Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут молекулярної біології і генетики

УДК 577.21:582.282.23:577.164.1

РОЗРОБКА СИСТЕМ ГЕНЕТИЧНОЇ ТРАНСФОРМАЦІЇ ДЛЯ ФЛАВІНОГЕННИХ ДРІЖДЖІВ PICHIA GUILLIERMONDII ТА CANDIDA FAMATA

03.00.26 - молекулярна генетика

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

ВОРОНОВСЬКИЙ АНДРІЙ ЯРОСЛАВОВИЧ

Київ - 2001



Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділах регуляції клітинного синтезу низькомолекулярних сполук та біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України (з 1.10.2000р. - Інститут біології клітини НАН України, м. Львів).

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Сибірний Андрій Андрійович, Інститут біології клітини НАН України, завідувач відділу молекулярної генетики і біотехнології.

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України Мацелюх Богдан Павлович, Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України (м. Київ), завідувач відділу генетики мікроорганізмів;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Черепенко Олена Йосипівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ), провідний науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

Провідна установа: Львівський національний університет ім. І. Франка, кафедра мікробіології.

Захист відбудеться "12" червня 2001 року о 10⁰⁰ на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ, вул. акад. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеках Інституту молекулярної біології і генетики НАНУ та Iнституту бiології клітини НАНУ.

Автореферат розіслано "10" _травня 2001 р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради,

кандидат біологічних наук Підпала О. В.



АНОТАЦІЯ

Вороновський А.Я. Розробка систем генетичної трансформації для флавіногенних дріжджів Pichia guilliermondii та Candida famata. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.26 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2001.

У дисертації подано результати роботи зі створення трансформаційних систем вектор-господар для флавіногенних дріжджів P. guilliermondii та C. famata. біосинтез дріжджі флавіногенний ген

Декілька штамів P. guilliermondii і C. famata з блокованою ГТФ-циклогідролазою (rib1) або РФ-синтазою (rib7), а також мутантів C. famata з пошкодженою -ізопропілмалатдегідрогеназою (leu2) відібрано як реципієнтні для трансформаційних систем вектор-господар. Гени RIB1 i RIB7 P. guilliermondii та LEU2 S. cerevisiae відібрано як селективні маркери для цих систем.

Виявлено і локалізовано ARS-елемент дріжджів P. guilliermondii. Клоновано п'ять фрагментів ДНК C. famata, що несуть ARS-послідовності. Сконструйовано реплікативні плазміди, які є човниковими для E. coli і флавіногенних дріжджів. На основі розроблених трансформаційних систем клоновано ген біосинтезу РФ дріжджів C. famata, що кодує РФ-синтазу.

Ключові слова: флавіногенні дріжджі, реципієнтний штам, генетичний маркер, ARS-послідовність, реплікативна плазміда, трансформація, електропорація, клонування гена.



АННОТАЦИЯ

Вороновский А.Я. Разработка систем генетической трансформации для флавиногенных дрожжей Pichia guilliermondii и Candida famata. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2001.

В диссертации представлены результаты работы по созданию трансформационных систем вектор-хозяин для флавиногенных дрожжей P. guilliermondii и C. famata.

Несколько штаммов дрожжей P. guilliermondii и C. famata с блокированной ГТФ-циклогидролазой (rib1) или РФ-синтазой (rib7), а также мутантов C. famata с повреждённой -изопропилмалатдегидрогеназой (leu2) отобраны в качестве реципиентных для трансформационных систем вектор-хозяин. Гены RIB1 и RIB7 P. guilliermondii, а также LEU2 S. cerevisiae отобраны в качестве селективных маркеров для этих систем.

Выявлен и локализирован ARS-елемент дрожжей P. guilliermondii. Клонировано пять фрагментов ДНК C. famata несущих ARS-последовательности. Сконструированы репликативные плазмиды являющиеся челночными для E. coli и флавиногенных дрожжей. На базе разработанных трансформационных систем клонирован ген биосинтеза РФ дрожжей C. famata кодирующий РФ-синтазу.

Ключевые слова: флавиногенные дрожжи, реципиентный штамм, генетический маркер, ARS-последовательность, репликативная плазмида, трансформация, электропорация, клонирование гена.



SUMMARY

Voronovsky A.Y. Development of transformation systems for flavinogenic yeasts Pichia guilliermondii and Candida famata. - Manuscript.

Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences, speciality 03.00.26 - molecular genetics. - Institute of molecular biology and genetics, National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2001.

The thesis contains results of the work on development of host-vector transformation systems for flavinogenic yeasts P. guilliermondii and C. famata.

A number of P. guilliermondii and C. famata auxotrophic mutants were tested for complementation by corresponding selectable marker genes. The P. guilliermondii strains RG21 (hisx rib1), RG130 (hisx rib7), RG162 (hisx rib7), and C. famata R7 (rib1), R8 (rib7), L203 (leu2), L2012 (leu2), L20105 (leu2), 8-33 (leu2 rib7) deficient in GTP cyclohydrolase (rib1) or riboflavin synthase (rib7), or -isopropylmalate dehydrogenase (leu2) were selected as recipients for the host-vector transformation systems. The P. guilliermondii RIB1 and RIB7 genes and the Saccharomyces cerevisiae LEU2 gene were selected and served as markers for these systems.

Transformation methods (spheroplasting, electroporation) for flavinogenic yeasts were optimized.

The P. guilliermondii ARS (designated PgARS) was discovered and localised in the 3' flanking region of the RIB1 gene encoding GTP cyclohydrolase. PgARS conferred high transformation frequencies (10⁴-10⁵ transformants/мg DNA) and autonomous replication to hybrid plasmids in P. guilliermondii. Based on the PgARS element a series of Escherichia coli-P. guilliermondii shuttle vectors was developed.

C. famata genomic library was constructed on non-replicative plasmid carrying S. cerevisiae LEU2 gene and five fragments (called CfARSs) providing autonomous replication of the plasmids in the cells of C. famata host strain leu2 were isolated. This enabled the construction of the series of shuttle vectors that are able to replicate both in the E. coli and C. famata cells.

C. famata genomic library based on one of these shuttle vectors was constructed. C. famata RIB7 gene encoding riboflavin synthase, the last step enzyme of riboflavin biosynthesis was cloned from this library by functional complementation of the corresponding C. famata mutant strain deficient in riboflavin biosynthesis. Heterologous transformation of the rib7 mutant of another flavinogenous yeast, P. guilliermondii, showed that the C. famata RIB7 gene functionally complements this mutation and, therefore, is expressed in P. guilliermondii.

