Віруси та вірусні захворювання чорного перцю (Piper nigrum L.) в умовах закритого ґрунту та тропічних і субтропічних агроценозів

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК 578.85/.86 (048)

ВІРУСИ ТА ВІРУСНІ ЗАХВОРЮВАННЯ ЧОРНОГО ПЕРЦЮ (Piper nigrum L.) В УМОВАХ ЗАКРИТОГО ҐРУНТУ ТА ТРОПІЧНИХ І СУБТРОПІЧНИХ АГРОЦЕНОЗІВ

03.00.06-вірусологія

Автореферат

на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

БИСОВ АНДРІЙ СЕРГІЙОВИЧ

КИЇВ 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано на кафедрі вірусології Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка, м. Київ.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Бойко Анатолій Леонідович, Київський Національний Університет імені Тараса Шевченка, завідувач кафедри вірусології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Співак Микола Якович Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, завідувач відділу проблем інтерферону та імуномодуляторів

кандидат біологічних наук Зарицький Микола Макарович Інститут сільськогосподарської мікробіології УААН, Старший науковий співробітник, завідувач лабораторії фітовірусології і біотехнології

Провідна установа: Нікітський ботанічний сад - національний науковий центр УААН, м. Ялта.

Захист дисертації відбудеться 14.01.2003 р. о14 годині на засіданні Спеціалізованої вченої ради Д 26.001.14 Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, Київ, проспект Глушкова, 2, корпус 12, ауд. 215 Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського Національного Університету імені Тараса Шевченка: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 12.12.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради Молчанець О.В.

З великої кількості рослин що ростуть на Землі, тільки 1 тис. використовується в агропромисловому виробництві. При цьому приблизно 15 їх забезпечують основний обёєм рослинної їжі (рис, пшениця, кукурудза, цукрова тростина, батат, квасоля, соя, кокосова пальма, банан, цитрусові), більшість цих рослин вирощується в тропічних та субтропічних країнах. Сільськогосподарські рослини тропічних та субтропічних регіонів мають велике економічне значення. В останні роки у світі збільшились об'єми споживання тропічних та субтропічних рослин і зокрема чорного перцю. Збільшення об'ємів виробництва цих культур є основою економічного зростання країн, де вони вирощуються.

Подальший розвиток сільського господарства передбачає зниження втрат врожаю від шкодочинних патогенів, зокрема вірусної природи. Надзвичайно гостро ця проблема постала перед країнами Азії, Африки, Латинської Америки та Південного В'єтнаму. Ці патогени завдають збитків як в агроценозах, так і в закритому ґрунті. Одним з шляхів зниження втрат врожаю є оздоровлення та створення стійких щодо вірусних патогенів сортів.

Щоб виробити правильну стратегію боротьби з вірусними хворобами чорного перцю та інших тропічних і субтропічних сільськогосподарських рослин, необхідно встановити причини їхніх захворювань на всій території вирощування, визначити фактори, що негативно впливають на рослину, та виявити шляхи передачі й збереження їх в агроценозах, розробити діагностичні тест-системи для виявлення та ідентифікації патогенів. Такий підхід необхідний для прогнозування розвитку вірусних хвороб та прийняття певних заходів боротьби з ними. У сучасній літературі питання вірусних хвороб чорного перцю практично не висвітлено.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконувалась згідно з науковими темами кафедри вірусології біологічного факультету Київського національного університету: тема (реєстраційний номер №01БФ036-01) “Моніторинг збудників вірусних інфекцій з метою розробки наукових основ екологічно чистих технологій вирощування сільськогосподарських культур”, керівник - доктор біологічних наук, професор, акад. УААН, завідувач кафедри вірусології Бойко А.Л., міжнародної угоди (реєстраційний номер №2000Д009) “Розробка технологічних прийомів боротьби проти вірусних хвороб сільськогосподарських культур СРВ (кава, чай, чорний перець, цитрусові та інші)”, керівник - доктор біологічних. наук, професор, акад. УААН, завідувач кафедри вірусології Бойко А.Л.

Мета та задачі дослідження. Має велике значення вивчення вірусів як об'єкта різносторонніх досліджень в тих регіонах, де вирощуються рослини чорного перцю. Як об'єкт досліджень був взятий вірус, виділений з чорного перцю, тому що він є найпоширенішим на плантаціях, де він вирощується в тропічних та субтропічних країнах.

Вивчити розповсюдженість фітовірусів, що уражують чорний перець (Piper nigrum L.) з різних таксономічних груп в умовах закритого та відкритого ґрунту, оцінити можливості виникнення епіфітотій, спричинених цими вірусами, за допомогою сучасних вірусологічних методів та методів комп'ютерного моделювання. Удосконалити існуючі та розробити нові методики ідентифікації вірусів тропічних та субтропічних рослин.

Для досягнення цієї мети необхідно було вирішити такі питання:

1. Виділити і проаналізувати віруси тропічних та субтропічних рослин, і зокрема чорного перцю закритого та відкритого ґрунту за допомогою методів біологічних тестів на рослинах-індикаторах, електронної мікроскопії, флуоресцентної мікроскопії та імуноферментного аналізу у різних модифікаціях.

2. Отримати діагностичні сироватки до вірусів, які уражують рослини чорного перцю, для їх ідентифікації імуноферментним методом.

3. Розробити методику оздоровлення рослин чорного перцю (Piper nigrum L.).

4. Створити банк здорового (безвірусного) посадкового матеріалу рослин чорного перцю.

5. Розробити математичну модель для імітації розвитку вірусних захворювань на рослинах чорного перцю (Piper nigrum L.)

Об'єкт дослідження - віруси, що уражують чорний перець (Piper nigrum L.). чорний перець вірус сироватка

Предмет дослідження - біологічні та епідеміологічні властивості вірусів чорного перцю (Piper nigrum L.)

