Морфофункціональні особливості мегакаріоцитів і тромбоцитів при мієлодиспластичному синдромі

Размещено на http://www.allbest.ru/

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

УДК: 612.419+612.111.7

МОРФОФУНКЦІОНАЛЬНІ ОСОБЛИВОСТІ МЕГАКАРІОЦИТІВ

І ТРОМБОЦИТІВ ПРИ МІЄЛОДИСПЛАСТИЧНОМУ СИНДРОМІ

03.00.11 - цитологія, гістологія

Автореферат дисертації на здобуття

наукового ступеня кандидата біологічних наук

Бєлінська Ірина Василівна

Київ-2002

АНОТАЦІЯ

Бєлінська І.В. Морфофункціональні особливості мегакаріоцитів і тромбоцитів при мієлодиспластичному синдромі. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.11 - цитологія, гістологія. - Київський національний університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертаційна робота присвячена вивченню цитологічних і цитохімічних характеристик мегакаріоцитів, ролі ліпідного матриксу мембран та мембранозв'язаних ферментів в функціонуванні тромбоцитів та розвитку мегакаріоцитів при мієлодиспластичному синдромі. Дослідження популяції мегакаріоцитів показало збільшення кількості гіпосегментованих мегакаріоцитів, мікромегакаріоцитів та диспластичних клітин, незрілих базофільних мегакаріоцитів, які утворюють тромбоцити, у разі зменшенної кількості зрілих поліхроматофільних мегакаріоцитів. При мієлодиспластичному синдромі в мегакаріоцитах зменшується вміст глікогену і неспецифічної естерази. Виявлені зміни будови мегакаріоцитів призводять до утворення функціонально неповноцінних тромбоцитів, що підтверджується гальмуванням агрегації тромбоцитів і зменшенням в них глікогену, азурофільних гранул та кислої фосфатази. Зниження Ca²⁺-АТФазної та підвищення Na⁺,K⁺-АТФазної активностей сумарної фракції мембран тромбоцитів є причиною зниження їх агрегації.

Ключові слова: мегакаріоцити, агрегація тромбоцитів, глікоген, неспецифічна естераза, кисла фосфатаза, ліпіди мембран, Са²⁺- і Na⁺,K⁺-АТФазні активності мембран.

АННОТАЦИЯ

Белинская И.В. Морфофункциональные особенности мегакариоцитов и тромбоцитов при миелодиспластическом синдроме. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.11 - цитология, гистология. - Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертационная работа посвящена изучению морфологических и цитохимических характеристик мегакариоцитов, роли липидного матрикса мембран и мембраносвязанных ферментов в функционировании тромбоцитов и развитии мегакариоцитов при миелодиспластическом синдроме. Выявлено, что уменьшение количества тромбоцитов в крови не связано с достоверным уменьшением количества мегакариоцитов в костном мозге при миелодиспластическом синдроме. Не уменьшается количество мегакариоцитов, которые образовывают тромбоциты. Исследование морфологической структуры мегакариоцитов показало увеличение гипосегментированных мегакариоцитов, микромегакариоцитов и диспластических мегакариоцитов. Выявлено увеличение мегакариобластов, промегакариоцитов и базофильных мегакариоцитов, которые образуют тромбоциты. При этом уменьшается количество полихроматофильных мегакариоцитов, которые являются функционально активными клетками в норме. Увеличивается количество оксифильных мегакариоцитов и "свободных" ядер мегакариоцитов, что свидетельствует об укорочении "жизни" мегакариоцитов в костном мозке. При миелодиспластическом синдроме в мегакариоцитах уменьшается содержание гликогена и неспецифической эстеразы. Выявленные изменения мегакариоцитов сопровождаются образованием функционально неполноценных тромбоцитов, что подтверждается торможением агрегации тромбоцитов и уменьшения в них гликогена, азурофильних гранул и кислой фосфатазы. В липидном матрике сумарной фракции тромбоцитарных мембран выявлено увеличение содержания холестерола и его эфиров, жирных кислот, триглицеридов и лизофосфатидилхолина, что свидетельствует о нарушениях обмена липидов в мегакариоцитах и тромбоцитах при миелодиспластическом синдроме. Снижение Са²⁺АТФазной и повышение Na⁺,K⁺-АТФазной активности сумарной фракции мембран тромбоцитов при миелодиспластическом синдроме отображает активность мембранных транспортных АТФаз в мегакариоцитах, из которых образовываются тромбоциты, и свидетельствует обо образовании аномальных мегкариоцитов. Предполагается, что повышенный электрохимический потенциал натрия способствует мембранному симпорту глюкозы и антипорту ионов Са²⁺. Низкая Са²⁺-АТФазная активность мембран тромбоцитов приводит к снижению содержания Са²⁺ во внутриклеточных депо и есть причиной синжения агрегации тромбоцитов при их активации.

Ключевые слова: мегакариоциты, агрегация тромбоцитов, гликоген, неспецифическая эстераза, кислая фосфатаза, липиды мембран, Са²⁺- и Na⁺,K⁺-АТФазные активности мембран.

SUMMARY

Byelinska I.V. Morphofunctional parameters of megakaryocytes and platelet attached to myelodysplastic syndromes. - Manuscript.

The dissertation for scientific degree of candidate of the biological science in speciality 03.00.11. - Cytology and Hystology. - National Taras Shevchenko University of Kyiv, Kyiv, 2002.

