Аналіз молекулярно-генетичного поліморфізму культурної сої

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

УДК 575.174.015.3:633.57

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ПЛР - АНАЛІЗ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧНОГО ПОЛІМОРФІЗМУ КУЛЬТУРНОЇ СОЇ (Glycine max L.)

03.00.26 - молекулярна генетика

БРИК Олександр Федорович

Київ - 2002

Дисертація є рукопис.

Роботу виконано у відділі генної інженерії Селекційно-генетичного Інституту УААН (м. Одеса) (1995-1999) та у відділі молекулярної біології Південного біотехнологічного центру у рослинництві УААН (м. Одеса)

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор, академік УААН Сиволап Юрій Михайлович, Південний біотехнологічний центр у рослинництві УААН, директор.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор, член-кореспондент НАН України

Кунах Віктор Анатолійович,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, завідувач відділу генетики клітинних популяцій;

кандидат біологічних наук

Комарницький Ігор Климентійович,

Інститут клітинної біології і генетичної інженерії НАН України, старший науковий співробітник відділу цитофізіології і клітинної біології.

Провідна установа: Інститут фізіології рослин і генетики НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться “26” березня 2002 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “26” лютого 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

кандидат біологічних наук О.В. Підпала

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

поліморфізм соя генотип ланцюговий

Актуальність теми. Важливим елементом при розробці селекційних програм поліпшення культурної сої є встановлення особливостей її генетичного поліморфізму. Соя, порівняно з багатьма видами сільськогосподарських рослин, має відносно низький рівень генетичної варіабельності, що ускладнює процес селекції. Розробка підходів до диференціації й ідентифікації сортів цієї культури дуже актуальна для генетико-селекційних досліджень і для захисту авторських прав.

Бурхливий розвиток ПЛР-технології сприяв розробці низки варіантів аналізу, що розрізняються характеристикою застосованих праймерів, типом успадковування ампліконів, кількістю одночасно аналізованих локусів та іншими властивостями. Розрізняють спрямовану (із залученням пари праймерів) і ПЛР з одиничними довільними праймерами (ДП-ПЛР). Найбільший інтерес у варіантів першого типу викликає метод SSRP (simple sequence repeats polymorphism). Інший тип ПЛР представлений в основному методами ДП-ПЛР ( arbitrary primed PCR) і ISSR ( inter-simple sequence repeat). Кожен із цих методів простий у використанні та має порівняно високу роздільну здатність. SSR-маркери численні, мають кодомінантний тип успадковування і стабільно відтворювані. ДП-ПЛР-маркери мають нижчий рівень відтворюваності, успадковуються за домінантним типом і становлять полілокусну систему. ISSR - метод має ту ж перевагу, що й ДП-ПЛР (ідентифікація великої кількості ПЛР-маркерів), але є більш відтворюваним, оскільки праймери мають послідовності, цілком зворотно комплементарні матриці. Названі методи на сьогодні є найефективнішими для розподілу селекційного матеріалу, його ідентифікації та реєстрації.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі генної інженерії Селекційно-генетичного інституту УААН (1995-1999 рр.) і в Південному біотехнологічному центрі у рослинництві УААН (2000-2001 рр.) у межах програми НТП УААН “Теоретичні основи селекції та насінництва сільскогосподарських культур” (03.04-МВ/322-97).

Мета і завдання дослідження. Метою цієї роботи було дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму геному культурної сої (Glycine max L.) з використанням ПЛР-аналізу для диференціації, ідентифікації та паспортизації досліджуваного матеріалу.

Відповідно до поставленої мети вирішували такі завдання: 1. Добір праймерів, що детектують поліморфізм досліджуваних сортів сої та оптимізація умов ПЛР. 2. Вивчення молекулярно-генетичного поліморфізму культурної сої за допомогою ДП-ПЛР аналізу з подальшою диференціацією на основі генетичних дистанцій 150 сортів і гібридних форм. 3. Дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму 32 сортів сої різного еколого-географічного походження трьома методами ПЛР-аналізу (ДП-ПЛР, SSRP та ISSR). 4. Порівняльний аналіз дискримінаційного потенціалу використаних методів ПЛР у дослідженні внутрішньовидового поліморфізму сортів культурної сої різного еколого-географічного походження. 5. Розробка методу паспортизації досліджених генотипів сої на основі ДП-ПЛР, SSR- і ISSR- маркерів.

Об'єкт дослідження - геном культурної сої.

Предмет дослідження - молекулярно-генетичний поліморфізм ДНК культурної сої.

Методи дослідження - різновиди полімеразної ланцюгової реакції (ДП-ПЛР, SSRP та ISSR).

Наукова новизна одержаних результатів. Наукова новизна дисертації полягає в розробці ДНК-технології диференціації й ідентифікації генотипів сої, проведенні порівняльного аналізу трьох типів маркерних систем, отриманих різними методами ДНК-профілювання (ДП-ПЛР, SSRР- і ISSR), обґрунтуванні вибору визначеного типу маркерів для вирішення конкретних завдань.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблено систему ПЛР-аналізу генетичного поліморфізму сої, визначено найбільш і найменш генетично віддалені селекційні форми культурної сої конкурсного сортовипробування відділу селекції сої СГІ (найвіддаленіші в генетичному аспекті генотипи рекомендовані для використання при отриманні високогетерозисних комбінацій, а найменш віддалені, що відрізняються за господарсько-цінними ознаками, для поліпшення конкретних ознак). Розроблено принцип ідентифікації генотипів сої.