Методи дослідження включали метод біологічного тестування з використанням рослин-індикаторів, метод імуноферментного аналізу, електронної мікроскопії, флуоресцентної мікроскопії, метод математичного моделювання, цитологічні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше представлені результати порівняльного аналізу рослин чорного перцю закритого ґрунту Ботанічного саду імені О.В. Фоміна та Нікітського ботанічного саду - національного наукового центру УААН (м. Ялта) з рослинами відкритого ґрунту Південного В'єтнаму, які контаміновані вірусами, серологічно спорідненими з ВТМ, ХВК, УВК, МВК та SВК.

Створено карту розповсюдженості фітовірусів тропічних і субтропічних рослин Південного В'єтнаму. Вперше всебічно досліджено та описано вірус, виділений з рослин чорного перцю, що подібний до представників родини Potyviridae.

На основі розробленої математичної моделі розвитку вірусних захворювань на рослинах чорного перцю (Piper nigrum L.) можлива побудова довгострокових прогнозів розвитку вірусної інфекції на чорному перці.

Практичне значення роботи. Проведено широкомасштабне обстеження плантацій чорного перцю та інших супутніх рослин (маша, сої, полонії, апельсину солодкого, кави, орхідей) Південного В'єтнаму на наявність вірусних інфекцій.

Отриманні поліклональні антитіла до вірусу, що уражує чорний перець, які можна використовувати для діагностики хвороб.

Розроблено технологічну схему отримання високоякісного безвірусного посадкового матеріалу рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) на основі культивування меристем від здорових рослин-донорів.

Розроблено математичну модель розвитку вірусних захворювань на рослинах чорного перцю (Piper nigrum L.).

Особистий внесок здобувача. Інформаційний пошук, опрацювання літературних даних, розробку схеми експерименту, отримання експериментальних даних, їх узагальнення та інтерпретацію автором дисертації здійснено особисто.

Апробація результатів дисертації. Матеріали були представлені на: Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси”, Київ, Україна, 2001 рік, міжнародній конференції “Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources”. 26-31 may 2002, Yalta, Ukraine, наукових семінарах кафедри вірусології, конференціях біологічного факультету, присвячених проблемам фітовірусології (1998-2002 р.).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових праць, з яких 4 статті у наукових журналах та 2 - матеріали конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається із вступу, огляду літератури, матеріалів та методів, результатів та їх обговорення, підсумків, висновків та переліку використаних літературних джерел. Повний обсяг роботи складає 130 сторінок друкованого тексту, що включає 35 рисунків (з них 15 фотографій), 6 таблиць та перелік використаних джерел (219, з них 157 - іноземні).

Огляд літератури

Огляд літератури складається з 4 глав, в яких наведенні дані останніх років стосовно вірусів та вірусних хвороб тропічних та субтропічних рослин, висвітлені питання хвороб чорного перцю (Piper nigrum L.).

Матеріали та методи досліджень

Відбір зразків. Первинний скринінг інфекційного матеріалу проводили за зовнішніми ознаками, які з'являються на рослинах (характерні симптоми ураження) та проявляються у вигляді жовтих смуг на листкових пластинках, їх деформацій, вкорочення стебел та пагонів, зміні забарвлення листя, появі хлоротичних та некротичних плям на листках та ін.

Для дослідження вірусів з плантацій тропічних і субтропічних сільськогосподарських культур (чорного перцю) відбирали зразки культурних рослин та ґрунту в трьох повторностях зразка з трьох точок методом рендомізованого польового експерименту, які вносили в стерильні пакети. Відбір проводили в чотирьох головних провінціях Південного В'єтнаму: у провінції Бінь-Фуок, у провінції Донг-Най, провінції Вунг-Тау, та острові Фу-Куог. Для препаративного виділення та накопичення вірусів відбиралися зразки культурних рослин та рослин-індикаторів з візуальними симптомами вірусного ураження.

Виділення та очищення вірусних препаратів. Виділення вірусного матеріалу проводили шляхом гомогенізації свіжозаморожених інфікованих рослин в 0.1 М калій-фосфатному буфері (К2НР04-КН2РО4), рН 7.4, з додаванням 0.01 М Na2SO3, освітленням хлороформом вірусного екстракту у співвідношенні 1:7 та подальшим низькошвидкісним центрифугуванням протягом 20 хв при 4 тис. об/хв на центрифузі РС-6. Концентрування препаратів проводили за допомогою інкубації надосадової рідини на магнітній мішалці з додаванням 5% поліетиленгліколю 6000 ("Serva", США) та 1.2% NaCl протягом 60 хв при 4°С. Після інкубації режим центрифугування становив 10 тис. об/хв протягом 15 хв. У подальшому осад ресуспендували в 0.01 М калій-фосфатному буфері, рН 7.4, з подальшим високошвидкісним центрифугуванням в режимі 30 тис об/хв протягом 1.5 год на центрифузі "Beckman", ротор SW-40. Відбирали осад, який знову ресуспедували в 0.01 М калій-фосфатному буфері та проводили через сахарозну подушку при 30 тис. об/хв протягом 2.5 год. на тому ж роторі. Осад ресуспендували в 0.01 М тріс-НСІ, рН 7.6, та діалізували протягом ночі при 4°С проти 0.01 М тріс-НСІ. При роботі з вірусним матеріалом були використані буфери, що не містять солей натрію. Концентрацію вірусу визначали спектрофотометрично за формулою:

С = A260*N/Kg

де С - концентрація вірусу в мг/мл,

А260 - екстинкція при довжині хвилі 260 нм,

N - розведення вірусного препарату,

Kg - коефіцієнт екстинкції, що для ВТМ становить 2.7.

