4

Спільні структурні фрагменти, характерні для блокаторів і активаторів клітинних рецепторів, виявлені за допомогою ЕТМ

Контрольна молекула	Фрагменти (№ атомів)*	Кількість молекул, у яких зустрічається фрагмент
		Блокатори	Активатори
Блокатори (антагоністи) рецепторів
Обзидан	5, 6, 11, 16, 21 5, 6, 7, 16, 21 2, 11, 12, 18 8, 9, 10, 17 3, 4, 9, 15 6, 13, 21 4, 16, 17	4 4 4 4 4 4 4	0 0 0 0 0 0 0
Празозин	9, 10, 26, 27, 28 1, 2, 7, 30 9, 10, 28, 29 17, 18, 22, 28 6, 9, 21, 22 5, 9, 10, 12 5, 6, 8, 21 6, 7, 8, 16 25, 26, 30 18, 19, 24	4 4 4 4 4 4 4 4 4 4	0 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Йохімбін	5, 6, 11, 16, 21 5, 6, 7, 16, 21 2, 11, 12, 18 8, 9, 10, 17 3, 4, 9, 15 6, 13, 21 4, 16, 17	4 4 4 4 4 4 4	0 0 0 0 0 0 0
Атропін	5, 6, 15, 21 6, 15, 18, 21 3, 13, 17, 18 3, 13, 15, 16 1, 2, 13, 14 8, 10, 22 1, 2, 17	4 4 4 4 4 4 4	0 0 0 0 0 0 0
Активатори (агоністи) рецепторів
Ізадрин	8, 11, 13, 19 8, 12, 13, 18 1, 12, 13, 17 10, 18, 19	0 0 0 0	4 4 4 4
Мезатон	2, 9, 10, 14 1, 2, 9, 14 1, 2, 9, 12 7, 12, 14 1, 10, 14 2, 9, 14	0 0 0 1 0 0	4 4 4 5 4 4
Клонідин	4, 10, 11, 16 1, 2, 3, 5 1, 5, 10	0 0 0	4 4 4
Карбахол	6, 7, 8, 10 1, 2, 6	0 1	4 5
fMLP	1, 2, 5, 27 17, 33, 34 5, 26, 34	0 1 0	4 5 4

*Робоча нумерація атомів, застосована для виявлення спільних структурних фрагментів, харак-терних для блокаторів і активаторів клітинних рецепторів наведена на рис.1.

Ні в молекулах антагоністів, ні в молекулах агоністів не вдається виділити конкретний, єдиний для кожної з цих двох груп, універсальний фармакофорний центр, який цілком відповідав би за їх блокуючі або активуючі ефекти. Разом з тим, вдалося виявити велику кількість спільних фрагментів вельми простої будови.

У молекулах блокаторів виявлений 31 спільний фрагмент, кожний з яких присутній тільки в молекулах даної групи і відсутній в молекулах активаторів. У активаторів визначено 18 найбільш загальних фрагментів. З них 15 присутні в яких-небудь чотирьох з п'яти досліджених молекул, але відсутні в групі антагоністів, а 3 фрагменти є у всіх п'яти сполуках даної групи, але одночасно присутні і в якій-небудь одній з речовин блокуючого типу дії. Для прикладу в таблиці 5 наведена електронно-топологічна матриця одного зі спільних фрагментів, знайдених для блокаторів рецепторів при використанні атропіну як контрольної молекули. Цей фрагмент складається з двох зв'язаних атомів вуглецю (№5 і №6), що належать ароматичному кільцю, і також зв'язаних між собою атомів вуглецю (№15) та азоту (№21), розташованих на певній відстані від першої пари.