Key words: flavinogenic yeast, recipient strain, marker gene, ARS, replicative plasmid, electroporation, transformation system, gene cloning.



ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. На сьогоднішній день досягнуто значних успіхів у вивченні шляху біосинтезу рибофлавіну та його регуляції у флавіногенних дріжджів (Sibirny, 1996). Для подальшого дослідження молекулярних механізмів регуляції флавіногенезу у цих мікроорганізмів і конструювання надпродуцентів рибофлавіну (РФ), важливе значення має застосування методів роботи з рекомбінантною ДНК. Такі методи широко розроблені для пекарських та окремих видів неконвенційних дріжджів (Guthrie and Fink, 1991; Wolf, 1996). Активне використання методів роботи з рекомбінантною ДНК можливе лише при наявності ефективних систем генетичної трансформації для того чи іншого виду. Система генетичної трансформації (або трансформаційна система вектор-господар) передбачає наявність “господаря” - реципієнтного штаму мікроорганізму і “вектора” - засобу введення та експресії певного спадкового матеріалу. Для багатьох видів дріжджів розроблено системи генетичної трансформації із застосуванням як комплементаційних , так і домінантних маркерів. Клоновано велику кількість різноманітних генів, визначено їх нуклеотидні послідовності, досліджено і порівняно структурні, промоторні та термінаторні ділянки. Створено велику кількість рекомбінантних конструкцій, в тому числі з використанням сильних дріжджових промоторів, що забезпечують ефективну експресію гетерологічних білків. Одержані на основі цього знання мають велике фундаментальне значення. Деякі з розроблених систем експресії вже застосовуються для промислового виробництва певних речовин (Guthrie and Fink, 1991; Wolf, 1996).

Водночас слід зазначити, що молекулярно-генетичні дослідження неконвенційних дріжджів знаходяться лише на початку інтенсивного розвитку. Для багатьох видів, вивчення яких має фундаментальне та прикладне значення, системи трансформації не створені взагалі. Це стосується, зокрема, флавіногенних дріжджів Pichia guilliermondii та Candida famata. Таким чином, розробка ефективних систем генетичної трансформації для цих мікроорганізмів дасть змогу інтенсивно досліджувати різноманітні аспекти метаболізму (флавіногенезу зокрема) на молекулярно-генетичному рівні.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дана робота є частиною фундаментальних досліджень відділів регуляції клітинного синтезу низькомолекулярних сполук та біохімічної генетики Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім О.В. Палладіна НАНУ за темами: ”Клонування структурних і регуляторних генів флавіногенезу та конструювання штамів-надсинтетиків рибофлавіну у еукаріотичних мікроорганізмів“ (№ держреєстрації 080401/00 2К-95), “Біохімічні та генетичні аспекти регуляції деградації і біогенезу пероксисом та біосинтезу флавінів у неконвенційних дріжджів“ (№ держреєстрації 0198V003026). Автор дисертаційної роботи є одним із виконавців вищеназваних досліджень.

Мета і завдання дослідження. Метою даної роботи була розробка систем генетичної трансформації для флавіногенних дріжджів P.guilliermondii і C.famata. Відповідно до мети, поставлені такі завдання:

1. Перевірити можливість використання рибофлавінових та деяких інших ауксотрофів P. guilliermondii і C. famata як реципієнтних штамів та генів RIB1 і RIB7 P. guilliermondii, LEU2 Sacharomyces cerevisiae як маркерних для трансформації P. guilliermondii і C. famata.

2. Порівняти та оптимізувати різні методи трансформації дріжджів P. guilliermondii і C. famata (літієвий метод, метод сферопластування, електропорацію).

3. Дослідити властивості отриманих трансформантів: мітотичну стабільність, статус плазміди в клітині.

4. Сконструювати реплікативні рекомбінантні плазміди (вектори), що забезпечують ефективну трансформацію P. guilliermondii та C. famata, котрі можуть бути задіяними при використанні методології рекомбінантної ДНК.

5. На основі розроблених трансформаційних систем клонувати структурний ген (гени) біосинтезу РФ дріжджів C. famata.

Об'єктом дослідження даної роботи є біосинтез РФ та його регуляція у флавіногенних дріжджів. Предметом дослідження цієї роботи є трансформаційні системи вектор-господар для флавіногенних дріжджів P. guilliermondii і C. famata. Розробка вищеназваних систем дає змогу вивчати біосинтез РФ та його регуляцію на молекулярно-генетичному рівні.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше розроблено системи генетичної трансформації для флавіногенних дріжджів P. guilliermondii і C. famata. Підібрано реципієнтні штами цих мікроорганізмів, а також гомологічні і гетерологічні маркерні гени для даних трансформаційних систем. Оптимізовано методи трансформації флавіногенних дріжджів (сферопластування, електропорацію).

Вперше виявлено і локалізовано ARS-елемент дріжджів P. guilliermondii. Вперше клоновано фрагменти геномної ДНК C. famata, котрі несуть ARS-послідовності. Сконструйовано реплікативні плазміди, котрі є човниковими для E. coli і флавіногенних дріжджів. На основі розроблених трансформаційних систем клоновано структурний ген біосинтезу РФ дріжджів C. famata, що кодує РФ-синтазу.

Практичне значення одержаних результатів. Одержані в результаті даної роботи системи вектор-господар можуть застосовуватися для клонування інших геномних фрагментів флавіногенних дріжджів. Елементи сконструйованих плазмід можуть використовуватися при розробці систем експресії генетичного матеріалу флавіногенних дріжджів. Розроблені системи генетичної трансформації відкривають шлях до одержання нових і покращення наявних надпродуцентів вітаміну В₂ методами генної інженерії.

Особистий внесок здобувача. У процесі виконання дисертаційної роботи автором особисто відібрано та проаналізовано наукову літературу за темою наукового дослідження. Дисертантом розроблено програму проведення досліджень, відібрано методи вирішення поставлених завдань та виконано викладені в роботі експерименти. Аналіз та обговорення результатів досліджень проведено з науковим керівником.

Апробація роботи. Матеріали дисертації доповідалися на VI-ому з'їзді Українського товариства генетиків і селекціонерів ім. М. І. Вавилова (Полтава, 1992), VI-ому Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1992), I-ому установчому (VIII) з'їзді Українського мікробіологічного товариства (Одеса, 1993), Всеукраїнській конференції з фізіології і біохімії тварин (Львів, 1994), 8-ому Європейському конгресі з біотехнології (Будапешт, Угорщина, 1997), VII-ому Українському біохімічному з'їзді (Київ, 1997).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 4 статті та тези 6 доповідей.

