Вплив амфіфільних сполук на осмотичну і температурну чутливість еритроцитів

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут проблем кріобіології і кріомедицини

03.00.19 - Кріобіологія і кріомедицина

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Вплив амфіфільних сполук на осмотичну і температурну чутливість еритроцитів

Орлова Наталія Вікторівна

Харків - 2001



Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України

Науковий керівник:

кандидат біологічних наук Шпакова Наталія Михайлівна, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, старший науковий співробітник відділу кріофізіології клітини

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук Гордієнко Євген Олександрович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, завідувач відділу низькотемпературної консервації;

доктор біологічних наук, професор Перський Євген Єфроїмович, Харківський національний університет ім. В.І. Каразіна, кафедра фізіології людини та тварин.

Провідна установа:

Харківський державний медичний університет Міністерства охорони здоров'я України, кафедра нормальної фізіології.

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України (61015, м. Харків, вул. Переяславська, 23)

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність роботи. На сьогодні однією з актуальних проблем кріобіології є дослідження механізмів ушкодження і захисту клітин при їхньому охолодженні та заморожуванні. Вважається, що основними факторами, які визначають ушкодження клітин, є зміни температури, а також дія висококонцентрованих розчинів солей, що утворюються в позаклітинному середовищі при виморожуванні води (Білоус А.М., Бондаренко В.А., 1982). Зміну фізико-хімічних умов зовнішнього середовища першої сприймає плазматична мембрана, що має високу чутливість до дії кріопошкоджуючих факторів (Meryman H.T., Wіllіаms R.J., Douglas M.S.J., 1977; Гордієнко Є.О., Пушкар Н.С., 1994; Коваленко С.Є., 1999).

На сьогодні отримані дані, які свідчать про те, що зміна стану клітин на етапах, що передують дії стресового фактору, може призводити до підвищення їхньої стійкості до наступної різкої зміни осмотичних і температурних умов середовища. Так, попередня часткова дегідратація еритроцитів (Поздняков В.В., 1989) або дозоване додавання до еритромаси розчину кріопротектора ПЕО-1500 при температурі 0^оС (Бабійчук Л.О., Землянських Н.Г., 2001) дозволяє істотно підвищити стійкість клітин до наступного осмотичного стресу і заморожування. Насичення клітин глюкозою також сприяє підвищенню їхньої стійкості до гіпертонічного стресу (Мельнікова О.В., Бондаренко Т.П., 1991). Водночас, стійкість еритроцитів до зміни осмотичних і температурних умов середовища може бути також підвищена безпосередньо в момент дії стресових факторів при наявності в літичному середовищі деяких фармакологічних препаратів (Дунаєвська О.М., Шпакова Н.М., Бондаренко В.А., 1997). З вищевикладеного випливає, що рівень осмотичного і температурного пошкодження клітин може визначатися як їх станом перед дією стресових факторів, так і станом безпосередньо в момент дії стресових факторів.

При вивченні гіпотонічного лізису еритроцитів Hagerstrand H. та Isomaa B. (1991) показали, що досить різноманітні за хімічною будовою амфіфільні сполуки знижують рівень гіпотонічного пошкодження клітин. Цей ефект автори пов'язують зі здатністю амфіфілів впливати на стан плазматичної мембрани. Відомо, що окремі представники амфіфільних сполук підвищують стійкість клітин до гемолізу, який було викликано мелітином (Rudenko S.V., Nipot E.E., 1996), а також до постгіпертонічного стресу (Ніпот О.Є., 1997). В умовах гіпертонічного стресу і постгіпертонічного кріогемолізу еритроцитів деякі амфіфільні речовини, зокрема похідні фенотиазінового ряду, здатні підвищувати стійкість клітин (Дунаєвська О.M., Панталер О.Р., Шпакова Н.М., Бондаренко В.А., 1995). Однак, дані про антигемолітичну активність амфіфільних речовин в цих умовах одиничні, розрізнені і часто стосуються представників одного класу.

Доцільно було дослідити вплив амфіфільних сполук, які є представниками різних класів поверхнево-активних речовин (катіонних, аніонних, неіонних, цвіттеріонних), на чутливість еритроцитів до гіпертонічного стресу і постгіпертонічного кріогемолізу, а також роль вихідного стану еритроцитів у реалізації антигемолітичної активності амфіфільних речовин при гіпертонічному стресі.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана згідно з науковим напрямком роботи відділу кріофізіології клітини ІПКіК НАН України за темами: "Клітинні механізми контролю холодової й осмотичної чутливості" (шифр теми 2.2.6.53); "Фактори і механізми регуляції стійкості клітини до змін температурного й осмотичного параметрів середовища "(шифр теми 2.2.6.86); де автор виконувала самостійні розділи.

Мета і задачі дослідження.

Мета дослідження - корекція чутливості еритроцитів до зміни температурних і осмотичних умов середовища за допомогою представників різних класів амфіфільних сполук, а також роль вихідного стану еритроцитів у реалізації антигемолітичної активності амфіфілів при гіпертонічному стресі

Задачі дослідження.