Зрозуміло, що ні цей, ні кожний з інших знайдених фрагментів нарізно не може визначати агоністичну або антагоністичну активність ФАР. Можна зробити висновок, що такі найбільш загальні властивості речовин, як активуюча або блокуюча спрямованість їх дії на ті або інші рецептори, в свою чергу визначаються і найбільш загальними ознаками будови ФАР. Ці ознаки не можуть бути зведені до якого-небудь одного конкретного фармакофорного угрупування, як це має місце при встановленні зв'язку між структурою і якимось більш певним видом активності, скажімо, блокади або активації якого-небудь одного конкретного рецептора. Треба вважати, що найбільш загальні ознаки будови ФАР, об'єднаних лише по загальній спрямованості дії на біосубстрати, полягають у сполученнях множини більш певних структурних характеристик.

Загалом отримані дані підтверджують припущення про наявність елементів структурної спільності в групах активаторів та блокаторів біомакромолекул та правомірність виділення відповідних груп при побудові другого рівня ієрархічної класифікації ФАР.

Висновки

1. У дисертації наведене нове вирішення наукової задачі, що виявляється в визначенні біорегуляторного впливу агоністів та антагоністів зовнішньомембранних рецепторів на процес транскрипції in vitro.

2. Вперше показаний біорегуляторний вплив специфічних лігандів зовнішньомембранних рецепторів клітини на процес транскрипції. Встановлено, що блокатори рецепторів клітинних сиг-нальних каскадів пригнічують транскрипцію. Серед активаторів рецепторів жодна ФАР не інгібувала РНК-полімеразну реакцію, а деякі з них (мезатон, клонідин, карбахол і fMLP) в концентрації 1*10-4 моль/л достовірно активують транскрипцію. При цьому зберігається стереотип дії активаторів та блокаторів рецепторів, незважаючи на те, що система транскрипції не має безпосереднього зв'язку з клітинними системами сигнальної трансдукції.

3. Показано, що активуюча або блокуюча спрямованість дії специфічних лігандів зов-нішньомембранних рецепторів не може бути пов'язана з конкретним єдиним для кожної з цих груп універсальним фармакофорним центром. Водночас, у молекулах антагоністів виявлено 31 спільний фрагмент, у активаторів 18 найбільш загальних фрагментів, які у сукупності можуть обумовлювати відповідно антагоністичну або агоністичну дію сполук на рецептори.

4. Показана ефективність застосування еволюційної стратегії в комбінації з методом "k -найближчих сусідів" для прогнозування активності сполук, об'єднаних по загальній спрямованості дії на біосубстрати. Отримана ефективна комп'ютерна система, яка може розподіляти речовини на класи за типом їх впливу на адрено- та холінорецептори з достатньо високим відсотком правильної класифікації (до 95%).

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Прокопенко В.В., Набока Ю.Н., Метелица Л.А., Могилевич С.Е., Гуща Т.О., Луйк А.И. Чувствительность молекулярных, надмолекулярных и клеточных биообъектов к катионам тяжелых металлов // Современные проблемы токсикологии. - 1999. - №3. - С. 18-21.

2. Луйк А.И., Прокопенко В.В., Набока Ю.Н. Метелица Л.А., Могилевич С.Е., Чарочкина Л.Л., Семенюта И.В. Молекулярные, надмолекулярные и клеточные биомодели как объекты экологического мониторинга // Доповіді НАН України. - 1999. - №10. - С. 160-165.

3. Прокопенко В.В., Луйк А.И. Транскрипция in vitro как модельная система для выявления наиболее общих свойств физиологически активных веществ, действующих на рецепторы внешеней клеточной мембраны // Доповіді НАН України. - 1999. - №6. - С. 176-179.

4. Прокопенко В.В., Холодович В.В., Луйк А.И. Выявление наиболее общих свойств агонистов и антагонистов внешнеклеточных рецепторов на модели транскрипции in vitro // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, №1. - С. 23-27.

5. Батрак Г.Н., Могилевич С.Н., Луйк А.И., Прокопенко В.В. Топологическое подобие участков связывания антагонистов в рецепторах биогенных аминов // Укр. биохим. журнал. - 1999. - Т. 71, №3. - C. 73-77.

