Розподіл негемового заліза в організмі за даними спектроскопії електронного спінового резонансу

Размещено на http://www.allbest.ru/

Київський національний університет імені Тараса Шевченка

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

РОЗПОДІЛ НЕГЕМОВОГО ЗАЛІЗА В ОРГАНІЗМІ ЗА ДАНИМИ СПЕКТРОСКОПІЇ ЕЛЕКТРОННОГО СПІНОВОГО РЕЗОНАНСУ

03.00.02 - біофізика

Дудченко Наталія Олександрівна

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті прикладних проблем фізики та біофізики

Національної Академії наук України.

Науковий керівник: кандидат хімічних наук Михайлик Ольга Михайлівна, Інститут прикладних проблем фізики та біофізики НАНУ, провідний науковий співробітник

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Зима Валентин Леонідович, Київський національний університет імені Тараса Шевченка, професор

кандидат біологічних наук Бурлака Анатолій Павлович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р. Є. Кавецького НАНУ, старший науковий співробітник

Провідна установа: Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна НАН України, м. Київ

Захист відбудеться "_16_"_cічня__2003_ р. о_16.00_ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38. Київського національного університету імені Тараса Шевченка (Київ, пр. акад. Глушкова, біологічний факультет, ауд. 215).

Поштова адреса: 01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Київського національного університету імені Тараса Шевченка (01033, Київ-33, вул. Володимирська, 64).

Автореферат розісланий 30 листопада 2002р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д 26.001.38. Давидовська Т. Л.

АНОТАЦІЇ

негемовий залізо біологічний спектроскопія

Дудченко Н.О. Розподіл негемового заліза в організмі за даними спектроскопії електронного спінового резонансу. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика. - Київський національний Університет імені Тараса Шевченка, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено вдосконаленню оригінальних методик кількісного аналізу заліза у складі трансферину та лабільного пулу заліза в біологічних зразках методом низькотемпературної ЕСР - спектроскопії, а також вивченню особливостей метаболізму негемового заліза в групах здорових дорослих та здорових новонароджених, та при порушеннях статусу заліза в організмі (пацієнтів, хворих на гліальні пухлини мозку, пацієнтів з гемохроматозом, визваним надмірним надходженням заліза в організм в умовах виробництва) з використанням вдосконалених методик. Вперше визначено показники обміну негемового заліза в цільній крові для груп порівняння (здорові дорослі та новонароджені). Введено новий показник - концентрація заліза у складі трансферину в клітинах крові та цей показник визначений для груп здорових дорослих та новонароджених. Показано, що для експериментальних гліальних пухлин мозку щурів спостерігається гіпоферемія, а хворим з гліальним пухлинам мозку притаманна гіперферимія. Показники метаболізму негемового заліза визначені для групи пацієнтів з перевантаженням залізом, що викликане надлишковим надходженням заліза в організм в умовах виробництва та досліджено вплив препарату ліпоєвої кислоти на метаболізм негемового заліза в цій групі.

Ключові слова: метаболізм негемового заліза, кількісна спектроскопія електронного спінового резонансу, залізо трансферину, здатне до хелатування залізо.

Дудченко Н. А. Распределение негемового железа в организме по данным спектроскопии электронного спинового резонанса. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02 - биофизика. - Киевский национальный Университет имени Тараса Шевченко, Киев, 2002.

Диссертация посвящена усовершенствованию оригинальных методик количественного анализа железа в составе трансферина и лабильного пула железа в биологических образцах методом низкотемпературной ЭСР - спектроскопии, а также изучению с использованием усовершенствованых методик особеностей метаболизма негемового железа в группах здоровых взрослых и здоровых новорожденных, и при нарушениях статуса железа в организме (при глиальных опухолях человека и експериментальных животных, у пациентов с гемохроматозом, вызванным избыточным поступлением железа в организм в условиях производства). Впервые определены показатели обмена негемового железа, а именно, концентрация железа в составе ферритина, концентрация железа в составе трансферрина, концентрация белка трансферрина, степень насыщения белка трансферрина железом в цельной крови и плазме крови, а также концентрация железа, способного хелатироватся десферриоксамином В в плазме крови для групп сравнения (здоровые взрослые и новоржденные). Показано, что определение железа трансферрина и насыщения трансферрина в цельной крови при высокой степени насыщения трансферрина железом, является более информативным для оценки перегрузки организма железом, в связи с потерей высоконасыщенного трансферрина при получении плазмы крови и сыворотки крови из цельной крови. Отметим, что показатель степень насыщения трансферрина железом считают наиболее информативным критерием для фенотипического скрининга пациентов с перегрузкой железом (степень насыщения плазмы крови железом более 45%). Поэтому, для адекватной диагностики именно при высоких степенях насыщения трансферрина железом, важной является возможность определения концентрации железа трансферрина и степени насыщения трансферрина железом в цельной крови. Введён новый показатель - концентрация железа в составе трансферрина в клетках крови, и этот показатель определён для групп здоровых взрослых и новорожденных. В целом, наблюдается повышение концентрации железа трансферрина в клетках крови при повышении концентрации железа трансферрина в цельной крови. Среднее значение этого параметра в группе новорожденных значительно (в три раза) и достоверно превышает соответствующее значение, определённое для группы здоровых взрослых. Проведена оценка обмена негемового железа при экспериментальных глиальных опухолях мозга крыс, а также у пациентов с глиомами головного мозга. Выявлены различия в метеболизме железа между глиальными опухолями мозга экспериментальных животных и человека, а именно, при экспериментальных глиальных опухолях мозга наблюдается гипоферримия, а глиальным опухолям мозга человека свойственна гиперферремия. Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об изменении метаболизма негемового железа уже на начальных стадиях роста экспериментальных глиальных опухолей мозга. Концентрация железа трансферрина и степень насыщения трансферрина понижается, а концентрация белка трансферрина повышается по отношению к данным сравнения, как для малых (диаметр до 3 мм), так и для больших опухолей (диаметр от 8 мм). У пациентов с глиальными опухолями мозга обмен железа в организме значительно отличается от обмена железа в организме здоровых людей. Концентрация железа трансферрина в цельной крови, плазме крови, в форменных элементах крови, а также степень насыщения трансферрина железом, определённые для пациентов с глиальными опухолями мозга, превышают данные сравнения. Показатели метаболизма негемового железа определены также в группе пациентов с перегрузкой железом, вызванной излишним поступлением железа в организм в условиях производства. Концентрация железа трансферрина в цельной крови, плазме крови, а также степень насыщения трансферрина железом, определённая в цельной крови для этой группы пациентов, статистически достоверно превышают данные сравнения. Изучено влияние препарата липоевой кислоты на метаболизм негемового железа, а именно, для группы пациентов с перегрузкой железом, вызванной излишним поступлением железа в организм в условиях производства, наблюдается понижение концентрации "лабильного" железа в крови, а также нормализация концентраций железа в составе трансферрина, определённых в цельной крови и плазме крови, после приёма препарата липоевой кислоты.

