Гетерогенність популяції представників роду Аегососсиs і її роль у клініці і розробці нових пробіотиків

доктор медичних наук, професор Сидорчук Ігор Йосипович, Буковинська державна медична академія МОЗ України, завідувач кафедри імунології, алергології та ендокринології

Провідна установа: Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України

Захист відбудеться 25.10.2002 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої Вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: 61057: м. Харків, вул. Пушкінська, 14.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України за адресою: м. Харків, вул. Пушкінська, 14.

Автореферат розісланий 23.09.2002 р.

Вчений секретар

спеціалізованої Вченої ради

к.мед.н., с.н.с. С.В. Бруснік

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. В боротьбі з інфекційними та нагнійно-запалювальними хворобами бактеріальної, вірусної та грибкової етіології в умовах сучасної клініки ведуча роль належить антибіотикам і сульфаніламідним препаратам. Та в значній мірі ефективному використанню цих вельми цінних ліків сьогодні перешкоджає формування стійкості збудників захворювань до них, селекція та інтенсивне розповсюдження полірезистентних штамів. Вказане диктує нагальну необхідність пошуку нових надійних засобів хіміотерапії, антисептики та дезинфекції (Г.К.Палій, 1998; В.В.Смирнов, 1999; І.Й. Сидорчук, 2001).

При цьому в останні десятиріччя набули достатньо інтенсивного розвитку дослідження по розробці та використанню профілактичних і лікувальних препаратів біологічного походження, сконструйованих на основі сапрофітних та умовно-патогенних мікроорганізмів з вираженими антагоністичними властивостями по відношенню до збудників патологічних процесів. Враховуючи нерідко низьку клінічну ефективність хіміопрепаратів та цілий ряд їх негативних ефектів (токсичність, алергізація, вплив на імунну систему, формування стійких варіантів збудників) фактично відроджується підхід наших великих попередників - Мечникова, Мапасеіна, Габричевського, Гамалеї, Ермольєвої, - щодо формування в екологічних нішах організму людини мікробіоценозів, оптимально збалансованих для підтримки його гомеостазу.

Цілком виправдане захоплення клініцистів чудодійним ефектом хіміотерапевтичних засобів на початку ери антибіотиків і в її подовження поступово змінюється на помірне і навіть песімистичне. Дійсно, навіть в країнах з високим рівням охорони здоров'я, не дивлячись на вельми широкий арсенал антибіотиків і антисептиків, кількість післяопераційних гнійних ускладнень, в т.ч. і сепсису, поступово збільшується і в деяких клініках вже перевищує рівні, характерні для доантибіотичної ери.

Відповідно до визначника бактерій Берджі (1994) аерококи відносяться до 17-ї групи, яка об'єднує аеробні і факультативно-аеробні позитивні коки. Типовим видом родини Aerococcus є A.viridans. В останні роки на основі 16S pPHK секвенування, біохімічного і жирнокислотного аналізу, шляхом дослідження фенотипової і генетичної кревності аерококоподібних мікроорганізмів, вилучених від людей, диференційовано ще два види аерококів - A.urinae і A.christensenii sp. nov. (M.D. Collins ; M.R. Jovita, R.A. Hutson, 1999).

Все зростаючий інтерес дослідників до аерококів пов'язаний як з наявністю серед них патогенного виду A.urinae (викликає нагнійно-запальні захворювання сечових шляхів, ендокардити, сепсис), так і з вираженими антагоністичними властивостями A.viridans - представника нормальної мікрофлори людини, з широким спектром біохімічної активності, суперпродуцента альфагліцерофосфат оксидази (M. Mackova, J Kost'Al, K Demnerova, 2000) і L-лактат оксидази (K. Maeda-Yorita, K. Aki, H. Sagai, 1995). A.christansenii sp.nov. (тип CCUG 28831Т) ізольовані із піхви людини, та біологічна роль їх поки що не встановлена.

Лікувально-профілактичний препарат для боротьби з гнійно-запальними і кишковими інфекціями з представників нормальної мікрофлори організму людини, грампозитивних коків роду Аеrососсиs розроблений колективом кафедри мікробіології Дніпропетровської медичної академії і в даний час, згідно з наказом МОЗ України від 7 липня 1995 р. включений до реєстру лікарських препаратів, дозволених для застосування в Україні.

Нечисленні дослідження біологічних властивостей аерококів, які визначають їх антагоністичні властивості, відсутність даних по генетиці цих мікроорганізмів і новизна використання аерококів-антагоністів в якості лікувально-профілактичних препаратів для лікування гнійно-запальних інфекцій шкіри і слизових оболонок обумовили мету і задачі дослідження.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи - характеристика явища гетерогенності встановлення гетеротрофності аерококів для розробки нових пробіотиків і можливості контролю їх автентичності.

Виходячи з поставленої мети, визначені такі основні завдання дослідження:

Вилучення аерококів з різних джерел, вивчення їх морфологічних, фізіологічних і біохімічних властивостей.

Вивчення гетерогенності виділених культур аерококів. Дослідження частоти і умов появи атипічних клітин аерококів і їх властивостей.

Отримання стабільних клонів атипових клітин аерококів і дослідження процесу їх реверсії до вихідних типів аерококів.

Дослідження властивостей ревертантів і їх ідентичності вихідним типам. Визначення можливості використання ревертантів для створення нових активних клонів аерококів.

Визначення і дослідження біологічних процесів і метаболітів, пов'язаних з антагоністичною активністю аерококів, розроблення індикаторних середовищ для реєстрації біохімічних властивостей аерококів.