The morphology, cytochemical indexes and function parameters, membrane's lipids and ATPases activity of bone marrow megakaryocytes and blood platelet attached to myelodysplastic syndromes were investigated. It was found the increase of number of megakaryoblasts, promegakaryocytes and basophilic megakaryocytes with platelet formation. Simultaneous reliable decrease in the quantity of polychromatophilic megakaryocytes, that were the most functional active cells in the control group. Decreasing in number of glikogen, non-specific asterase inside megakaryocytes was shown. Changes of megakaryocytes cause the decrease of platelet aggregation, number azurophilic granule and granule with acid phosphatase in platelets. The study of Са²⁺-AТP-ase and Na⁺,K⁺-AТP-ase platelet membrane activities showed the decrease in Са²⁺-AТP-ase and the increase in Na⁺,K⁺-AТP-ase activity in patients with myelodysplastic syndromes. The decrease of Са²⁺-AТP-ase activity couses the decrease concentration of Са²⁺ inside the endoplasmic reticulum and of platelet aggregation and apearing of altered megakaryocytes.

Key words: megakaryocytes, platelet aggregation, glikogen, nonspecific asterase, acid phosphatase, lipids and Са²⁺- andNa⁺,K⁺-ATPases activity of platelet membrane.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі цитофізіології біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка та Науковому центрі радіаційної медицини АМН України

Наукові керівники: доктор біологічних наук, професор Рибальченко Володимир Корнійович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, завідувач відділу цитофізіології біологічного факультету

доктор медичних наук, професор Клименко Віктор Іванович, Науковий центр радіаційної медицини АМН України, завідувач відділенням гематології Інституту клінічної радіології

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, старший науковий співробітник Родіонова Наталія Василівна, Інститут зоології ім. І.І.Шмальгаузена НАН України, завідувач відділу цитології та гістогенезу

доктор медичних наук, старший науковий співробітник Білько Надія Михайлівна, Національний університет "Києво-Могилянська Академія", професор кафедри біології природничого факультету

Провідна установа: Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця МОЗ України, м. Київ

Захист відбудеться 27 січня 2003 р. о 17 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д26.001.38 Київського національного університету імені Тараса Шевченка за адресою: 03022, Київ-22, пр. акад. Глушкова, 2, ауд.215. Поштова адреса: 01033, Київ, вул. Володимирська, 64, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка: 01033, м.Київ, вул. Володимирська, 58.

Автореферат розісланий 21 грудня 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38 Т.Л. Давидовська

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Вивчення кровотворної тканини людини при мієлодиспластичному синдромі - стану гемопоезу, при якому спостерігається нормальна або підвищена кількість гемопоетичних клітин в кістковому мозку і зменшена кількість їх нащадків - клітин крові - є одним із найактуальніших питань в сучасній цитології та гематології [Глузман и соавт., 1998, 2000; Drunning, Mckenna, 1994; Beutler et al, 1995]. Даний стан кровотворення характеризується наявністю морфологічно змінених клітин трьох ростків гемопоезу: лейкоцитарного, еритроцитарного і тромбоцитарного та затримкою диференціювання їх попередників (неефективний гемопоез) в кістковому мозку [Зверкова и соавт., 1997; Клименко и соавт., 1998, 1999; Бебешко и соавт., 1999; Френкель и соавт., 1999; Савва и соавт., 2001]. Такі аномалії є результатом порушення диференціювання стовбурових клітин кісткового мозку [Sawada et al, 1995; Hoffman et al, 1999, 2000]. Унікальність мієлодиспластичного синдрому полягає в тому, що він часто передує розвитку гострого лейкозу і його вважають передлейкозним станом [Greenberg et al, 1997; Oguma et al, 1997; Lemez et al, 2000; Picard et al, 2001].

При мієлодиспластичному синдромі більш детально вивчені зміни структури і розвитку еритроцитарної та лейкоцитарної ліній гемопоезу. Вивчається ріст цих клітин у культурі тканин, виявлена затримка (і навіть блокування) їх розвитку при даному стані гемопоезу [Билько, 1998; Drunning, Mckenna, 1994; Sawada et al, 1995]. При мієлодиспластичному синдромі виявлено збільшення кількості гемопоетичних клітин в стадії апоптозу, що пов'язують з неспроможністю їх до кінцевого диференціювання і, як наслідок, зниження кількості клітин у крові [Ража и соавт., 1999; Anzai et al, 1997; Delforge et al, 2001; Kawabata et al, 1996]. Останнє питання є дискусійним і до кінця не вирішеним, оскільки є протилежні дані відносно резистентності клітин кісткового мозку і крові до індукції апоптозу [Horikawa et al, 1997; Yoshida et al, 1997].

Зміни в мегакаріоцитарному ростку кровотворення при мієлодиспластичному синдромі вивчені недостатньо тому, що, по-перше, кількість мегакаріоцитів в кістковому мозку значно менша, ніж клітин-попередників лейкоцитів та еритроцитів (мієлокаріоцитів нараховується 44000-190000, а мегакаріоцитів - 50 - 150 клітин в 1 мкл кісткового мозку) [Коленкин, Михеева, 1999; Колосков, 1995; Ронин, 1992]. По-друге, до середини 90-х років минулого сторіччя був невідомий фактор росту мегакаріоцитів - тромбопоетин, що перешкоджало вивченню механізмів росту та розвитку цих клітин в культурі тканин. По-третє, рівень тромбопоетину в плазмі крові при мієлодиспластичному синдромі був невідомий і не з'ясований зв'язок даного фактору росту з розвитком мегакаріоцитів. Синтез тромбопоетину в 1994 році п'ятьма незалежними групами дослідників сприяв значному збільшенню експериментальних робіт по вивченню мегакаріоцитопоезу як в нормі, так і при різних патологічних станах [Kuter, 1996; Hou et al, 1998; Hoffman et al, 1999; Wendling, 1999]. Але детальний аналіз морфології мегакаріоцитів, їх ступеня дозрівання і функціональної активності цих клітин в кістковому мозку залишаються недостатньо вивченими. Крім того, в доступній нам літературі немає робіт, які б пов'язували особливості структури мегакаріоцитів з функціональною активністю їх нащадків - тромбоцитів крові та активністю мембранозв'язаних ферментів цих клітин, які беруть участь в їх диференціюванні та функціонуванні.