Ключевые слова: метаболизм негемового железа, количественная спектроскопия электронного спинового резонанса, железо трансферрина, способное хелатироваться железо.

Dudchenko N. O. Distribution of nonheme iron assesed by the electron-spin resonance spectroscopy data. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.02 - biophysics. - Kyiv Taras Shevchenko national University, Kyiv, 2002.

The dissertation is devoted to the improvement of the original methods of quantitative analysis of transferrin iron and labile (chelatable) iron in biological samples using low-temperature ESR-spectroscopy, as well as to the investigation of the non-heme iron methabolism in healthy adults and healthy neonates, and iron methabolism disturbancies in organism (patients and experimental animals with glial brain tumours, patients with hemochromatosis, induced by excessive iron entry to the organism in the occupational conditions) using the improved methods.

Indices of non-heme iron methabolism, namely, ferritin iron concentration, transferrin iron concentration, transferrin protein concentration, transferrin saturation in the blood and plasma as well as concentration of iron chelatable with desferrioxamine B, were determined in the whole blood in reference groups (healthy adults and healthy neonates) for the first time. New index of non-heme iron methabolism is introduced, namely, transferrin iron concentration determined in the blood cells. This index was determined in the groups of healthy adults and neonates. In general, increase in transferrin iron concentration in the whole blood occurs with an increasing transferrin iron concentration in the blood. Experimental glial brain tumours of rats are characterised by hypoferremia whereas human glial brain tumours are characterised by hyperferremia. Indices of non-heme iron methabolism were determined in patients with iron overload caused by excessive iron entry to the organism in occupational conditions and the influence of alpha-lipoic acid on the indices of iron metabolism in this grou of patients has been studied.

Key words: nonheme-iron methabolism, quantitative electron-spin resonanse spectroscopy, transferrin iron, chelatable iron.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Для сучасного стану науки характерне все більш широке застосування точних фізичних методів для дослідження складних біологічних об"єктів.

Залізо є дуже важливим мікроелементом для усіх форм життя, за винятком деяких мікроорганізмів (напр. Lactobacillus plantarum). За розповсюдженістю, залізо є шостим елементом у всесвіті, четвертим - у земній корі, та серед металів - другим після алюмінію. Але не дивлячись на це, доступність заліза для використання біологічними системами ускладнюється тим, що при нейтральному (фізіологічному) рН залізо практично нерозчинне (ДР _Fe(OH)3 = 4*10^-38). Для того, щоб задовольнити свої потреби, живим організмам потрібні сполуки, які спроможні хелатувати залізо і, таким чином, переводити залізо в доступну для використання розчинну форму. Для транспортування заліза мікроорганізми та рослини синтезують сполуки, що мають високу ступінь спорідненості до заліза (сидерофори). Ссавці, зокрема людина, для забезпечення життєвоважливих біохімічних процесів також потребують залізо. Для транспортування та депонування заліза, в організмі тварин синтезуються білки, здатні депонувати та транспортувати залізо - феритин/гемосидерин та білок, що транспортує залізо - трансферин. Сидерофори, навантажені залізом, або входять в клітину в результаті зв'язування з мембранними рецепторами трансферину та феритину, або віддають своє залізо асоційованим з мембраною білкам-переносникам заліза (DMT1 та ін.).