Дослідження спонтанної і індукованої мінливісті культур аерококів для отримання високоактивних клонів з біологічними властивостями, що прогнозуються, і селекція нових культур аерококів з визначенням аспектів їх використання.

Розробка нового критерію визначення автентичності А-бактерину на основі його антагоністичної і оксидазної активності, а також по ступеню індукції виникнення атипових клітин.

Об'єкт дослідження - гетерогенні за біологічними властивостями мікроорганізми роду Аеrососсиs та пробіотичний препарат А-бактерин, створений на їх основі. реверант аерокок клон клітина

Предмет дослідження - штами аерококів з тонкими варіаціями, щодо культуральних (потреба в ауксинах) та біохімічних властивостей, антагоністичної дії, чутливості до антибіотиків, спонтанної мінливості, здатності до цілеспрямованої селекції клонів з заданими якостями.

Методи дослідження. Для виконання поставлених завдань використані мікробіологічні, біохімічні, фізичні, генетичні та статистичні методи.

Наукова новизна одержаних результатів. Показана гетерогенність культур аерококів, що мають різне походження, за біохімічними властивостями. Встановлена наявність в популяції аерококів "Н₂О₂ ^- " мутантів аерококів, раніше не описаних, що мають складні морфологічні зміни, пояснені підвищеною продукцією метилгліоксалю. У аерококів означений механізм продукції перекису водню, обумовлений сумою лактатоксидазної, а-гліцерофосфатоксидазної, піруватоксидазної, супероксиддисмутазної активності, що включає в себе утворення супероксидного аніона і його дисмутацію. При цьому виявлений також метаболічний шлях, який веде до продукції молочної кислоти через продукцію метилгліоксалю.

Встановлено декілька біотипів аерококів у залежності від оксидазної або редуктазної активності клонів. Виявлені оригінальні стабільні морфофункціональні мутанти аерококів, які дають гетерогенні ревертанти з різними морфологічними, біохімічними і фізіологічними ознаками.

Отримані результати відкривають перспективу досліджень, пов'язаних з розв'язанням питань щодо ролі аерококів в мікробіоценозах і їхнього впливу на біологічні процеси в місцях колонізації на слизових оболонках.

Практичне значення одержаних результатів. Селекціоновані два штами аерококів: полірезистентний до антибіотиків штам № 167 і штам № 308 - неактивний "Н₂0₂ “ мутант, призначений для отримання високоактивних клонів аерококів у процесі реверсії або при генетичній трансформації. Розроблені селективно-індикаторні середовища для аерококів, які дозволяють провести виділення аерококів з контамінованих іншими бактеріями матеріалів, диференціювати їх за біохімічною активністю, гетерогенністю.

Підібраний хіміотерапевтичний комплекс з фармакопейних препаратів "грамурин-етоній", високоантагоністично активний відносно умовно-патогенних і патогенних бактерій, неінгібуючий ріст і розмноження аерококів, що створює селективні умови для аерококів з інгібізацією росту контамінантів у бактерійному препараті. Грамурин-етоній раціонально включати до складу середовищ для вирощування і ліофілізації клітин аерококів.

Удосконалена схема означення автентичності А-бактерину для введення в ФС і ПР виробництва препарату. Отримані і досліджені "Н₂О₂ -^“ мутанти аерококів, що мають складні морфологічні зміни.

Отримані результати відкривають перспективи розв'язання питання щодо ролі аерококів в мікробіоценозах, їх впливу на біологічні процеси в місцях колонізації на слизових оболонках, перспективи створення нового біологічного препарату. Вдосконалені етапи отримання препарату з аерококів з підвищенням антагоністичної активності клітин і їх виживання в процесі ліофільної сушки. Розроблений високочутливий лактатоксидазний сенсор для визначення молочної кислоти на базі іммобілізованих клітин з культур аерококів з підвищеною лактатоксидазною активністю. Запропоновані методи виділення та ідентифікації аерококів з об'єктів зовнішнього середовища, організму людини і тварин.

Особистий внесок здобувача. Дисертантом самостійно проаналізована література з фізіологічних. біохімічних, антигенних та антагоністичних властивостей бактерій роду Аеrососсиs, дана оцінка сучасного стану розробки та використання в медицині пробіотиків, визначена перспектива пошуку штамів-антагоністів з широким спектром дії для користування більш ефективних профілактичних та лікувальних засобів. Автором самостійно проведено вивчення гетерогенності популяцій аерококів, ізольованих від людей, тварин та навколишнього середовища, а також дана оцінка їх з позицій явища гетерогенності, перш за все щодо біохімічних властивостей мікробних компонентів А-бактерину. Самостійно вивчена спонтанна мінливість аерококів та селекціоновано їх МФ-мутанти для удосконалення технології виробництва і підвищення клінічної ефективності А-бактерину. Разом з вченими кафедри мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської медичної академії МОЗ України розроблені та впроваджені в медичну практику селективно-індикаторні живильні середовища СІС-1. СІС-2 та СІС-3 для вилучення аерококів з контамінованих іншими бактеріями обєктів та оцінки їх біохімічних властивостей. Матеріали, представлені в роботі, є особистим внеском автора у вирішення проблеми. що вивчається. Автору належить вибір теми дисертації, самостійно виконані: патентно-інформаційний пошук, огляд літератури, визначення напрямків дослідження, накопичення та обробка фактичного матеріалу.

Разом з вченими Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечникова АМН України розроблені та затверджені МОЗ України методичні рекомендації “ Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій “, Харків, 2000.