Рослини-індикатори. Для оцінки інфекційних властивостей вірусів використовували метод рослин-індикаторів. Для ідентифікації вірусу брали молоді рослини:

Datura stramonium (на стадії чотирьох справжніх листків), які дають симптоми мозаїки, що іноді супроводжується некрозами для ХВК, мозаїки для ВТМ;

Nісotiana tаbaсum, сорту Trapeson, які дають симптоми деформації та мозаїки для ВТМ, мозаїки, іноді деформації для ХВК, посвітління жилок, мозаїки, затримки росту УВК; Chenopodium amaranticolor, які дають некротичну реакцію для ВТМ. Інфікування рослин проводили механічно такими вірусами, як ВТМ, ХВК, УВК.

Симптоми вірусних захворювань спостерігалися залежно від вірусу через 3-18 днів після інфікування.

Електронна мікроскопія. Для вивчення морфології вірусів застосовувалися трансмісійні електронні мікроскопи JEM-1200 (JEOL, Японія) JEM-100В (JEOL, Японія), ЕМ-125 (Суми, Україна) з негативним контрастуванням вірусних часточок.

Для виготовлення плівок-підкладок використовували 0,2 % розчин форм вару (полівінілформальдегіду) в хлороформі. Для негативного контрастування використовували розчини солей важких металів: 2% розчин фосфорновольфрамової кислоти (ФВК) рН 7-7,4 та 2% розчин уранілацетату в дистильованій воді (Бойко А.Л.,1990).

Імуноферментний аналіз. Імуноферментний аналіз проводили методом непрямого ІФА (indirect ELISA) на полістиролових планшетах, використовуючи кролячі антисироватки до досліджуваних вірусів та антикролячу антисироватку, мічену пероксидазою хрону. Результати реєстрували на автоматичному ELISA-рідері при довжині хвилі 405 нм. За позитивний результат приймався показник Е405, що вдвічі перевищував показник негативного контролю (сік здорової рослини).

Електрофоретичні дослідження. Електрофорез досліджуваних білків проводили за Лемлі з використанням 14% розділяючого поліакриламідного гелю та 5% концентруючого гелю. Перед нанесенням на гель зразки інкубували на водяній бані при 100°С протягом 3 хв. у буфері з SDS (1%) і 2-меркаптоетанолом (1%).

Електрофорез проводили у комерційному апараті для вертикального електрофорезу ("Хійу Каллур", Латвія) при 90 мВ і 25 мА на гелеву пластинку завтовшки 1 мм протягом 2.5 годин при 4°С. Фарбування проводили протягом ночі в розчині кумасі блакитного R- 250 (" Serva", Німеччина):

Після фарбування гелі відмивали в 7% водному розчині оцтової кислоти. Для визначення молекулярних мас використовували набір маркерних білків LMW ("Pharmacia", Швеція).

Хромосомні дослідження проводили за методом Кунах В.А., (1975) Для досліду брали молоді корінці рослин чорного перцю (Piper nigrum L.), які відділяли від рослини і заливали етиловим спиртом (70%) та льодяною оцтовою кислотою у співвідношенні 3:1 на 24 год. Потім матеріал переносили на 24 год в С2Н5ОН (70%). Зразки на 30 хвилин занурювали в речовину Х в розведенні 1:4 (одна частина речовини Х та 4 частини 96% етилового спирту). Далі зразки ставили на водяну баню на 30 хв при t=60 Co. Після закінчення експозиції зразки знімали з водяної бані та давали їм охолонути, відбирали розчин, заливали 3 частинами етилового спирту і 1 частиною льодяної оцтової кислоти на 30 хв. Для фіксації використовували 45% розчин льодяної оцтової кислоти протягом 15 хв. Зразки відмивали дистильованою водою і занурювали в барвник на 12 год. Як барвник використовували ацетонарсеїн. Зразки готували методом давлених препаратів. Зразки продивлялися при інструментальному збільшенні 63х12,5.

Люмінесцентна мікроскопія. Для вивчення вірусних внутрішньоклітинних включень використовували метод люмінесцентної мікроскопії. Для приготування зразків брали нижній міжжилковий епітелій листка рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) з симптомами хвороби. Як барвник використовували акридиновий оранжевий в розведенні (1:1000). З листків з симптомами знімали нижній міжжилковий епітелій та занурювали його в 3% розчин трихлороцетової кислоти на 3 хвилини, щоб відбулася фіксація зразка.

Одержання специфічних сироваток. Для вивчення серологічних властивостей вірусу чорного перцю нами були отримані кролячі поліклональні сироватки. Імунізація однорічних самців кролів породи “Шиншила” вагою 3-3,5 кг (по три тварини в групі) проводилась в три етапи з інтервалом в 14 діб. Першу імунізацію проводили з повним адювантом Фрейнда (“Sigma”, США) у співвідношенні 1:1. Доза імуногенну складала 200 мкг вірусного препарату. Наступні імунізації проводили з неповним aдювантом Фрейда (“Sigma”, США) при зростаючій концентрації вірусу чорного перцю.

Перші три імунізації здійснювали підшкірно на внутрішньому боці стегон. Останню імунізацію проводили внутрішньовенно дозою вірусного антигену 800 мкг. Забір крові здійснювали з вушної вени на 7-й день після останньої імунізації, для подальших досліджень об'єднували сироватки кролів однієї групи.

Для визначення титру отриманих сироваток застосовували метод непрямого ІФА.

Статистична обробка даних ІФА

Статистична обробка результатів проводилася за допомогою комп'ютерної бази даних з вирахуванням стандартного відхилення :

Е= Е±а

Е = (Е1 + Е2 +... + Еі) / і

А = |Еmax-E| = | Emin-E|,

де Е - це достовірне значення екстинкції, Е - середнє арифметичне виміряних значень екстинкції Е1...Ei; а - стандартне відхилення.