Враховуючи відсутність детального аналізу структури та функціональної активності мегакаріоцитів в залежності від ступеня дозрівання при мієлодиспластичному синдромі, актуальність вивчення морфологічних і цитохімічних характеристик розвитку мегакаріоцитів, ролі ліпідного матриксу мембран та мембранозв'язаних ферментів в функціонуванні тромбоцитів та розвитку мегакаріоцитів при мієлодиспластичному синдромі не викликає сумнівів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках науково-дослідної роботи Київського національного університету імені Тараса Шевченка №97097 "Дослідження первинних механізмів зв'язування пептидних гормонів з мембранами різного ступеня організації" (№ держреєстрації 0197U003105) та науково-дослідницьких тем Наукового центру радіаційної медицини №17/11Н-99.03 "Вивчити особливості перебігу та лікування різних форм мієлодиспластичного синдрому та лейкемій серед осіб, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС" і №327 “Вивчити механізми трансформації мієлодиспластичного синдрому в лейкемію у осіб, які постраждали внаслідок аварії на Чорнобильській АЕС, у віддалений період" (№ держреєстрації 0101U001450).

Мета і задачі досліджень. Метою роботи є визначення ролі морфофункціональних змін мегакаріоцитів різного ступеня зрілості у порушенні тромбоцитопоезу і ліпідного матриксу мембран та мембранозв'язаних ферментів в функціонуванні тромбоцитів в нормі та при мієлодиспластичному синдромі.

Задачі дослідження:

1. Вивчити структуру, ступінь дозрівання і функціональну активність мегакаріоцитів в нормі та при мієлодиспластичному синдромі.

2. Визначити вміст кислої фосфатази, неспецифічної естарази і глікогену в мегакаріоцитах і тромбоцитах в нормі та при мієлодиспластичному синдромі.

3. Вивчити функціональну активність тромбоцитів крові в нормі та при мієлодиспластичному синдромі.

4. Дослідити ліпідний склад мембран і роль мембранозв'язаних Са²⁺- і Na⁺,K⁺-АТФаз в забезпеченні функцій тромбоцитів.

5. Визначити найбільш характерні морфофункціональні зміни мегакаріоцитів і тромбоцитів, які можуть бути істотними критеріями при діагностиці мієлодиспластичного синдрому.

Об'єкт дослідження - механізми порушення мегакаріоцитопоезу при мієлодиспластичному синдромі на клітинному та мембранному рівнях.

Предмет дослідження - структура та функціональний стан мегакаріоцитів кісткового мозку і тромбоцитів крові в нормі та при мієлодиспластичному синдромі.

Методи дослідження - цитологічні та цитохімічні методи досліджень мегакаріоцитів кісткового мозку та тромбоцитів крові, біохімічні методи досліджень агрегації тромбоцитів, активності мембранозв'язаних ферментів, ліпідного складу мембран.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше на основі аналізу морфологічних та функціональних характеристик мегакаріоцитів кісткового мозку з урахуванням ступеня їх диференціювання встановлено зростання кількості незрілих базофільних мегакаріоцитів, які утворюють тромбоцити, що супроводжується зменшенням кількості зрілих функціонально активних поліхроматофільних та збільшенням кількості старіючих оксифільних мегакаріоцитів при мієлодиспластичному синдромі. Показано зменшення вмісту глікогену, кислої фосфатази та неспецифічної естерази в мегакаріоцитах та тромбоцитах при мієлодиспластичному синдромі.

Вперше виявлена роль мембранозв'язаних ферментів тромбоцитів в порушенні функцій цих клітин при мієлодиспластичному синдромі. Зниження Са²⁺-АТФазної активності сумарної фракції мембран тромбоцитів свідчить про зменшення накопичення іонів Са²⁺ в ендоплазматичних пулах, що спричинює зниження відповіді тромбоцитів на дію активуючих стимулів. Низька Са²⁺-АТФазна активність мембран тромбоцитів свідчить про зниження аналогічної активності в мегакаріоцитах і є однією з причин порушення Са²⁺-залежного диференціювання цих клітин, появи мікромегакаріоцитів, гіпосегментованих мегакаріоцитів і клітин з низьким вмістом глікогену, неспецифічної естерази та кислої фосфатази. Виявлене в наших дослідженнях підвищення Na⁺-K⁺-АТФазної активності мембран тромбоцитів свідчить про їх утворення з незрілих мегакаріоцитів, оскільки в останніх відбуваються активні Na⁺-залежні транспортні процеси глюкози. Виявлені зміни активності мембранозв'язаних ферментів тромбоцитів дають наукове обгрунтування причини зниження їх функціональної активності і нездатності до кінцевого диференціювання мегакаріоцитів кісткового мозку.

Практичне значення одержаних результатів. Виявлені морфофункціональні особливості мегакаріоцитів кісткового мозку та тромбоцитів крові при мієлодиспластичному синдромі можуть бути використані як істотні критерії при діагностиці даної хвороби. Важливість цих критеріїв обумовлена існуючими труднощами встановлення даного діагнозу. мегакаріоцит мієлодиспластичний синдром тромбоцит

Результати дисертації впроваджені в навчальний процес біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка при проведенні практичних занять за спецкурсами "Цитохімія" і "Гематологія" на кафедрі цитології, гістології і біології розвитку.

Особистий внесок здобувача полягає у плануванні та виконанні експериментальних досліджень, підборі та обробці даних літератури, одержанні і узагальненні результатів досліджень, формулюванні основних положень дисертаційної роботи та висновків (за участю наукових керівників), в оформленні дисертації.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертаційної работи були представлені на 8 наукових формумах: VІ студентській науково-практичній конференції МІ УАНМ (Київ, 1999); ІV з'їзді гематологів та трасфузіологів України (Київ, 2001); Конференції молодих вчених НЦРМ АМН України (Київ, 2001); 3-ій Міжнародній конференції "Медичні наслідки Чорнобильської катастрофи: 15-річний досвід досліджень" (Київ, 2001); Всеукраїнській науковій конференції "Актуальні проблеми гастроентерології" (Київ, 2001); науково-практичній конференції з нагоди 15-річчя створення відділу клінічної імунології Наукового центру радіаційної медицини АМН України (Київ, 2002); 7-му міжнародному форумі Європейської Гематологічної Асоціації (Флоренція, Італія, 2002); науково-практичній конференції "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (Санкт-Петербург, 2002).