Актуальність теми. Хоча залізо і необхідне для життя, надлишок його може бути фактором ризику виникнення деяких захворювань людини. Зокрема, показано, що надлишок заліза в організмі асоціюється з підвищенням ризику захворювання на рак, діабет, хвороби серцево-судинної системи, ураження центральної нервової системи. Надлишок заліза в організмі в цілому може призводити до розвитку хвороби перевантаження залізом - гемохроматозу. Коли захворювання носить спадковий характер, його називають спадковим, первинним чи ідиопатичним гемохроматозом. Розвиток спадкового гемохроматозу пов'язують насамперед з мутаціями у нещодавно відкритому HFE-гені за гомозиготним типом. Частота гомозиготності становить в середньому приблизно 1 випадок з 200 в Європейській популяції. Частота мутації C282Y становить 2,5%, а частота мутації H63D становить 17% в Українській популяції. Це означає, що з 50 міліонів населення України, біля 250 тисяч людей можуть бути носіями мутантних генів та схильні до розвитку первинного гемохроматозу. Схильність до надмірного накопичення заліза є характерною також для гетерозиготних носіїв мутантних генів гемохроматозу, які складають в середньому біля 13% європейського населення. Це означає, що в Україні 6,5 міліонів населення можуть мати схильність до надмірного накопичення заліза в організмі. Наведені дані свідчать про значну розповсюдженість гену гемохроматозу в европейській популяції. Інші форми гемохроматозу є вторинними за своєю природою. Причини виникнення захворювання можуть бути ендогенними (зокрема, масивне руйнування еритроцитів, підвищене всмоктування заліза в кишечнику) та екзогенними (гемотрансфузії, безконтрольне застосування препаратів заліза, підвищене надходження заліза в організм в умовах виробництва).

Розвиток вторинного гемохроматозу може бути асоційованим з розвитком деяких захворювань (діабет, рак, захворювання печінки, серцево-судинної системи та ін.). На молекулярному рівні при порушеннях статусу заліза в організмі найбільших коливань зазнають саме вміст негемового заліза у складі транспортних і депонуючих білків та лабільного пулу заліза. Кількісне дослідження розподілу заліза у цих формах та їх співвідношення є важливим для вивчення ролі заліза в розвитку паталогій та диагностики захворювань, пов'язаних з порушенням метаболізму заліза в організмі. Існуючі методи кількісного аналізу негемового заліза в біологічних зразках не є достатніми для визначення концентрацій заліза у складі депонуючих та транспортуючих білків, а також лабільного пулу заліза. Таким чином, актуальними є завдання вдосконалення методів кількісного аналізу форм негемового заліза для раннього виявлення перевантаження організму залізом (гіперферимії), тобто, фенотипічного скринінгу населення для виявлення осіб, схильних до надлишкового накопичення заліза в організмі, своєчасної корекції стану пацієнтів, надання своєчасних рекомендацій щодо відповідного способу життя (дієта, фізичні вправи і т. ін.) для обмеження надходження заліза в організм та запобігання подальшого розвитку (прогресування) захворювання.

Наявність характерних та специфічних спектрів ЕСР заліза у складі трансферину та заліза у складі хелатуючого агенту десфериоксаміну В дають можливість визначати концентрацію заліза у складі трансферину та концентрацію заліза у складі лабільного пулу, здатного до хелатування. Визначення концентрації негемового заліза саме у цих формах дає уявлення про порушення обміну заліза в організмі і є актуальним для скринінгу та ранньої діагностики захворювань, пов"язаних з надлишком заліза в організмі.

Зв"язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота пов”язана з темами, в яких брав участь автор:

“Розробка і вдосконалення методів кліничної діагностики, інтенсивної терапії і виходжування новонароджених, профілактики пери- і неонатальної патології”. Державний реєстраційний номер: 01000000618. Тема виконується в відділенні неонатальної патології клініки "Охматдет".

“Розробка методу діагностики новоутворень головного мозку шляхом введення в організм препаратів на сонові сполук заліза, що збільшують контраст в ЯМР-томографії”. Державний реєстраційний номер: 019811001002. Тема була виконана протягом терміну липень 1997 - грудень 1998 в Інституті нейрохірургії ім. акад. А. П. Ромоданова АМН України.

“Розробка поєднаних хірургічних, регіонарних, хіміо-, імуно- та генотерапевтичних технологій лікування гліом півкуль головного мозку” Державний реєстраційний номер: 0199U004590. Тема була виконана в Інституті нейрохірургії ім. акад. А. П. Ромоданова АМН України (1999 - 2001).

“Вивчити основні механізми детоксикації та оцінити ефективність сучасних антидотних засобів при хронічній інтоксикації свинцем та синдромі перевантаження організму залізом”. Державний реєстраційний номер: 01960009096. Тема була виконана протягом 1998 - 1999 років в Інституті медицини праці АМН України.

“Вторинний гемохроматоз як професійне захворювання”. Державний реєстраційний номер: 0100U002244. Тема виконується в Інституті медицини праці АМН України (2000 - 2004).

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи було вивчення особливостей метаболізму негемового заліза в групах здорових дорослих та здорових новонароджених, а також при порушеннях статусу заліза в організмі (пацієнтів, хворих на гліальні пухлини мозку, пацієнтів з гемохроматозом, визваним надмірним надходженням заліза в організм в умовах виробництва). Для досягнення цієї мети, були вдосконалені методики кількісного аналізу заліза у складі трансферину та лабільного пулу заліза в біологічних зразках методом низькотемпературної ЕСР - спектроскопії.