Математичне моделювання впливу фітовірусів на рослини чорного перцю. Для побудови та дослідження математичних моделей процесу репродукції фітовірусів за різних умов вирощування рослин чорного перцю використовували методи побудови математичних моделей біологічних об'єктів, метод оптимізації моделей, методи чисельного диференціювання та інтегрування функцій. Програмне забезпечення побудоване на мові програмування Delphi. При розробці моделі розвитку рослин чорного перцю створено методику, яка визначає структуру об'єкта досліджень з урахуванням потреб елементів цієї структури (процесів) у речовинах та можливої кількості речовин, яку можуть отримувати ці елементи (потенційні та реальні інтенсивності процесів).

Результати та їх обговорення

3.1 Первинний скринінг вірусних хвороб рослин чорного перцю (Piper nigrum L.)

Протягом багатьох років вивчали вірусні хвороби рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) в умовах закритого ґрунту Ботанічного саду імені О.В. Фоміна Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Застосовуючи специфічні антисироватки до різних фітовірусів відмічено, що протестовані методом непрямого імуноферментного аналізу рослини мають 40% позитивної реакції на ВТМ, 80% на УВК, 50% рослин було контаміновано ХВК, 20% -SВК, 30% - МВК від загальної кількості проаналізованих рослин. (рис. 1.)

Нами були також обстежені оранжереї Нікітського ботанічного саду (м. Ялта) на наявність вірусних патогенів на рослинах чорного перцю (Piper nigrum L.)

Рослини чорного перцю (Piper nigrum L.) Нікітського ботанічного саду мали аналогічні симптоми з рослинами, які вирощувались в оранжереях в умовах закритого ґрунту Ботанічному саду імені О.В. Фоміна.

Після постановки ІФА позитивну реакцію на ВТМ мали 30% рослин, на ХВК 30%, УВК- 60%, МВК-20%, SВК-20% від загальної кількості проаналізованих рослин (рис. 2.).

Серед вірусів, які уражують чорний перець, найчастіше трапляються віруси, які викликають мозаїки на рослинах. При цьому ураженість ними може призвести до загибелі цілих плантацій чорного перцю, в наслідок цього збитки сягають 40-80%.

Було показано, що в умовах Південного В'єтнаму рослини чорного перцю мали яскраво виражені симптоми вірусного ураження, які мали як системний, так і локальний характер.

Хлоротична крапчастість (жовта крапчастість). Зустрічалась на листках середнього, нижнього та рідше верхнього ярусів, та проявлялась у вигляді жовтих точок та дрібних плям круглої і неправильної форми розміром від 1 до 3 мм. Кількість плям на листку коливається від 1 до 20. Кучерява деформація листків (кучерявість листків), спостерігалась на верхньому рівні та не виявлялись на листках середнього та нижнього рівнів. Кучерявість листків проявлялась у гофруванні поверхні листкової пластинки.

Гофрування листків (деформація листків). Спостерігалось на листах різних стадій розвитку та проявлялись у вигляді гофрування поверхні листків, займаючи більшу частину листкової поверхні.

Хлоротична мозаїка (жовта мозаїка). Зустрічалась на листках різних стадій розвитку. Ураження листя супроводжується появою між прожилками плям жовтого кольору розміром від 3 до 7 мм. На початковій стадії розвитку інфекції вони поодинокі, проте потім ураження набувають системного характеру, і їх кількість збільшується, утворюючи при злитті мозаїчний малюнок, що займає до 60 - 80% листкової поверхні.

Проростання верхньої частини листка (виродження верхньої частини листкової пластинки). Симптоми зустрічались на листках різних ярусів. Один з їх проявів - деградація апікальної частини верхівки листка. Цей симптом супроводжувався хлоротичною мозаїкою та крапчастістю. Іноді листя сильно редукує, зменшуючись у розмірах у 3-5 разів в порівнянні з листям здорових рослин.

Темно-зелена мозаїка. Патологія спостерігалась на листках середнього ярусу та проявлялась у вигляді темно-зелених плям, які локалізувались у середині листкової пластинки, іноді утворюючи продовгуваті мозаїчні зони вздовж центральних та бічних жилок.

Некрози листків (некротична крапчастість). Симптоми з'являлись на листковій пластинці у вигляді невеличких (0.5 - 1 мм) прозорих некрозів округлої форми. Іноді утворювалась вузька хлоротична облямівка завширшки 0.1 - 0.2 мм. Симптоми зустрічались на листях усіх ярусів, по мірі розвитку рослини величина некрозу збільшувалась до 3 - 5 мм, некротична пляма набувала неправильної форми, висохлий листок у місці некрозу розривався, що призводило до утворення отворів.

Концентрична плямистість. На листках утворювались великі плями, що поступово зливались і являли собою чергування кільцеподібних світлих та темних зон. Симптоми починали проявлятися на листках нижніх ярусів, швидко поширювались уверх.

На основі даних візуальної діагностики встановлено, що ураження рослин на плантаціях, як правило, складає від 2 до 78% (від загальної кількості обстежених рослин) залежно від сорту, технології вирощування та ін. (рис. 3.).

3.2 Морфологічна характеристика вірусів чорного перцю

Віруси, зокрема фітовіруси, є одним із компонентів навколишнього середовища, тому природно, що всі представники цього середовища здійснюють взаємний вплив один на одного. Віруси тропічних та субтропічних рослин поряд з іншими популяціями підпадають під вплив екологічних факторів, таких як кліматичні умови, радіоактивність тощо. Вплив на віруси тропічних та субтропічних рослин може здійснюватись безпосередньо (зокрема на їх НК), або опосередковано при реплікації у рослинах - хазяях та комахах-переносниках. Повне розуміння процесу екологічних чинників на фітовіруси повинне поєднувати в собі механізм як прямого, так і опосередкованого впливу, оскільки тільки за таких умов у поле зору потрапляють всі компоненти цього процесу - віруси, резервуари, екологічні фактори.