Публікації. За результатами дисертації опубліковано 3 статті у фахових наукових виданнях та 5 тез доповідей на конференціях і з'їздах.

Структура та обсяг роботи. Дисертація викладена на 137 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, результатів досліджень та їх обговорення, узагальнення результатів досліджень, висновків. Список використаних джерел літератури містить 201 найменування, з них українською та російською мовами - 87, англійською мовою - 114. Робота ілюстрована 39 рисунками і 5 таблицями.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи досліджень

У дослідах використовували аспірат кісткового мозку та тромбоцити крові 16 осіб без захворювань крові (контрольна група) та з мієлодиспластичним синдромом (14 - з рефрактерною анемією, 2 - з рефрактерною анемією з кільцевими сидеробластами, 14 - з некласифікованим варіантом).

Загальну кількість клітин кісткового мозку, які містять ядра (мієлокаріоцитів), підраховували традиційним методом [Меньшиков, 1987]. Загальну кількість мегакаріоцитів підраховували в камері Горяєва і обчислювали за формулою, як викладено в роботі[Ронин, 1992].

Морфологічні дослідження мегакаріоцитів проводили на цитологічних препаратах кісткового мозку. Мазки кісткового мозку готували загальноприйнятим методом та фарбували за методом Романовського-Гімза [Меньшиков, 1987]. Підраховували 50-100 мегакаріоцитів при збільшенні мікроскопа х1000. Мегакаріоцити поділяли на такі групи: 1) за ступенем зрілості: мегакаріобласти, промегакаріоцити, базофільні, поліхроматофільні, оксифільні (за ступенем спорідненості до кислих та основних барвників) [Ронин, 1992]; 2) мікромегакаріоцити (клітини з 1-2-сегментованим ядром і розмірами клітини не більше 30 мкм), диспластичні мегакаріоцити (1-сегментоване ядро, розміри клітини більше 30 мкм), гіперсегментовані мегакаріоцити (8 і більше сегментів ядра), мегакаріоцити з фрагментацією ядра (сегменти ядра, які з'єднані тоненьким містком ядерного матеріалу), мегакаріоцити з повною фрагментацією ядра (сегменти ядра не з'єднані між собою) [Колосков и соавт., 1997]. Підраховували мегакаріоцити, які утворюють тромбоцити (функціонуючі мегакаріоцити), в залежності від ступеня зрілості клітин. На 50 мегакаріоцитів підраховували кількість "вільних" ядер цих клітин.

Морфологічні дослідження тромбоцитів проводили на цитологічних препаратах крові. У 100 тромбоцитах підраховували кількість азурофільних гранул, обчислювали відсоток незрілих базофільних тромбоцитів, встановлювали розміри тромбоцитів [Коробова и соавт., 2000].

Вміст кислої фосфатази вивчали за методом Goldberg and Barka, вміст глікогену - McManus та Hotchkiss, вміст -нафтилацетат естерази (неспецифічної естерази) - Leffler [Меньшиков, 1987]. Продукт реакції підраховували в 50 мегакаріоцитах кісткового мозку та 100 тромбоцитах. Клітини поділяли на три групи: з низьким вмістом продукту реакції, з середнім вмістом продукту реакції, з високим вмістом продукту реакції. Середній цитохімічний коефіцієнт визначали за методом Kaplow [Меньшиков, 1987].

Функціональну активність тромбоцитів вивчали кількісним методом з застосуванням ФЕК за зміною коефіцієнта світлопропускання (Т, %) збагаченої тромбоцитами плазми до та після внесення індукторів агрегації AДФ (0,2 мМ) або колагену (0,2%) [Берковский и соавт., 1999].

Сумарну фракцію мембран тромбоцитів виділяли за методом [Алмазов и соавт., 1988, Гуревич и соавт., 1990]. Са²⁺-AТФазну активність мембран тромбоцитів вивчали як викладено в роботах [Рыбальченко, 1988; Enouf et al, 1984], Na⁺,K⁺-AТФазну - у відповідності з роботами [Рыбальченко, 1988; Mazzanti et al, 1997]. Ліпідний склад мембран вивчали методом тонкошарової хроматографії [Весельський та співавт., 2001; Ростовцев, Резник, 1982].

Статистичну обробку даних проводили з використанням критерію Стьюдента за допомогою сучасної комп'ютерної техніки. Різницю між контрольною і дослідною групами вважали достовірною при p<0,05 [Гланц, 1999].

Результати досліджень та їх обговорення

Кількісний аналіз мієлокаріоцитів і мегакаріоцитів в кістковому мозку та тромбоцитів крові. Результати досліджень показали, що при мієлодиспластичному синдромі в кістковому мозку кількість мієлокаріоцитів не відрізняється від контрольних показників, що узгоджується з даними літератури [Глузман и соавт., 2000; Beutler et al, 1995; Drunning, Mckenna, 1994]. Загальна кількість мегакаріоцитів на 20% нижча в групі з мієлодиспластичним синдромом, але вірогідно не відрізняється від контрольних значень; кількість тромбоцитів в крові знижена на 58% (p<0,001). Ці результати свідчать, що істотне зменшення кількості тромбоцитів в крові не є наслідком тенденції до зниження кількості мегакаріоцитів в кістковому мозку. Для з'ясування можливих причин зниження кількості тромбоцитів крові при мієлодиспластичному синдромі нами проведений цитологічний аналіз мегакаріоцитів кісткового мозку.