Результати дослідження рекомендовані і використовуються в програмах навчання лікарів на кафедрах вищих медичних учбових закладів та в системі післядипломної освіти (Дніпропетровська державна медична академія, Вінницький державний медичний університет ім. М.І. Пирогова, Харківська державна медична академія післядипломної освіти).

Апробація роботи. Матеріали дисертації відображені в доповідях на Міжнародній науковій конференції “Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями”, Харків, 2001; Всеукраїнських науково-практичних конференціях “Розвиток санітарної мікробіології в Україні”, Чернівці, 2002 і “Україна наукова”, Київ, 2002; 10-й ювілейній Міжнародній конференції “Нові інформаційні технології в медицині і екології”, Гурзуф, 2002, а також на засіданнях Дніпропетровського філіалу Українського наукового товариства мікробіологів, 1998, 1999, 2000.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 8 - наукових робіт, з них 3 - в центральних фахових журналах, 2 методичні рекомендації, затверджені МОЗ України (у співавторстві).

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота викладена на 147 сторінках, містить вступ, огляд літератури, розділ матеріалів і методів досліджень, три розділи власних досліджень з 23 таблицями і 15 рисунками, розділ аналізу і узагальнення здобутих результатів, висновки, список використаних джерел літератури з 213 найменувань, який займає 21 сторінку.

Основний зміст роботи

У вступі проаналізовано стан проблеми таксономії аерококів і створення пробіотиків на їх основі, викладено суть мети та наукових завдань, які розв'язувались при виконанні дисертаційної роботи, обгрунтовано актуальність теми дисертації, визначено зв'язок роботи з державними науковими програмами і темами, розкрито наукову новизну і практичне значення здобутих результатів, апробацію результатів дисертації, вказано її обсяг і структуру.

У першому розділі подано огляд літератури, в якому наведені та проаналізовані основні дані щодо філогенетичного положення аерококів у систематиці прокаріот, підступи щодо їх ідентифікації за фено- та генотиповими ознаками, нуклеотидними послідовностями 16Sр РНК і гомологєю ДНК-ДНК. Стисло викладено і проаналізовано досягнення сучасної світової науки в розробці пробіотиків. На основі даних літератури доведено актуальність і перспективу конструювання високоефективних пробіотичних препаратів для попередження і лікування нагнійно-запальних захворювань.

Матеріали, методи і обсяг досліджень наведено у другому розділі. У роботі використані мікробіологічні, біохімічні, генетичні і статистичні методи дослідження.

З таксономічною метою було досліджено 105 культур аерококів, виділених з організму людини, 16 культур, виділених з об'єктів зовнішнього середовища, 15 культур, виділених від тварин, 2 виробничих штами для приготування бактерійного препарату і 3 музейні культури аерококів.

Морфологія бактерій досліджувалася за допомогою фазово-контрастної і електронної мікроскопії. Дезінтеграція клітин аерококів досягалася обробкою лізоцимом з ЕДТА (1,2 мг/мл і 0,001 М -відповідно) або ультразвуком на установці УРСК-7Н.

Виділення і часткове очищення ферментного комплексу аерококів проводили за допомогою висолювання сульфатом амонію білків з лізатів клітин, розчиненням осаду в 0,01 М фосфатному буфері (рН 7,4) і діалізом розчину через целофанову мембрану проти 0,01 М фосфатного буфера (рН 7,4), як описано Р. Скоупсом (1985). НАД-незалежна лактатдегідрогеназна активність аерококів визначалася згідно з Н.W.Dое11е (1971). Глутатіонредуктазна активність визначалася за методом, описаним Ю.І.Губським з співавт. (1983). Супероксиддисмутазна активність аерококів визначалася згідно з Е.В.Макаренком (1988). Електрофоретичні фракції ферментного комплексу з супероксиддисмутазною активністю локалізувалися за методом С.О.Deauchamp et al. (1971).

Молочна кислота визначалася ензиматичним методом (F.NоІІ, 1974), піровиноградна кислота - ензиматичним та хімічним методами за Умбрайтом (В.Г.Колбом з співавт., 1982). Протеоглікани визначалися за методом Т.Bitter еї а1. (1962), гліоксалаза - як описано Е.Racker (1957). Метилгліоксаль визначався ензиматичним методом (В.С.Асатіані, 1969) і хімічним (В.С.Алексеєв, 1978). Паперова хроматографія метилгліоксаля проводилася, як описано К.Мацеком (1962). Малоновий диальдегід визначався за утворенням дієнового кон'югата з тіобарбітуровою кислотою (Е.А.Строєв з співавт., 1986). Перекис водню враховували ензиматичним методом (Державна фармакопея України, 2001). Білок визначався біуретовим методом (А.G. Gornall еt а1., 1949) і в реакції скріплення білка з барвником - кумассі синім (Р.Скоупс, 1985). Активнісгь розщеплення вуглеводів клітинами аерококів визначалась кондуктометричним методом на апараті ІФАМ - 1. Поглинання кисню при окисленні молочної кислоти клітинами аерококів і їх ферментними комплексами визначали полярографічно і за допомогою електрода Кларка (К.К.АІехаndег еt а1., 1985). Контроль відсутності мутагенної дії аерококів і їх продуктів проводили згідно з В.Ames et а1. (1973).

Іммобілізацію клітин аерококів за допомогою глутарового альдегіду проводили, як описано Ж.Ж.Гальбо з співавт. (1988). Результати досліджень оброблені статистичними методами (П.П.Ашмарін, 1962; П.Ф.Рокицький, 1967).

Результати власних досліджень наведено у третьому - п'ятому розділах.