Вплив речовин, що відносяться до різних класів амфіфільних сполук, на чутливість еритроцитів до гіпертонічного стресу в середовищі, що містить 4,0 Моль/л NaCl при температурі 37 і 0 ⁰С;

Вплив амфіфільних сполук на стійкість до гіпертонічного стресу еритроцитів, попередньо проінкубованих у розчинах, що містять 0,45 Моль/л і 0,7 Моль/л NaCl, при температурі 37 і 0 ⁰С;

Вплив амфіфільних речовин на чутливість еритроцитів, модифікованих діамідом, до гіпертонічного стресу;

Дія амфіфільних сполук на стійкість еритроцитів до постгіпертонічного кріогемолізу (охолодження від 37 до 0 ⁰С в розчині 1,2 Моль/л NaCl);

Вплив амфіфільних сполук на динамічну структуру еритроцитарної мембрани, її бар'єрні властивості (проникність мембрани для іонів калію) і морфологічні особливості клітин.

Об'єкт дослідження - гіпертонічний стрес еритроцитів, постгіпертонічний кріогемоліз еритроцитів.

Предмет дослідження - осмотична та температурна чутливість еритроцитів у присутності амфіфільних сполук; антигемолітична активність амфіфільних сполук при зміні вихідного стану еритроцитів (часткова дегідратація; обробка діамідом); стан мембрани еритроцитів у присутності амфіфільних сполук (проникність мембрани для іонів калію, мікров'язкість мембрани).

Наукова новизна одержаних результатів. Дані про вплив амфіфільних сполук на чутливість еритроцитів до різних типів стресу були істотно доповнені представленими в нашій роботі результатами про прояв антигемолітичної активності амфіфільних речовин в умовах гіпертонічного стресу і постгіпертонічного кріогемолізу еритроцитів.

Уперше показано, що досліджувані речовини, які відносяться до різних класів амфіфільних сполук, знижують рівень гемолізу еритроцитів при перенесенні в середовище, що містить 4,0 Моль/л NaCl, при температурі 37 і 0⁰С, і величини максимальної антигемолітичної активності амфіфілів залежать від температурних умов проведення гіпертонічного стресу.

Уперше виявлено, що прояв антигемолітичного ефекту всіх амфіфільних сполук при перенесенні еритроцитів у середовище, що містить 4,0 Моль/л NaCl, визначається станом клітин перед гіпертонічним стресом.

На підставі результатів власних досліджень, доведена односпрямованість зміни величини антигемолітичної активності амфіфільних сполук в умовах гіпертонічного стресу при варіюванні як температурних умов проведення гіпертонічного стресу, так і осмотичних умов дегідратації клітин, що передують гіпертонічному лізису.

Отримані нові дані про вплив досліджуваних сполук на чутливість еритроцитів до постгіпертонічного кріогемолізу. Представники катіонних й аніонних амфіфілів протектують еритроцити від ушкодження в умовах постгіпертонічного кріогемолізу, а представники неіонних і цвіттеріонних амфіфілів не мають такої здатності.

Уперше показано, що всі досліджувані амфіфільні речовини виявляють антигемолітичну активність при перенесенні еритроцитів, модифікованих діамідом, у середовище, що містить 4,0 Моль/л NaCl. Однак, значення антигемолітичної активності досліджуваних речовин при гіпертонічному гемолізі модифікованих діамідом еритроцитів є нижчими за значення антигемолітичної активності речовин в умовах гіпертонічного стресу не модифікованих діамідом клітин.

Виявлено, що антигемолітична активність досліджуваних речовин не залежить від їх здатності змінювати форму клітини по типу дискоцит > ехіноцит чи дискоцит > стоматоцит.

Показано, що при гіпертонічному гемолізі еритроцитів амфіфільні сполуки не впливають на вихід катіонів калію з клітин.

На підставі результатів власних досліджень, доведена загальна здатність представників різних класів амфіфільних речовин збільшувати мікров'язкість еритроцитарної мембрани. Трансмембранна локалізація зазначеного ефекту для кожного класу речовин є різною.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані в роботі результати можуть бути використані як основа для подальших розробок щодо застосування цих речовин у складі кріозахисних середовищ. Результати роботи можуть бути рекомендовані для наукового використання в навчальному процесі, спрямованому на підготовку фахівців у різних галузях біології, зокрема, кріобіології, мембранології, фармакології.

Особистий внесок здобувача. Дисертація є самостійним дослідженням здобувача. Автором самостійно сформульована мета і визначені задачі роботи, проведені експерименти, статистично оброблені результати, здійснений аналіз експериментальних даних, зроблені висновки, засновані на експериментальних даних. У спільних наукових публікаціях співавтори проводили морфологічні дослідження (методика, фотографування), визначали вміст калію в супернатанті (методика), дослідження методом ЕПР спектроскопії (методика).

Апробація результатів дисертації. Результати роботи були представлені на II-ому з'їзді Українського біофізичного товариства (Харків, 1998), Конференції молодих учених ІПКіК НАН України (Харків, 1999), робочому засіданні ЮНЕСКО "Cryolability and Cryostability of Biological Objects" (Харків, 1999)

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 робіт, з них у фахових наукових журналах - 5 , у збірниках матеріалів конференцій - 3.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 137 сторінках машинописного тексту і складається зі вступу, огляду літератури, чотирьох глав власних досліджень, обговорення отриманих результатів, висновків. Список використаної літератури містить 164 джерела, з них 37 вітчизняних і країн близького зарубіжжя та 127 іноземних. Робота ілюстрована 25 таблицями, 14 рисунками.



ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження. Роботу виконували на еритроцитах, отриманих з донорської крові II-ої - групи.

Гіпертонічний стрес еритроцитів здійснювали перенесенням клітин у середовище, що містить 4,0 Моль/л NaCl, при температурі 37 і 0⁰С. Попередню часткову дегідратацію еритроцитів проводили в розчинах, що містять 0,45 і 0,7 Моль/л NaCl.

Постгіпертонічний кріогемоліз еритроцитів здійснювали охолодженням клітин від 37 до 0⁰С в розчині, що містить 1,2 Моль/л NaCl.

Кінцевий гематокрит суспензії еритроцитів складав 0,4%. Амфіфільну речовину додавали в літичне середовище перед внесенням клітин.

Вміст гемоглобіну, що вийшов у супернатант, визначали спектрофотометрично на СФ-4А з проточною кюветою на довжині хвилі 543 нм. За 100% приймали поглинання проби, у яку додавали детергент тритон Х-100 у концентрації 0,1%.

Кожен експеримент повторювали не менше 6 разів у двох паралельних пробах. Надалі обчислювали середнє арифметичне значення і середнє квадратичне відхилення величини гемолізу еритроцитів для кожної концентрації амфіфільної речовини. Для кожного наведеного в роботі графіка представлене значення максимального середньоквадратичного відхилення величини гемолізу еритроцитів із серії дослідів одного експерименту у вигляді крапки з розкидом значень, що має відповідне маркірування.

За ефективну концентрацію амфіфільної речовини в серії дослідів одного експерименту було прийняте середнє арифметичне величин концентрацій даної речовини, що відповідають мінімальному значенню гемолізу клітин. Значення максимальної антигемолітичної активності (АГ_max) амфіфільної сполуки в серії дослідів одного експерименту являє собою середню арифметичну величину зі значень максимальної антигемолітичної активності даної сполуки, розрахованих за формулою:

, де

к - величина гемолізу еритроцитів у даних експериментальних умовах у відсутності амфіфільної речовини.

а - мінімальна величина гемолізу еритроцитів у присутності амфіфільної речовини;

Обробку еритроцитів діамідом проводили за методом, представленим в роботі (Haest C., Kamp D., Plasa G., Deuticke B., 1977).

Методом світлової мікроскопії проводили морфологічний аналіз еритроцитів з фотографічною реєстрацією форми клітин (мікроскоп МБІ-15У).

Методом атомно-абсорбційної спектрофотометрії досліджували бар'єрні властивості еритроцитарної мембрани за виходом іонів калію з еритроцитів у присутності амфіфільних сполук (Прайс В., 1967). Виміри проводили на спектрофотометрі С-115-М1 у режимі емісії при довжині хвилі 766,5 нм, полум'я пропан-повітря, з використанням шкали концентрацій.

Методом електронного парамагнітного резонансу (ЕПР) спінових зондів вивчали динамічну структуру мембрани еритроциту (Ліхтенштейн Г.І., 1976). У роботі були використані зонди - похідні жирних кислот, що містять нітроксильний радикал: амід пальмітинової кислоти, 5-доксилстеаринову кислоту, 16-доксилстеаринову кислоту. Спектри ЕПР зондів реєстрували на спектрометрі ЕПР ЕR-100 D "Bruker" (Німеччина), обладнаному стандартною термоприставкою. Для оцінки динамічного стану мембрани використовували параметри, що характеризують частоту обертальної рухливості нітроксильного радикала зонду - ₊ (с^-1), та емпіричний параметр Н⁺ (Тл). Збільшення значення Н⁺ (Тл) відповідає зниженню значення ₊ (с^_1) (Ліхтенштейн Г.І., 1976).

У роботі були використані речовини:

децилсульфат натрію, додецилсульфат натрію (СинтезПАВ)

3-децилдиметиламмоній-1-пропансульфонат натрію,

3-цетилдиметиламмоній-1-пропансульфонат натрію

додецил-,D-мальтозид (Calbiochem); хлорпромазин гідрохлорид (Calbiochem);

амід пальмітинової кислоти (Reanal)

діамід; 5-доксилстеаринова кислота, 16-доксилстеаринова кислота (Sigma).

Інші реактиви були вітчизняного виробництва кваліфікації "хч" і "чда".

Статистичну обробку результатів проводили за допомогою дисперсійного, регресивного і кореляційного аналізу (Карасев А.І., 1977, Шенк Х., 1972).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕННЯ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Вплив амфіфільних сполук на чутливість еритроцитів до гіпертонічного стресу та постгіпертонічного кріогемолізу. Для дослідження були використані амфіфільні сполуки, що відносяться до різних класів. Неіонні амфіфіли представлені додецил-,D-мальтозидом (ДМ), катіонні _ хлорпромазином (ХП). Аніонні сполуки представлені гомологами алкілсульфату натрію з довжиною алкільного ланцюга 10 і 12 вуглецевих атомів (С10 і С12, відповідно). Цвіттеріонні сполуки - це представники алкілдіметиламмоній пропансульфаната натрію з довжиною алкільного ланцюга 10 і 16 вуглецевих атомів (Z10 і Z16, відповідно).