Для препаративного виділення та накопичення вірусів відбирали зразки з рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) та рослин-індикаторів з симптомами вірусного ураження. Дослідження проводили у чотирьох головних провінціях Південного В'єтнаму: у провінції Бінь-Фуок, у провінції Донг-Най, провінції Вунг-Тау, на острові Фу-Куог. Також для порівняння відбирали зразки з оранжерей Ботанічного саду імені О.В. Фоміна Київського національного Університету імені Тараса Шевченка.

Відібрані рослини чорного перцю (Piper nigrum L.) з різних провінцій Південного В'єтнаму мали схожі симптоми вірусного ураження, які проявлялись у вигляді мозаїк та некротичних плям. У подальшому відібрані рослини гомогенізували в фосфатно-сольовому буфері, рН 7.4, іонна сила якого дозволяє зберігати вірусні часточки стабільними та приводити до осадження рослинних решток, потім проводили низькошвидкісне центрифугування для видалення грубих рослинних решток.

Для електронномікроскопічних досліджень був використаний надосад, отриманий після центрифугування. Зразки для електронної мікроскопії готували методом негативного контрастування з використанням уранілацитату. У результаті електронномікроскопічних досліджень були виявлені ниткоподібні віруси, розміри яких становили 700 - 750 х 11+\-0.3 нм, що є характерним для родини Potyviridae (рис. 4.).

Також у результаті електронномікроскопічних досліджень соку рослин чорного перцю були виявлені паличкоподібні віруси, розміри яких становили 300 х 15+/-0.3 нм, що є характерним для роду Tobamovirus.

Інокуляцію вірусними препаратами, отриманими із соку рослин, відібраних на плантаціях чорного перцю (Piper nigrum L.), проводили механічно із застосуванням карборунду на стадії 4-х справжніх, які в подальшому використовувались в експерименті.

Симптоми вірусних захворювань у рослин спостерігалися через 3 - 18 днів після інфікування. Ниткоподібний вірус чорного перцю був виділений з них на 18-й день після інокуляції.

Чистоту очищених вірусних препаратів визначали спектрофотометрично. Як відомо, показник Е260/Е280 є досить вдалим, для аналізу концентрації та чистоту вірусного препарату. Виділений високоочищенний вірусний матеріал був отриманий в концентрації 5мг/мл. Визначені нами спектрофотометричні характеристики показали, що співвідношення Е260/Е280 становило 2.5, що характерно для Potyvirus. Ці показники Е260 /Е280 лежать в межах норм для YBK - 2.3-2.9 і свідчать про відсутність домішок білків та нуклеїнових кислот у препаратах. Форма графікa, який відображає спектрофотометричну характеристику вірусного препарату, типова для Potyvirus, що містить 5% нуклеїнової кислоти та 95% білку.

У всіх випадках й у всіх рослин, які реагують на ВТМ, в клітинах епідермісу та інших тканинах утворюються різної морфології та величини кристалічні включення. Ці компоненти, присутні в тканинах поодинці або в різних поєднаннях, є надійною ознакою для швидкого і простого діагностування вірусного захворювання.

Для вивчення локалізації вірусних внутрішньоклітинних включень використовували метод люмінесцентної мікроскопії. Як барвник використовували акридиновий оранжевий в розведенні 1:1000. Різні флюорохроми використовують для виявлення і вивчення вірусних включень і зокрема для їх кількісного підрахунку. При фоновому синьо - зеленому свіченні компонентів клітини, кристалічні включення (після обробки акрединоранжем) флуоресціювали оранжевим кольором (рис. 5).

Як показали наші досліди, люмінесцентно-мікроскопічний аналіз дає можливість розрізняти зернисті скупчення в цитоплазмі, які виникають у результаті руйнування хлоропластів.

3.3 Cерологічна характеристика вірусів чорного перцю

Дослідження серологічних властивостей вірусів, які уражують чорний перець в умовах Південного В'єтнаму, здійснювали методом ІФА в модифікації DAS-ELISA, контролем слугувала нормальна кроляча сироватка. Для достовірності результатів аналіз проводили у трьох повторностях. В результаті проведених досліджень були отримані результати, представлені на рис. 6.

Протестовані в провінції Бинь-Фок рослини мають 25% позитивної реакції на ВТМ, 20% на ХВК, 20% на УВК, 50% - SВК, 25% - MBK.

Схожа ситуація спостерігалася на рослинах чорного перцю (Piper nigrum L.) в провінції Вунг-Тау. Вірусом тютюнової мозаїки було контаміновано 70% рослин чорного перцю, ХВК - 90%, УВК - 70%, SВК - 50%, МВК - 20% рослин.

В провінції Дог-Най ВТМ було уражено 10% рослин, ХВК - 90%, УВК - 30%, SВК - 10%, МВК - 10%. При проведенні досліджень на острові Фу-Куго показано, що вірусом тютюнової мозаїки було інфіковано 50% рослин, УВК - 45%, УВК - 20%, SВК - 10%, МВК - 15%.

Для вивчення біологічних властивостей досліджуваного вірусу чорного перцю та порівняння його с типовим штамом УВК потрібно було виявити відмінність між структурними білками виділеного нами вірусу та УВК. Для порівняння їх молекулярних мас між собою був проведений аналітичний електрофорез досліджуваного вірусу в поліакриламідному гелі по Лемлі з використанням ДСН (ПААГ-ДСН).

У результаті проведення електрофорезу та фарбування гелю в кумасі блакитному R - 250 в треці спостерігався тільки один білковий компонент, обрахунок молекулярної маси якого за калібрувальною кривою залежності lg Mr від довжини пробігу маркерних білків становив 43±0.5 кДа, що корелює з молекулярними масами структурного білка УВК.

