Культивирование клеток и тканей растений

Размещено на http://www.allbest.ru/

Культивирование клеток и тканей растений - сравнительно молодая отрасль биотехнологии. Как известно, в природных условиях клетки растений находятся в тканях и органах, защищены от механических воздействий внешней среды.

Кроме того, эти клетки нуждаются во множестве компонентов минеральной и органической природы для метаболизма и роста, поэтому эксперименты культивирования этих клеток in vitrо в прошлом завершались неудачно. Сначала к минеральным средам добавляли экстракты растений или сыворотку, и лишь в 1922 году Роббинсу удалось на синтетической питательной среде осуществить рост меристемы кончиков корней томатов и кукурузы. Начало практического культивирования тканевых культур растительного происхождения можно отнести к 1955 г.

Растения являются незаменимым источником получения очень многих практически важных веществ. При этом следует подчеркнуть, что промышленное получение некоторых соединений, например, сердечных гликозидов, флавоноидов, кумаринов, эфирных масел достигается только путем выделения их из растительного сырья. Между тем возможности получения так называемых "метаболитов интереса" в достаточном количестве зачастую ограничены. Это связано с сокращением ресурсов некоторых ценных дикорастущих растений, принадлежностью многих лекарственных растений к группам эндемов, редким и исчезающим видам. В связи с этим большой интерес в качестве источника биологически активных веществ представляют культуры растительных клеток.

Использование данных методик - пример слияния высоких технологий, науки и экономически выгодного способа получения лекарственного сырья. Сбор дикорастущего сырья наносит вред экологической обстановке региона и всей планете в целом, а при неправильном сборе может и вовсе привести к вырождению зарослей. Культивировать целое растение также не практично если в качестве сырья используется, к примеру, только его корневища или корни. Это значит, что вся надземная часть в лучшем случае идёт на корм животным или просто выбрасывается. Культивирование изолированных клеток и тканей даёт возможность получать именно то сырьё которое необходимо, и кроме того позволяет увеличить количество и качество самих биологически активных веществ.

В самом общем смысле культура клеток и тканей - это искусственное in vitro индицирование делений клеток или выращивание в пересадочной культуре тканей, возникших путём пролиферации клеток изолированных сегментов разных частей растения.

Все объекты, культивируемые in vitro, выращиваются стерильными. Стерилизуются исходные кусочки ткани растений (экспланты), питательная среда, антисептически в специальных боксах стерильным инструментом проводятся манипуляции по выращиванию объектов. Сосуды в которых культивируются ткани и клетки, закрываются так, чтобы предотвратить инфицирование в течение продолжительного времени. В культуре тканей лекарственных растений можно выделить три главных направления: получение недифференцированной каллусной массы, создание источников генетического разнообразия форм растений, а так же клеточную селекцию и клональное микроразмножение растений. В природе каллусообразование - естественная реакция на повреждение растений. В культуре изолированных тканей при помещении экспланта (т. е., фрагмента ткани или органа) на питательную среду его клетки дедифференцируются, переходят к делению, образуя однородную недифференцированную массу - каллус. В асептических условиях каллус отделяют и помещают на поверхность агаризованной питательной среды для дальнейшего роста.

В результате получают культуру каллусной ткани, которую можно поддерживать неограниченно долго, периодически разделяя её на трансплантаты и пересаживая её на свежую среду. Каллусы легко образуются на эксплантах из различных органов и частей растений: отрезков стебля, листа, корня, проростков семян, фрагментов паренхимы, тканей клубня, органов цветка, плодов, зародышей и т. д.

Культивирование каллусных клеток проводят главным образом двумя способами: на агаризованных питательных средах или различных гелеобразующих подложках (силикагель, биогели, полиакриламидные гели, пенополиуретан и др.) и в жидкой питательной среде. В жидкой питательной среде каллус легко распадается на отдельные агрегаты клеток и даёт начало так называемой суспензионной культуре.

Каллусные клетки в культуре in vitro подвержены значительной генетической изменчивости. Изменчивость геномов может приводить к генетическим изменениям у растений - регенерантов, полученных из культуры каллусных клеток, клеточных суспензий или изолированных протопластов. Такие растения получили названия сомаклональных вариантов. Сомаклональные варианты, сохраняя основные свойства прототипа, часто выгодно отличаются от него устойчивостью к болезням, экологическим стрессам, а иногда несколько изменённой биосинтетической способностью и более высокой продуктивностью.