Структура та обсяг роботи. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, експериментальної частини (матеріалів і методів досліджень, результатів та їх обговорення), підсумків, висновків і списку літератури, що охоплює 131 найменування. Роботу викладено на 138 сторінках машинописного тексту і проілюстровано 28 рисунками та 9 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали та методи. У роботі використовували такі штами дріжджів: P. guilliermondii - RG21 (hisx rib1, гістидинозалежний, з пошкодженою ГТФ-циклогідролазою II), RG162, RG130 (hisx rib7, гістидинозалежні, з блокованою РФ-синтазою) (Шавловский и др., 1979); C. famata - R7 (rib1, з пошкодженою ГТФ-циклогідролазою II), R8 (rib7, з блокованою РФ-синтазою), L203, L2012, L20105 (усі leu2, з пошкодженою -ізопропілмалатдегідрогеназою), 8-33 (leu2 rib7, з блокованими -ізопропілмалатдегідрогеназою та РФ-синтазою). Усі вищеперелічені мутанти C. famata були одержані Кшановською Б. В. (відділ молекулярної генетики і біотехнології Інституту біології клітини НАНУ) з вихідного дикого штаму VKM Y-9.

Для селекції та ампліфікації плазмід здійснювали трансформацію бактерійних штамів E. coli DH5 (lacZM15, recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17(r_K^-, m_K⁺), supE44, relA1, deoR, (lacZYA-argF)U169), C600 (thi-1, thr-1, leuB6, lacY1, tonA21, supE44) (Ausubel et al., 1990), а також РФ-залежних ribA802-81 (з блокованою ГТФ-циклогідролазою ІІ) і ribB802-45 (з пошкодженою РФ-синтазою) (Тесляр и Шавловский, 1983). Два останні штами є похідними від К802 (hsdR⁺, hsdM⁺, gal^-, met^-, supE) (Тесляр и Шавловский, 1983). К802 використовували як контрольний штам при визначенні активності РФ-синтази у трансформантів E. coli.

Бактерійні штами вирощували при 37^оС на багатому (LB), або мінімальному (М9) середовищах (Ausubel et al., 1990). Для селекції плазмідовмісних бактерій використовували ампіцилін у концентрації 100 мг/л. Рибофлавінозалежні штами E. coli вирощувалися на середовищі, котре містило РФ (50 мг/л).

Дріжджові штами вирощували при 28^oС на багатому середовищі (YPD: 1 % дріжджовий екстракт, 1,5 % пептон, 2 % глюкоза (Ausubel et al., 1990) або на стандартному мінімальному середовищі (YNB: 0,67 % Yeast Nitrogen Base ("Difco", США), 2 % глюкоза). Для рибофлавінозалежних штамів дріжджів у середовище додавали РФ в кількості 200 мг/л. Агаризовані середовища і для бактерійних, і для дріжджових штамів містили 2 % агар.

Для конструювання рекомбінантних плазмід використовували вектори E. coli pUC7, pUC18 i pUC19 (Yanisch-Perron et al., 1985), а також човниковий для S. cerevisiae та E. coli вектор YЕp13 (Guthrie and Fink, 1991). Плазміди зберігались в стандартному TE-буфері (10мМ тріс-HCl (pH 8,0), 1мМ ЕДТА) (Ausubel et al., 1990).

Трансформацію дріжджів різними методами (“літієвим”, сферопластуванням, електропорацією) виконували за методиками з модифікаціями (Gleeson et al., 1986; Wolf, 1996).

Трансформацію бактерій E. coli (“кальцієвим” методом та електропорацією) здійснювали за раніше описаними методиками (Маниатис и др., 1984; Electro Cell Manipulator ECM600, Operation Manual, 1998).

Виділення сумарної ДНК з клітин дріжджів та плазмідної ДНК з клітин E. coli здійснювали модифікаціями раніше описаних методів (Mauersberger et al., 1996; Маниатис и др., 1984).

Різноманітні маніпуляції з ДНК (електрофорез в агарозному гелі, розщеплення рестриктазами, затуплення “липких” кінців, лігування, елюція з агарозного гелю) виконували методами описаними раніше; у деяких випадках застосовували модифікації (Маниатис и др., 1984).

Конструювання геномних бібліотек флавіногенних дріжджів C. famata здійснювали за принциповою схемою, описаною для дріжджів S. cerevisiae (Guthrie and Fink, 1991).

Результати та їх обговорення. Конструювання системи трансформації для дріжджів P. guilliermondii. Незважаючи на значний прогрес у впровадженні методології рекомбінантної ДНК стосовно багатьох видів неконвенційних дріжджів (Wolf, 1996), для P. guilliermondii ефективної системи вектор-господар не було розроблено. Застосування методів роботи з рекомбінантною ДНК щодо даного виду дало б змогу вивчати регуляцію біосинтезу РФ на молекулярному рівні та працювати (використовуючи новітні генно-інженерні засоби) у напрямку одержання промислового надпродуцента вітаміну В₂. Тому метою даної роботи було, зокрема, створення системи генетичної трансформації для флавіногенних дріжджів P. guilliermondii.

Трансформація рибофлавінових ауксотрофів P. guillermondii.

Було досліджено можливість трансформації рибофлавінових ауксотрофів P. guilliermondii плазмідами, що містять гомологічні гени флавіногенезу. Як реципієнтні штами використовували мутанти RG21 (rib1, з пошкодженою ГТФ-циклогідролазою II) і RG162 (rib7, з блокованою РФ-синтазою).

Було сконструйовано низку рекомбінантних плазмід, що містять гени P. guilliermondii RIB1, RIB7, або RIB1 та RIB7 одночасно (рис. 1). Плазміда p19R1 містить фрагмент хромосомної ДНК P. guilliermondii (величиною 2,1 тисяч пар нуклеотидів (т.п.н.)), що несе ген RIB1, клонований у pUC19. p19R1Xh містить зменшений фрагмент ДНК P. guilliermondii (величиною 1,68 т.п.н.), що несе ген RIB1. Плазміда p19R7 має фрагмент геному (величиною 1,4 т.п.н.), що містить ген RIB7 P. guilliermondii, інсертований у рUC19. Плазміди p19R7R1-1 i p19R7R1-5 є похідними p19R7. Вони містять хромосомний фрагмент P. guilliermondii (величиною 2,1 т.п.н.) з геном RIB1 клонований у EcoRI-сайт p19R7 в протилежних орієнтаціях (рис. 1).