Попередній таксономічний аналіз дозволив виділити коло мікроорганізмів, схожих з аерокока-ми за основними критеріями групи коків (вміст Г + Ц пар в ДНК, морфологія, культуральні особливості, фізіологічні властивості, біохімічна активність) і близьких до представників роду Аегососсus, описаних R.Е.Williams еt а1. (1953).

Було проведене експериментальне порівняння властивостей виділених культур коків і виробничих штамів з музейними культурами аерококів.

Визначено, що морфологічно схожі вказані мікроорганізми являють собою грампозитивні коки неправильної форми, розташовані по два, чотири, нерідко скупченнями. Доведено широку мінливість морфології аерококів - від зерноутворення до формування гігантських клітин.

Вивчені культури коків ростуть убого на стандартних поживних середовищах: м'ясопептоному агарі та м'ясопептоному бульйоні. Додавання до цих середовищ 10%-вої кінської сироватки майже повністю пригноблює ріст культур, у той час як наявність у середовищі 1 - 3 % людської крові або крові тварин стимулює ріст бактерій. Ріст культур на кров'яному агарі супроводжується багатофазовою зміною кольору навколо колоній. На початку росту навколо колоній виникає виражене позеленіння, що і призвело раніше до їх видового найменування. Після 2-3 діб експозиції при кімнатній температурі позеленіння навколо колоній поступово змінюється на іржаво-червоний стійкий колір, що пов'язано з утворенням окису заліза.

Всі виділені культури і аерококи мали однакові поживні потреби при рості в середовищі певного біохімічного складу з включенням біотину, нікотинової кислоти, пантотенової кислоти, пуринів (гуанін, аденін, ксантин, гіпоксантин), які в деяких випадках можуть бути замінені на рибозо-5-фосфат. Потреба в амінокислотах може мінятися у різних культур коків, але для більшості з них для росту необхідно гліцин, глутамінова кислота, валін, цистеїн і лейцин.

У аерококів відсутні гемутримуючі структури: цитохроми, каталаза і пероксидаза. Культури володіють супероксиддісмутазною і лактатоксидазною активністю, продукують су-пероксидні радикали і перекис водню, добре утилізують більшість вуглеводів, розщеплюючи їх до кислоти без газоутворення, не виділяють аміак при розщепленні аргініну, але відновлюють метиленовий синій при культивуванні в молоці.

Використання спеціально розробленого селективно-індикаторного середовища для оцінки біохімічної активності культур аерококів дозволило диференціювати їх по здатності окислювати йодистий калій у результаті продукування перекису водню /оксидазна активність/ і відновлювати селен з його солі /редуктазная активність/ на три групи: а)культури з вираженою оксидазною активністю, колонії яких при рості на селективно-індикаторному середовищі забарвлюються в інтенсивно-чорний колір і мають чорне забарвлення середовища навколо; б) культури з переважно вираженою редуктазною активністю, колонії яких забарвлені в червоний колір без зони забарвлення навколишнього середовища; в) культури з оксидазно-редуктазною активністю, колонії яких мають червоне забарвлення з чорною зоною забарвлення середовища навколо колоній.

У табл. 1 наведена характеристика культур аерококів по тестах біохімічної активності при рості на селективно-індикаторному середовищі. Аерококи мають ідентичну стійкість до фізико-хімічних чинників: не ростуть при 45 °С, рН 5,0, чутливі до більшості антибіотиків, що широко застосовуються в клініці, стійкі до прогрівання при 60 ° С протягом ЗО хв., ростуть при вмісті в поживному середовищі К₂ТеОз близько 100 -мкг/мл, стійкі до дії антисептиків (водень пероксид, фурацилін).

Нуклеотидний склад вивчених штамів мікококів і аерококів дорівнював 38,1-41,8 мол.%Г+Ц в ДНК. Грунтуючись на таксономічному аналізі відомих властивостей аерококів і аналізі експериментального матеріалу, група безпігментних мікококів, продуцентів водень пероксиду, представників нормальної мікрофлори організму людини і тварин, класифікована нами до роду Аегососсus.

Таблиця 1

Характеристика груп аерококів по тестах активності при рості на селективно-індикаторному середовищі

Створення з аерококів лікувально-профілактичного препарату, призначеного для лікування гнійно-запальних інфекцій шкіри і слизових оболонок людини, ініціювало розв'язання питання щодо механізмів антагоністичної активності аерококів.

Давно відомо, що аерококн продукують перекис водню (М.Л.Горбунова, 1970) і гліколіпопротеїд "виридоцин", антагоністична дія якого нейтралізувалася каталазою, додецилсульфатом натрію і прогріванням при 60° С протягом 30 хв. (J.M.Ballester et. al., 1977, 1980).

У роботі І.І.Самойленко з співавт. (1983) була показана підвищена чутливість мутантів бактерій з порушеною репарацією ДНК до дії перекису водню. Використання диких типів Есherichia соlі АВ 1157, Васіllus subtilis GSY 228 і рекомбінація дефектних мутантів Есhеrісhіа соli АВ 2463 гес А13, Васіllus subtilis 1618 гес F виявило підвищену чутливість мутантів в порівнянні з їх дикими типами до дії екзометаболітів аерококів.

Чітко збалансовані селективно-індикаторні середовища і синтетичні середовища певного біохімічного складу багато в чому визначають успіхи у вивченні фізіологічних, біохімічних та генетичних властивостей бактерій. Для Аегососсus viridans раніше запропоноване селективне середовище (R..Е. Williams еt а1., 1950) і була зроблена спроба розробки середовища певного біохімічного складу (Т.L.Міlleг еt а1., 1970), яка не увінчалася успіхом. Для виділення аерококів з контамінованих матеріалів використовувалося поживне середовище (м'ясо-пептоний агар), що містить 0,01% перекису водню (М.Л.Горбунова, 1970).