Особистий внесок здобувача. Експериментальна робота, статистична обробка цифрового матеріалу, написання тексту дисертації та її оформлення виконано здобувачем особисто.

Обговорення та аналіз результатів проведено спільно з науковим керівником.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були повідомлені на Міжнародній конференції “Молекулярно-генетические маркеры растений” (Ялта, 1996 р.); на Міжнародній конференції “Агробіотехнологія рослин та тварин” (Київ, 1997 р.), на Міжнародній конференції “Молекулярная генетика и биотехнология” (Мінськ, 1998 р.), на Міжнародній конференції “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біологічних розробок у генетико-селекційних дослідженнях” (Одеса, 1998 р.); на Міжнародній конференції “Семинар по современным методам селекции растений” (Київ, 1999 р.), на Міжнародній конференції “World Soybean Research Conference VI” (Чикаго, США, 1999 р.), на Міжнародній конференції “Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии” (Москва, 2000 р.).

Публікації. Результати дисертаційної роботи опубліковані в трьох статтях, одному методичному посібнику і тезах шести доповідей.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається з вступу, шести розділів - огляду літератури, матеріалів і методів, результатів і обговорення (у чотирьох частинах), висновків.

Роботу викладено на 127 сторінках. Дисертацію проілюстровано 20 рисунками і 21 таблицею. Список використаної літератури охоплює 104 джерела.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

Матеріали і методи

Використовуваний матеріал. У роботі використано 150 селекційних форм і сортів культурної сої (Glycine max L.) конкурсного сортовипробування відділу селекції сої СГІ. Аналізовані сорти і селекційні форми сої у більшості представлені генотипами, отриманими від схрещування сорту Еванс із L 21 - 22, L 31 - 31, L 40 - 42; сорту Ходсон з L 40 - 42, WC 347; сорту Свіфт із L 21 - 22; M 65 - 217 на L 21 - 22, L 31 - 31; сортів Чайка з Іскра; Білосніжка з Кіровоградська 4; Провар з Веселка. Також представлені сорти: Альтаір, Аркадія одеська, Гея, Красноградська 86, Чарівниця степу, Юг 40, Южанка.

Для дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму сортів культурної сої та їх подальшої паспортизації з колекції відділу селекції сої СГІ отримано 32 сорти з різних еколого-географічних зон: 8 сортів американського походження: Провар, Анока, Капітал, Магна, Амсой, A-100, Блекхок, Ада; 8 сортів далекосхідного походження: Грібовська місцева, Амурська 42, Амурська 111, Амурська 57, Амурська 51, Амурська 321, Амурська 154, Амурська 347; 8 сортів китайського походження: К 2601, Харбінська, К 2441, Ларедо, К 766, К 2408, Тзи-ті 4, К 2406; сорти європейського походження: Ронест 104, Маусерова біла, Ронест 1, Дунайка, К 3-382, КZ-26, TSZ 14, Попельсдорфер.

Виділення рослинної ДНК. ДНК виділяли з етіольованих триденних корінців. Корінець (100 мг) ретельно розтирали в епендорфі скляним товкачиком з 0,5 мл лізуючого буферу (1,4 М NaCl, 20 mМ Na₃EDTA, 100 mМ Tris-HCl p 8.0 (25 C), 2 % CTAB) до повної мацерації тканин. Інкубували на водяній бані протягом 1 години при 60 ⁰С. Депротеїнізацію проводили рівним об'ємом суміші хлороформ-ізоаміловий спирт (24:1). Центрифугували протягом п'яти хвилин у центрифузі Eppendorf 5415 при 12000 об/хв, водяну фазу (не зачіпаючи інтерфази) переносили в інший епендорф. ДНК екстрагували рівним об'ємом ізопропанолу з наступним центрифугуванням протягом п'яти хвилин при 12000 об/хв. Надосадову рідину обережно зливали. Осад промивали 1 мл 70% етанолу. Отриманий осад ДНК розчиняли в 500 мкл розчину TE (10 mМ Tris-HCl pH 8.0, 1 mМ Na₃EDTA) з 1 мкг/мл РНКазою А. Концентрацію ДНК вимірювали на флуориметрі TKO 100 у розчині 1 х TNE (10 mМ Tris-HCl pH 7.4 (25 ⁰C), 100 mМ NaCl, 1mМ Na₃EDTA) з 100 мкг/мл інтеркалюючого барвника Hoechst 33258.

Умови ПЛР, гель-електрофорез, візуалізація ампліконів. Реакційний буфер для ампліфікації методом ДП-ПЛР містив: 50 mМ KCl, 20 mМ трис-HCl, pН 8.4, 3,5 mМ MgCl₂, 0,01 % Tween-20, 0,15 mМ кожного dNTP, 0,2 mkМ праймера, 20 нг ДНК і 1 од. Taq-полімерази. ПЛР проводили при двох різних температурах відпалу залежно від довжини праймера. Для тестування продуктів ампліфікації використовували 2,0 % агарозні гелі. Для реакції з ISSR-праймерами використовували буфер для ДП-ПЛР, що містить 2,5 mМ хлориду магнію. Температура відпалу ISSR-праймерів була 58 ⁰С для праймерів із тринуклеотидним повтором і 55 ⁰С для праймера з динуклеотидним повтором.