6. Луйк А.И., Прокопенко В.В., Танчук В.Ю., Холодович В.В., Семенюта И.В. Общие свойства фармакологических агонистов и антагонистов внешнемембранных рецепторов // Вопросы мед. химии. - 1999. - Т. 45, №6. - С. 514-523.

7. Луйк О.І., Прокопенко В.В., Танчук В.Ю., Холодович В.В. Загальні властивості фізіологічно активних речовин, які діють на рецептори зовнішньої клітинної мембрани // Ліки. - 1998. - №6. - С. 62-67.

8. Luik A.I., Prokopenko V.V., Kholodovych V.V. Influence of agonists and antagonists of external cellular receptors on T7 RNA polymerase in vitro transcription // 1st International Conference on Signal Transduction, Dubrovnik, Croatia. - 1998. - P. 76.

9. Kholodovych V.V., Kovalishyn V.V., Prokopenko V.V., Luik A.I. Search of Common Features in Groups of Cellular Receptors' Agonists and Antagonists // 5th World Congress оf Theoretically Oriented Chemists, WATOC'96. London, UK. - 1999. - P. 529.

рецептор vitro молекула антагоніст

Анотація

Прокопенко В.В. Елементи стереотипної регуляції транскрипції днк in vitro фізіологічно активними речовинами. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 02.00.10 - біоорганічна хімія. Інститут біоорганічної хімії та нафтохімії НАН України, Київ, 2001

Дисертацію присвячено виявленню елементів біорегуляторної стереотипії у дії фізіологічно активних речовин на процес транскрипції in vitro із застосуванням методів математичного моделювання. Показаний біорегуляторний вплив специфічних лігандів зовнішньомембранних рецепторів клітини на процес транскрипції. При цьому зберігається стереотип дії активаторів та блокаторів рецепторів. З застосуванням електронно-топологічного методу знайдені елементи структурної спільності в групах блокаторів та активаторів зовнішньомембранних рецепторів. Отримана ефективна комп'ютерна система, яка може розподіляти речовини на класи за типом їх впливу на адрено- та холінорецептори.

Ключові слова: біорегуляторний стереотип, фізіологічно активні речовини, транскрипція, електронно-топологічний метод, методи штучного інтелекту.

Аннотация

Прокопенко В.В. Элементы стереотипной регуляции транскрипции днк in vitro физиологически активными веществами. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 02.00.10 - биоорганическая химия. Институт биоорганической химии и нефтехимии НАН Украины, Киев, 2001.

Ведущая роль универсальных клеточных сигнальных систем (аденилатциклазной и фосфолипидной) в биорегуляции самых разнообразных клеточных функций является основой для определения функциональной общности ксенобиотиков, сходным образом влияющих на активность основных сигнальных систем. Это сходство проявляется в наличии в различных в химическом и фармакологическом отношении физиологически активных веществах (ФАВ) стереотипного компонента в механизмах их биорегуляторного воздействия. К настоящему времени получены весомые свидетельства указанной выше общности, определяющей, по-видимому, не только направленность (определяемую понятием "биорегуляторный стереотип") и характер влияния различных ФАВ на основные сигнальные системы, но и общий профиль физиологической активности веществ. В то же время, политропность и характер воздействия многих ФАВ на различные молекулярные мишени в рамках основных сигнальных систем свидетельствует о наличии не только функциональной, но и структурной общности указанных веществ.

Выделение элементов аденилатциклазной и фосфолипидной сигнальных систем, основных универсальных органов управления функциями клетки, стало отправным положением иерархической классификации ФАВ. В высшем таксоне этой классификации вещества группируются по способности усиливать или ослаблять клеточные функции, которые управляются основными сигнальными системами, независимо от уровня преобладающего влияния: внешние рецепторные структуры, ключевые ферменты или эффекторные биосубстраты. В частности, ФАВ первого класса активируют аденилатциклазную и подавляют фосфолипидную систему. ФАВ второго класса имеют обратную направленность действия: ингибируют аденилатциклазную систему и активируют фосфолипидную. Согласно концепции "биорегуляторной стереотипии", предполагалось, что на втором уровне иерархической классификации ФАВ в каждом из исходных классов можно будет выделить вещества, действующие с помощью активации или блокады функциональных элементов основных сигнальных систем, и установить наличие элементов фармакологической и структурной общности в каждой из групп.