Морфологічна та функціональна характеристика мегакаріоцитів. В кістковому мозку осіб з мієлодиспластичним синдромом виявлено збільшення кількості незрілих форм мегакаріоцитів: мегакаріобластів, промегакаріоцитів та базофільних мегакаріоцитів. Дані зміни відбуваються при зменшенні кількості поліхроматофільних мегакаріоцитів, які є найбільшою популяцією клітин в нормі. Також виявлено збільшення кількості оксифільних клітин (рис.1). Оксифільні мегакаріоцити є "старіючою" популяцією клітин. Вони мають низьку функціональну активність, тобто майже не утворюють тромбоцитів (рис.2). Разом із збільшенням кількості оксифільних клітин підвищується вміст "вільних" ядер мегакаріоцитів при мієлодиспластичному синдромі, що свідчить про підсилений розпад цих клітин. Можливо, збільшення кількості оксифільних мегакаріоцитів і "вільних" ядер мегакаріоцитів є морфологічною ознакою залучення мегакаріоцитів до апоптозу [Thiele et al.,1997].

При дослідженні вищевказаних форм мегакаріоцитів в підгрупах з рефрактерною анемією, рефрактерною анемією з кільцевими сидеробластами та некласифікованим варіантом виявлені односпрямовані зміни, що дає можливість досліджувати групу з мієлодиспластичним синдромом без розподілу за підгрупами.

Таким чином, збільшення кількості незрілих мегакаріоцитів при мієлодиспластичному синдромі відображає стимуляцію мегакаріоцитарної ланки гемопоезу. Підвищення кількості незрілих мегакаріоцитів і "старіючих" клітин при зменшенні кількості поліхроматофільних мегакаріоцитів свідчать про скорочення часу життя мегакаріоцитів в кістковому мозку.

Дослідження кількості мегакаріоцитів, які утворюють тромбоцити (функціонуючі мегакаріоцити), показало, що в кістковому мозку в контрольній групі (рис.2) 57,02,2% клітин утворюють тромбоцити. Наші дані не співпадають з результатами досліджень Cramer з співавт. [1997] в культурі клітин, які свідчать про функціональну активність 30% мегакаріоцитів. Це пояснюється різними умовами дослідження мегакаріоцитопоезу та тромбоцитопоезу.

В групі з мієлодиспластичним синдромом кількість клітин, що утворюють тромбоцити, суттєво не відрізняється від контрольних показників (52,52,3%) (рис.2). Кількість функціонуючих мегакаріоцитів в підгрупах мієлодиспластичного синдрому також суттєво не відрізняється. Зниження кількості тромбоцитів в крові можна було б пов'язати зі зменшенням кількості функціонуючих мегакаріоцитів, але дане припущення не підтверджується.

При вивченні функціональної активності мегакаріоцитів в залежності від ступеня зрілості клітин виявлено, що в групі з мієлодиспластичним синдромом збільшується кількість функціонуючих базофільних мегакаріоцитів, які є незрілими клітинами (рис.2). В базофільних мегакаріоцитах відбуваються інтенсивні синтетичні процеси, завдяки яким збільшується об'єм цитоплазми, накопичуються ферменти та глікоген, які необхідні для утворення тромбоцитів.

Рис.2. Кількість функціонуючих мегакаріоцитів в залежності від ступеня зрілості клітин в контролі та при мієлодиспластичному синдромі

Утворення тромбоцитів такими незрілими клітинами призводить до формування "неповноцінних" пластинок. Збільшення кількості функціонуючих базофільних мегакаріоцитів також свідчить про стимуляцію і "напруження" в мегакаріоцитарній ланці гемопоезу. Одночасно відбувається зменшення кількості функціонуючих поліхроматофільних мегакаріоцитів, які є найбільшою функціонально активною популяцією клітин в контрольній групі (рис.2). Зменшення кількості зрілих і збільшення кількості незрілих функціонуючих клітин також може бути причиною зменшення продукції тромбоцитів, що і призводить до тромбоцитопенії в крові.

Дослідження розподілу мегакаріоцитів за кількістю сегментів ядра свідчить, що в контрольній групі найбільшою популяцією клітин є мегакаріоцити з 4-7 сегментами ядра. Клітини з несегментованим ядром є мегакаріобластами. На стадії промегакаріоцитів відбувається збільшення кількості сегментів ядра від 2 до 8. В контрольній групі зрілих мегакаріоцитів з одно- чи дво-сегментованими ядрами не виявлено. Але зрілі мегакаріоцити з 3 сегментами ядра зустрічаються в контрольній групі, хоча кількість їх незначна (рис.3).

В групі з мієлодиспластичним синдромом з'являються зрілі (поліхроматофльні та оксифільні) мегакаріоцити з 1-сегментованим ядром та збільшується кількість клітин з 2-сегментованими ядрами (рис.3). Кількість клітин з 3-ма сегментами ядра в двох групах вірогідно не відрізняється, але в підгрупі з рефрактерною анемією з кільцевими сидеробластами вірогідно зростає (p<0,05). Збільшення кількості гіпосегментованих мегакаріоцитів відбувається за рахунок зменшення кількості мегакаріоцитів з 4-7 сегментами ядра, які є домінуючою популяцією клітин в контрольній групі.

Кількість гіперсегментованих клітин (рис.3), які мають 8 та більше сегментів ядра, в контрольній і дослідній групах не відрізняється. Гіперсегментовані мегакаріоцити вважають високоплоїдними найбільш функціонально активними клітинами [Колосков и соавт., 1994, 1997; Arnold et al, 1997]. Тому, збільшення кількості таких клітин спрямоване на утворення великої кількості тромбоцитів для покриття дефіциту останніх. Хоча при мієлодиспластичному синдромі рівень тромбопоетину в крові високий [Zwerzina et al, 1998; Hellstrom-Linberg et al, 1999; Hoffman et al, 1999], мегакаріоцити кісткового мозку не здатні до адекватної відповіді на даний фактор диференціювання і тому не спостерігається збільшення кількості мегакаріоцитів високої плоїдності.