продукти ампліфікації розділяли в 1,5 % агарозному гелі. Далі гелі з ДП- і ISSR-ПЛР продуктами забарвлювали бромистим етидієм і фотографували в УФ-світлі на фотоплівку “Мікрат 300”. Реакцію з SSR-праймерами виконували в буфері ідентичному такому для ДП-ПЛР, однак, вміст MgCl₂ варіював від 2,5 до 3,5 mМ. Температура відпалу SSR-праймерів була 52-55 ⁰С. Продукти ампліфікації фракціонували в 10 % ПААГі з 8 М сечовиною , візуалізували - фарбуванням гелів сріблом. Кількість циклів ампліфікації для всіх ПЛР-методів варіювала від 29 до 35. Реакцію ампліфікації проводили на приладах “Терцик” .

Визначення ступеня подібністі даних і побудова дендрограм. Отримані дані зображували у вигляді матриці: присутність чи відсутність у профілях ДНК, однакових за розміром продуктів ампліфікації, розглядали як стан 1 і 0, відповідно. Ступінь подібністі аналізованих генотипів визначали, використовуючи коефіцієнт SM (simple matching) для даних ДП-ПЛР- і ISSR-аналізів і NL (Nei, Li) для даних SSRP-аналізу. Дендрограми, що визначають рівень феногенетичних стосунків між генотипами, будували, використовуючи кластерний аналіз на основі незваженого парно-групового методу з арифметичним усередненням “UPGMA”. Встановлення генетичних дистанцій з використанням коефіцієнтів SM і NL і кластерний аналіз із графічною побудовою дендрограм здійснювали за допомогою комп'ютерної програми “TREES” (Календар, 1994).

Документація та аналіз отриманих даних. Профілі ДНК на гелях реєстрували за допомогою системи відеодокументації “Image Master VDS”. Для обчислення генетичної різноманітності (GD: gene diversity) досліджених сортів методами ДП- ПЛР і ISSR використовували формулу запропоновану для самозапильників (Akkaya, 1992):

GD=1-Sp_i²,

де p_i - частота зустрічальності i-алеля досліджуваного локусу в даній виборці. Цей показник відповідає поняттю “очікувана гетерозиготність” (H_ex) та “індексу поліморфності” (PIC), що використовується для мікросателітів(Anderson et al., 1992; Keim еt al, 1989).

Середній рівень очікуваної гетерозиготності для кожного типу маркерів обчислювали за формулою:

H_av= SH_ex/n_p

Оскільки ДП-ПЛР і ISSR методи полілокусні, а SSRP-аналіз монолокусний, то для їх порівняння найоб'єктивнішим є використання маркерного індексу (MI) (Powell et al, 1996):

MI=E H_av ,

де E - рівень полілокусності, що визначається як добуток числа одночасно аналізованих незалежних ПЛР-локусів по одній доріжці гелю на фракцію поліморфних ПЛР-локусів (співвідношення поліморфних ПЛР-локусів до суми поліморфних і неполіморфних ПЛР-локусів).

Результати досліджень та їх обговорення

Аналіз молекулярно-генетичного поліморфізму сортів і селекційних форм сої

Метою даної роботи було дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму сортів і селекційних форм сої і розподіл їх за рівнем генетичної близькості.

Перший етап дослідження полягав у підборі праймерів, що детектують міжсортовий поліморфізм. з 35 ДП-ПЛР праймерів довжиною від 10 до 24 нуклеотидів, що показали внутрішньовидовий поліморфізм за літературними даними (сиволап и др., 1995), 9 виявили мінливість профілів ДНК на аналізованих сортах сої.

Для перевірки генетичної чистоти вихідного матеріалу в двадцяти індивідуальних проростках кожного з п'яти довільно обраних сортів виділяли ДНК і проводили ампліфікацію з декількома праймерами, що виявляють поліморфізм на досліджуваних сортах сої. Аналізований матеріал є гомогенною популяцією і може бути використаний для визначення генетичних дистанцій і розподілу за допомогою кластерного аналізу за бінарними даними.

Кількість детектованих на гелях смуг - фрагментів ампліфікації ДНК варіювала від 8 до 26 залежно від праймера, а поліморфних - від 2 до 12. Рівень поліморфізму, що виявляється, складав від 18 до 70 %. З 136 детектованих фрагментів ампліфікації 55 були поліморфними, що склало 40 %. Застосування ПЛР-аналізу створило можливість дослідження молекулярно-генетичної внутрішньовидової мінливості сої на такому ж рівні як у ячменю і пшениці.