Нами поставлена і вирішена задача розробки штучного живильного середовища для аерококів, яке володіло б індикаторними властивостями на продукцію клітинами водню пероксиду.

Оптимальним живильно-індикаторним середовищем виявилась композиція за таким складом інгредієнтів (в гр/л дистильованої води):

Нижній селективно-індикаторний шар

Розчинний крохмаль 10,0

Сольовий концентрат

Амонію хлорид 20,0

Амонію нітрат 4,0

Натрію сульфат 8,0

Калію водень фосфат 12,0

Калію діводень фосфат 4,0

Магнію сульфат 0,4

Грамурін 0,15

Етоній 0,015

Верхній ростовий шар

Сольовий концентрат 200,0

Нікотинова кислота 0,05

Біотин 0,001

Кальцію пантотенат 1,0

Пурин (або рибозо-5-фосфат) 0,01

Глутамінова кислота 0,5

Гліцин 1,0

Цистеїн 0,05

Лейцин 0,05

Валін 0,05

Марганцю гліцерофосфат 0,4

Інозит 1,0

Глюкоза 10,0

Агар-агар 12,0

Компоненти середовища стерилізуються при 1 ат протягом ЗО хв. При приготуванні середовища спочатку формується нижній індикаторний шар, а після його застигання в чашці Петрі зверху нашаровується верхній ростовий шар. Після затвердіння середовище готове до висіву культури мікробів. Середовище отримало умовне найменування СІС-2.

При роботі з мікроорганізмами з невідомими поживними потребами можлива заміна вказаного вище верхнього шару на м'ясо-пептонний агар або будь-яке інше повноцінне середовище (СІС-1). Для направленого визначення лактатоксидазної активності клітин аерококів до складу СІС-2 у ростовий шар додається на 1 л середовища, молочна кислота в концентрації 0,05 г на 1 л середовища і глутатіон відновлений - 0,1 г, що відіграє роль протектора клітин аерококів (СІС-3). Диференціація культур аерококів на "оксидазні", "редуктазні" і проміжні варіанти можлива при їх посіві на середовища СІС-1 і СІС-2.

При розсіюванні клітин аерококів газоном на СІС-2 і внесенні у вміщений в центр чашки Петрі металевий циліндр 0,045 М розчину молочної кислоти або її солі навколо циліндра утворюється зона окислення лактату чорного забарвлення (d = 35-40 мм).

Дослідження лактатоксидазної активності ферментних комплексів, що виділяються з лізатів аерококів, показало їх НАД - незалежність і залежність окислення лактату від концентрації білка в ферментному комплексі. Було виявлено, що піруват, який нагромаджується в реакції окислення лактату, здатний реагувати з екзогенним воднем пероксидом. У той же час, екзогенний піруват, що вводиться до складу поживного середовища в концентрації 5 мМ, практично повністю нейтралізує антагоністичну дію 6мМ водню пероксиду відносно чутливих тест-бактерій, а також знімає антагоністичну дію аерококів, обумовлену продукцією водню пероксиду. Результати експериментів вказують на антиоксидантну роль піровиноградної кислоти у аерококів та мікроорганізмів, позбавлених гемвмісних систем (каталаза, пероксидаза, цитохром).

У табл. 2 підсумовані результати експериментів по визначенню активності ферментів і накопиченню біологічно активних метаболітів у ланцюзі утворення і окислення молочної кислоти у аерококів. Наведені дані щодо 2-х "оксидазних" варіантів - № 201 і № 167, "редуктазного" штама - № 82006, стосовно якого проводився розрахунок достовірності відмінностей показників, і "Н₂0₂^-“ мутанта № 308. Видно, що активність лактатоксидази і супероксид-дисмутази ферментних комплексів "оксидазних" штамів достовірно вище за ті ж види "редуктазного" штаму. У "Н₂0₂^-“ мутанта відсутні лактатоксидазна активність, продукція супероксидного радикалу і водню пероксиду.

На процес окислення молочної кислоти ферментним комплексом, поглинання кисню і антагоністичну активність аерококів впливають амінокислоти, введені в реакційну систему або до складу поживного середовища, на якому вирощуються аерококи для випробування антагоністичної активності. Тирозин, гліцин, лізин, треонін, ізолейцин, валін, пролін, глута-тіон окислений та цистин достовірно посилюють лактатоксидазну активність ферментного комплексу. Лізин, треонін, глутамінова кислота, метіонін, аланін гістидин, пролін, глутатіон окислений і відновлений, цистеїн і цистин посилюють поглинання кисню при окисленні ферментним комплексом молочної кислоти. Введення до складу поживного середовища треоніну, глутамінової або аспарагінової кислоти, валіну, глутатіону відновленого і цистеїну посилює антагоністичну активність аерококів "іn vitro".

Дослідження показали, що антагоністична активність препарату з аерококів зумовлена продукцією водню пероксиду і АЕК. Штам Aerococcus viridans 167, використаний для приготування препарату, є диким типом аерококів, виділеним з грудного молока, чутливим до більшості антибіотиків. Технологічний регламент приготування препарату з аерококів був запозичений з регламенту виробництва колібактерину і не враховував особливостей метаболізму аерококів. Заплановане широке застосування нового оригінального препарату з аерококів для лікування гнійних ран та кишкових порушень ставить завдання отримання антибіотикорезистентного варіанту аерококів, що обумовило б можливість його подальшого застосування в комплексі або разом з антибіотиками.