На рис. 1 представлені концентраційні залежності гіпертонічного гемолізу еритроцитів у присутності амфіфільних речовин при температурі 37 і 0⁰С. Видно, що всі амфіфільні сполуки при використанні у певних концентраціях знижують рівень гемолізу еритроцитів.

Для того, щоб порівняти ефективність лдосліджуваних сполук та усунути вплив індивідуальних розходжень донорської крові, ми використовували поняття антигемолітичної активності речовини. Значення максимальної антигемолітичної активності й ефективні концентрації досліджуваних речовин при гіпертонічномустресі еритроцитів представлені на рис. 2. Видно, що значення максимальної антигемолітичної активності всіх амфіфільних сполук є вищим при температурі 37⁰С (70-90%), ніж при 0⁰С (20-60%).

Значення ефективних концентрацій речовин знаходяться в широкому діапазоні: від 2 до 778 мк Моль/л. Таким чином, речовини, що відносяться до різних класів амфіфільних сполук, підвищують стійкість еритроцитів до гіпертонічного стресу (4,0 Моль/л NaCl). Величини їх антигемолітичної активності залежать від температури.

Раніше Поздняковим В.В. (1989) було показано, що пошкодження еритроцитів у середовищі, яке містить 4,0 Моль/л NaCl, залежить від вихідного стану клітин. Так, інкубування еритроцитів у розчині, що містить 0,45 Моль/л NaCl, робить їх більш стійкими до наступної дії висококонцентрованих розчинів солей. У той же час, клітини, проінкубовані в розчині 0,7 Моль/л NaCl, характеризуються метастабільним станом, і вони сильно пошкоджуються при перенесенні у висококонцентроване середовище.

Введення амфіфільних сполук у середовище, що містить 4,0 Моль/л NaCl, при температурі 37 ⁰С дозволяє значно знизити рівень ушкодження еритроцитів, попередньо проінкубованих не тільки в 0,45 Моль/л NaCl, але й у 0,7 Моль/л NaCl (рис. 3). Отже, використання амфіфільних сполук дозволяє підвищити стійкість до гіпертонічного стресу і метастабільних клітин.

Величини максимальної антигемолітичної активності й ефективні концентрації речовин у розглянутих умовах представлені на рис. 4.

Звертає на себе увагу той факт, що у випадку метастабільних клітин, тобто тих, котрі попередньо були проінкубовані в 0,7 Моль/л NaCl, величини максимальної антигемолітичної активності всіх речовин були трохи нижчими. У тому випадку, коли ці метастабільні клітини вносили в літичне середовище при температурі 0⁰С (крива 1 рис. 5), зниження рівня гіпертонічного гемолізу не відзначено в присутності всіх досліджуваних речовин. Таким чином, величини антигемолітичної активності досліджуваних амфіфільних сполук в умовах гіпертонічного стресу визначаються також вихідним станом клітин.

У вищеописаних експериментах попередню інкубацію клітин і гіпертонічний лізис здійснювали при одній температурі (або 37, або 0⁰С). Для того, щоб виявити значення температури літичного середовища в прояві антигемолітичної активності речовин, ми змінили постановку експерименту. Умови вихідної інкубації клітин залишились колишніми (температура 0⁰С, розчин 0,7 Моль/л NaCl), а температуру літичного середовища підвищили до 37⁰С (крива 2 рис. 5). Як видно, у даних умовах зниження гемолізу еритроцитів є чітко вираженим. Таким чином, при однакових умовах вихідної гіпотермічної дегідратації клітин наступний ефект амфіфільних сполук визначається температурою літичного середовища (4,0 Моль/л NaCl).

Постгіпертонічний кріогемоліз - це охолодження еритроцитів до температур, близьких до нульових, після інкубації клітин у гіпертонічному середовищі. Відомо, що деякі представники катіонних амфіфільнних сполук знижують рівень ушкодження еритроцитів в умовах постгіпертонічного кріогемолізу (Шпакова Н.М., Панталер О.Р., Бондаренко В.А., 1995). Був вивчений вплив представників різноманітних класів амфіфільних сполук на чутливість еритроцитів до охолодження від 37 до 0⁰С у середовищі, що містить 1,2 Моль/л NaCl. Досліджувані речовини вводили в середовище на етапі охолодження клітин

З концентраційної залежності гемолізу еритроцитів очевидно (рис. 6), що аніонні і катіонні амфіфіли знижують рівень ушкодження еритроцитів, а цвіттеріонні та неіонні сполуки практично не змінюють чутливість клітин до постгіпертонічного кріогемолізу.

Таким чином, на підставі того факту, що в умовах гіпертонічного стресу всі досліджувані амфіфільні речовини виявляють антигемолітичну активність, а в умовах постгіпертоничного кріогемолізу така здатність виявлена тільки у заряджених амфіфілів, можна припустити, що механізм ушкодження еритроцитів різний для досліджуваних типів стресу.

Рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів залежить від умов вихідної інкубації клітин, температурних умов гіпертонічного стресу, та концентрації амфіфільної речовини. Ця залежність має вигляд:

Р = Р* + а₁С+а₂С²+а₃С³+а₄С⁴, де

Р - рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів,

Р* - рівень вихідного гіпертонічного гемолізу еритроцитів (у відсутності амфіфільної речовини),

а₁, а₂, а₃, а₄ - коефіцієнти регресії,

С - концентрація амфіфільної речовини.

Показано, що залежності рівня гіпертонічного гемолізу еритроцитів від концентрації амфіфільної речовини підпорядковуються закономірностям одного типу для всіх речовин (табл. 1), що свідчить про неспецифічність їхньої дії.

Таблиця 1

Залежність гемолізу еритроцитів від концентрації (С) амфіфільної речовини

Фактор	Коефіцієнт регресії
	C10	C12	ХП	ДМ	Z16	Z10
C	-3,489	-4,074	-1,113	-19,189	-10,237	-0,176
C2	0,0901	0,152	0,0141	3,30	1,207	0,00026
C3	-0,00091	-0,0016	-0,00010	-0,227	-0,029	-0,00000015
C4	0,0000032	0,0000054	0,0000004	0,0055	0,0001	0

У табл. 2 представлені дані про вміст іонів калію в розчині 4,0 Моль/л NaCl у присутності амфіфільних сполук.



Таблиця 2

Вміст калію в супернатанті після того, як еритроцити були проінкубовані у різноманітних середовищах в присутності амфіфільних речовин, n = 6

Речовина	Конц., мкМоль/л	Вміст калію, мг/л в середовищах
		0,15 Моль/л NaCl	4,0 Моль/л NaCl	Дист. вода с 0,1 %Тритон Х-100*
Контроль	0	0,24 0,03	10,97 1,06	11,971,20
Z16	6	0,27 0,04	10,99 0,93
ДМ	6	0,21 0,02	11,12 1,11
С12	20	0,20 0,02	10,73 0,91
С10	40	0,22 0,02	10,52 0,89
ХП	120	0,25 0,03	11,05 1,10

Примітка. Вміст калію в супернатанте у порівнянні з контролем статистично не відрізняється при р < 0,05.

* гемоліз еритроцитів у зазначеному середовищі в експериментах щодо гіпертонічного стресу був прийнятий за 100%.

гіпертонічний амфіфільний антигемолітичний еритроцит

Видно, що вихід іонів калію з клітин у середовище в присутності амфіфільних речовин знаходиться на рівні контролю. Таким чином, досліджувані амфіфільні сполуки знижують рівень гемолізу еритроцитів, але вони не можуть вплинути на вихід катіонів калію з клітини в умовах гіпертонічного стресу.

Вплив амфіфільних сполук на чутливість модифікованих діамідом еритроцитів до гіпертонічного стресу. Відомо, що в умовах постгіпертонічного кріогемолізу сульфгідрильний реагент діамід знижує рівень ушкодження еритроцитів (Шпакова Н.М., Семенченко О.Ю., Бондаренко В.А., 1991). Однак ми не виявили подібного ефекту в умовах гіпертонічного стресу еритроцитів (4,0 Моль/л NaCl).

Дослідження антигемолітичної активності речовин в умовах гіпертонічного стресу еритроцитів, оброблених діамідом, показало (рис. 7), що антигемолітична активність ХП і С10 знижувалася як при температурі 37, так і при 0С. Для інших речовин зазначений ефект спостерігався на рівні тенденції.

При дослідженні динамічної структури мембрани еритроцитів, оброблених діамідом (табл. 3), спостерігалося гальмування обертальної рухливості нітроксильного радикала всіх зондів: аміду пальмітинової кислоти (АПК), 5_доксил стеаринової кислоти (5-ДС), 16_доксил стеаринової кислоти (16-ДС)

Таблиця 3

Значення параметрів обертальної рухливості зондів АПК, 16-ДС, 5-ДС у мембрані еритроцитів, оброблених діамідом, n = 6

Діамід, м Моль/л	АПК,+ х 10-8 ,с-1	5-ДС,H+ х 10-4 , Тл	16-ДС,+ х 10-8 ,с-1
Контроль	5,41 0,06	26,0 0,3	1,54 0,03
10	4,03 0,05	26,800,4	1,320,05

Примітка. Значення параметрів обертальної рухливості зондів у порівнянні з контролем статистично відрізняються при р < 0,05.

Отже, можна припустити, що відзначене зниження антигемолітичної активності досліджуваних речовин пов'язане зі зміною динамічної структури мембрани під дією діаміду.

Вплив амфіфільних сполук на динамічну структуру мембран еритроцитів. Морфологічний аналіз показав, що досліджувані сполуки змінювали форму еритроцитів. Так, хлорпромазин призводив до появи в середовищі стоматоцитів, а інші речовини були яскраво вираженими ехіноцитогенними агентами. Трансформація еритроцитів у присутності досліджуваних амфіфілів свідчить про розподіл речовин у мембрану і різну їх локалізацію в ній.