Экспериментальное изучение направленности воздействия на транскрипцию in vitro ФАВ, являющихся агонистами или антагонистами определенных внешнемембранных рецепторов сигнальных каскадов, продемонстрировало, что вещества, блокирующие рецепторы клеточных сигнальных каскадов, подавляют РНК-полимеразную реакцию (в концентрации 1* 10-4 моль/л, на 30-45%). Среди активаторов рецепторов ни одно ФАВ не ингибировало транскрипцию. Наоборот, в концентрации 1* 10-4 моль/л мезатон, клонидин, карбахол и fMLP достоверно активируют РНК-полимеразную реакцию. То есть биорегуляторные стереотипы ФАВ проявляются даже на такой высокоспецифической и автономной модельной системе, как транскрипция in vitro, которая не имеет никакой прямой связи с внешнемембранными рецепторными структурами.

Полученные данные позволили предположить, что ФАВ, объединенные в каждой из данных двух групп, имеют некоторые общие элементы строения, а между молекулами активаторов и блокаторов рецепторов, наоборот, существуют качественные структурные отличия.

Результаты, полученные с помощью электронно-топологического метода, продемонстрировали, что наиболее общие свойства веществ, такие, как активирующая или блокирующая направленность их действия на те или иные внешнемембранные рецепторы клетки, определяются наиболее общими признаками строения ФАВ, которые не могут быть сведены к какой-то одной конкретной фармакофорной группировке. Следует считать, что наиболее общие признаки строения ФАВ, объединенных лишь по общей направленности действия на биосубстраты, состоят в сочетании множества мелких структурных характеристик.

С применением методов искусственного интеллекта было проведено распределение веществ на классы по типам их влияния на адрено- и холинорецепторы. Вещества не дифференцировали по специфичности (к активаторам были отнесены все вещества, активирующие -, -адренорецепторы, m-холинорецепторы; аналогично все блокаторы были объединены в группу блокаторов), то есть не учитывалась селективность их воздействия на тот или иной тип рецептора.

Анализ топологических индексов, полученных на основе химического строения указанных веществ методами искусственного интеллекта, дал высокий процент (93,28%) верной классификации. Таким образом, созданная компьютерная система позволяет внеэкспериментально предсказывать наличие у ФАВ активирующей или блокирующей активности по отношению к внешнемембранным рецепторам клетки.

Совокупность полученных данных подтверждает предположение о наличии элементов структурной общности в группах активаторов и блокаторов биомакромолекул и правомочность выделения соответствующих групп при построении второго уровня иерархической классификации ФАВ.

Ключевые слова: биорегуляторный стереотип, физиологически активные вещества, транскрипция, електронно-топологический метод, методы искусственного интеллекта.

Abstract

Prokopenko V.V. The elements of stereotype regulation of in vitro DNA transcription by physiologically active compounds. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree in biological sciences on speciality 02.00.10 - bioorganic chemistry. - Institute of Bioorganic Chemistry and Petrochemistry of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The thesis is devoted to revealing of bioregulatory stereotypy elements of physiologically active compounds influence on in vitro transcription with application of mathematical modelling methods. Bioregulatory influence of specific ligands of extracellular receptors on transcription was shown. Using electron topological method the elements of pharmacological and structural community have been found in the groups of physiologically active compounds that block and activate external cellular receptors. The effective computer system capable to divide of substance on classes correspondingly to their influence on adrenergic and cholinergic receptors was obtained.

Key words: bioregulatory stereotype, physiologically active compounds, transcription, electron topological method, methods of artificial intelligence.

Размещено на Allbest.ru

...