3.4 Отримання безвірусних рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) за допомогою мікроклонального розмноження

На сьогодні нами розроблено ряд способів мікроклонального розмноження та оздоровлення рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) (рис. 7.). В їх основі лежать три принципових підходи: індукція до поділу клітин пазушних меристем; утворення із тканин експлантата пагонів та ембріоїдів і їх ділення (прямий ембріогенез); отримання калусної тканини з наступною індукцією органогенезу (непрямий ембріогенез) та перевірка їх на наявність вірусних патогенів на кожному етапі роботи.

Для мікроклонального розмноження рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) відбирали пазушні бруньки з здорової рослини і перевіряли її на наявність вірусних патогенів за допомогою ELISA-тесту. Позитивними вважалися результати, значення оптичної густини для яких було в 3 рази більше, ніж значення позитивного контролю. Тест застосовували на всіх етапах мікроклонального розмноження. Якщо результат аналізу був позитивним, рослину використовували для подальшої роботи. Брали молодий пагін рослини і різали стерильним скальпелем на сегменти завдовжки приблизно 10 мм так, щоб частина над брунькою становила 2 - 3 мм, а під нею 5 - 7 мм. Потім листка має знаходитись над агаром.

Культивували клони при температурі 250 - 280С, освітленні 2-3 клк., 16-годинному фотоперіоді, відносній вологості повітря 70 - 75%.

Через 3-4 тижні з пазушних бруньок розвиваються рослини-регенеранти, які знову можна брати для розмноження живцями. В цей час проводили перевірку на наявність вірусу в рослині.

Для індукування калусної тканини in vitro простерилізований рослинний матеріал надрізали і переносили на живильне середовище. При цьому клітини рослини, що перебувають на крайній стадії диференціації, під дією індукторів клітинного поділу - ауксинів і цитокінінів, переходять у дедиференційований стан і поновлюють меристематичну активність.

Для отримання калусу брали середовище Мурасіге і Скуга, доповнене регуляторами росту. Для індукції калусоутворення використовували живильні середовища з високим співвідношенням ауксин : цитокінін (10:1).

Утворення калусу залежить також від утворення експлантата. Первинний експлантат, як правило, мав розмір 5 - 10 мм3 і вагу 20 - 100 мг.

Після утворення калусу in vitro його відділяли від експлантата і поміщали на поверхню агаризованого середовища. В результаті цього отримували калусну тканину, яка мала вигляд аморфної маси, що складається з тонкостінних паренхімних клітин без визначеної анатомічної структури. Калусну тканину підтримували у культурі тривалий час, періодично розділяючи її на фрагменти і пересаджуючи на свіже середовище. Чашки з рослинним матеріалом культивували в термостаті при температурі 250 - 260С. Через 25 - 30 днів спостерігали утворення калусу на експлантантах. Після вибраковки за допомогою вірусологічних тестів отримували безвірусні рослини-донори, які в подальшому слугували матеріалом для подальшої роботи та висадки у відкритий ґрунт.

3.5 Дослідження впливу вірусів на хромосомний апарат клітини чорного перцю (Piper nigrum L.)

Нами були проведені хромосомні дослідження клітин чорного перцю (Piper nigrum L.) та підраховані хромосоми у клітинах, виявлені аберації під впливом вірусних патогенів (рис. 8.). Кількість хромосом в клітині сановить 110+\-5 штук під впливом ізоляту УВК виділеного з чорного перцю, в нормі кількість хромосом становила 128+\- 3 штук. Було доведено, що вірусні патогени мають негативний вплив на хромосомний апарат клітин чорного перцю.

3.6 Дослідження впливу вірусів на розвиток рослин чорного перцю за допомогою використання нових комп'ютерних технологій

Дослідження впливу вірусів на розвиток рослин чорного перцю проводилося нами на базі математичного моделювання з використанням нових комп'ютерних технологій. У комп'ютерному проекті КЕІС 2.0 (комп'ютерна екологічна система), який підтримує розподільчі системи, пропонується методика використання регіональних моделей на базі об'єктно-матричного методу.(Ю.В. Загородній, А.Л. Бойко, 2001).

У пошуку основ імітації впливу на функціонування організмів фітовірусів використовували підхід інформаційної системології. Інформаційна системологія визначає основне поняття - система як елементи, об'єднані інформаційною і енергетичною складовими. Інформаційна складова системи містить у собі ціль системи та план її поведінки (реалізація цілі) і визначає енергетичну складову та структуру системи. Енергетична складова - це деякий потенціал системи, який дозволяє здійснювати перехід з початкового стану до стану цілі. Структура системи - сукупність матеріальних елементів та зв'язків між ними, тобто сукупна матеріальна реалізація системи. Під станом цілі мається на увазі стан системи (конкретне значення характеристик структури), при якому реалізується ціль. Ціль як інформаційна складова поєднує визначену загальність елементів у систему і є деяким внутрішнім фактором, що визначає поведінку системи для досягнення стану цілі.

Підсистему першого рівня генерують інші підсистеми нижчих рівнів. Таким чином, екологічна система презентує двомірний простір, кожна точка якого складається з характеристик вищеназваних підсистем і який відкритий до розширення і розвитку.

Базовий рівень структури екосистеми - це двомірний простір, наприклад чорного перцю, кожна точка якого характеризується набором параметрів та взаємовідношень між ними. Територіальний чи факторний розподіл одного з параметрів (наприклад, рівня забруднення чи значення температури) представляється матрицею даних, яку ми назвали шаром накопичених даних. Відношення між параметрами можуть бути наступними:

- відношення, які визначають строгу залежність параметрів від часу;

- горизонтальні відношення: відносини, що залежать тільки від знаходження точки на карті теритоторіального чи факторного розподілу;

- вертикальні відношення: відношення між різними параметрами однієї точки розподілу.