Неотселектированные недифференцированные клетки накапливают, как правило, незначительное, по сравнению с интактным растением, количество веществ специализированного обмена. Только благодаря правильно разработанной стратегии получения высокопроизводительных штаммов к настоящему времени получены культуры тканей, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить лекарственным сырьем. Однако для многих культур неоднократные попытки различных исследователей определить условия накопления продуктов, характерных для родительских растений, были неудачными. Это касается, в частности, индукции морфинановых алкалоидов в культуре ткани Papaver somniferum, винбластина - в Catharanthus roseus, хинолиновых алкалоидов - в Cinchona ledgeriana, дигоксина - Digitalis lanata и др.

Чаще всего в клеточных культурах при длительном культивировании снижается или совсем теряется способность клеток накапливать соединения вторичного метаболизма из-за возникновения малоактивных, но более жизнеспособных вариантов. Снижение биосинтетического потенциала в культуре in vitro происходит из-за подавления дифференциации клеток и их специализации, т. е., в результате потери способности к реализации генетической информации, относящейся ко вторичному обмену.

Важной характеристикой клеточной популяции является ее стабильность в отношении синтеза, транспорта и депонирования метаболитов «интереса». Стабильность может сохраняться в течение всего времени существования популяции. При этом сохраняются и активно работают гены синтеза, системы транспорта и депонирования.

Возможен случай постепенного (в течение нескольких лет) увеличения числа клеток со сниженным синтезом метаболитов. И, наконец, в случае полной нестабильности клетки популяции очень быстро теряют свой биосинтетический потенциал. Вопрос о стабильности и нестабильности тесно связан с изучением биологии клеток разных популяций.

В организме растения синтез метаболитов, их транспорт и отложение в запас находятся под строгим контролем развития. Часто эти события не только разведены во времени, но и происходят в разных органах растения. Клетка вне организма обычно не транспортирует метаболиты в соседние клетки или в питательную среду, хотя в ряде случаев это явление наблюдается (биосинтез алкалоидов в клеточных культурах мака).

На выход вторичных продуктов в культурах растительных клеток влияют многие факторы, однако все способы регуляции вторичного метаболизма в культуре in vitro можно разделить на две группы: физиологическая и генетическая регуляции синтеза вторичных метаболитов.

Подбор физических и химических условий культивирования является наиболее простым и часто применяемым подходом для повышения продуктивности. В основе физиологического регулирования процессов вторичного синтеза лежит изучение влияния факторов культивирования на рост и метаболизм клеток. Большое внимание уделяется таким факторам культивирования, как регуляторы роста, минеральные вещества, витамины, сахара, свет, аэрация, температура, а также иммобилизация клеток и обработка элиситорами. Во многих случаях эти работы привели к успеху, однако они выполняются эмпирически и поэтому длительны и трудоемки. К тому же следует оговориться, что несмотря на эффективность повышения уровня биосинтеза физиологическими методами, добиться количественно значимых изменений в недифференцированных клеточных культурах, сопоставимых с уровнем в интактном растении, лишь за некоторым исключением, не удается. Стимулирование же синтеза элиситорами носит, к сожалению, временный характер.

Более эффективной в этом плане является генетическая регуляция синтеза вторичного метаболизма в системе in vitro.

С использованием экспериментального мутагенеза стало возможным получение довольно продуктивных штаммов. С помощью этого метода в ИФР РАН был получен мутантный штамм Dioscorea deltoidea DM-0.5 (мутаген - N- нитрозометилмочевина, доза - 0.5 ммоль/ч) - сверх продуцент фуростаноловых гликозидов, высокая способность к синтезу - 6-8% в сухой массе клеток - сохранялась в течение длительного времени (около 30 лет).

Следует отметить, что метод индуцированного мутагенеза носит также эмпирический характер и не менее трудоемок, чем физиологические способы регуляции вторичного метаболизма. Ряд перспективных культур был получен в результате генетической трансформации и других генно-инженерных манипуляций. Особенно следует отметить трансформанты, полученные с помощью плазмид агробактерий (Agrobacterium rhizogenes A. Tumefaciens), в частности «бородчатых корней», продуктивность которых оказалась достаточно высокой. Поскольку одной из основных причин снижения уровня биосинтеза в культурах in vitro является дедифференциация ткани, то один из путей повышения синтеза вторичных соединений в клеточных культурах связан с дифференцировкой ткани и органогенезом. Повышение содержания вторичных соединений было отмечено в органогенных культурах видов Senecio, Lichroa ledgeriana.