Трансформацію вищеназваних РФ-залежних мутантів P. guilliermondii було здійснено трьома методами: сферопластуванням, електропорацією та літієвим методом. Однаково ефективними методами трансформації для штаму RG21 виявилися сферопластування і електропорація. Частота при використанні цих методів досягала 5х10⁴ транс./мкг ДНК. Для мутанта RG162 ефективним було лише сферопластування; частота в даному випадку досягала 7,5х10⁴ транс./мкг ДНК. Для електропорації штам RG162 як реципієнтний не підходить - після виконання всіх необхідних для цього методу маніпуляцій даний штам ревертує до РФ-прототрофності з частотою понад 10^-5 і не трансформується. Найменш ефективним методом як для RG21, так і RG162 є літієвий. Він забезпечує частоту лише до 1,5х10² транс./мкг ДНК.

Отже, проведені експерименти показали, що штами P. guilliermondii RG21 і RG162 можуть використовуватися як реципієнтні, а гени RIB1 та RIB7 як маркерні при різних методах трансформації.

Цікавими виявилися результати трансформації в контексті застосованої тієї, чи іншої рекомбінантної конструкції. Було показано, що при трансформації літієвим методом мутанта RG21 плазмідою p19R1 частота трансформації є в 125 разів вищою порівняно з трансформацією мутанта RG162 плазмідою p19R7. При застосуванні сферопластування результати трансформації були такими - для RG21 (плазміда р19R1) - 1,5х10⁴ транс./мкг ДНК, для RG162 (плазміда p19R7) - лише 50 транс./мкг ДНК. Обидві плазміди сконструйовані на основі бактерійного вектора pUC19 і відрізняються лише дріжджовими фрагментами. Плазміда p19R1Xh (рис. 1), що несе фраґмент ДНК величиною 1,68 т.п.н. з геном RIB1 забезпечує частоту трансформації на тому ж рівні, що і p19R1. Якщо у плазміду p19R7 (несе ген RIB7) ввести фрагмент ДНК P. guilliermondii з геном RIB1 (див. плазміди p19R7R1-1 i p19R7R1-5; рис. 1), то це призводить до підвищення частоти трансформації штаму RG162 в 950-1500 разів. Одержані результати свідчать на користь того, що фрагмент ДНК P. guilliermondii, який несе ген RIB1 може містити у собі ARS-послідовність (Autonomously Replicating Sequence), оскільки відомо - наявність такої послідовності на плазміді підвищує частоту трансформації дріжджів в 100-100000 разів (Struhl et al.,1979; Cregg and Madden, 1987; Wolf, 1996).

Виявлення і характеристика АRS-послідовності P. guilliermondii.

Було проведено аналіз нуклеотидної послідовності фрагмента хромосомної ДНК P. guuilliermondii, що несе ген RIB1 і виявлено дві послідовності, названі 5'ARSLS i 3'ARSLS (ARS-Like Sequence, рис. 2) - котрі фланкують структурну частину цього гена і мають риси, притаманні ARS-елементам. Дані послідовності характеризуються високим вмістом А+Т пар - 71-73 % упродовж 140-160 пар нуклеотидів. Це значно вище від середнього вмісту А+Т пар (55-65 %), описаного для хромосомної ДНК видів Pichia (Storck and Alexopoulos, 1970). В межах 5'ARSLS i 3'ARSLS наявні послідовності, гомологічні до ACS (ARS Consensus Sequence) S.cerevisiae (Rowley et al., 1994). Окрім цього, обидві виявлені “ARS-подібні” послідовності містять інвертовані повтори, що теж є характерним для ARS-елементів (Cregg et al., 1985).

Для з'ясування чи насправді яка-небудь із двох “ARS-подібних” послідовностей функціонує як плазмідний реплікатор, було створено низку конструкцій, котрі містять 5'ARSLS, або 3'ARSLS вбудовану у p19R7 (рис. 2). Плазміди p19R7-34 i p19R7-38 несуть HincII-фрагмент 5'-ділянки гена RIB1 P. guilliermondii (величиною 0,76 т.п.н.) інсертований в EcoRI-сайт p19R7 в протилежних орієнтаціях. Плазміди p19R7-51 i p19R7-55 містять PstІ-фрагмент гена RIB1 величиною 1,33 т.п.н., теж інсертований в EcoRI-сайт p19R7 в протилежних орієнтаціях (рис. 2). Плазміди p19R7-3 i p19R7-7 містять HincII-фрагмент 3'-ділянки гена RIB1 P. guilliermondii (величиною 0,82 т.п.н.) вбудований в EcoRI-сайт p19R7 в протилежних орієнтаціях (рис. 2).

Результати трансформації мутанта rib7 P. guilliermondii показали, що значне підвищення частоти трансформації - більше, ніж в 1000 разів - забезпечується плазмідами p19R7-3 i p19R7-7, котрі несуть 3'ARSLS. Плазміди ж, що містять 5' “ARS-подібну” послідовність (p19R7-34, p19R7-38, p19R7-51 i p19R7-55) трансформують вищеназваний мутант на рівні p19R7.

Отже, саме послідовність 3'ARSLS (але не 5'ARSLS) забезпечує високу частоту трансформації дріжджів P. guilliermondii, що, як відомо, є ознакою ARS (Struhl et al.,1979; Cregg and Madden, 1987; Wolf, 1996).

Було перевірено мітотичну стабільність дріжджових трансформантів. Виявилося, що трансформанти, одержані за допомогою плазмід, котрі містять 5'ARSLS були стабільними. Вони зберігали Rib⁺-фенотип у неселективних умовах, що може свідчити про інтеграцію плазміди у хромосомну ДНК. На відміну від цього, трансформанти, одержані за допомогою плазмід, котрі містять 3'ARSLS, були нестабільними - від 70 до 90 % клітин втрачали Rib⁺-фенотип. Мітотична нестабільність фенотипічної ознаки, котра визначається плазмідним геном, є свідченням автономного (екстрахромосомного) статусу плазміди (Cregg and Madden, 1987; Piredda and Gaillardin, 1994; Wolf, 1996). Наявність 10-30 % стабільних трансформантів можна пояснити або інтеграцією плазміди у хромосомну ДНК (при наявності гомологічних послідовностей таке є цілком можливим), або ж мультимеризацією плазміди - останнє, як відомо, забезпечує стабільне успадкування ознаки (Hansen and Hollenberg, 1996).