У результаті послідовного пасирування початкового штаму аерококу № 167 на поживних середовищах, що містять зростаючі концентрації антибіотиків, отриманий полірезистентний штам № 167 VR з підвищеною антагоністичною активністю щодо пеніцилінорезистентних і пеніциліночутливих стафілококів.

Аналіз достатньої кількості колоній з природного розсіювання аерококів і з розсіванням суспензій, оброблених N- нітрозо N-N-метилсечовиною і етиленіміном, дозволив виявити групу “Н₂О₂ - “ мутантів, які характеризувались втратою лактатоксидазної і антагоністичної активності, а також зміною морфології клітин.

При електронно-мікроскопічному дослідженні клітин “Н₂О₂ - “ мутанта № 308 виявлено, що на відміну від клітин початкового штама № 167, у клітин мутанта виявляється фібрилярна мікрокапсула і електронно-щільні глибки різних розмірів у цитоплазмі, а також більш великі електронно-щільні відсвіти в зоні нуклеотиду. Реверсія “Н₂О₂ - “ мутантів до "дикого" типу вела до відновлення морфології початкових клітин, лактатоксидазної і антаго0ністичної активності "in vitro" з появи ревертантів двох типів. "Оксидазні" варіанти характеризувалися гіперсинтезом водню пероксиду і посиленням антагоністичної активності. "Редуктазні" ревертанти відрізнялися слабкою продукцією водню пероксиду і підвищенням концентрації антагоністичної фракції в АЕК.

У табл.3 представлені основні властивості початкових штамів аерококів і ревертантів двох типів, отриманих з "Н₂0₂ -“ мутанта № 308. Посилення корисних властивостей ревертантів дозволяє використати прояви прямої мутації і реверсії для направленої селекції високобіологічноактивних культур аерококів.

Лікувальний ефект різних штамів аерококів, відібраних у процесі селекції, був доведений на моделі місцевої синьогнійної інфекції у мишей. Застосування аерококів вело до швидкого зняття симптомів локального запалення. Профілактичний ефект тих же штамів був показаний і на моделі сальмонельозної інфекції у білих мишей.

Тест Еймса з використанням повної мікросомальної активуючої системи не виявив мутагенної дії ні клітин аерококів, ні їхніх метаболітів.Встановлення механізмів антагоністичної активності, селекція високоактивних штамів, підбір чинників, що впливають на антагоністичну активність, дозволили запропонувати ряд удосконалень технологічного процесу приготування пробіотичного препарату з аерококів. Для стимуляції синтезу антагоністичної фракції АЕК запропоновано введення в середовище вирощування 1%-вої глюкози, а для посилення синтезу водню пероксиду запропоновано введення в середовище вирощування аерококів 0,01% -вого треоніну.

Як антиконтамінуючу добавку запропоновано введення в середовище висушування препарату антибактерійного комплексу грамурину з етонієм, а для захисту клітин від токсичних метаболітів - лізат Deinococcus radiodurans, що містить супероксиддисмутазу.

Таблиця 3

Біологічна активність “дикого” типу аерококів № 167, селекціонованого 167VR, "Н₂0₂-“ мутанта № 308 і ревертантів “оксидазного” і “редуктазного” типів

Висока специфічність лактатоксидазної активності аерококів, особливо "оксидазних" культур, дозволила розробити лактатчутливий сенсор на базі імобілізованих клітин аерококів для визначення молочної кислоти з пороговою чутливістю 0,1 - 1,0 мМ лактату в зразку.

У розділі аналізу і узагальнення результатів досліджень у стислій формі наведено підсумки проведених експериментів, результати реалізації поставленої мети і задач дисертаційної роботи.

В дисертаційній роботі на підставі теоретичного аналізу та експериментального дослідження обгрунтовано нові оригінальні підступи щодо ідентифікації аерококів та селекції штамів з вираженими антагоністичними властивостями і на їх основі конструювання ефективних пробіотичних препаратів.

Висновки

Охарактеризована гетерогенність мікроорганізмів роду Аеrососсиs, вилучених з різних джерел, з врахуванням спонтанної і індукованої мінливості, селекціоновані клони аєрококів із завданими біологічними властивостями.

Встановлено, що повна втрата лактатоксидазної активності у "Н₂0₂ -“ мутантів аерококів пов'язана з втратою антагоністичної активності "in vitro" і морфологічними змінами клітин в результаті порушення розподілу клітин, що цілком ймовірно пов'язано з накопиченням метилгліоксалю. Відновлення лактатоксидазної активності у ревертантів аерококу супроводиться відновленням початкової морфології клітин і посиленням синтезу водню пероксиду і антагоністично активної пептидної фракції у частини клонів ревертантів.

3. Селекціоновано штами аерококів: полірезистентий до антибіотиків варіант Aerococcus viridans 167 VR, що використовується для приготування бактерійного препарату, і "Н₂0₂ -“ мутант аерококу № 308, призначений для біохімічних і генетичних досліджень, а також для отримання високоактивних клонів аерококів.

4. Розроблені селективно-індикаторні середовища для виділення аерококів з контамінованих іншими бактеріями матеріалів і для оцінки їх біохімічних властивостей: СІС-1 - середовище невизначеного біохімічного складу; СІС-2 - середовище певного біохімічного складу, що не містить субстрат окислення; СІС-3 - середовище певного біохімічного складу, що містить специфічний субстрат окислення і протектор клітин. Показана внутрішньовидова диференціація культур аерококів при рості на СІС-1 і СїС-2 по ступеню вираженості біохімічних властивостей.