Известно, что физиологическое действие условий in vitro приводит к генетической гетерогенности системы. Речь идет о так называемой сомаклональной изменчивости, которая возникает при длительном культивировании. На генетической изменчивости клеток в культуре in vitro основана селекция штаммов, обеспечивающая большой выход ценных продуктов вторичного метаболизма растительных клеток. При клонировании суспензионной культуры клеток паслена были выделены линии, накапливающие больше 3% соланидина, получен штамм клеток руты душистой, содержащей в 20 раз больше алкалоида рутакридона по сравнению с растением. Биотехнологическое использование клеточных культур в качестве сырья в промышленных масштабах становится реальностью. В виде примеров можно привести производство шиконина из Lithospermum erythrorhison в Японии (фирма Toshiba) - ценного для косметики, пищевой промышленности и медицины растительного нафтохинонового пигмента. В России производство культуры ткани женьшеня («Биоженьшень») осуществляется на биохимических заводах. Экстракт, получаемый из биомассы женьшеня, используется в качестве биологически активной добавки к кремам, лосьонам, а в пищевой промышленности - для приготовления тонизирующих напитков. Для получения ценного противоаритмического препарата аймалина на ХПХФО «Здоровье» (Харьков, Украина) организовано опытное производство биомассы культуры тканей Rauwolfia serpentina. Таким образом, возможности, открытые методом культуры тканей, позволили в настоящее время создать биотехнологическое производство принципиально новых видов сырья для получения необходимых соединений.

В лаборатории биохимии и биотехнологии растений также получены значительные результаты по получению культур растительных клеток - продуцентов экдистероидов. В начале 90-х годов были получены каллусные культуры Serratula coronata и Ajuga reptans - продуценты экдистероидов. Полученные штаммы различались по степени соответствия интактным растениям по количественному составу экдистероидов и соотношению индивидуальных компонентов. Если в клеточных культурах S. Coronata наблюдали заметное снижение уровня биосинтеза по сравнению с интактными растениями (20-100 раз), то ряд каллусных культур A. Reptans по суммарному содержанию экдистероидов не уступал дикорастущим растениям. Для обеих клеточных культур была отмечена тенденция к снижению уровня синтеза экдистероидов с увеличением продолжительности культивирования, однако были выявлены штаммы и со стабильным уровнем синтеза. Среди длительно культивируемых каллусных культур S. Coronata и A. Reptans были выявлены штаммы с относительно высоким содержанием 20-гидроксиэкдизона (экдистероида, обладающего высоким тонизирующим и ранозаживляющим действием), из которых в 1999 г. нами были получены суспензионные культуры. Методы глубинного культивирования клеток высших растений в последние годы привлекают все больший интерес, поскольку этот метод обладает рядом преимуществ перед поверхностным культивированием (каллусными культурами): обеспечение одинаковых условий для всех клеток популяции, увеличение скорости их роста и биосинтетического потенциала, возможность автоматизации процессов.

Культуры клеток высших растений имеют две сферы применения:

1. Изучение биологии клетки, существующей вне организма, обуславливает ведущую роль клеточных культур в фундаментальных исследованиях по генетике и физиологии, молекулярной биологии и цитологии растений. Популяциям растительных клеток присущи специфические особенности: генетические, эпигенетические (зависящие от дифференцированной активности генов) и физиологические. При длительном культивировании гетерогенной по этим признакам популяции идет размножение клеток, фенотип и генотип которых соответствуют данным условиям выращивания, следовательно, популяция эволюционирует. Все это позволяет считать, что культуры клеток являются новой экспериментально созданной биологической системой, особенности которой пока мало изучены. Культуры клеток и тканей могут служить адекватной моделью при изучении метаболизма и его регуляции в клетках и тканях целого растения;

2. Культивируемые клетки высших растений могут рассматриваться как типичные микрообъекты, достаточно простые в культуре, что позволяет применять к ним не только аппаратуру и технологию, но и логику экспериментов, принятых в микробиологии. Вместе с тем, культивируемые клетки способны перейти к программе развития, при которой из культивируемой соматической клетки возникает целое растение, способное к росту и размножению.