Задачами дослідження були:

Вдосконалити методики кількісного визначення показників обміну негемового заліза в біологічних зразках, в тому числі в цільній крові (вибір умов реєстрації спектрів, відпрацювання підготовки зразків для аналізу, побудова калібрувальних залежностей, та ін.) за допомогою методу низькотемпературної спектроскопії ЕСР.

Визначення показників обміну негемового заліза з використанням розроблених методів в групах порівняння (групах здорових дорослих і новонароджених); оцінка інформативності введених показників.

Вивчення особливостей обміну негемового заліза при гліальних пухлинах мозку людини і експериментальних тварин, і при перевантаженні організму людини залізом внаслідок надлишкового надходження заліза в організм в умовах виробництва.

Оцінка з використанням введених показників обміну негемового заліза в організмі ефективності терапії станів з перевантаженням залізом.

Об”єкт дослідження - цільна кров, плазма та сироватка крові здорових дорослих та новонароджених, пацієнтів з гемохроматозом, викликаним надмірним надходженням заліза в організм в умовах виробництва. Цільна кров, плазма та сироватка крові, а також тканини експериментальних тварин (щурів) з гліальними пухлинами головного мозку та пацієнтів, хворих на гліальні пухлини мозку. Предметом дослідження є розподіл негемового заліза в організмі умовно здорових дорослих та новонароджених, пацієнтів, хворих на гліальні пухлини мозку, пацієнтів з гемохроматозом, викликаним надмірним надходженням заліза в організм в умовах виробництва, за даними спектроскопії електронного спінового резонансу.

Методи дослідження - метод низькотемпературної спектроскопії електронного спінового резонансу. Наявність характерних та специфічних спектрів електронного спінового резонансу заліза у складі трансферину та заліза у складі десфериоксаміну В, за наявності відповідних калібровок, дають змогу визначати концентрацію заліза у складі трансферину та концентрацію заліза у складі лабільного пулу, здатного до хелатування.

Наукова новизна одержаних результатів. Введено нові показники метаболізму негемового заліза: визначені в цільній крові концентрації заліза у складі трансферину, білку трансферину, ступінь насичення трансферину залізом, концентрація заліза у складі лабільного пулу, а також концентрація заліза у складі тансферину в клітинах крові. Введені показники визначені в групах здорових дорослих і здорових новонароджених (дані порівняння) в цільній крові та клітинах крові, а також, в плазмі крові. Вперше виявлені особливості статусу негемового заліза при гліальних пухлинах мозку в групах експериментальних тварин та пацієнтів. Проведено аналіз стану обміну негемового заліза у пацієнтів з перевантаженням залізом, визваним надлишковим надходженням заліза в умовах виробництва, і оцінку ефективності терапії препаратом ліпоєвої кислоти з метою виведення надлишку заліза з організму з використанням розроблених методів.

Практичне значення одержаних результатів.

Вдосконалені специфічні методи визначення показників метаболізму негемового заліза в цільній крові та інших біологічних зразках, методом низькотемпературної спектроскопії ЕСР.

Показано, що введені показники є інформативними для виявлення порушень обміну негемового заліза в організмі.

Одержані дані порівняння по нових показниках обміну негемового заліза в групах здорових дорослих та здорових новонароджених.

Вдосконалена методика готова до використання для проведення фенотипічного скрінінгу пацієнтів з порушеннями статусу заліза в організмі.

Особистий внесок здобувача. Здобувачем вдосконалено методики кількісного визначення концентрації негемового заліза у складі трансферину, концентрації білку трансферину, ступіню насичення трансферину залізом, а також концентрації заліза у складі лабільного пулу в цільній крові, плазмі, сироватці крові, тканинах експериментальних тварин та людини методом низькотемпературної ЕСР-спектроскопії. Здобувачем визначено ці показники в групах здорових новонароджених, здорових дорослих, пацієнтів з гліомами головного мозку та пацієнтів з професійними паталогіями, пов"язаними з надлишковим інгаляційним надходженням заліза в організм. Здобувачем вивчено вплив препарату -ліпоєвої кислоти на показники негемового заліза у пацієнтів з професійними паталогіями, пов"язаними з надлишковим інгаляційним надходженням заліза.