Дані про зміну мікров'язкості мембрани в присутності амфіфільних речовин представлені в табл. 4.

Таблиця 4

Значення параметрів обертальної рухливості зондів АПК, 16-ДС, 5-ДС у мембрані еритроцитів, оброблених амфіфільными речовинами, n = 6

Речовина	Конц. мкМоль/л	АПК+ х 10-8, с-1	5-ДСH+ х 10-4 ,Тл	16-ДС+ х 10-8, с-1
Контр.	0	8,05 0,05	25,9 0,3	5,21 0,06
Z16	20	8,12 0,06*	29,0 0,5	5,28 0,05*
ДМ	50	5,66 0,06	27,0 0,4	4,18 0,05
С12	70	6,76 0,07	25,5 0,5*	4,52 0,07
С10	100	6,76 0,06	25,8 0,3*	4,27 0,08
ХП	180	6,02 0,05	25,90,3*	5,28 0,07*

Примітка: *Значення параметра обертальної рухливості зонду в порівнянні з контролем статистично не відрізняються при р < 0,05.

Видно, що ДМ зменшує частоту обертання всіх трьох зондів, С10 і С12 збільшують мікров'язкість мембрани в полярній області й у мікрооточенні зонда 16-ДС, ХП збільшує мікров'язкість мембрани тільки в полярній області, а Z16 - тільки в мікрооточенні зонда 5-ДС. Таким чином, усі досліджувані речовини збільшують мікров'язкість мембрани, але мембранна локалізація зазначеного ефекту є різною.

Незважаючи на те, що в роботі використовувались речовини, різнорідні за хімічною структурою, усі вони виявляли подібний ефект при гіпертонічному стресі еритроцитів, а саме, величини антигемолітичної активності всіх речовин збільшувалися або зменшувалися односпрямовано при зміні як вихідного стану еритроцитів, так і температури літичного середовища. Варто додати, що в присутності всіх досліджуваних сполук спостерігалося збільшення мікров'язкості мембрани, і вихід із клітин катіонів калію в розчин 4,0 Моль/л NaCl залишався на рівні контролю.

Отримані нами результати дозволяють припустити, що механізм антигемолітичної дії є неспецифічним для представників різних класів амфіфільних сполук. У той же час, прояв антигемолітичної активності, зокрема, буде залежати як від виду стресу, так і від особливостей впливу речовини на мембрану.

При вбудовуванні амфіфільних сполук у зовнішній моношар мембрани повинен відбуватися перерозподіл речовин і (чи) мембранних компонентів між двома моношарами, щоб мембрана зберігала стабільну бішарову конфігурацію. На користь цього свідчать дані про перерозподіл спін-мічених фосфоліпідів під дією хлорпромазину (Rosso J., Zachowski A., Devaux P.F., 1988), а також під дією інших амфіфільних сполук, використовуваних у нашій роботі (Pantaler E., Kamp D., Haest C.W., 2000). Очевидно, у момент різкої зміни умов середовища пертурбація мембрани амфіфілами робить її більш лабільною, що дозволяє мембрані краще адаптуватися до дії стресових факторів.



ВИСНОВКИ

На сьогодні однією з актуальних проблем кріобіології є корекція осмотичної і температурної чутливості еритроцитів. Відомо, що в умовах гіпертонічного стресу і постгіпертонічного кріогемолізу еритроцитів деякі катіонні амфіфільні сполуки виявляють антигемолітичну активність, але ці дані одиничні та розрізнені. Тому доцільно було дослідити дію представників аніонних, катіонних, неіонних, цвіттеріонних класів амфіфільних сполук на чутливість еритроцитів до гіпертонічного стресу і постгіпертонічного кріогемолізу, а також їх вплив на структуру еритроцитарної мембрани. Для вирішення поставлених задач використовували методи спектрофотометрії, ЕПР спектрометрії та мікроскопії.

В умовах гіпертонічного стресу еритроцитів представники аніонних, катіонних, неіонних і цвіттеріонних класів амфіфільних сполук виявляють антигемолітичну активність. Значення ефективних концентрацій речовин знаходяться в діапазоні від 2 до 778 мкМоль/л.

Максимальна антигемолітична активність досліджуваних речовин залежить як від осмотичних і температурних умов вихідної інкубації клітин, так і від температурних умов гіпертонічного стресу еритроцитів.

При гіпертонічному стресі еритроцитів залежності рівня гемолізу клітин від концентрації амфіфільної речовини підкоряються закономірностям одного типу для представників всіх класів амфіфілів, що свідчить про неспецифічність їхньої дії.

В умовах гіпертонічного стресу еритроцитів, модифікованих діамідом, усі досліджувані амфіфільні речовини виявляють антигемолітичну активність. Однак рівень антигемолітичної активності речовин є нижчим в цьому випадку, ніж для не модифікованих діамідом еритроцитів в аналогічних умовах.

В умовах постгіпертонічного кріогемолізу еритроцитів амфіфільні сполуки, що відносяться до аніонних і катіонних класів, виявляють антигемолітичну активність (40 - 70 %), на відміну від амфіфільних сполук, що належать неіонним і цвіттеріонним класам.