Можно назвать несколько направлений создания новых технологий на основе культивируемых тканей и клеток растений:

1) Получение биологически активных веществ растительного происхождения:

- традиционных продуктов вторичного метаболизма (токсинов, гербицидов, регуляторов роста, алкалоидов, стероидов, терпеноидов, имеющих медицинское применение);

- синтез новых необычных соединений, что возможно благодаря исходной неоднородности клеточной популяции, генетической изменчивости культивируемых клеток и селективному отбору клеточных линий со стойкими модификациями, а в некоторых случаях и направленному мутагенезу;

- культивируемые в суспензии клетки могут применятся как мультиферментные системы, способные к широкому спектру биотрансформаций химических веществ. В результате биотрансформации получают уникальные биологически активные продукты на основе синтетических соединений или веществ промежуточного обмена растений других видов.

2) Ускоренное клональное микроразмножение растений, позволяющее из одного экпланта получать от 10000 до 1000000 растений в год, причем все они будут генетически идентичны.

3) Получение безвирусных растений.

4) Эмбриокультура и оплодотворение in vitro часто применяются для преодоления постгамной несовместимости или щуплости зародыша, для получения растений после отдаленной гибридизации. При этом оплодотворенная яйцеклетка вырезается из завязи с небольшой частью ткани перикарпа и помещается на питательную среду. В таких культурах можно также наблюдать стадии развития зародыша.

5) Антерные культуры - культуры пыльников и пыльцы используются для получения гаплоидов и дигаплоидов.

6) Клеточный мутагенез и селекция. Тканевые культуры могут производить регенеранты, фенотипически и генотипически отличающиеся от исходного материала в результате сомаклонального варьирования. При этом в некоторых случаях можно обойтись без мутагенной обработки.

7) Криоконсервация и другие методы сохранения генофонда.

8) Иммобилизация растительных клеток.

9) Соматическая гибридизация на основе слияния растительных протопластов.

10) Конструирование клеток путем введения различных клеточных оганелл.

11) Генетическая трансформация на хромосомном и генном уровнях.

12) Изучение системы «хозяин - паразит» с использованием вирусов, бактерий, грибов и насекомых.

Синтез вторичных метаболитов.

Вторичный метаболизм культивируемых клеток привлекает всё больше внимания исследователей, это обусловлено, прежде всего перспективностью промышленного использования культивируемых клеток растений для получения соединений специализированного обмена растений. Особую актуальность этот вопрос приобретает в связи с возрастающей остротой экологических проблем. В медицине 25% всех применяемых лекарств содержат соединения растительного происхождения. Если приплюсовать к этому потребности пищевой промышленности, парфюмерии, сельского хозяйства, то становится очевидной необходимость замены плантационного, а тем более дикорастущего сырья на гарантированно получаемую промышленным способом биомассу культивируемых клеток, содержащую необходимые соединения в достаточном количестве.

Как показал почти полувековой опыт исследования вторичных соединений в клеточных культурах растений (с 1940 года), для этого необходимо решение многих фундаментальных проблем биологии культивируемых клеток. растение мутагенез метаболит

Наиболее серьёзной из них является разработка стратегии контроля синтеза вторичных соединений в культивируемых клетках растений. До сих пор неясно, возможна ли разработка единой стратегии или она должна быть специфической для разных классов вторичных соединений, или же индивидуальной для каждого конкретного случая.

Список использованной литературы

1. Артамонов В.И. Биотехнология - агропромышленному комплексу. М.: Наука, 1999. 160 с.

2. Атанасов А. Биотехнология в растениеводстве. Новосибирск: ИЦ и Г СО РАН, 1993. 241 с.

3. Бекер М.Е., Лиепиньш Г.К., Райпулис Е.П. Биотехнология. М.: Агропромиздат, 1990. 334 с.

4. Биотехнология / Под ред. А.А. Баева. М.: Наука, 1994. 309 с.

5. Блинов А.Г. Бесклеточные белоксинтезирующие системы // Методы молекулярной генетики и генной инженерии. Новосибирск: Наука, 1990. С. 80-86.

6. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1994 г. 272 с.

7. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений. М.: Наука, 1994. 272 с.

8. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений и биотехнология. М.: Наука, 1996. 286 с.

9. Валиханова Г.Ж. Биотехнология растений. Алматы: Конжык, 1996. 272 с.

10. Запрометов М.Н. Вторичный метаболизм и его регуляция в культурах клеток и тканей растений // Культура клеток растений. М.: Наука, 1991. С. 37-50.

11. Кирай З., Барабаш З. Результаты и перспективы использования биотехнологии в растениеводстве и защите растений // Международный агропромышленный журнал. 1990. №3. С. 7-10.

Размещено на Allbest.ru