Успадковування продуктів ампліфікації ДНК із довільними праймерами відбувається переважно за домінантним типом. У нашому матеріалі виявлено кодомінантні ампліфіковані фрагменти. Продукти ампліфікації ДНК сої розміром 1014 і 1108 пар нуклеотидів за допомогою праймера Р57 виявили кодомінантність. В усіх аналізованих зразках був присутній тільки один із цих фрагментів. Частота алелю 1108 п.н. склала p=0,6, а 1014 п.н. р=0,4. За допомогою використаних праймерів виявлено три ПЛР-фрагменти, що були кодомінантними. Це склало 5,6 % від загальної кількості поліморфних ампліконів, що збігається з аналогічним показником літературних даних. Величина t-критерію Стьюдента різниці частот зустрічальності продуктів ампліфікації не вірогідна і не перевищує поріг 1,6, що може свідчити про відсутність добору за даними локусами. Їх можна рекомендувати для використання у феногенетичному аналізі.

За результатами кластерного аналізу за допомогою програми “TRЕЕS” побудовано дендрограми феногенетичних стосунків сортів і селекційних форм сої. Представлені генотипи на трьох типах дендрограм отримані при використанні коефіцієнтів подібністі NLxy, Jxy і SMxy, розподілялися на вісім кластерів і несуттєво розрізнялися за угрупуванням сортів, що входять до їх сполуки. Генетичні дистанції між сортами були відносно невеликі, але достатні для дискримінації. В цілому, дендрограми, отримані в результаті обчислень із застосуванням кожного із трьох індексів подібні, і в даному випадку вибір того чи іншого коефіцієнта подібністі для побудови дендрограм не є принциповим.

Для подальших розрахунків використовували дендрограму, отриману за допомогою коефіцієнта подібності SMxy. Навести дендрограму, що містить 150 сортів одним суцільним масивом, не можливо. Кожен із восьми кластерів, що складають дану дендрограму, позначили літерою латинського алфавіту (A-H). Сорти Южанка, Аркадія одеська, Альтаір, Юг 40, Успіх, Гея, Чарівниця степу, Красноградська 86 знаходилися в кластері А. Форми, що отримані від схрещування сорту Еванс із лініями L 11-41, L 21-22, L 31-31, L 40-42, рівномірно представлені в усіх кластерах, крім кластера Е, а генотипи від схрещування сорту Свіфт і L 21-22 і L 22-23 локалізовані в кластері А. Форми, створені схрещуванням сортів Чайка з Іскра, представлені в кластерах C, D, F, G, H, а Ходсон з L 40-46, WC 347 знаходяться в кластерах A, B, D, E, G. Форми від схрещування М 65-217 з L 21-22, розташувалися в кластерах A, C, D, E, H. Отримані від схрещування сортів Білосніжка і Кіровоградська 4 генотипи знаходилися в кластерах C, F, H.

Визначено найвіддаленіші один від одного сорти з метою залучення їх до подальшої селекційної роботи. Генетично найвіддаленіші генотипи рекомендовано для використання при отриманні високогетерозисних комбінацій, а найменш віддалені, що відрізняються за господарсько-корисними ознаками, для поліпшення за конкретними ознаками.

Сорти сої мають досить складні родоводи. Проведене дослідження виявило відповідність педігрі більшості сортів результатам кластерного аналізу даних генетичних дистанцій між ними.

Детекція генетичної мінливості сортів сої та класифікація генотипічного матеріалу різного еколого-географічного походження

У даній роботі досліджували молекулярно-генетичний поліморфізм сої за допомогою ДП-ПЛР, SSRP і ISSR з метою диференціації та ідентифікації сортів сої різного еколого-географічного походження.

Кількість детектованих ДП-ПЛР-локусів, залежно від праймера, варіювала від 9 до 18, а поліморфних ампліконів від 1 до 14. З огляду на відносно невисокий рівень відтворюваності даного методу, ампліфікацію із довільними праймерами для кожного зразка ДНК проводили не менш, ніж у трьох повторностях. Для аналізу відбирали тільки відтворювані в усіх повторностях продукти ампліфікації. Всього отримано 93 продукти ампліфікації довжиною від 500 до 2000 п.н., з яких 43 були поліморфними. Рівень поліморфізму варіював від 11,11 % до 82,35 %. Значення очікуваної гетерозиготності склали від 0,16 до 0,48.

При ампліфікації з 8 парами праймерів до мікросателітних повторів, кількість алелів на локус, детектованих на досліджуваній вибірці сортів варіювала від 2 до 5. Всього тестовано 25 алелів. Для більшості досліджених локусів детектовано по 3 алеля на локус. Середня кількість алелів на локус становила 3,1. Значення індексу поліморфності (РІС) варіювало від 0,19 до 0,71.

При ампліфікації з 7 ISSR-праймерами показано, що залежно від праймера детектовано від 7 до 31 продукту ампліфікації. Розмір виявлених фрагментів варіював від 300 до 2500 п.н.. Кількість поліморфних смуг в отриманих профілях ДНК складала від 2 до 23 на праймер. Загальна кількість ISSR - локусів, що виявлена даним методом - 130, із яких 81 були поліморфними. Рівень поліморфізму варіював від 28,57% до 76,67% залежно від праймера. Найвищі показники рівня поліморфізму (70,97 % і 76,67 %) спостерігали при використанні праймерів, послідовність яких складалася із тринуклеотидного повтору, а найнижчий показник рівня поліморфізму (28,57 %) виявлявся при ампліфікації з праймером, що містить динуклеотидний повтор. Ці дані трохи відрізняються від результатів, наведених у літературі (Глазко и др, 1999). Значення очікуваної гетерозиготності у наших дослідженнях, отримані при використанні ISSR - методу, варіювали від 0,14 до 0,41. Дана модифікація ПЛР близька до ДП-ПЛР - аналізу. Значною позитивною відмінністю є досить високий рівень відтворюваності отриманих результатів порівняно з останнім. Як відомо, при ДП-ПЛР актуальна проблема відтворюваності отримуваних профілів ДНК. Ампліфікацію з ISSR - праймерами для кожного зразка ДНК проводили тричі, в усіх випадках спостерігали відтворення продуктів ампліфікації.