Антигемолітична активність досліджуваних речовин не залежить від їх здатності змінювати форму клітини по типу дискоцит > ехіноцит чи дискоцит > стоматоцит. Показано, що при гіпертонічному гемолізі еритроцитів амфіфільні сполуки не впливають на вихід катіонів калію з клітин. Представники різних класів амфіфільних сполук збільшують мікров'язкість еритроцитарної мембрани; трансмембрана локалізація зазначеного ефекту для кожного класу амфіфільних сполук є різною.



СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Действие двухвалентных катионов на чувствительность эритроцитов к гиперосмотическому стрессу и холодовому шоку// Пробл. криобиологии.- 1998.- №1.- С. 30_35.

Орлова Н.В. Действие двухвалентных катионов и гемина на чувствительность эритроцитов к гиперосмотическому стрессу// Пробл. криобиологии.- 1999.- №2.- С. 17_21.

Шпакова Н.М., Панталер Е.Р., Орлова Н.В. Влияние додецил-в,D-мальтозида на устойчивость предварительно дегидратированных эритроцитов к гиперосмотическому и холодовому шоку// Пробл. криобиологии.- 1999.- №3.-С. 10_16.

Орлова Н.В., Цымбал Л.В., Шпакова Н.М. Действие хлорпромазина на структурно-функциональное состояние мембран эритроцитов// Биол. вестник.- 1999.- 3, №1-2.- С. 71_75.

Кулешова Л.Г., Орлова Н.В., Шпакова Н.М. Антигемолитическая и трансформирующая активность амфифильных соединени.// Пробл. криобиологии.- 2001.- №1- С. 9_15.

Shpakova N.M., Koba L.V., Bondarenko V.A., Kozlov A.S., Orlova N.V., Pantaler E.R. Amphiphilic substances increase the stability of erytrocytes to the action of cold and hyperosmotic stress// 34-th Annual Meeting of Society for Cryobiology - Barselona, Spain, 1997.- P. 160.

Шпакова Н.М., Панталер О.Р., Орлова Н.В. Ефекти катіонних і неіонних амфіфільних сполук при холодовому та гіперосмотичному стресі еритроцитів// Тез.доп. II-ого з'їзду Українського біофізичного товариства. Харків, 1998.- С. 198.

Орлова Н.В. Вплив двовалентних катіонів на стійкість еритроцитів до гіпертонічного та холодового стресу// Тез.доп. з'їзду Сучасні проблеми гематології та транфузіології.- Київ, 1998.- С. 58.

АНОТАЦІЯ

Орлова Н.В. "Вплив амфіфільних сполук на осмотичну і температурну чутливість еритроцитів".- Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19в 2001.

У дисертації наведені теоретичне узагальнення і новий підхід до вирішення наукової задачі корекції осмотичної і температурної чутливості еритроцитів за допомогою амфіфільних сполук, а також визначена роль вихідного стану клітин у реалізації антигемолітичної активності амфіфілів при гіпертонічному стресі еритроцитів.

У роботі були використані амфіфільні сполуки: представники катіонних (хлорпромазин гідрохлорид), аніонних (децилсульфат натрію, додецилсульфат натрію), неіонних (додецил-,D-мальтозид) і цвіттеріонних (3-децилдиметиламмоній-1-пропансульфонат натрію, 3_цетилдиметиламмоній-1-пропансульфонат натрію) класів поверхнево-активних речовин.

Представники різних класів амфіфільних сполук при використанні в мікромолярних концентраціях істотно знижують рівень гіпертонічного гемолізу еритроцитів. Зазначений ефект реалізується при одночасній дії на клітину гіпертонічного середовища як стресового фактору й амфіфільної сполуки. Величини антигемолітичної активності в стресових умовах залежать як від особливостей досліджуваних речовин, так і від вихідного стану клітин.

Ключові слова: гіпертонічний стрес, постгіпертонічний кріогемоліз, еритроцит, еритроцитарна мембрана, попередня модифікація еритроцитів, амфіфільні сполуки, антигемолітична активність, ефективна концентрація.



АННОТАЦИЯ

Орлова Н.В. "Влияние амфифильных соединений на осмотическую и температурную чувствительность эритроцитов”.- Рукопись

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19. - Криобиология и криомедицина. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков 2001.

В диссертации приведены теоретическое обобщение и новый подход к решению научной задачи коррекции осмотической и температурной чувствительности эритроцитов амфифильными соединениями, а также определена роль исходного состояния клеток в реализации антигемолитической активности амфифилов при гипертоническом стрессе эритроцитов.

В работе были использованы амфифильные соединения: представители катионных (хлорпромазин гидрохлорид), анионных (децилсульфат натрия, додецилсульфат натрия), неионных (додецил-в,D-мальтозид) и цвиттерионных (3_децилдиметиламмоний-1-пропансульфонат натрия, 3-цетилдиметиламмоний-1-пропансульфонат натрия) классов поверхностно-активных веществ.