Рис.3. Розподіл мегакаріоцитів за кількістю сегментів ядра в контролі та при мієлодиспластичному синдромі

Зміна кількості гіпосегментованих мегакаріоцитів може бути наслідком двох процесів. По-перше, такі клітини можуть утворюватись внаслідок скорочення часу диференціювання мегакаріоцитів. На користь такого припущення свідчить збільшення мегакаріоцитів на ранніх стадіях дозрівання, вільних ядер та оксифільних мегакаріоцитів при зменшенні поліхроматофільних клітин, що є наслідком скорочення терміну життя і підсиленого розпаду. Це, в свою чергу, шляхом зворотнього зв'язку, прискорює диференціювання незрілих мегакаріоцитів для покриття дефіциту клітин, оскільки суттєвого зменшення кількості мегакаріоцитів нами не виявлено.

По-друге, поява гіпосегментованих мегакаріоцитів може бути наслідком порушення диференціювання стовбурових клітин, що характерно для передлейкозних станів та лейкозів [Sawada et al, 1995; Hoffman et al, 1999, 2000]. На користь цього свідчать результати досліджень росту мегакаріоцитів в культурі клітин при дії тромбопоетину: при мієлодиспластичному синдромі кількість мегакаріоцитарних колоній та їх розміри зменшені [Hoffman et al, 1999, 2000].

Дослідження мегакаріоцитів з фрагментацією ядер показало, що кількість клітин з частковою фрагментацією ядер (при якій сегменти ядра пов'язані тоненьким містком ядерного матеріалу) збільшується в групі з мієлодиспластичним синдромом. Також з'являються клітини, в яких один або всі сегменти ядра не з'єднані між собою (клітини з повною фрагментацією ядер). Виділення нами такої окремої групи мегакаріоцитів пов'язано з тим, що фрагментація ядер є ознакою старіючих клітин і, можливо, є морфологічною ознакою залучених до апоптозу клітин.

При мієлодиспластичному синдромі 10% мегакаріоцитів є мікромегакаріоцитами та 8,5% - диспластичними мегакаріоцитами. В контрольній групі таких клітин не виявлено. Наші дані співпадають з результатами інших досліджень [Савва и соавт., 2001; Greenberg et al, 1997; Oguma et al, 1997]. Поява таких аномальних мегакаріоцитів є діагностичною ознакою мієлодиспластичного синдрому, але причина їх утворення залишається не з'ясованою. Ймовірно, такі клітини з'являються внаслідок порушення диференціювання мегакаріоцитів.

Цитохімічна характеристика мегакаріоцитів кісткового мозку. Дослідження вмісту ферментів у мегакаріоцитах кісткового мозку за допомогою цитохімічних методів в нормі та при патологічних станах малочисельні. Такі дані дають уявлення про ступінь порушення мегакаріоцитопоезу, про спроможність клітин накопичувати глікоген, кислу фосфатазу та неспецифічну естеразу.

За даними середнього цитохімічного коефіцієнту в мегакаріоцитах кісткового мозку при мієлодиспластичному синдромі виявлено зниження вмісту глікогену та неспецифічної естерази. Вміст кислої фосфатази суттєво не змінювався. Але вивчення розподілу клітин за вмістом ферменту показало, що в групі з мієлодиспластичним синдромом вірогідно збільшується кількість мегакаріоцитів з низьким вмістом кислої фосфатази (p<0,05) і знижується - з середнім вмістом (p<0,01). Тенденція до збільшення клітин з високим вмістом ферменту, що, ймовірно, свідчить про залучення клітин до апоптозу [Вашкинель, 1992], "приховує" зниження кислої фосфатази в мегакаріоцитах за показником середнього цитохімічного коефіцієнту. Зменшення вмісту глікогену, неспецифічної естерази і кислої фосфатази в мегакаріоцитах при мієлодиспластичному синдромі свідчить про низьку синтетичну активність цих клітин. Це підтверджується результатами досліджень про низьку активність ядерцевих організаторів мегакаріоцитів при мієлодиспластичному синдромі [Колосков и соавт., 1994, 1997; Mamaev, 1997].

Морфологічна та цитохімічна характеристика тромбоцитів. Для визначення, до яких змін тромбоцитів призводять виявлені порушення в структурі мегакаріоцитів кісткового мозку, були проведені морфологічні та цитохімічні дослідження тромбоцитів крові.

В контрольній групі найбільшу популяцію тромбоцитів крові складають зрілі клітини, які містять 5-8 азурофільних гранул. Незрілі тромбоцити в середньому складають 10% клітин, а 4% - не містять азурофільних гранул. Останні вважають формами стимуляції ("подразнення") мегакаріоцитарної ланки гемопоезу [Коробова и соавт., 2000]. В групі з мієлодиспластичним синдромом збільшується кількість незрілих форм (клітин з базофільною цитоплазмою), тромбоцитів без зернистості та з малою кількістю гранул (1-4 гранули). Ці зміни відбуваються одночасно із зменшенням кількості клітин з 5-8 гранулами. Зміни в будові тромбоцитів крові відповідають змінам, які виявлені в мегакаріоцитах кісткового мозку. Збільшення кількості незрілих форм і тромбоцитів із зменшеною кількістю гранул пов'язане зі збільшенням кількості гіпосегментованих мегакаріоцитів і незрілих базофільних мегакаріоцитів, які утворюють тромбоцити.