Загальна кількість ПЛР-локусів, як і кількість поліморфних ПЛР-локусів, що детектуються ДП-ПЛР-методом, значно нижча відповідних значень для результатів, отриманих за допомогою ISSR - аналізу (в обох випадках використовували однакову кількість праймерів). Середнє значення рівня поліморфізму за даними ДП-ПЛР-аналізу складало 45,74 %, а за даними ISSR - аналізу - 62,31 %, що значно (на 16,57 %) вище, ніж аналогічний показник у даних отриманих від проведення ДП-ПЛР - аналізу.

Таблиця 1

Порівняльні характеристики основних показників трьох методів ПЛР (ДП-ПЛР, SSRP, ISSR), що виявляють поліморфізм у досліджених сортів сої

Тип ПЛР	Кількість використаних праймерів	Загальна кількість поліморфних ПЛР-локусів чи алелів	Рівень поліморфізму ( %)	Очікувана гетерозиготність ( Hav )	Маркерний індекс ( MI)
ДП- ПЛР	7	43	45,74	0,33	2,02
SSR	16	25	100,0	0,50	0,50
ISSR	7	81	62,31	0,32	3,69

Одним із найрозповсюджених показників інформативності маркерів, отриманих тим чи іншим ПЛР-методом, є очікувана гетерозиготність (у випадку SSR-аналізу їй відповідає значення індексу поліморфності). Очікувана гетерозиготність показує ймовірність того, що два випадково взяті з популяції генотипи будуть мати різні алелі за даним локусом. Середнє значення індексу поліморфності для SSR - даних - 0,5 (табл. 1). Ці дані трохи нижчі відповідних показників (0,6), що відомі в літературі для сортів сої (Rongwen et al 1995, Maughan et al 1995). Середні значення очікуваної гетерозиготності для ДП ПЛР-даних ( 0,33) і для ISSR - даних ( 0,32) практично збігаються і значно нижчі аналогічного показника ( PIC ) для SSR - даних, як і слід було очікувати, тому що число алелів на SSR- локус не менше двох, а на ДП-ПЛР- і ISSR- локуси тільки два. Однак, таке порівняння виявляється не зовсім коректним: ДП-ПЛР і ISSR методи полілокусні, а SSRP-аналіз монолокусний. Для порівняння даних методів більш показовим є маркерний індекс, що враховує згадані вище особливості даних методів. Значення маркерного індексу для досліджених у даній роботі ПЛР-підходів склали: ДП-ПЛР - 2,02; SSRP - 0,5; ISSR - 3,69. Очевидно, що найменш інформативним є SSR - аналіз, а найінформативнішим ISSR - аналіз.

За результатами ДП-ПЛР-, ISSR- і SSRP- аналізів за допомогою комп'ютерної програми “ТRЕЕS” побудовано дендрограми, що відбивають феногенетичні стосунки досліджених сортів сої. За даними ISSR-аналізу отриманий чіткий розподіл сортів американської, європейської, китайської і далекосхідної селекції. Відокремлюються такі компоненти: кластер, що охоплює всі сорти американського походження, до якого прилягають, утворюючи окрему групу, далекосхідний сорт Амурська 42 і європейський сорт Попельсдорфер; кластер, що включає сорти китайського походження; невеликий кластер з далекосхідних сортів; до кластеру, що складається з європейських сортів, входить також один китайський сорт (К 2406); ще один кластер із сортами далекосхідного походження.

За даними ДП-ПЛР і SSRP-аналізу такого розподілу, як на основі ISSR-маркерів, ми не одержали, що пояснюється меншою кількістью поліморфних фрагментів, отриманих при ампліфікації. Побудовано сумарну дендрограму за даними всіх трьох досліджуваних варіантів ПЛР. Розташування на ній сортів сої мало мінімальні розходження з дендрограмою, побудованою на основі даних ISSR-аналізу. Оскільки сумарна дендрограма (149 поліморфних ПЛР-локусів) і дендрограма, побудована на основі даних ISSR-аналізу (81 поліморфний ПЛР-локус), мають високий ступінь подібності, зрозуміло, що для отримання достовірної картини феногенетичних стосунків досліджуваних сортів необхідно отримати 70 - 90 поліморфних продуктів ампліфікації.

Ідентифікація і паспортизація сортів сої на основі ssr-, пп-пцр- та issr- маркерів

Завданням даної роботи було дослідження молекулярно-генетичного поліморфізму генотипів сої за допомогою ДП-ПЛР, ISSR і SSR-систем, ідентифікація і паспортизація сортів сої складанням генетичної “формули (паспорта) сорту”. Під “паспортом генотипу” мається на увазі формула алельного стану фіксованих локусів, що відображає специфічність даного генотипу і дозволяє його унікально ідентифікувати.