5. Вдосконалені етапи отримання пробіотичного препарату, в результаті чого в два рази посилена антагоністична активність безклітинного компонента "А-бактерину" за рахунок стимуляції продукції водню пероксиду DL-треоніном, у 16 разів посилений синтез антагоністично активного пептиду додаванням глюкози до середовища вирощування, на 8,8 - 11,5% підвищене виживання клітин аерококів при введенні в середовище висушування лізату Deinococcus radiodurans.

6. Розроблений лактатоксидазний сенсор на базі імобілізованих клітин аерококів, чутливий до D- і L- ізомерів молочної кислоти з пороговою чутливістю 0,1 - 1,0 мМ лактату у зразках, що досліджуються.

Список робіт, опублікованих по темі дисертації

1. Кременчуцький Г.М., Горбунова М.Л., Юргель Л.Г., Чуйко В.І., Черняєв С.А. Біологічні властивості аерококів-антагоністів -представників мікробіоценозів людини.// Мікробіол.журн. 1994. Т 56, N4, С. 36-42

2. Риженко С.А., Черняєв С.А., Кременчуцький С.Г. Зміна біологічних властивостей усередені популяції Aerococcus viridans // Медичні перспективи. 2002. Т.2. №2. С. 18-21.

3. Кременчуцький Г.М., Юргель Л.Г., Черняєв С.А., Кутовий А.Б. Інгібітори протео-літичних ферментів аерококового походження // Мікробіол.ж. 1994. Т.56, №2. С. 75.

4. Риженко С.А., Кременчуцький С.Г., Черняєв С.А., Кулішенко С.Г. Біологічні властивості А-бактерину // Вісник СумДУ. 2001. №11(32). С. 159-1б9.

5. Кременчуцький Г.М., Черняєв С.А., Риженко С.А., т.ін. Розробка селективно-індикаторних середовищ визначеного біохімічного складу для дослідження фізіологічних властивостей Аегососсиs viridans // Тези доп. "Розвиток санітарної мікробіології в Україні" Чернівці, 2002. С. 61-66.

6. Черняєв С.А., Кременчуцкий С.Г., Кошевая И.П., Мединская О.Н. Ферменты аэрококков, обеспечивающие биологическую активность аэрококков // Международная научно-практическая конференция “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ”.Алушта, 2002. С. 102 - 103.

7. Кременчуцкий Г.Н., Черняев С.А., Юргель Л.Г., Кулишенко С.Г. Биологически активные вещества аэрококков. Международная научно-практической конференция “Новые технологии получения и применения биологически активных веществ”.-Алушта, 2002. С.

8. Роль аэрококков в биохимических поцессах макроорганизма /Кременчуцкий Г.Н., Юргель Л.Г., Черняев С.А. и др. // Актуальные вопросы микробиологии, эпидемиологии и иммунологии инфекционных болезней: Тез. докл. науч.-практ. конф.Харьков, 1993. Вип. 4. Часть 1. С. 198. Методичні рекомендації, затверджені МОЗ України:

9. Лабораторна діагностика та діагностичні критерії змішаних гострих кишкових інфекцій “. Харків, 2000. 52 c. (у співавторстві).

10. Мікробіологічна діагностика рахнельозів (захворювань, спричинених Rachnella aquatilis). Харків, 1997. 22 с.

Анотація

Черняєв С.А. Гетерогенність популяції представників роду Аегососсиs і її роль у клініці і розробці нових пробіотиків. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07-Мікробіологія.-Інститут мікробіології та імунології ім. І.І.Мечникова АМН України.- Харків, 2002.

Дисертація присвячена дослідженню морфологічної, фізіологічної і біохімічної гетеротрофності аерококів, які представляють основу А-бактерину: розробці нових пробіотиків і методів контролю їх автентичності. Показані відмінності культур аерококів, що мають різне походження, за біохімічними властивостями.

Встановлена наявність у популяції аерококів "Н₂0₂ -“ мутантів аерококів, не описаних раніше, що мають складні морфологічні зміни, пов'язані з підвищеною продукцією метилгліоксалю. Визначений механізм продукції аерококами водню пероксиду, який полягає в поєднанні лактатоксидазної, -гліцерофосфатоксидазної і супероксиддисмутазноі активності, що обумовлює утворення супероксидного аніону і його дисмутацію; виявлено метаболічний шлях продукції молочної кислоти аерококами через утворення метилгліоксалю. Визначено декілька біотипів аерококів у залежності від оксидазної або редуктазної активності клонів.

Вперше виявлені стабільні морфофункціональні мутанти аерококів, які дають гетерогенні ревертанти з різними морфологічними, біохімічними і фізіологічними ознаками.

Отримані результати відкривають перспективу досліджень, пов'язаних з розв'язанням питань щодо ролі аерококів у мікробіоценозах і їх вплив на біологічні процеси в місцях колонізації на слизових оболонках.

Селекціоновані два штами аерококів: № 167 (полірезистентний до антибіотиків варіант) і № 308 - неактивний "Н₂0₂ -“ - мутант, призначений для отримання високоактивних клонів аерококів у процесі реверсії або при генетичній трансформації. Розроблені селективно-індикаторні середовища для аерококів, що дозволяють виділити аерококи з контамінованих іншими бактеріями матеріалів, диференціювати їх за біохімічною активністю, дослідити їх біохімічну гетерогенність.

Підібрано хіміотерапевтичний комплекс з фармакопейних препаратів "грамурин-етоній", високоантагоністично активний відносно умовно-патогенних і патогенних бактерій, неінгібуючий ріст і розмноження аерококів, що створює селективні умови для аерококів.

Розроблений високочутливий лактатоксидазний сенсор для визначення молочної кислоти на базі культур аерококів з підвищеною лактатоксидазною активністю.