Матричний обчислювач є ядром системи КЕІС. Він проводить розрахунки значень параметрів системи, враховуючи всі встановлені користувачем відносини. Матричний обчислювач містить:

1) Змінну t - характеристика поточного кроку динамічної моделі;

2) Набір простих параметрів (множина С), що не мають розподілу в базовому двомірному просторі. На логічному рівні ці параметри можуть утворювати масиви (одно - та багатовимірні);

3) Набір матриць територіального чи факторного розподілу (множина L). Кожна матриця - відповідний шар даних;

4) Набір алгебраїчних виразів (множина Е). Вираз представляється зворотним записом.

Інтерфейс матричного процесора дозволяє виконувати наступні дії:

1) створювати загальну структуру екологічної моделі, завдавати розмірність розподілу, кількість параметрів, шарів відношень.

2) Задавати початковий стан екосистеми: значення параметрів, конфігурацію регіонів, встановлювати відношення алгебраїчних виразів;

3) Змінювати стан системи за кроком часу, використовуючи дані пункту 2.

4) Отримувати та аналізувати поточний стан екосистеми. (Ю.В. Загородній, А.Л. Бойко, 2001).

3.7 Моделювання та імітація розвитку вірусних захворювань на рослинах чорного перцю (Piper nigrum L.)

Введемо наступні математичні позначення:

1. Вектор процентного ураження рослин перцю в залежності від вірусу:

,

де - процентне ураження плантації відповідним вірусом за час t:

2. Вектор процентного ураження плантації відповідною симптоматикою:

, де

- процент появи і -ї симптоматики в час t.

3. Матриця B, яка вказує лінійну залежність симптоматики від вектора процентного ураження за наступною формулою:

Тоді значення вектора x може змінюватися тільки в межах того, щоб розрахункове значення вектора симптоматики було невід'ємним:

Кожна компонента вектора змінюється за часом. Тобто в кожний момент часу має нове значення, збільшуючись чи зменшуючись. Динаміку такої зміни можна описати за допомогою моделі:

,

де є два параметри:

- швидкість поширення хвороби з часом;

- коефіцієнт граничної межі поширення.

Значення цих коефіцієнтів можуть залежати від різних умов навколишнього середовища.

Так, було показано, що вірусна інфекція на плантаціях чорного перцю буде розвиватися повільно, як видно на рис. 9 максимального піку досягне через 6 місяців й інфіковано буде близько 60% рослин. Це дасть можливість вжити певних заходів.

Висновки

1. Вперше проведена якісна та кількісна оцінка рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) закритого та відкритого ґрунту в тропічному та субтропічному кліматі на наявність шкодочинних вірусів. Показана нерівномірність розповсюдження фітовірусів на території Південного В'єтнаму.

2. В умовах закритого ґрунту Ботанічного саду імені О.В. Фоміна та Нікітського ботанічного саду - національного наукового центру УААН (м. Ялта) встановлена значна ураженість рослин чорного перцю патогенами, які належать до Tobamovirus, Potexvirus, Potyvirus, Carlavirus (ВТМ - 30%, ХВК - 30%, УВК - 60%, МВК - 20% та SВК - 20%).

3. Методом електронної мікроскопії ідентифікований вірус, який уражує рослини чорного перцю (Piper nigrum L.). Встановлено, що він має ниткоподібну форму (розміри вірусних часток становили 700-750 х 11+/-0.3 нм), за серологічними та морфологічними показниками він є подібним до вірусів родини Potyviridae.

4. Отриманні поліклональні антитіла до вірусу що уражує чорний перець, доли можливість діагностувати захворювання в різних регіонах як у закритому, так і у відкритому ґрунті.

5. Вперше створено карту розповсюдження вірусів, що уражують чорний перець (Piper nigrum L.), в агроценозах Південного В'єтнаму.

6. Розроблено технологічну схему мікроклонального розмноження рослин чорного перцю (Piper nigrum L.) та отримання високоякісного безвірусного посадкового матеріалу.

7. Створено математичну модель розвитку вірусних інфекцій на рослинах чорного перцю (Piper nigrum L.), що дасть можливість прогнозувати розвиток епідемій.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертації

1. Бисов А.С. Віруси і вірусні хвороби рослин чорного перцю в умовах Південного В'єтнаму // Вісн. Київ. Націонал. Університету ім. Тараса Шевченка. Біологія. 2001. №35. С. 19-21

2. .Бойко А.Л., Бисов А.С. Дослідження вірусних хвороб чорного перцю (Piper nigrum L.) та орхідей роду цимбідіум (Cymbidium sp.) в умовах природного довкілля та закритого ґрунту // Вісн. Київ. Націонал. У-ту. ім. Тараса Шевченка. Інтродукція та збереження рослинного різноманіття. 2000. №3. С. 67-69.

3. Поліщук В.П., Бойко O.А., Муж Г.В., Молчанець О.В., Бисов А.С., Капустіна Н.О., Потівіруси в агроценозах // Захист рослин. 2001. №12. С. 19-20.

4. Doan Thi Ai Thuyen, Bysov A.S., Thai Xuan Du, Boyko A.L., Nguen Tien Thang. A Preliminary diagnosis study on black pepper (Piper nigrum L.) grown in east provinces of the South of Vietnam // Trong tam khoa hoc tu nhien & Concg nghe quoc gia, Vien sinh hoc nhiet doi, Tuyen tap cong trinh nghien cuu, Khoa hoc cong nghe (1999-2000). Nha xuat ban nong nghiep, Co Chi Minh. 2001, P. 189- 196.

5. Тханг Н.Т., Бойко А.Л., Бисов А.С., Кучеренко М.Є., Зу Т.С., Колонюк І.А., Тхуен Д. Т. Віруси та вірусні хвороби рослин чорного перцю в умовах Південного В'єтнаму // Тези доповіді ІІІ Міжнародній конференції “Біоресурси та віруси”, Київ, Україна, 2001. С. 65-66.