При дослідженні мікросателітних локусів сорти перевіряли на гомозиготність. Для роботи брали тільки ті сорти, генотипи яких були гомозиготі за даним локусом. За допомогою 8-ми пар до мікросателітних локусів у ДНК 32 сортів сої виявлено 25 продуктів ампліфікації, що дозволило диференціювати всі досліджені сорти сої. На підставі отриманих даних складено формули генотипів. У даних формулах локус позначено літерою латинського алфавіту, а молекулярна маса алеля наводиться в нижньому індексі. Згідно з наведеними даними усі досліджені сорти сої диференційовані.

При дослідженні даних сортів сої методом SSRP-аналізу за локусом SOYHSP176 (Low MW Heat shok protein gene) у сортів з Китаю, Європи і з Далекого Сходу виявлено алель довжиною 109 п.н., у сорту американського походження зустрічається також алель довжиною 119 п.н.. Для локусу SOYHSP179 (Heat shock protein gene (Gmhsp17.9-D)) характерні два алелі довжиною 92 п.н. і 212 п.н., причому, останній спостерігався тільки у сортів китайської та європейської селекції. Розподіл алелів у досліджених сортів сої за локусом SOYSC514 (Lipoxygenase gene) характеризується таким чином: далекосхідні сорти мають тільки алель довжиною 187 п.н., а в сортів європейської селекції виявлено алель 209 п.н., що не зустрічається у інших сортів. Для найваріабельнішого у нашій вибірці сортів локусу SAT 1 характерні п'ять типів алелів: 273 п.н, 267 п.н., 255 п.н., 241 п.н. і 221 п.н.. Алель довжиною 273 п.н. зустрічається тільки у далекосхідного сорту, крім того, у сортів даного походження не знайдено алель 241 п.н., який характерний для китайських сортів. На сортах американської і європейської селекції детектовано алель довжиною 267 п.н., проте, в американських сортів, крім цього зустрічається алель 255 п.н., а в європейських - 241 п.н.. У китайських і далекосхідних сортів за локусом SATT 1 характерний один тип алеля: 147 п.н.(тільки один китайський сорт має алель довжиною 117 п.н.), тоді як сорти з Європи предсталені всіма трьома типами алелів, що виявлені у даного локусу (155 п.н., 147 п.н. і 117 п.н.).

Таблиця 2. Характеристика поліморфних ISSR-локусів, відібраних для паспортизації досліджених сортів сої

Найменування праймера	Послідовність праймера	Кількість поліморфних ПЛР-локусів	Розмір ПЛР- локусів (п.н.)	Код праймера
R5	(AGC)6C	13	1682 1551 1411 1314 1193 1046 910 706 612 537 493 432 400	А
R7	(TCG)6G	5	1533 1150 1085 628 416	B
R6	(AGC)6G	4	1244 721 682 592	C
R3	(CAC)7A	4	1374 1032 657 605	D
R2	(AGC)6T	2	1700 543	E
R1	(ACC)6G	2	1132 915	F

При дослідженні 32 сортів сої за допомогою ДП-ПЛР детектовано 53 продукти ампліфікації, 25 з яких були поліморфними. Для паспортизації використовували 16 стабільно відтворених фрагментів ампліфікації з частотою зустрічальності 0,4-0,6. Така кількість ампліконів була мінімальною для повної диференціації досліджуваних сортів сої. Дані за цими локусами заносили до матриці: 1 - присутність смуги на гелі, 0 - відсутність. Потім кожному амплікону даного праймера, починаючи із самого високомолекулярного, привласнювали літеру латинського алфавіту. На основі даного шаблону створюється паспорт сорту за результатами ДП-ПЛР-аналізу: літера - найменування амплікону, нижній індекс - код праймера, що детектує даний амплікон. Як і у випадку з SSRP- аналізом, літерами латинського алфавіту позначено локуси. Розходження двох підходів полягає в тому, що при ДП-ПЛР у нижньому індексі наводиться код праймера.

Використовуючи 6 ISSR праймерів (табл. 2), досліджували 32 сорти сої. В результаті протестовано 123 фрагменти ампліфікації ДНК, з яких 79 поліморфні. Рівень поліморфізму, детектованого даними праймерами, склав 64 %. З цих поліморфних фрагментів відібрано 30, частота зустрічальності яких у досліджуваній популяції знаходилася в таких межах: 0,3 - 0,7.

Для паспортизації використовували стабільно відтворені фрагменти ампліфікації. Дана кількість ампліконів дозволила повністю диференціювати досліджувані сорти сої.

Результати аналізу поліморфних локусів занесено до матриці, що аналогічна такій при ДП-ПЛР.

Оскільки ISSR-маркери відрізняються від ДП-ПЛР-маркерів більшою відтворюваністю, можна використовувати інший запис паспорта сорту. У даному випадку літера латинського алфавіту позначає праймер, що виявив поліморфізм (табл. 3), а нижній індекс - молекулярну масу детектованого локусу, як у випадку SSRP-аналізу.