Плазміди p19R7-3, p19R7-7, p19R7R1-1 i p19R7R1-5 (рис. 1 та 2) було виділено з трансформантів P. guilliermondii у кількостях, достатніх для ретрансформації E. coli. З трансформантів E. coli виділено плазміди, ідентичні до тих, якими трансформували дріжджовий мутант rib7. Спроба виділити плазміди з трансформантів P. guilliermondii rib7/p19R7, rib7/p19R7-34, rib7/p19R7-38, rib7/p19R7-51, rib7/p19R7-55, успіху не мала.

Гібридизація за Саузерном, виконана нашими колегами - науковцями Технічного університету м. Грац (Австрія) додатково засвідчила позахромосомний статус плазмід p19R1, p19R7-7 i p19R7R1-5 в клітинах дріжджових трансформантів. Водночас у цьому експерименті було показано інтегративний статус плазміди p19R7 (Boretsky et al., 1999).

ARS-послідовності (ARS-елементи), як відомо, забезпечують автономний статус плазмід і високу частоту трансформації. Як правило, ARS-послідовності є видоспецифічними і не функціонують в клітинах інших видів дріжджів. Зокрема, ARS1 S. cerevisiae не проявляє активності у Schizosaccharomyces pombe, K. lactis, K. fragilis, P. pastoris, C. maltosa. оri-послідовність 2 мкм плазміди S.cerevisiae неефективно функціонує в K. lactis i P. pastoris, і взагалі не функціонує в K. fragilis i C. maltosa. Водночас, ARS-елементи різних видів можуть мати спільні особливості (підвищенийй вміст А+Т пар, наявність інвертованих повторів) і гомологічні послідовності (Cregg and Madden, 1987; Wolf, 1996).

Таким чином, було ідентифіковано ARS-послідовність дріжджів P. guilliermondii (названу PgARS), котра знаходиться в 3' ділянці гена RIB1. PgARS має особливості, характерні для ARS-ів інших видів дріжджів - а саме - підвищений вміст А+Т пар - 71 % упродовж 160 п.н., інвертовані повтори, дві послідовності, гомологічні до ACS S. cerevisiae. Друга “ARS-подібна” послідовність, що знаходиться у 5' ділянці гена RIB1 (5'ARSLS) не функціонує як плазмідний реплікатор, хоча теж має особливості, характерні для цих елементів. Можливо, 5'ARSLS не містить якихось важливих (неідентифікованих поки що) послідовностей, котрі є обов'язковими для функціонування ARS у P. guilliermondii.

Показано, що наявність PgARS у складі рекомбінантних плазмід забезпечує автономну реплікацію і високу частоту трансформації P. guilliermondii. PgARS було використано для конструювання низки реплікативних плазмід, човникових для E. coli i P. guilliermondii. Таким чином, розроблено систему генетичної трансформації (вектор-господар) для P. guilliermondii на основі реципієнтних штамів RG21 (rib1), або RG162 (rib7) і плазмідних векторів, що містять гени RIB1, або RIB7 як селективні маркери. Така система є важливою умовою застосування методології рекомбінантної ДНК для флавіногенних дріжджів P. guilliermondii.

Розробка системи генетичної трансформації для дріжджів C. famata. Флавіногенний потенціал дріжджів C. famata є дуже високим; деякі мутанти цього виду належать до найкращих з відомих на сьогодні надпродуцентів вітаміну В₂; вони нагромаджують понад 20 г РФ/л (Heefner et al., 1993).

Під час конструювання промислового надпродуцента РФ C. famata - штама dep8 - використовувалися лише методи традиційної селекції (Heefner et al., 1993). Методів молекулярного клонування (векторів, трансформації, т. ін.) не було розроблено ні для штамів дикого типу, ні для промислового продуцента. А такі методи надають зовсім нові можливості для одержання більш активних та стабільних надсинтетиків РФ. Загалом, застосування методів генетичної інженерії дозволяє здійснити ампліфікацію структурних генів флавіногенезу (це особливо важливо для генів, що лімітують даний процес); ампліфікацію бажаних та розрив (або делецію) небажаних регуляторних генів, задіяних в біосинтезі РФ чи в забезпеченні цього біосинтетичного шляху попередниками.

Трансформація рибофлавінових ауксотрофів C. famata rib1 та rib7.

Для розробки системи генетичної трансформації дріжджів C. famata були використані РФ-залежні штами цього виду R7 (rib1 з пошкодженою GTP-циклогідролазою II) і R8 (rib7, з блокованою РФ-синтазою) та рекомбінантні плазміди p19R1 i p19R7-7 (рис. 1 та 2). Плазміда p19R1 містить у своєму складі ген RIB1, а плазміда p19R7-7 - ген RIB7 дріжджів P. guilliermondii.

Було здійснено трансформацію сферопластів штаму R7 плазмідою p19R1. Частота трансформації коливалася від 10 до 100 транс./мкг ДНК. Досліджено стабільність одержаних трансформантів C. famata. Вони виявилися мітотично нестабільними: в середньому 64 % клітин втрачали Rib⁺-фенотип після росту в неселективних умовах. Плазміду p19R1 було виділено з трансформантів C. famata шляхом ретрансформації E. coli сумарною дріжджовою ДНК.

Здійснено також трансформацію сферопластів мутанта R8 плазмідою p19R7-7. Частота трансформації коливалася від 2х10² до 5х10² транс./мкг ДНК. Досліджено стабільність одержаних трансформантів C. famata. Вони, як і у випадку з трансформантами R7/p19R1, виявилися мітотично нестабільними: в середньому 72 % клітин втрачали Rib⁺-фенотип після росту в неселективних умовах. Плазміду p19R7-7 було виділено з трансформантів C. famata шляхом ретрансформації E. coli сумарною дріжджовою ДНК.

Отже, про автономний статус p19R1 та p19R7-7 в C. famata свідчать такі факти: 1) нестабільність Rib⁺-фенотипу дріжджових трансформантів; 2) виділення даних плазмід з клітин C. famata через ретрансформацію E. coli. Причиною низької частоти трансформації C. famata може бути неефективне функціонування плазмідного гетерологічного реплікатора (PgARS-послідовності) в клітинах цього виду дріжджів.

Таким чином, гени RIB1 і RIB7 дріжджів P. guilliermondii експресуються в клітинах C. famata. Очевидно, ці гени (як трансформаційні маркери) і, водночас, мутанти R7 та R8 (як реципієнтні штами) є придатними для використання в системах генетичної трансформації дріжджів C. famata.