Апробація результатів дисертації. Результати дослідження, що включені до дисертації, оприлюднено на 5-му Міжнародному Симпозіумі "Іони металів в біології та медицині", Нюрнберг/Мюнхен, Німеччина, 8 - 10 травня 1998, 4-му Конгресі Європейськой Гематологічної Асоціації EHA4, Барселона, Іспанія, 9 - 12 червня 1999, Міжнародному симпозиумі “Слідові метали у людині та тварині” TEMA 10, Евіан, Франція, 2-7 травня 1999, Міжнародному конгресі по метаболізму заліза BIOIRON'99, Соренто, Італія, 23-28 травня 1999, 2-ому Міжнародному симпозиумі по біометалам Biometals 2000, Тюбінген, Німеччина, 24-29 квітня 2000, Конференції молодих вчених, присвяченої 71-й річниці заснування Інституту медицини праці АМНУ, Київ, Україна, 29 грудня 1999, 3-й науковій конференції молодих учених "Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології, Київ, Україна, 21-22 лютого 2000, 2-ому Міжнародному Симпозіуму "Актуальні проблеми біофізичної медицини", Київ, Україна, 17-19 травня 2000, 3-му національному конгресу патофізіологів України, Одеса, Україна, 29-31 травня 2000, Конференції молодих учених - 2000 Інституту Біохімії ім. О. В. Палладіна НАНУ, Київ, Україна, 24-25 травня 2000, Всесвітньому конгресі по метаболізму заліза BIOIRON 2001, Cairns, Australia, 18-23 серпня, 2001.

Публікації. Результати дисертації опубліковані в 8 статтях у наукових журналах, у 3 статтях в збірниках наукових праць конференцій. Опубліковано 12 тез у збірниках тез конференцій.

Структура дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (розділи 1 - 3), експериментальної частини (розділи 4 - 8), висновків і списку використаних літературних джерел.

Повний обсяг дисертації складає 112 сторінок, дисертація містить 28 ілюстрацій та 18 таблиць, а також список використаних джерел, який складається із 250 найменувань.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи. В цьому розділі наведені результати роботи по вдосконаленню методик кількісного визначення негемового заліза, включаючи концентрацію заліза у складі трансферину, концентрацію білку трансферину, ступінь насичення трансферину залізом, концентрацію заліза, здатного до хелатування (лабільний пул заліза) в біологічних мікрозразках методом спектроскопії ЕСР. В основі методу лежить наявність характерних та специфічних спектрів ЕСР заліза у складі трансферину та заліза у складі комплексу з хелатуючим агентом десфериоксаміном В.

В цьому розділі наведені матеріали та реактиви, що були використані в роботі, способи приготування калібрувальних зразків комплексів залізо (ІІІ) - трансферин та залізо (ІІІ) - десферіоксамін В, які були використані для побудови калібрувальних залежностей, а також способи підготовки біологічних зразків для визначення вмісту білку трансферину, ступеню насичення трансферину залізом, та концентрації заліза, здатного до хелатування в біологічних зразках.

Далі наведені власне методики, які використовувалися для кількісного визначення заліза у складі феритину, трансферину, концентрації білку трансферину та ступеню насичення трансферину залізом, а також концетрації заліза, здатного до хелатування з використанням методу низькотемпературної спектроскопії ЕСР. Принциповою і досі невикористаною є можливість визначати методом кількісної спектроскопії ЕСР такі параметри як концентрація заліза у складі трансферину, концентрація білку трансферину і ступінь насичення трансферину залізом у мікрозразках цільної крові, яка була втілена в цій роботі.

Було виявлено, що при високому ступеню насичення трансферину залізом ступінь насичення визначений в зразках плазми та сироватки крові виявляється меншим за ступінь насичення, визначений в цільній крові тих самих пацієнтів. Можна припустити, що це явище пояснюється втраченням високонасиченого трансферину при одержанні плазми крові і сироватки з цільної крові. Для адекватної діагностики саме при високих ступенях насичення трансферину залізом важливою є можливість визначення концентрації заліза трансферину і ступіню насичення трансферину залізом в цільній крові.

Останнім часом в клінічних дослідженнях визначають параметри, що характеризують клітини крові, зокрема, концентрація феритину у формених елементах крові. Проте такі показники як вміст заліза трансферину в цільній крові і формених елементах крові досі ще не визначались. В цій роботі було оцінено концентрацію заліза у складі трансферину у формених елементах крові , користуючись експериментальними значеннями концентрації заліза у складі трансферину плазми крові і цільній крові і співвідношенням

.

Вважаємо, що можна ввести новий індекс обміну негемового заліза - концентрація заліза трансферину у формених елементах крові. В цілому спостерігається зріст концентрації заліза трансферину в клітинах крові при підвищенні концентрації заліза трансферину в цільній крові. Середнє значення цього параметру в групі здорових новонароджених значно (втричі) достовірно перевищує відповідне значення, визначене в групі здорових дорослих.

В цьому ж розділі наведені дані щодо кинетики зв”язування заліза зі складу ядра феритину з десферриоксаміном В в суспензії феритину, яку було оцінено використовуючи експериментальні спектри ЕСР феритину. В суспензії феритину одразу реєструється залізо, що включається в комплекси з десфериоксаміном В. При подальшій інкубації суспензії з розчином десфериоксаміну В, зростає концентрація заліза у складі комплексів з десфериоксаміном В. Загальна концентрація заліза в суспензії феритину з концентрацією 80 мг/мл, згідно одержаних нами даних, як було визначено за методом з десфериоксаміном В після інкубації в кислому середовищі в присутності відновника, дорівнює 122 мМ. Цій концентрації заліза відповідає ступінь заповнення феритину залізом 810 атомів на молекулу білку (ступень заповнення біля 18%). Ззовні ядра згідно наших даних знаходиться 0,63 мМ заліза. Тобто лише 0,5% від загальної концентрації заліза в суспензії феритину знаходиться ззовні ядра феритину.