6. Koroteeva A.V., Poischuk V.P., Boyko A.L., Bysov A.S., Lavrentyeva A.N. Necessity for virus control on different stages of Orchidaceae plants introduction // Abst. Nikitsky botanic garden - National scientific center institute of Cell Biology and Genetic engineering under auspices. Biotechnology Approaches for Exploitation and Preservation of Plant Resources. Ukraine, 26-31 may 2002, Yalta. p. 45-46.

Анотація

Бисов А.С. Віруси та вірусні захворювання чорного перцю (Piper nigrum L.) в умовах закритого грунту та тропічних і субтропічних агроценозів.- Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.06 - вірусологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертація присвячена актуальній проблемі вірусології - дослідженню вірусів та вірусних захворювань чорного перцю (Piper nigrum L.) в умовах закритого ґрунту та тропічних і субтропічних агроценозів. Вперше представлені результати порівняльного аналізу рослин чорного перцю закритого ґрунту Ботанічного саду імені О.В. Фоміна та Нікітського ботанічного саду - національного наукового центру УААН (м. Ялта) з рослинами відкритого ґрунту Південного В'єтнаму, які контаміновані вірусами, серологічно спорідненими до ВТМ, ХВК, УВК, МВК та SВК.

Методом електронної мікроскопії виявлено вірус ниткоподібної форми, який уражує рослини чорного перцю (Piper nigrum L.). Розміри вірусних часток становили 700-750 х 11+\-0.3 нм. За серологічними та морфологічними ознаками патоген подібний до вірусів родини Potyviridae.

Отримані поліклональні антитіла до виділеного вірусу чорного перцю, придатні для діагностики вірусного захворювання, а також встановлена серологічна спорідненість антигенів вірусу чорного перцю, які за молекулярними масами подібні до білків інших вірусів родини Potyviridae.

У роботі представлені методичні підходи використання методу хромосомних аберацій для дослідження впливу вірусної інфекції на хромосомний апарат клітин рослини. Створена математична модель та перевірена її робота, для прогнозу розповсюдження вірусної інфекції на рослинах чорного перцю в умовах закритого та відкритого ґрунту.

Ключові слова: віруси, рослини чорного перцю (Piper nigrum L.), аналіз.

Аннотация

Бысов А.С. Вирусы и вирусные болезни черного перца (Piper nigrum L.) в условиях закрытого грунта, тропических и субтропических агроценозов. - Рукопись.

Диссертация на присуждение ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.06 - вирусология. - Киевский Национальный Университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертация посвящена актуальной проблеме вирусологии - исследованию вирусов и вирусных болезней черного перца (Piper nigrum L.) в условиях закрытого грунта, тропических и субтропических агроценозов. Впервые представлены результаты сравнительного анализа растений черного перца (Piper nigrum L.) закрытого грунта Ботанического сада имени О.В. Фомина Никитского ботанического сада - национального научного центра УААН (г. Ялта) с растениями открытого грунта Южного Вьетнама, контаминироваными вирусами, серологически родственными c ВТМ, ХВК, УВК, МВК и SВК.

Методом электронной микроскопии выявлен виру нитевидной формы, который поражает растения черного перца (Piper nigrum L.). Размеры вирусных частиц составили 700 - 750 х 11+\ - 0,3 нм. По морфологическим признакам патоген сходный с вирусам, относящимся к семейству Potyviridae.

Получены поликлональные антитела к выделенному вирусу черного перца (Piper nigrum L.), необходимые для диагностики вирусного заболевания, а также определено серологическое родство антигенов вируса черного перца, которые по молекулярным массам подобны другим белкам вирусов семейства Potyviridae.

В роботе представлены методологические подходы использования метода хромосомных аберраций для исследования воздействия вирусной инфекции на хромосомный аппарат клетки растений. Создана математическая модель и проверена ее работа для прогноза развития вирусной инфекции на растениях черного перца в условиях закрытого и открытого грунта. Также разработана схема микроклонального размножения растений черного перца (Piper nigrum L.) для получения высококачественного безвирусного посадочного материала.

Ключевые слова: вирусы, растения черного перца (Piper nigrum L.), анализ.

Annotation

A.S. Bysov. Viruses and viral diseases of black pepper (Piper nigrum L.) in conditions of closed ground, and tropical and subtropical agrocenoses. -Manuscript.

The thesis for obtaining PhD degree in speciality 03.00.06 - virology. Taras Shevchenko' Kyiv National University, Kyiv, 2001.

The thesis is dedicated to studying of actual problem of virology - viruses and viral diseases of diseases of black pepper (Piper nigrum L.) in conditions of closed ground, and tropical and subtropical agrocenoses. Results of comparative study of plants grown in closed ground of O.V.Fomin' Botanic Garden (Kyiv) and Nikitsky Botanic Garden (Yalta) with plants of open ground from South Vietnam infected by serologically related viruses TMV, PVX, PVY, PVM and PVS are represented for the first time.

Using electron microscopy, filamentous virus infecting black pepper plants (Piper nigrum L.) 700 - 750x11+/-0.3 nm in size was revealed. According to serological and morphological characteristics, the virus relates to representatives of Potyviridae family.

Polyclonal antibodies to the virus of black pepper that may be used for diagnostics of viral disease were obtained. Serological relationships among coat protein of this virus and other potyviruses' has been demonstrated, confirming thus results of protein electrophoresis.

Methodic approaches for using of chromosome aberrations' technique to study effect of viral infection on cell chromosome apparatus are developed in the work. Mathematical model for prognosing of spreading of viral infection on black pepper plants in conditions of closed and grounds has been created and verified.

Keywords: viruses, black pepper plants (Piper nigrum L.), analysis.

Размещено на Allbest.ru

...