Ідентифікація мутантів C. famata з блокованою -ізопропілмалатдегідрогеназою шляхом трансформації лейцинових ауксотрофів плазмідами, що містять ген LEU2 S. cerevisiae.

Для різних видів дріжджів у трансформаційних системах часто застосовують так звані стандартні маркери, як от ген -ізопропілмалатдегідрогенази, або оротидинмонофосфатдекарбоксилази (відповідно LEU2 i URA3 у S. cerevisiae). При розробці системи вектор-господар для C. famata з метою клонування генів флавіногенезу (а саме біосинтез вітаміну В₂ становить найбільший інтерес у даного виду), такі маркери як RIB1 і RIB7 є незручними, оскільки вони задіяні у вищеназваному процесі. Таким чином, одним із завдань цієї роботи було дослідження можливості застосування маркера LEU2 в системі C. famata. Для цього здійснено ідентифікацію leu2 мутантів даного виду дріжджів з колекції лейцинозалежних ауксотрофів. Ідентифікацію було виконано шляхом трансформації п'ятьох leu---мутантів (L203, L207, L2012, L20100, L20105) плазмідами, що несуть ген LEU2 S. cerevisiae. Для цього використали дві плазміди - стандартний дріжджовий вектор YEp13 (Guthrie and Fink, 1991) i рекомбінантну конструкцію PRpL2 (рис. 3). Плазміду PRpL2 створено таким чином: з вектора YEp13 вищеплено за допомогою рестриктази Pst I фрагмент ДНК S. cerevisiae (величиною 4,2 т.п.н.), що містить ген LEU2. Водночас з плазміди p19R1 (рис. 1) за допомогою цієї ж рестриктази вищеплено фрагмент величиною ~3,5 т.п.н., котрий містить повну послідовність pUC19 i PgARS-елемент. Здійснено ліґування обидвох Pst I-послідовностей (з векторів YEp13 і p19R1). Таким чином одержано рекомбінантну конструкцію PRpL2 (рис. 3).

Трансформацію leu---мутантів проводили методом сферопластування. Виявилося, що штами L203, L2012 i L20105 трансформувалися плазмідами YEp13 і PRpL2 до утворення прототрофних за лейцином колоній. Вищеназвані плазміди виділялися з дріжджових трансформантів через ретрансформацію E. coli.

Частота трансформації для штаму L203 становила 250 і 106 транс./мкг ДНК плазмідою PRpL2 і YEp13 відповідно; для L2012 - 105 і 30; для L20105 - 290 і 30. Всі три мутанти були стабільними; частота реверсії до прототрофності була меншою, ніж 10^-7 і не зростала після сферопластування.

Таким чином, було ідентифіковано мутанти leu2 дріжджів C. famata шляхом комплементації відповідного дефекту плазмідами, котрі містять ген LEU2 S. cerevisiae. Показано автономний статус плазмід PRpL2 і YEp13 в клітинах одержаних дріжджових трансформантів. Низька частота трансформації може свідчити про відсутність ефективного плазмідного реплікатора (ARS-послідовності) у складі вищеназваних векторів. Отже, штами L203, L2012 i L20105 є придатними як реципієнтні, а ген LEU2 S. cerevisiae як маркерний в трансформаційних системах для дріжджів C. famata.

Клонування ARS-елементів C. famata.

Жоден із перевірених гетерологічних ARS-елементів (PgARS, ori 2 мкм плазміди - див. вище) не забезпечував високої частоти трансформації дріжджів C. famata. Ефективна трансформація (високий рівень частоти - 10³ транс./мкг ДНК і вище (Cregg and Madden, 1987) є важливим чинником для системи вектор-господар, котра створюється з метою клонування генетичного матеріалу. Тому, одним із завдань даної роботи було одержання ефективного гомологічного плазмідного реплікатора (ARS-послідовності) C. famata.

Стратегія одержання ARS C. famata полягала у клонуванні вищеназваної послідовності з геномної бібліотеки цього виду, сконструйованої на базі вектора, що не містить дріжджового плазмідного реплікатора. Як вектор для конструювання геномної бібліотеки штаму C. famata VKM Y-9 було використано плазміду p19L2 (4,86 т.п.н.; рис. 4). Її одержано таким чином: Sal I-Xho I-фрагмент величиною 2,17 т.п.н. (несе ген S. cerevisiae LEU2, що кодує -ізопропілмалатдегідрогеназу) за допомогою відповідних рестриктаз вищеплено з вектора YEp13 і вбудовано у Sal I-cайт плазміди pUC19. Плазмідою p19L2 (рис. 4) здійснено трансформацію сферопластів мутанта L20105 (leu2), ідентифікованого раніше. В експериментах, де застосовували для усунення клітинної стінки грубий препарат ферменту літикази (Lyticase, crude “Sigma”) частота трансформації становила 30 транс./мкг ДНК. При використанні частково очищеного препарату цього ж ферменту (кваліфікації “partially purified”) - частота становила 1х10⁴ транс./мкг ДНК. Слід зауважити, що переважна більшість колоній дріжджових трансформантів (97 % в експериментах з літиказою кваліфікації “crude” і 99,9 % - з ферментом “partially purified”) були дрібними. При виконанні реплік з чашок, що містили такі трансформанти на селективне середовище понад 97 % колоній елімінувалися - втрачали Leu⁺-фенотип. Отже, при застосуванні плазміди p19L2 спостерігали так звану абортивну трансформацію - в процесі селективного росту фенотипова ознака, детермінована маркерним геном підтримувалася лише у невеликого відсотка (менше 3 %) одержаних колоній. Цей факт свідчить про відсутність ефективного плазмідного реплікатора на p19L2. Наявність такого реплікатора забезпечує високу частоту трансформації (не менше 10³ транс./мкг ДНК) і стабільну підтримку (в процесі селективного росту) фенотипової ознаки, детермінованої плазмідним маркером.

На плазміді p19L2 було сконструйовано геномну бібліотеку C. famata штаму VKM Y-9. Плазмідною ДНК одержаної бібліотеки здійснено трансформацію сферопластів штаму C. famata L20105 (leu2). Частота трансформації за лейциновим маркером становила 6х10⁴ транс./мкг ДНК. Це в шість разів вище, ніж частота, одержана при використанні вектора p19L2. Понад 80 % дріжджових колоній, що виросли після трансформації геномною бібліотекою зберігали Leu⁺-фенотип в умовах селективного росту. Як згадувалося вище, за таких самих умов понад 97 % трансформантів, одержаних за допомогою плазміди p19L2, втрачали прототрофність. Отже, (а) підвищена частота трансформації і (б) стабільна підтримка Leu⁺-фенотипу трансформантами можуть свідчити про присутність ARS-елементів у складі інсертів сконструйованої геномної бібліотеки C. famata.

