Біологічні особливості штамів IRPEX LACTEUS FR - продуцентів протеїну з молокозсідальною дією

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Біологічні особливості штамів IRPEX LACTEUS FR. - продуцентів протеїна з молокозсідальною дією

Бойко Сергій Михайлович

1.Загальна характеристика роботи

міцелій молокозсідальний фермент

Актуальність теми. Виявлення нових продуцентів кормових та харчових білків, а також різних біологічно активних речовин, та розробка наукових основ їх культивування на рівні організму та клітини, є актуальними завданнями сучасної біотехнології. Дослідження в галузі експериментальної мікології, зокрема вивчення фізіології і біохімії вищих грибів, дозволило віднести останні в ряд перспективних об'єктів біотехнології. Багато з них відомі не тільки як продуценти харчових білків (Горленко, 1983; Дудка та ін., 1985, 1988; Белова, 1990), але і біологічно активних речовин (Даниляк та ін., 1989; Белова, 1991; Агужен, 1997; Нікітіна, 1999; Grzywnowicz, 2001), що мають широкий спектр дії (антибактеріальна, протипухлинна, фібринолітична, фітотоксична, молокозсідальна та ін.).

Дослідження фізіології і біохімії вищих базидіальних грибів значно розширилися за останні 30 - 40 років (Бисько, 1983; Соломко та ін., 1985, 2000; Klan et al., 1990) і носять більш планомірний характер. Цьому сприяло успішне культивування грибів на живильних середовищах і їх здатність синтезувати в культурі різноманітні біологічно активні речовини.

Вивчення протеолітичної активності вищих базидіоміцетів має безсумнівний інтерес, тому що дає змогу одержати більш повну картину їх біохімічної діяльності й одночасно з'ясувати розподіл цієї активності за таксономічними групами (Денисова, 1990; Псурцева та ін., 1996). Крім того, гострий дефіцит протеолітичних ферментів в усьому світі стимулює розгорнуті дослідження з пошуку нових продуцентів протеїназ.

Дві обставини обумовлюють пошук ферментів харчового і медичного призначення серед вищих базидіоміцетів: наявність значного числа їстівних грибів і відсутність спороношення в культурі (останнє зменшує небезпеку фахових захворювань в умовах виробництва). Це є перевагою вищих грибів перед традиційним джерелом протеїназ - мікроміцетами.

Гострий дефіцит сичужного ферменту - реніну в багатьох країнах світу спонукає учених на пошук нових джерел одержання цього ферменту. Дані дослідження охопили хоча і численну, але досить вузьку групу організмів. Замінники сичужного ферменту, в основному одержують з мікроміцетів. Дослідження з виявлення замінників сичужного ферменту серед вищих грибів проводяться в багатьох країнах світу. Вони показали, що ферментні препарати сичужної дії, отримані з базидіоміцетів, за своєю активністю ні в чому не поступаються ферментним препаратам, які використовуються у промисловості. Встановлено, що гриб Irpex lacteus Fr. утворює протеїнази молокозсідальної дії, які можуть стати замінниками сичужного ферменту (Kobayashi et al., 1983, Kikuchi, 1985).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дослідження виконувались в рамках комплексної держбюджетної теми № ДР 0196U013135 "Отримати та апробувати нові високоактивні штами базидіальних грибів, розробити на їх основі технології виробництва цінних біопрепаратів та харчових продуктів", яка виконується за замовленням Міністерства освіти та науки України.

Мета і завдання дослідження. Метою роботи було дослідити біологічні особливості штамів сапротрофного дереворуйнівного гриба Irpex lacteus Fr. для обгрунтування перспективності використання його в якості продуцента протеїназ молокозсідальної дії.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися такі завдання:

виділити культури сапротрофного дереворуйнівного гриба I. lacteus та провести їх скринінг на здатність до синтезу молокозсідальних протеїназ;

вивчити морфологічні та біохімічні особливості відібраних штамів;

визначити оптимальні умови культивування (температура, кислотність живильного середовища), що впливають на синтез протеїназ молокозсідальної дії;

з'ясувати специфіку вуглецевого живлення штамів-продуцентів;

дослідити фізіологічні особливості селекціонованих штамів-продуцентів при тривалих термінах їх культивування та впливу віку інокулюма на синтез молокозсідальних протеїназ;

оптимізувати живильне середовище методом математичного планування експерименту та за допомогою введення різноманітних біологічно активних речовин;

одержати ферментний препарат молокозсідальної дії та вивчити його біохімічні властивості.

Об'єкт дослідження. Штами сапротрофного дереворуйнівного гриба I. lacteus, що зростали на території Донецької області.

Предмет дослідження. Здатність відібраних штамів I. lacteus до активного синтезу протеїназ молокозсідальної дії та дослідження властивостей цих протеїназ.