Вивчення розподілу тромбоцитів за їх розмірами показало, що в нормі найбільшою популяцією клітин є тромбоцити діаметром 3 мкм. Тромбоцити розмірами 2 мкм в середньому складають 25%. В групі з мієлодиспластичним синдромом відмічена тенденція до збільшення кількості великих тромбоцитів (4 мкм) та збільшення кількості гігантських форм (p<0,01). При цьому зменшується кількість тромбоцитів діаметром 3 мкм (p<0,01). Зростання діаметру тромбоцитів свідчить про стимуляцію мегакаріоцитарної ланки гемопоезу [Коробова и соавт., 2000]. Така активація мегакаріоцитопоезу, ймовірно, пов'язана з тим, що кількість тромбоцитів в крові зменшена і спрямована на покриття дефіциту останніх. Поява гігантських форм тромбоцитів обумовлена порушеннями утворення їх з мегакаріоцитів. Результати цитохімічних досліджень показали, що в тромбоцитах при мієлодиспластичному синдромі зменшується вміст глікогену та кислої фосфатази. Зменшення вмісту глікогену виявлено нами в мегакаріоцитах кісткового мозку. Тобто мегакаріоцити утворюють тромбоцити з дефіцитом запасної енергетичної речовини, що призводить до "енергетичного голоду" і неспроможності повноцінно виконувати свої функції. Вивчення вмісту кислої фосфатази показало, що в нормі найбільшою популяцією клітин є тромбоцити, які містять 3-5 та більше гранул з кислою фосфатазою. При мієлодиспластичному синдромі вміст ферменту в тромбоцитах зменшується.

Зменшення вмісту глікогену та кислої фосфатази в тромбоцитах при мієлодиспластичному синдромі пов'язане з утворенням їх з незрілих мегакаріоцитів та з гіпосегментованих мегакаріоцитів, які мають низький синтетичний потенціал. Вищевказані зміни в тромбоцитах свідчать про зниження їх функціональної активності і разом з низькою кількістю тромбоцитів в крові спричиняють підвищену схильність до кровотеч у осіб з даним захворюванням.

Функціональна характеристика тромбоцитів. Cумарний індекс агрегації тромбоцитів після 5 хвилин дії індукторів агрегації AДФ складає 71,02,8%, колагену - 65,73,4%, а в групі з мієлодиспластичним синдромом 48,51,1% і 44,51,3%, відповідно. Тобто, індекс агрегації тромбоцитів хворих знижується в порівнянні з індексом агрегації контрольної групи на 23% та 21% (p<0,05), відповідно. Дослідження агрегації тромбоцитів протягом 5 хвилин показало, що за першу хвилину дії AДФ, як індуктора агрегації ступінь агрегації тромбоцитів в контрольній і дослідній групах істотно не відрізняється, а починаючи з 2-ї хв в групі з мієлодиспластичним синдромом сумарний індекс агрегації є меншим в порівнянні з контролем, і ця різниця зберігається протягом 5-и хвилин.

Аналогічні зміни функціональних властивостей тромбоцитів при мієлодиспластичному синдромі виявлені і іншими авторами [Blockmans et al, 1995; Gordon et al, 1995; Hicsonmez et al, 1995; Mittelman, Zeidman, 2000].

Таким чином, при мієлодиспластичному синдромі виявлено зменшення агрегації тромбоцитів при дії двох різних індукторів цього процесу: AДФ та колагену. Виходячи з того, що процес активації тромбоцитів прямо пов'язаний з концентрацією іонів Са²⁺ в цитоплазмі [Сергеев и соавт., 1997; Dean et al, 1997; Furukawa et al, 1997; Kovacs et al, 1997; Wolosker et al, 1997], та змінами концентрацій моновалентних катіонів [Алмазов и соавт., 1990; Шитикова, 2000] можна припустити, що зменшення відповіді тромбоцитів хворих на дію індукторів агрегації пов'язане з активністю мембранних іон-транспортних АТФаз, основними серед яких є Са²⁺- та Na⁺,K⁺-AТФази.

Са²⁺- та Na⁺,K⁺-AТФазні активності мембран тромбоцитів. У осіб з мієлодиспластичним синдромом Na⁺,K⁺-AТФазна активність сумарної фракції мембран тромбоцитів переважає аналогічну активність контрольної групи майже вдвічі, а Са²⁺-AТФазна активність зменшується в 1,8 рази. Підвищення Na⁺,K⁺-AТФазної активності може бути свідченням утворення тромбоцитів з незрілих мегакаріоцитів, оскільки в таких клітинах відбувається активний Na⁺-залежний транспорт глюкози. Na⁺,K⁺-AТФаза відновлює рівень Na⁺ в цитозолі. Не виключено також, що підвищений градієнт іонів Na⁺ призводить до зниження концентрації іонів Са²⁺ в цитозолі (за рахунок Na-Ca-антипорту), що є однією з причин зменшення агрегації тромбоцитів.

Зниження Са²⁺-AТФазної активності сумарної фракції мембран тромбоцитів свідчить про зменшення накопичення іонів Са²⁺ в цистернах ендоплазматичного ретикулуму. Це, в свою чергу, веде до низького рівня Са²⁺ в цитозолі тромбоцитів при дії активуючих агентів (наприклад, АДФ та колагену), і, як наслідок, до зниження їх агрегації. Зниження Са²⁺-AТФазної активності мембран тромбоцитів може бути результатом їх утворення з незрілих мегакаріоцитів, як це було продемонстровано в наших морфологічних дослідженнях, а також обумовлено змінами ліпідного складу мембран.

Так, при мієлодиспластичному синдромі в сумарній фракції мембран тромбоцитів збільшується вміст фосфоліпідів на 28%, холестеролу на 29% (p<0,05) та його ефірів на 40% (p<0,05), що сприяє ущільненню ліпідного бішару, яке характерне для мембран з низькою ферментативною активністю [Рибальченко та співавт., 1988, 1997]. Також вірогідно збільшується вміст вільних жирних кислот на 27% (p<0,05) та лізофосфатидилхоліну (p<0,05). Ці зміни свідчать про порушення обміну ліпідів та зміну окислювальних процесів мембран тромбоцитів при мієлодиспластичному синдромі.