Результати роботи вказують, що відпрацьовано процедуру визначення методом ЕСР мікромолярних концентрацій заліза, що здатне до хелатування в біологічних тканинах, по утворенню парамагнітного комплексу з десфериоксаміном В, для аналізу достатньо зразка вагою 20-50 мг. Процедура аналізу є досить простою і включає мінімальні маніпуляції із зразками.

Одержані для серії зразків тканин внутрішніх органів та мозку мишей, щурів та кролів порівняльні дані щодо концентрації заліза, яке хелатується, добре узгоджуються з аналогічними літературними даними, одержаними з використанням інших більш трудомістких методів.

Важливо підкреслити, що наведена методика визначення концентрації заліза, здатного до хелатування, як і всі інші, відомі з джерел літератури, є методикою оцінки концентрації саме заліза, що здатне до комплексоутворення в умовах вимірювання. Цей показник є важливим для порівняння доступності заліза для використання в різних тканинах. Такий підхід застосовували, наприклад, порівнюючи розчинність заліза зі складу феритину та гемосидерину, вилучених з тканин хворих на первинний та вторинний гемохроматоз, в кислому середовищі, що містить оксалат калію.

Результати досліджень і їх обговорення. Для правильної постановки диагнозу та отримання адекватної інформації про запаси заліза в організмі, важливо мати відповідні дані порівняння, тобто значення показників обміну негемового заліза для здорової людини.

В групі здорових дорослих (n = 17), яка складалася з 8 чоловіків та 9 жінок віком 39,514,3 років були досліджені параметри обміну негемового заліза, а саме концентрація гемоглобіну та рівень гематокриту, концентрація заліза трансферину в крові, плазмі та клітинах крові, концентрація білку трансферину , визначена в цільній крові, ступінь насичення трансферину , визначений в цільній крові, концентрація заліза у складі феритину в крові та плазмі крові, концентрація заліза, здатного до хелатування з десферіоксаміном В , визначений в цільній крові, з використанням розроблених методик. Концентрація заліза у складі трансферину в цільній крові здорових дорослих складає 15,72,9 мкМ. Концентрація заліза у складі трансферину в цільній крові та клітинах крові здорових жінок (16,83,4 мкМ та 6,13,5 мкМ, відповідно) перевищує концентрацію заліза трансферину в крові та клітинах крові здорових чоловіків (14,51,9 мкМ та 4,44,0 мкМ, відповідно). Концентрація заліза, що хелатується (~10 мкМ), визначена в клітинах крові, перевищує таку, визначену в плазмі (~6 мкМ) і цільній крові (~7 мкМ). Концентрація заліза феритину, визначена в клітинах крові перевищує таку, визначену в цільній крові та плазмі крові як у чоловіків, так і у жінок.

З метою визначення особливостей метаболізму негемового заліза при гліальних пухлинах мозку, була проведена оцінка стану обміну негемового заліза при експериментальних гліальних пухлинах головного мозку щурів, а також у хворих з гліомами головного мозку.

При експериментальних гліальних пухлинах мозку тварин виявлено зниження концентрації заліза у складі трансферину і ступеню насичення трансферину, визначених в цільній крові відносно даних порівняння. Концентрації заліза трансферину в цільній крові тварин з малими (29,610,7 мкМ) і великими (27,96,7 мкМ) пухлинами значно нижча за дані порівняння (33,85,8 мкМ), що вказує на розвиток гіпоферемії. Концентрація білку трансферину в цільній крові щурів з малими (68,829,7 мкМ) та великими (55,726,2 мкМ) пухлинами перевищує дані порівняння (43,914,3 мкМ). Ступені насичення трансферину, визначеня в цільній крові, суттєво і достовірно зменшуються у тварин як з малими (25,113,7%), так і з великими (28,19,2%) пухлинами по відношенню до даних порівняння (40,913,7%). Спостерігається значне підвищення індексу заліза у складі білків, що його депонують в крові, печінці, пухлинній тканині, кортексі протилежної півкулі симетрично пухлині, гіпоталамусі, а саме, в області пухлини він складає 10,57,0 мкг/г і в кортексі протилежної півкулі симетрично пухлині - 7,03,1 мкг/г по відношенню до даних порівняння (3,51,2 мкг/г) вже на початковій стадії росту пухлин. Тобто, мозок в цілому збагачується на залізо феритину/гемосидерину при розвитку гліальних пухлин мозку щурів. Концентрація заліза, здатного до хелатування з десфериоксаміном В підвищується в тканинах печінки і усіх досліджуваних тканинах мозку, крім гіпоталамусу, в процесі розвитку експериментальних гліальних пухлин мозку.

Пацієнтам з гліальними пухлинами головного мозку притаманна гіперферемія, що проявляється статистично достовірним підвищенням концентрації заліза трансферину в крові (19,52,9 мкМ) і плазмі крові (29,94,7 мкМ) та ступіню насичення трансферину (33,610,0%), визначеного в цільній крові, на відміну від тварин з експериментальними гліальними пухлинами мозку, яким притаманна гіпоферимія.