Таблиця 3

Генетичні формули сортів сої на основі ISSR-маркерів

№ 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32	Сорт(и) Провар Анока Капітал Магна Амсой A-100 Блекхок Ада Грібовська місцева Амурська 42 Амурська 111 Амурська 57 Амурська 51 Амурська 321 Амурська 154 Амурська 347 К 2601 Харбінська К 2441 Ларедо К 766 К 2408 Тзи-ті 4 К 2406 Ронест 104 Маусерова біла Ронест 1 Дунайка К3-382 KZ-26 TSZ 14 Попельсдорфер	“Формула” сорту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

ВИСНОВКИ

Дослідження внутрішньовидового поліморфізму сортів культурної сої (Glycine max L.) різними методами ПЛР (ДП-ПЛР, SSR і ISSR) дозволили зробити такі висновки:

1. Охарактеризовано діапазон внутрішньовидової мінливості виду Glycine max L.

2. Селекційні форми і сорти культурної сої, що досліджувались за допомогою кластерного аналізу, диференційовані на окремі групи за ступенем генетичної близькості. Отримані результати для більшості випадків виявили відповідність із даними педігрі. Застосування ПЛР-аналізу створило можливість дослідження молекулярно-генетичної різноманітності сої на такому рівні, який неможливо було досягнути при використанні інших типів маркерів.

3. Генотипи культурної сої різного еколого-географічного походження відрізняються за особливостями молекулярної організації, що дозволяють здійснити їх диференціацію.

4. На підставі результатів ПЛР-аналізу генотипи культурної сої представлені у вигляді формули, яка дозволяє проводити ідентифікацію і паспортизацію сортів.

5. Результати дослідження розподілу алелів у генотипах різних еколого-географічних зон дозволяють говорити про можливе адаптивне значення окремих алелів.

ПЕРЕЛІК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Сиволап Ю.М., Брик А.Ф., Сичкарь В.И. Исследование молекулярно-генетического полиморфизма сои (Glycina max L.) с помощью ПЦР-анализа // Цитология и генетика. - 1998 - Т.32, №4. - С. 89-96.

2. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М. Молекулярно-генетический полиморфизм сои детектированный ПП-ПЦР, SSRP и ISSR // Цитология и генетика. - 2001. - Т.35, №5. - С. 3 - 10.

3. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М. Молекулярно-генетическая идентификация и паспортизация сортов сои // Генетика. - 2001. - Т.37, №9. - C. 1265 - 1273.

4. Использование ПЦР-анализа в генетико-селекционных исследованиях / Сиволап Ю.М., Календарь Р.Н., Вербицкая Т.Г., Брик А.Ф., Кожухова Н.Э., Солоденко А.Е., Чеботарь С.В., Балашова И.А., Барышева И.А., Топчиева Е.А - К.: Аграрна наука, 1998. - 156 с.

5. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М., Сичкарь В.И. Исследование генетического разнообразия сои с помощью ПП-ПЦР анализа // Материалы Междунар. конф. “Молекулярно-генетические маркеры растений” - Ялта. - 1996. - С. 12-13.

6. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М., Сичкарь В.И. Использование микросателлитов для определения молекулярно-генетического полиморфизма у сои // Материалы Междунар. конф. “Агробиотехнология растений и животных” - Киев. - 1997. - С. 12.

7. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М., Сичкарь В.И. ПЦР-анализ молекулярно-генетического полиморфизма сортов сои различного эколого-географического происхождения // Материалы Междунар. конф. “Молекулярная генетика и биотехнология” - Минск. - 1998. - С. 16.

8. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М., Сичкарь В.И. Исследование сортов сои различного эколого-географического происхождения с помощью SSRP-анализа // Материалы Междунар. конф. “Використання сучасних молекулярно-генетичних і біологічних розробок у генетико-селекційних досліджень” - Одесса. - 1999. - С 12 - 13.

9. Brik A.F., Sivolap Yu.M., Sichkar V.I. PCR-analysis genetic diversity of soybean // World Soybean Research Conference VI. - Chicago, Illinois (USA) - 1999. - P. 523 .

10. Брик А.Ф., Сиволап Ю.М. Оценка генетического разнообразия и распределения генотипов сои с помощью ДНК-маркеров // Материалы Междунар. конф. “Семинар по современным методам селекции растений” - Киев. - 1999 . - C. 3.

АНОТАЦІЯ

Брик О.Ф. ПЛР-аналіз молекулярно-генетичного поліморфізму культурної сої (Glycine max L.). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.26 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2002.

До захисту подається дисертація, яка присвячена дослідженню молекулярно-генетичного поліморфізму геному культурної сої (Glycine max L.) з використанням ПЛР-аналізу для диференціації, ідентифікації і паспортизації досліджуваного матеріалу. Проведено ДП-ПЛР-аналіз 150 селекційних форм сої. Отримані результати у більшості випадків виявили відповідність з даними педігрі. На основі генетичних дистанцій було визначено найменш і найбільш віддалені один від одного сорти сої. Аналіз ДНК - патернів дозволив унікально диференціювати досліджені 32 сорти сої різного еколого-географічного походження. Розподіл більшості сортів на отриманій дендрограмі відповідає їх еколого-географічному походженню. Показано, що для диференціації сортів найефективнішим є ДП-ПЛР. SSRP-аналіз дозволяє охарактеризувати генотипічну чистоту матеріалу, детектувати гомо- і гетерозиготні генотипи. ISSR-метод поєднує ряд особливостей ДП-ПЛР і SSRP - полілокусність та відтворюваність. Розроблено принцип ідентифікації та паспортизації генотипів сої на основі ПЛР-аналізу. Запропоновано уніфіковані літеро-цифрові форми запису алельного стану фіксованих локусів, що відображають специфічність даного генотипу і дозволяють його унікально ідентифікувати.