Таким чином, зниження Са²⁺-AТФазної активності, підвищення Na⁺,K⁺-AТФазної активності тромбоцитарних мембран при мієлодиспластичному синдромі свідчать про зниження рівня Са²⁺ в цитозолі, наслідком чого є зменшення агрегації тромбоцитів. Виявлені зміни активності мембранозв'язаних ферментів можуть бути однією з причин утворення аномальних мегакаріоцитів.

ВИСНОВКИ

1. Наявність у кістковому мозку диспластичних мегакаріоцитів, мікромегакаріоцитів, збільшення кількості гіпосегментованих клітин, незрілих базофільних мегакаріоцитів, старіючих оксифільних мегакаріоцитів, клітин з фрагментацією ядра, у разі зменшення кількості зрілих поліхроматофільних мегакаріоцитів при мієлодиспластичному синдромі призводить до зменшення продукції та до утворення функціонально неповноцінних тромбоцитів. Про це свідчать і зміни Ca²⁺-АТФазної і Na⁺,K⁺-АТФазної активностей мембран тромбоцитів.

2. В мегакаріоцитах кісткового мозку та тромбоцитах крові при мієлодиспластичному синдромі зменшується кількість глікогену, кислої фосфатази і неспецифічної естерази.

3. Найбільшою популяцією тромбоцитів крові є зрілі клітини з 5-8 азурофільними гранулами в цитоплазмі. При мієлодиспластичному синдромі збільшується кількість незрілих тромбоцитів із зниженою функціональною активністю, про що свідчить зменшення кількості азурофільних гранул та гальмування агрегації тромбоцитів при активації процесу двома незалежними індукторами: АДФ та колагеном.

4. В ліпідній фракції мембран тромбоцитів при мієлодиспластичному синдромі виявлено збільшення вмісту холестеролу і його ефірів, жирних кислот і лізофосфатидилхоліну, що свідчить про зміни молекулярної організації мембран.

5. Зниження в 1,8 рази Ca²⁺-АТФазної та підвищення в 2 рази Na⁺,K⁺-АТФазної активностей сумарної фракції мембран тромбоцитів при мієлодиспластичному синдромі відображає активність мембранних транспортних АТФаз в незрілих мегакаріоцитах, з яких утворюються тромбоцити, і свідчить про утворення аномальних мегакаріоцитів. Низький рівень Ca²⁺-АТФазної активності мембран свідчить про зниження вмісту Ca²⁺ у внутриклітинних депо, що є причиною гальмування агрегації тромбоцитів.

6. Зростання кількості незрілих базофільних мегакаріоцитів, які утворюють тромбоцити, при мієлодиспластичному синдромі є характерною ознакою порушення тромбоцитопоезу і може бути істотним критерієм при діагностиці мієлодиспластичного синдрому.

СПИСОК опублікованих праць за темою дисертації

1. Бєлінська І.В., Клименко В.І., Радчук З.В., Рибальченко В.К. Морфологічна характеристика мегакаріоцитів кісткового мозку при мієлодиспластичних синдромах // Вісник Київського національного університету. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. - 2001. - Вип. 7 . - С. 34 - 37.

2. Белинская И.В., Рыбальченко В.К., Клименко В.И., Дягиль И.С. Агрегация тромбоцитов и мегакариоцитопоэз при миелодиспластическом синдроме // Проблеми екологічної та медичної генетики і клінічної імунології. Зб. наук. пр. - Київ-Луганськ-Харків. - 2001. - Вип.7(39). - С. 241-249.

3. Бєлінська І.В., Клименко В.І., Рибальченко В.К. Цитохімічна характеристика мегакаріоцитів в нормі та при мієлодиспластичному синдромі // Вісник Київського національного університету. Проблеми регуляції фізіологічних функцій. - 2002. - Вип. 8 . - С.29-32.

4. Belinskaja I., Klymenko V., Dyagil I., Rybalchenko V. Morphology of bone marrow megakaryocytes and platelet function in myelodysplastic syndromes // 3-rd International Conference "Health Effects of the Chernobyl Accident: results of 15-year follow-up studies", Kiev, Ukrain. - Int. Journ. Rad. Med. - 2001. - V.3, N1-2.- P.17.

5. Бєлінська І.В., Клименко В.І., Рибальченко В.К. Морфологічна характеристика мегакаріоцитів кіствого мозку при мієлодиспластичному синдромі // 30 Міжвідомчий збірник "Гематологія і переливання крові", ІУ з'їзд гематологів та трасфузіологів України, 2001. - Київ: "Нора-прінт" - 2001. - С.34.

6. Островська Г.В., Ковальчук Т.О., Рибальченко Т.В., Белінська І.В., Філінська О.М., Яблонська С.В., Рибальченко В.К. Порівняльна характеристика Mg²⁺,Ca²⁺-АТФазних активностей плазматичних мембран міоцитів тонкого кишечнику, гепатоцитів і тромбоцитів // Тези доп. Всеукраїнської наук. конф. “Актуальні проблеми гастроентерології”. - Київ, 2001. - С.33.

7. Bebeshko V.G., Klymenko V.I., Bazyka D.A., Dyagil I.S., Soloko V.V., Kadnikova T.V., Belinskaya I.V. Features of myelodysplastic syndrome - unklassified in the liquidators of the chornobyl accident consequences // Abstracts for the 7-th meeting of the European Hematology Association, Florence, Italy, 2002. - The Hematology Journal, Abstract Book. - 2002. - P.371-372.

8. Клименко В.И., Базыка Д.А., Любарец Т.Ф., Ильенко И.Н., Белинская И.В. Морфологическая и иммунологическая характеристика пациентов с миелодиспластическим синдромом, пострадавших вследствие аварии на ЧАЭС // Материалы Российской научно-практич. конф. "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии". - Санкт-Петербург. - 2002. - С. 118-119.

Размещено на Allbest.ru