При гліальних пухлинах, мозок збагачується на залізо феритину/гемосидерину як у пацієнтів, так і у експериментальних тварин: в пухлинній тканині мозку і прилеглій до неї перифокальній зоні значно і статистично достовірно підвищується концентрація заліза у складі феритину (гемосидерину) порівняно з концентрацією депонованого заліза у перифокальній зоні, віддаленій від пухлини, і в цільній крові. Концентрація заліза феритину значно (в 3-4 рази) і статистично вірогідно вища в пухлинній тканині (135129 мкМ) і перифокальній зоні, прилеглій до пухлини, (182162 мкМ), порівняно з перифокальною зоною, віддаленою від пухлини (5021 мкМ), та вища за концентрацію заліза феритину в крові і плазмі крові тих самих пацієнтів. Концентрація заліза, здатного до хелатування з десфериоксаміном В, у пацієнтів, хворих на гліальні пухлини головного мозку значно і статистично достовірно підвищується в зоні пухлини (15,68,9 мкМ) і прилеглій до неї перифокальній зоні (18,24,2 мкМ) в порівнянні з концентрацією у зоні, віддаленій від пухлини (6,6 мкМ), в цільній крові (6,51,4 мкМ) і плазмі крові (5,9 мкМ).

Виявлені особливості метаболізму заліза вказують на нові, потенційно ефективні підходи до ранньої діагностики гліальних пухлин головного мозку з урахуванням низки параметрів обміну заліза в організмі і терапії з використанням хелаторів заліза як антипроліферативних агентів.

Вперше методом кількісної спектроскопії були визначені концентрація заліза у складі трансферину, концентрація білку трансферину і ступінь насичення трансферину залізом в цільній крові пацієнтів з вторинним професійним гемохроматозом (Таблиця 1). Розглянуті питання щодо інформативності показників метаболізму негемового заліза, визначених за допомогою методу низькотемпературної ЕСР-спектроскопії, для моніторінгу пацієнтів з професійними паталогіями, що пов"язані з надлишковим інгаляційним надходженням заліза в організм, та проведена оцінка ефективності препарату ліпоєвої кислоти в нормалізації показників метаболізму негемового заліза при гіперфереміях.

Показано, що концентрація заліза у складі трансферину та ступінь насичення трансферину залізом в цільній крові пацієнтів з професійним вторинним гемохроматозом достовірно вищі, ніж відповідні показники, визначені в групі порівняння.

Таблиця 1. Концентрація заліза у складі трансферину в цільній крові і плазмі крові, концентрація білку трансферину в цільній крові , ступінь насичення трансферину залізом в цільній крові пацієнтів з перевантаженням організму залізом (вік 46,37,2 років) і дані порівняння, визначені в групі здорових дорослих (вік 39,5 12,0 років).

Примітки: зріст, N: в межах інтервалу порівняння

З використанням введених показників, показано, що препарат ліпоєвої кислоти ефективно нормалізує стан обміну негемового заліза у пацієнтів з професійним вторинним гемохроматозом стимулюючи вивод заліза із організму з сечею внаслідок хелатування заліза.

В модельних експериментах показано, що ліпоєва кислота не конкурує з трансферином за залізо, і зв"язує виключно нетрансферинове залізо. Можна вважати, що відомі позитивні ефекти ліпоєвої кислоти як антиоксиданта, принаймні частково, пов"язані з нормалізацією статусу заліза в організмі і зменшенням концентрації "лабільного" заліза в тканинах і нетрансферинового заліза в крові, з яким, головним чином, пов"язують ураження тканин при гіперферемії.

Перевантаження і дефіцит заліза можуть грати важливу роль у патогенезі захворювань у новонароджених. З метою визначення даних порівняння (показників метаболізму негемового заліза для здорових новонароджених), було проведено дослідження стану обміну негемового заліза в групі умовно здорових новонароджених (були визначені концентрації заліза трансферину, білку трансферину, ступінь насичення трансферину в цільній крові і плазмі крові здорових новонароджених). Дані щодо показників обміну негемового заліза у здорових новонароджених наведені в таблиці 2.

Таблиця 2. Концентрація гемоглобіну , показник гематокриту, концентрація заліза у складі трансферину в цільній крові, клітинах крові і плазмі крові, концентрація білку трансферину в цільній крові , ступінь насичення трансферину залізом в цільній крові , індекс заліза у складі феритину в цільній крові і плазмі крові в групах здорових вчасно народжених немовлят віком 2 - 6 діб і здорових дорослих віком 39,5 12,0 років та зміни параметрів у немовлят відносно дорослих

Примітки: зріст, зменшення, N: в межах інтервалу порівняння

Концентрація заліза трансферину в клітинах крові новонароджених більш ніж втричі перевищує таку у здорових дорослих. Показники, визначені в цільній крові є інформативними для виявлення різниці в стані обміну негемового заліза груп новонароджених різного віку. Концентрація заліза трансферину та ступінь насичення трансферину в цільній крові швидко знижуються одразу ж після народження. При цьому найбільших змін зазнає саме ступінь насичення трансферину в цільній крові.

ВИСНОВКИ

Вдосконалені специфічні методики кількісного аналізу заліза у складі трансферину та лабільного пулу заліза в біологічних зразках, в тому числі в цільній крові, методом низькотемпературної ЕСР - спектроскопії. Ця методика готова до використання для проведення фенотипічного скрінінгу пацієнтів з порушеннями статусу заліза в організмі.