Представители различных классов амфифильных соединени, при использовании в микромолярных концентрациях существенно снижают уровень гипертонического гемолиза эритроцитов. Указанный эффект реализуется при одновременном действии на клетку гипертонической среды, как стрессового фактора, и амфифильного соединения. Величины антигемолитической активности зависят как от особенностей исследуемых веществ, так и от исходного состояния клеток, подвергающихся действию стрессовых факторов. В условиях гипертонического стресса эритроцитов при температуре 37⁰С величины максимальной антигемолитической активности амфифильных соединений составляют 70_90%.

Исследуемые вещества способны дополнительно снижать уровень гемолиза эритроцитов, исходно проинкубированных в среде, содержащей 0,45 Моль/л NaCl, и перенесенных в литическую среду (4,0 Моль/л NaCl). При этом уровень гемолиза эритроцитов составляет 5_10%. Эритроциты, проинкубированные в среде, содержащей 0,7 Моль/л NaCl, характеризуются метастабильным состоянием. Амфифильные соединения способны проявлять достаточно высокую антигемолитическую активность (50_80%) при перенесении таких метастабильных клеток в среду, содержащую 4,0 Моль/л NaCl (37⁰С). Все исследуемые вещества проявляют высокую антигемолитическую активность (50_70%) и в условиях гипертонического стресса эритроцитов, модифицированных сульфгидрильным реагентом диамидом.

При варьировании условий проведения гипертонического стресса величины антигемолитической активности представителей различных классов амфифильных соединений изменяются однонаправленно. Так, изменение как температурных условий проведения гипертонического стресса (37 или 0⁰С), так и условий исходной обработки клеток (инкубация в растворах 0,45 или 0,7 Моль/л NaCl, модификация диамидом), предшествующей гипертоническому лизису, приводят либо к увеличению антигемолитической активности всех веществ, либо к снижению этих величин тоже для всех исследуемых соединений.

Статистический анализ полученных данных показал, что зависимости уровня гипертонического гемолиза эритроцитов от концентрации амфифильного вещества при варьировании как осмотических и температурных условий среды исходной инкубации клеток, так и температурных условий литической среды подчиняются закономерностям одного типа для всех веществ.

Исследуемые амфифильные соединения однонаправленно влияют и на состояние эритроцитарной мембраны. В эффективных концентрациях они увеличивают микровязкость мембраны и не изменяют её барьерные свойства для катионов калия.

Полученные нами результаты позволяют предположить, что в условиях гипертонического стресса эритроцитов механизм антигемолитического действия является неспецифическим для представителей различных классов амфифильных соединений. Амфифильные соединения способны распределяться в эритроцитарную мембрану, о чём свидетельствует изменение формы клеток. Мы полагаем, что выявленная способность исследуемых соединений предотвращать гемолиз эритроцитов обусловлена изменением структурно-динамического состояния эритроцитарной мембраны при встраивании в неё амфифильных веществ.

В условиях постгипертонического криогемолиза эритроцитов катионный и анионные вещества проявляют антигемолитическую активность (40_70%), в то время как неионный и цвиттерионные соединения не обладают такой способностью. На основании полученных данных можно предположить, что механизм, лежащий в основе гемолиза эритроцитов при гипертоническом стрессе и постгипертоническом криогемолизе, различен.

Выявленное антигемолитическое действие амфифильных соединений в условиях осмотического и температурного стресса эритроцитов является основанием для разработки методических подходов по применению этих веществ с целью предупреждения повреждений клеток при действии экстремальных факторов.

Ключевые слова: гипертонический стресс, постгипертонический криогемолиз, эритроцит, эритроцитарная мембрана, предварительная модификация эритроцитов, амфифильные соединения, антигемолитическая активность, эффективная концентрация.



SUMMARY

Orlova N.V. “The effect of amphiphilic compounds on osmotic and temperature susceptibility of erythrocytes”.- Manuscript.

Thesis for obtaining the scientific degree of candidate of biological sciences (PhD equivalent) on the speciality 03.00.19 - Cryobiology and cryomedicine.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of the Ukraine, Kharkov, 2001

Theoretical generalization and new approach for the solving of scientific task for the correction of osmotic and temperature erythrocytes susceptibility by amphiphilic compounds were presented, as well as the role of an initial cell state in the realization of amphiphiles antihemolytic activity under hypertonic stress of erythrocytes was determined.

Amphiphilic compounds: representatives of cationic (chlorpromazine hydrochloride), anionic (decylsulfate, dodecylsulfate), non-ionic (dodecyl-в,D-maltoside) and zwitterionic (3-decyldimethylammonium-1-propanesulfonate, 3-cetyldimethylammonium-1-propanesulfonate) classes of superficially active substances were used in the work.

The representatives of different classes of amphiphilic compounds, when using in micromolar concentrations significantly decreased the level of erythrocytes hypertonic hemolysis. This effect was realized under simultaneous effect of hypertonic medium on a cell both as a stress factor and amphiphilic compound. The values of antihemolytic activity depended both on the peculiarities of the studied substances and an initial cell state, subjected to stress.

Key words: hypertonic stress, posthypertonic cryohemolysis, erythrocyte, erythrocyte membrane, preliminary modification of erythrocytes, amphiphilic compounds, antihemolytic activity, efficient concentration.

Размещено на Allbest.ru

...