Для клонування ARS-послідовностей з ~50000 колоній C. famata, одержаних після трансформації геномною бібліотекою, виділили сумарну ДНК. Цією ДНК було здійснено трансформацію E. coli DH5. При додаванні 1 мкл сумарної ДНК трансформантів C. famata, виростало приблизно 100 ампіцилінорезистентних бактерійних колоній. З 16 таких колоній було виділено плазмідну ДНК. Виявилося, що всі одержані вектори були більшими від p19L2 і за величиною розділялися на п'ять груп. Для подальшого аналізу з кожної групи було взято по одній плазміді; ці рекомбінантні конструкції назвали - pCfARS1, pCfARS6, pCfARS7, pCfARS11, pCfARS16. Рестрикційний аналіз взятих плазмід показав, що всі вони є поєднанням вектора p19L2 із вставками різної величини. Було визначено приблизну величину інсертів: pCfARS1 - прибл. 3,4 т.п.н., (загальна довжина - ~8,3 т.п.н.); pCfARS6 має вставку ~6 т.п.н. (загальна довжина - ~10,9 т.п.н.); pCfARS7 - ~1,9 т.п.н. (загальна величина - ~6,8 т.п.н.); pCfARS11 - величина вставки ~3,6 т.п.н. (загальна довжина - ~8,5 т.п.н.); pCfARS16 має вставку ~0,25 т.п.н. (загальна величина ~5,1 т.п.н.; рис. 5).

Здійснено трансформацію сферопластів штаму C. famata L20105 (leu2) вищеописаними конструкціями. Виявилося, що частота трансформації плазмідами, котрі містять вставки, в середньому в 13 разів вища, ніж частота, одержана у випадку вектора p19L2 (1074 транс./мкг ДНК для плазмід, що несуть інсерти і 83 транс./мкг ДНК для p19L2). Для рекомбінантних конструкцій, котрі містять вставки, частота трансформації становила: для pCfARS1 - 850; pCfARS6 - 1100; pCfARS11 - 1060; pCfARS7 - 580; pCfARS16 - 1780 транс./мкг ДНК. Дріжджові трансформанти, одержані за допомогою плазмід, що несуть вставки, стабільно підтримували Leu⁺-фенотип в умовах селективного росту. Вони відрізнялися від трансформантів, одержаних за допомогою p19L2. Як було вже згадано, колонії останніх були дуже дрібними та елімінувалися при реплікуванні на селективне середовище. Всі рекомбінантні плазміди, що несуть вставки (на відміну від вектора p19L2) виділялися з трансформантів C. famata через ретрансформацію E. coli.

Виконано більш детальний рестрикційний аналіз плазмід pCfARS11, pCfARS6 і pCfARS16, котрі забезпечують найвищу частоту трансформації штама L20105 (див. рис. 5).

Таким чином, в результаті проведеної роботи, було клоновано та ідентифіковано п'ять фрагментів геномної ДНК штаму C. famata VKM Y-9 з функцією ARS-послідовності. Рекомбінантні конструкції pCfARS1, pCfARS6, pCfARS7, pCfARS11, pCfARS16 забезпечували а) ефективну трансформацію штаму L20105 до прототрофності за лейцином; б) стабільну підтримку Leu⁺-фенотипу дріжджових трансформантів під час селективного росту. Вищеназвані рекомбінантні плазміди (на відміну від вектора p19L2) автономно підтримувалися в клітинах трансформантів C. famata. Перелічені факти переконливо свідчать про наявність ARS-активності у клонованих фрагментів.

Оптимізація методу електротрансформації С. famata.

Для оптимізації умов електротрансформації C. famata було взято штам L20105 (leu2) і плазміди pCfARS6 та pCfARS16 (рис. 5). Електропорацію здійснювали на приладі марки ЕСМ600 фірми “ВТХ” (США). Були досліджені такі (важливі для електротрансформації) параметри: вік культури, напруженість електричного поля, тривалість електричного імпульсу та значення обробки клітин ДТТ. В результаті проведеної роботи показано, що а) для трансформації необхідно брати клітини експоненційної фази росту з оптичною густиною 6 од. (довжина хвилі - 540 нм); б) оптимальна напруженість електричного поля становить 11,5 кV/см; в) оптимальна тривалість електричного імпульсу - 4,5 мсек; г) обов'язковою умовою електропорації є обробка клітин ДТТ. Оптимізований метод забезпечує високу частоту електротрансформації дріжджів C. famata - 1х10⁵ транс./мкг ДНК.

Клонування гена RIB7 дріжджів C. famata, що кодує РФ-синтазу.

Першим етапом при клонуванні генів C. famata, задіяних в біосинтезі вітаміну В₂, є створення геномної бібліотеки на реплікативному для цього виду дріжджів векторі. У даному випадку як вектор було використано реплікативну плазміду pCf14 (рис. 6). Цю плазміду сконструйовано шляхом вбудови фрагмента величиною ~0,25 т.п.н., що несе CfARS-послідовність вектора pCfARS16 (рис. 5) у Sma I-сайт p19L2 (рис. 4). pCf14 має загальну величину ~5,1 т.п.н. Цей вектор несе фрагмент ДНК S. cerevisiae з геном LEU2 (маркерний ген), CfARS-послідовність (плазмідний реплікатор C. famata) і бактерійну частину (повну послідовність pUC19, котра містить ori E. coli та ген резистентності до ампіциліну). рCf14 містить унікальний BamH I-сайт (рис. 6). На основі вектора pCf14 було сконструйовано бібліотеку генів штама C. famata VKM Y-9.

Здійснено електротрансформацію мутанта C. famata 8-33 (leu2 rib7) плазмідною ДНК вищеописаної бібліотеки генів цього виду. Було одержано дві колонії дріжджових трансформантів прототрофних за лейцином і РФ. З клітин цих трансформантів (через ретрансформацію E. coli) виділили ідентичну плазмідну ДНК (її назвали pCR7). Одержану плазміду використали для електротрансформації штама 8-33. Виявилося, що pCR7 трансформує вищеназваний штам до Leu⁺Rib⁺-фенотипу з частотою приблизно 1х10³ транс./мкг ДНК. Через ретрансформацію E. coli з одержаних дріжджових трансформантів виділено плазмідну ДНК, ідентичну до pCR7. Отже, дана плазміда комплементує лейцинову та РФ ауксотрофності мутанта 8-33 та підтримується автономно в клітинах дріжджових трансформантів.