Показано, що визначення заліза трансферину і насичення трансферину в цільній крові при високому ступені насичення трансферину залізом є більш інформативним для оцінки перевантаження залізом, в зв”язку з втратою високонасиченого трансферину при одерженні плазми крові і сироватки з цільної крові.

Вперше визначені концентрація заліза у складі трансферину, ступінь насичення трансферину та концентрація білку трансферину та концентрація заліза, здатного до хелатування з десферіоксаміном В в цільній крові здорових дорослих та новонароджених.

Введено новий показник - концентрація заліза у складі трансферину в клітинах крові. Показано, що концентрація заліза у складі трансферину в клітинах крові у здорових дорослих і новонароджених підвищується з підвищенням концентрації заліза у складі трансферину в цільній крові.

Вивчені особливості статусу негемового заліза при гліальних пухлинах мозку в групах експериментальних тварин та пацієнтів. При експериментальних гліальних пухлинах мозку виявлено гіпоферимію, а при гліальних пухлинах мозку людини спостерігаться гіперферимія. Як експериментальним тваринам, так і пацієнтам з гліальними пухлинами мозку притаманно накопичення заліза у складі білків, що його запасають та заліза, здатного до хелатування, в пухлинній тканині та перифокальній зоні прилеглій до пухлини.

Визначено показники обміну негемового заліза у пацієнтів з перевантаженням залізом, викликаним надлишковим надходженням заліза в умовах виробництва, і показано інформативність введених показників обміну негемового заліза для оцінки ефекту препарату ліпоєвої кислоти в нормалізації обміну негемового заліза в цій групі пацієнтів.

СПИСОК ПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Дудченко Н. А., Михайлик О. М. Визначення в біологічних тканинах концентрації заліза, що хелатується, методом спектроскопії електронного спінового резонансу // Український біохімічний журнал - 1999. - Т. 71, №3. - С. 122-127.

2. Дудченко Н. О., Михайлик О. М. Концентрація заліза трансферину і ступінь насичення трансферину, визначені в цільній крові // Український біохімічний журнал - 2000. - Т. 72, №3. - С. 43-50.

3. Н. О. Дудченко, О. М. Михайлик, І. П. Лубянова. Вплив препаратів -ліпоєвої кислоти на рівень білірубіну, трансферину та вміст заліза у складі феритину і трансферину // Український біохімічний журнал - 2001. - Т. 73. , №2. - С. 102-105.

4. Mykhaylyk O.M., Dudchenko N.A. Nonheme iron determination in biological samples on evidence derived from electron spin resonance data. In: Metal Irons in Biology and medicine. - V. 5. - Paris. France: John Libbey Eurotext, 1998. - P. 3-7.

5. Mykhaylyk, O. M., Zozulya, Y. P., Razumenko, V. D., Cherchenko, A. P., Dudchenko, N. A. Glial brain tumour in patients is associated with hyperferremia in the blood, plasma, tumour and peritumoural brain tissue. In: Mengen- und Spuren-Elemente. - Verlag Harald Schubert, Leipzig, 1999. - p. 592-599.

6. Mykhaylyk, O. M., Dudchenko, N. A., Pyasetskaya, N. M., Orlova, T. A., Loubyanova, I. P. Nonheme iron exchange indices in the whole blood of healthy adults and neonates. In: Mengen- und Spuren-Elemente. - SCHUBERT-Verlag, Leipzig, 2000. - p. 489-496.

7. Кундиев Ю. И., Лубянова И. П., Михайлик О. М., Дудченко Н. О., Лампека Е. Г. Препарат альфа-липоевой кислоты Берлитион 300 ораль как средство коррекции изменений в организме, связанных с гиперферремией // Фармакологічний вісник. - 2000. - С. 6 - 9.

8. Зозуля Ю. П., Михайлик О. М., Розуменко В. Д., Черченко А. П., Дудченко Н. А., Лєбєдєв Є. О., Шурунов Б. С. Особливості обміну негемового заліза в організмі хворих з гліомами головного мозку // Український нейрохірургічний журнал - 2000. - № 2. - С. 29 - 37.

9. Кундиев Ю. И., Лубянова И. П., Михайлик О. М., Дудченко Н. О., Лампека Е. Г. Препарат альфа-липоевой кислоты Берлитион 300 ораль как средство коррекции изменений в организме, связанных с гиперферремией // Медицина труда и промышленная экология. - 2001. - № 1. - С. 14 - 18.

10. Зозуля Ю. П., Михайлик О. М., Черченко А. П., Розуменко В. Д., Дудченко Н. О., Лєбєдєв Є. О., Шурунов Б. С. Особливості метаболізму негемового заліза при експериментальних гліальних пухлинах мозку щурів (огляд літератури та власних досліджень) // Журнал АМН України. - 2001. - Т. 7, № 1. - С. 3 - 21.

11. Михайлик О.М., Дудченко Н. О., Лубянова І.П. Показники обміну негемового заліза в організмі здорових дорослих // Современные проблемы токсикологии. - 2002. - №. 1. - С. 83-94.

Размещено на Allbest.ru