Ключові слова: молекулярно-генетичний поліморфізм, ДП-ПЛР, SSRP, ISSR, паспортизація, соя.

АННОТАЦИЯ

Брик А.Ф. ПЦР-анализ молекулярно-генетического полиморфизма культурной сои (Glycine max L.). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.26 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев 2002.

Представляется к защите диссертация, которая посвящена разработке технологии молекулярно-генетического анализа сортов и селекционных форм культурной сои (Glycine max L.) с целью дифференциации, идентификации и паспортизации исследуемого материала.

С помощью ПП-ПЦР-праймеров проведен анализ 150 селекционных форм сои с целью разделения их на отдельные группы по уровню генетической удаленности. Полученные результаты для большинства случаев выявили соответствие с данными педигри. На основе генетических дистанций были определены наименее и наиболее отдаленные друг от друга сорта сои. Наиболее удаленные в генетическом отношении генотипы рекомендованы для использования при получении высокогетерозисных комбинаций, а наименее удаленные, отличающиеся по хозяйственно-ценным признакам, для улучшения по конкретным признакам.

Проведен сравнительный анализ дискриминационного потенциала использованных методов ПЦР (ПП-ПЦР, SSRP, ISSR) в исследовании внутривидового полиморфизма 32 сортов культурной сои различного эколого-географического происхождения. Анализ ДНК-профилей позволил уникально дифференцировать исследованные сорта сои. Распределение большинства сортов на полученной дендрограмме соответствует их эколого-географическому происхождению. Суммарная дендрограмма (149 полиморфных ПЦР-локусов) и дендрограмма, построенная на основе данных ISSR-анализа (81 полиморфный ПЦР-локус), имеют высокую степень подобия, очевидно, что для получения достоверной картины феногенетических взаимоотношений изучаемых сортов необходимо получить 70 - 90 полиморфных продуктов амплификации.

Для сравнения данных использованных методов применяли, кроме показателей уровня полиморфизма и ожидаемой гетерозиготности, маркерный индекс, учитывающий особенности данных методов (монолокусность, полилокусность). Значения маркерного индекса для исследованных в данной работе ПЦР-подходов составили: ПП-ПЦР - 2,02; SSRP - 0,5; ISSR - 3,69. Наименее информативным является SSRP - анализ, а наиболее информативен ISSR - анализ. Показано, что для дифференциации сортов наиболее эффективен ПП-ПЦР. SSRP-анализ позволяет охарактеризовать генотипическую чистоту материала, детектировать гомо- и гетерозиготные генотипы. ISSR-метод совмещает ряд особенностей ПП-ПЦР и SSRP - полилокусность и воспроизводимость.

Проведенные исследования распределения аллелей по восьми исследованным микросателлитным локусам у генотипов разных эколого-географических зон позволяют судить о возможном адаптационном значении отдельных аллелей.

Разработан принцип идентификации и паспортизации генотипов сои на основе ПЦР-анализа. Предложены унифицированные буквенно-цифровые формы записи аллельного состояния фиксированных локусов, отображающие специфичность данного генотипа и позволяющие его уникально идентифицировать на основе данных SSRP- и ISSR-подходов.

Ключевые слова: молекулярно-генетический полиморфизм, ПП-ПЦР, SSRP, ISSR, паспортизация, соя

SUMMARY

Brik A.F. PCR Analysis of the Molecular Genetic Polymorphism of Soy Bean Glycine max L. - Manuscript.

Thesis for the Degree of the Candidate of Biological Studies in speciality 03.00.26 “Molecular Genetics”. - Institute of Molecular Biology and Genetics, the National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The given dissertation is devoted to the creation of technology of soybean varieties molecular-genetic analysis with the goal to distinguish, identify and make genotypic passport of investigated material. AP-PCR analysis of 150 soybean varieties has been made. The received results in most cases corresponded to the pedigree data. On the base of genetic distances the most and the least remote soy bean varieties were detected. DNA pattern analysis allowed the unique distinction of 32 investigated soy bean varieties of different ecologic-geographic origin. Majority of varieties was distributed on the received dendrogram in accordance with their ecologic-geographic origin. The AP-PCR -analysis was found to be the most efficient to distinguish varieties. SSRP allows to evaluate the genotypic purity of investigated material, to detect homozygous and heterozygous genotypes. ISSR combines a number of features of AP-PCR and SSRP, namely the ability to detect multiple genetic loci and a good reproducibility. It was developed the principle to identify and assign genotypic passports of soybean varieties using a PCR-based analysis. We suggested unified letter/number records of allelic states of fixed PCR loci that reflect a specificity of a given genotype and allow its unique identification.

Key words: molecular genetic polymorphism, AP-PCR, SSRP, ISSR, genotypic passport, soy bean.

Размещено на Allbest.ru

...