На основі проведеного рестрикційного аналізу побудовано рестрикційну карту pCR7. Загальна довжина цієї плазміди становить приблизно 6,6 т.п.н., а величина вставки - ~1,5 т.п.н. (рис. 7).

Досліджено можливість комплементації плазмідою pCR7 мутації rib7 флавіногенних дріжджів P. guilliermondii. Для досягнення ефективної трансформації, в pCR7 вбудували фрагмент з PgARS-послідовністю. Нову плазміду назвали PRp7. Її розмір становить приблизно 7,4 т.п.н. (рис.8).

Здійснено трансформацію сферопластів штама P. guilliermondii RG130 (rib7) плазмідами pCR7 і PRp7. Виявилося, що обидві плазміди комплементують РФ-ауксотрофність штаму RG130. Rib⁺-прототрофи P. guilliermondii з'являються з частотою 2 транс./мкг ДНК і 110 транс./мкг ДНК у випадку pCR7 та PRp7, відповідно. З трансформантів RG130/pCR7 і RG130/PRp7 були виділені (через ретрансформацію E.coli) відповідні плазміди. Отже, і pCR7, і PRp7 підтримуються екстрахромосомно в клітинах P. guilliermondii. Плазміда PRp7 (очевидно, завдяки наявності у її складі PgARS-послідовності) трансформує штам RG130 з частотою у 55 разів вищою, ніж pCR7. Таким чином, наведені вище факти свідчать про те, що клонований геномний фрагмент C. famata, який знаходиться у складі плазмід pCR7 і PRp7 містить ген RIB7.



ВИСНОВКИ

В результаті виконаної роботи розроблено системи генетичної трансформації для флавіногенних дріжджів P. guilliermondii і C. famata.

Ідентифіковано мутанти дріжджів P. guilliermondii (RG21 (hisx rib1), RG130 (hisx rib7), RG162 (hisx rib7)) та C. famata (R7 (rib1), R8 (rib7), L203 (leu2), L2012 (leu2), L20105 (leu2), 8-33 (leu2 rib7)) придатні для трансформаційних систем вектор-господар як реципієнтні штами.

Встановлено, що гени RIB1 i RIB7 P. guilliermondii та LEU2 S. cerevisiae можуть бути використані як селективні маркери в системах генетичної трансформації флавіногенних дріжджів P. guilliermondii і C. famata.

Оптимізовано методи трансформації флавіногенних дріжджів (сферопластування, електропорацію).

Виявлено і локалізовано ARS-елемент дріжджів P. guilliermondii.

Клоновано п'ять фрагментів ДНК C. famata, що несуть ARS-послідовності.

Сконструйовано реплікативні плазміди, які є човниковими для E. coli і флавіногенних дріжджів.

На основі розроблених трансформаційних систем клоновано ген біосинтезу РФ дріжджів C. famata, що кодує РФ-синтазу.



ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Логвиненко Е. М., Стасив Ю. З., Злочевский М. Л., Вороновский А. Я., Бебуров М. Ю., Шавловский Г. М. Клонирование гена RIB7, кодирующего рибофлавинсинтазу дрожжей Pichia guilliermondii // Генетика. - 1993. - Т.29, №6. - С.922-927.

2. Вороновський А. Я., Сибірний А. А. Розвиток трансформаційних систем вектор-господар для клонування та експресії генетичного матеріалу у неконвенційних дріжджів // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т.15, №2. - С.122-132.

3. Boretsky Y., Voronovsky A., Liuta-Tehlivets O., Hasslacher M., Kohlwein S. D. and Shavlovsky G. M. Identification of an ARS element and development of a high efficiency transformation system for Pichia guilliermondii // Curr. Genet. - 1999. - V.36. - P.215-221.

4. Вороновський А. Я., Борецький Ю. Р. Ідентифікація ARS-послідовності флавіногенних дріжджів Pichia guilliermondii // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, №1. - С.46-52.

5. Логвиненко О. М., Закальський А. Є., Стасів Ю.З., Злочевський М. Л., Вороновський А. Я., Бебуров М. Ю., Шавловський Г. М. Плазміди, що містять гени RIB1 і RIB7 дріжджів Pichia guilliermondii // Тези доповідей VI-го з'їзду УТГіС ім. М. І. Вавилова. - Полтава. - 1992. - Т.І. - С121-122.

6. Логвиненко О. М., Вороновський А. Я., Шавловський Г. М. Синтез ГТФ-циклогідролази і РФ-синтази в клітинах Escherichia coli і Hansenula polymorpha трансформованих плазмідами, що несуть гени RIB1 та RIB7 дріжджів Pichia guilliermondii // Тези доповідей VI-го Укр. біохім. з'їзду (Ч.1.). - Київ. - 1992. - С.43.

7. Вороновський А. Я., Закальський А. Є., Шавловський Г. М. Дослідження флавіногенної активності та мітотичної стабільності Hansenula polymorpha і Pichia guilliermondii, трансформованих дріжджовим геном RIB1 // Тези доповідей І-го Установчого (VIII) з'їзду Укр. мікробіол. товариства; Одеса, 1993. Мікробіол. журнал. - 1994. - Т.56, №1. - С.43.

Струговщикова Л. П., Вороновський А. Я., Шавловський Г. М., Сидорович І. Б. Дослідження флавіногенезу у мутантів Candida famata О-3, одержаних за допомогою мутагенезу, і трансформантів C. famata RIB1, що містять ген RIB1 Pichia guilliermondii // Тези доповідей І-го Установчого (VIII) з'їзду Укр. мікробіол. товариства; Одеса, 1993. Мікробіол. журнал. - 1994. - Т.56, №1. - С.104.

Люта О. Є., Вороновський А. Я., Борецький Ю. Р., Шавловський Г. М. Дослідження флавіногенезу у трансформантів Pichia guilliermondii і Hansenula polymorpha, що містять клонований ген RIB7 // Тези доповідей Всеукр. конф. з фізіології і біохімії тварин. - Львів. - 1994. - Т.І. - С.87-88.

Вороновський А. Я., Кшановська Б. В., Сибірний А. А. Трансформація флавіногенних дріжджів Candida famata // Тези доповідей VIІ-го Укр. біохім. з'їзду (Ч.1.). - Київ. - 1997. - С.133-134.

Размещено на Allbest.ru

...