Удосконалена раціональна схема встановлення автентичності А-бактерину для введення в ФС і ПР виробництва препарату.

Ключові слова: мікроорганізми, аерококи, гетерогенність, А-бактерин, грамурин-етоній.

Аннотация

Черняев С.А. Гетерогенность популяции представителей рода Аегососсиs и ее роль в клинике и разработке новых пробиотиков. Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 03.00.07 Микробиология. - Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова АМН Украины. - Харьков, 2002.

Диссертация посвящена исследованию морфологической, физиологической и биохимической гетерогенности аэрококков, что служат основой А-бактерина; разработке новых пробиотиков и методов контроля их аутентичности. Показаны отличия культур аэрококков различного происхождения по биохимическим и физиологическим свойствам.

Установлено наличие в популяции аэрококков "Н₂0₂ -“ мутантов, не описанных ранее, с существенными морфологическими изменениями и повышенной продукцией метилглиоксаля.

У аэрококков установлен механизм продукции водород пероксида, который состоит в суммировании лактатоксидазной, -глицерофосфатоксидазной, пируватоксидазной и супероксиддис-мутазной активности, включает в себя образование супероксидного аниона и его дисмутацию. Выявлен также метаболический путь, ведущий к продукции молочной кислоты через образование метилглиоксаля.

Определено несколько биотипов аэрококков в зависимости от оксидазной или редуктазной активности клонов. Впервые выявлены стабильные морфофункциональные мутанты аэрококков, которые дают гетерогенные ревертанты с разными морфологическими, биохимическими и физиологическими признаками.

Полученные результаты открывают перспективу исследований, связанных с решением вопросов о роли аэрококков в микробиоценозах и их влияния на биологические процессы в местах колонизации на слизистых оболочках.

Селекционированы два варианта штамма аэрококков: № 167 -(полирезистентный к антибиотикам вариант) и № 308 - неактивный "Н₂0₂ -“ мутант, предназначенный для получения высокоактивных клонов аэрококков в процессе реверсии или генетической трансформации. Разработаны селективно-индикаторные среды для аэрококков, что позволяет провести выделение аэрококков из контаминированных другими бактериями материалов, дифференцировать их по биохимической активности, исследовать их биохимическую гетерогенность.

Подобранный химиотерапевтический комплекс из фармакопейных препаратов "грамурин-этоний" высокоантагонистически активен относительно условно-патогенных и патогенных бактерий, не ингибирует рост и размножение аэрококков, создает селективные условия для аэрококков и подавления роста контаминантов при изготовлении А-бактерина. Разработана рациональная схема определения аутентичности А-бактерина для введения в ФС и ПР производства препарата.

Разработан высокочувствительный лактатоксидазный сенсор для определения молочной кислоты на базе культур аэрококков с повышенной лактатоксидазной активностью.

Ключевые слова: микроорганизмы, аэрококки, гетерогенность, А-бактерин, грамурин-этоний.

Annotation

Chernyaev S.A. Geterogeneses of populations of representatives of Aerococcus and its role in clinic and creation new probiotics -Manuscript.

The dissertation on obtaining of scientific degree of the candidate of medical sciences on a speciality 03.00.07 -microbiology.- Institute of microbiology and immunology named by LLMechnikov, Kharkov, 2002.

The thesis is dedicated to research of a morphological, physiological and biochemic heterogenicity of aerococcuses, that form the basis A -bacterinum, for carry out new probiotics and possibility to control of their authenticity. The differences of cultures aerococcuses on biochemical and physiological properties that have a miscellaneous origin availability in a population of aerococcuses, "H₂0₂" mutants of aerococcuses which were not described earlier, that have the composite morphological changes explained by heightened production of methylglyoxal.

The mechanism of production hydrogen peroxide for aerococcuses is established, which one consists in the sum lactatoxidase, glyceropho-shateoxidase, pyruvateoxidase and superoxidedismutase activities, which one includes formation of superoxide anion, its dismutation, and also the metabolic pathway leading to production lactic acids through formation of methylglyoxal is detected.

Some biotypes of aerococcuses are detected depending on oxidase or re-ductase of activity of clones. For the first time are detected stable morphofunctional mutants of aerococcuses, which one give heterogenous re-vertants with miscellaneous morphological, biochemical and physiological characters.

The obtained outcomes open an outlook of researches, bound with the solution of problems on a role aerococcuses in microbiocenoses and their influencing on biological processes in places of colonization on mu-cosas.

Two variants of the strain of aerococcuses are selected: 167 - polyresis-tant to antibiotics, and strain 308 - inactive "H₂0₂" mutant intended for obtaining of highly active clones of aerococcuses during a reversion or genetical transformation. The selective - indicative mediums for aerococcuses are designed, that resolve to conduct allocation aerococcuses from contamination of other bacterias of A-bacterinum, to differentiate them on biochemical activity, to investigate their biochemical heterogeneity.

Chemiotherapeutic a complex from pharmaceutical drugs "Gramurinum -ethonium" is high anthagonistic centre pathogenic bacteriums not inhibiting growth of aerococcuses, that creates selective conditions for aerococcuses and depressing the growth contaminants of A - bacterinum. More full scheme ofinstaUation of an authenticity A - bacterinum for the introducing in PhA and Ж is designed.

Is designed highly sensitive lactateoxidase sensor for definition of lactic acid on the basis of cultures of aerocones with heightened lactateoxidase activity.

Key words: microorganism, aerococcus, geterogeneses, A-bacterin, gramurinum-ethonium.

Размещено на Allbest.ru