Методи дослідження. Для досягнення поставленої мети використані методи культурально-морфологічних досліджень, за допомогою яких виділено в чисту культуру I. lacteus, досліджено морфологію вегетативного міцелію та оцінена швидкість лінійного росту. Методи фізіолого-біохімічних досліджень застосовані для вивчення впливу екологічних факторів (температура, кислотність середовища), різних джерел вуглецевого живлення, складу поживного середовища на ріст I. lacteus та активність протеїназ молокозсідальної дії; методи математичного планування експериментів - для оптимізації складу живильного середовища з метою збільшення синтезу молокозсідальних протеїназ; статистичні методи - для оцінки вірогідності одержаних результатів.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше широко вивчались культури Irpex lacteus, які виділено з плодових тіл, що зростають в природних та штучних насадженнях Донецької області, та дана оцінка їх перспективності, як продуцентів протеїназ молокозсідальної дії.

Отримано дані про вплив температури культивування та рН середовища на ріст та біосинтетичну діяльність гриба. Встановлено, що при зростанні культур на середовищах з різною кислотністю, максимальний рівень активності протеїназ "сичужної" дії спостерігався при 3,5-4,0 рН. Кислотність живильного середовища у межах 5,1-6,0 позитивно діє на ріст міцелію грибів.

Вперше отримано дані про схожість культур I. lacteus за електрофоретичною рухливістю внутрішньоклітинних ізоферментів пероксидази та позаклітинних білків.

Отримано додаткові дані про ступінь використання базидіальним грибом I. lacteus різноманітних вуглеводів у якості джерела вуглецевого живлення. Досліджувані культури зростали швидше й інтенсивніше продукували молокозсідальні протеїнази на живильних середовищах, що містять глюкозу (штам Д-1, Д-4, Д-9, БН-3), ксилозу (штам Д-9) та крохмаль (штам Д-4).

У кількох активних культур (Д-1, Д-4, Д-9, БН-3) досліджена динаміка синтезу молокозсідальних протеїназ та накопичення біомаси, зміна рН живильного середовища і продуктивності синтезу білків при 30 добовому культивуванні.

Встановлено, що вік інокулюму не впливає на активність молокозсідальних ферментів.

Підібрано кількісні співвідношення компонентів живильного середовища, що дозволило зменшити їх витрату і збільшити біосинтез протеїназ молокозсідальної дії штамом БН-3 у 2,2 рази. Вивчено вплив різноманітних добавок до живильного середовища (екстракт картопляних паростків, натуральне молоко), на фізіологічний стан штамів I. lacteus. Вперше визначено, що додавання молока до складу живильного середовища у незначній кількості (1 мл на 1000 мл) після стерилізації призводить до більш значного накопичення біомаси (1,3-1,7 рази) ніж при додаванні його до стерилізації.

Здійснено одержання ферментного препарату молокозсідальної дії з культурального фільтрату штамів I. lacteus шляхом фракціонування сірчанокислим амонієм, очищення методом діалізу та ліофільним висушуванням.

Встановлено, що найбільш активною фракцією білків є фракція, яка була отримана при 80% насиченні культуральної рідини сірчанокислим амонієм, в ній спостерігався макимальний рівень питомої молокозсідальної активності.

Встановлено, що кристали протеїназ молокозсідальної дії, що були отримані з культуральної рідини штамів Д-1, Д-4, Д-9 і БН-3 I. lacteus мають схожість з кристалами ферментів тваринного походження.

Визначено якісний амінокислотний склад активної фракції молокозсідального ферментого препарату, у якій виявлені у великих кількостях аспарагінова та глутамінова кислоти. Це вказує, що фермент відноситься до кислих протеїназ.

Отримано нові дані про активність ферментного препарату молокозсідальної дії з I. lacteus при зміні кислотності і температури розчинника. Встановлено, що даний ферментний препарат активний при кислих значеннях рН. Оптимум його дії спостерігався при 3,05-4,20 рН. Зміна рН у лужний бік викликає падіння активності препарату. В інтервалі температур 7-37°С досліджені препарати молокозсідальної дії мали стабільну активність. Починаючи з 47°С спостерігається зниження їх активності. Температура 57°С повністю інгібує активність протеїназ молокозсідальної дії I. lacteus.

Практична цінність роботи. Отримані нові експериментальні дані з біології гриба I. lacteus дозволили нам відібрати культури Д-1, Д-4, Д-9, БН-3 як перспективні продуценти протеїназ молокозсідальної дії.

Завдяки простоті культивування, відсутності плодоношення у культурі та високому рівню синтезу протеїназ молокозсідальної дії ці штами є цінними біотехнологічними об'єктами і тому їх відправлено до спеціалізованої колекції культур Інституту ботаніки ім. М.Г. Холодного НАН України.

На штам Д-4 I. lacteus, як продуцент молокозсідального ферменту, отримано патент України № 34088 А.

Отримані результати використовуються в курсі лекцій з загальної мікології та при проведенні лабораторних занять з спецкурсу "ферментологія" на біологічному факультеті Донецького національного університету.

Особистий внесок здобувача. Робота є самостійним дослідженням здобувача, яким селекціонована 21 культура сапротрофного дереворуйнівного гриба Irpex lacteus, визначені їх культурально-морфологічні ознаки, досліджено вплив 8 температурних, 8 кислотних режимів, 6 вуглеводних сполук на зміну молокозсідальної активності, накопичення біомаси, споживання глюкози, зміну концентрації білку у культуральній рідині та зміну кислотності середовища. Оптимізовано живильне середовище з метою збільшення виходу протеїназ сичужної дії, отримано ферментні препарати молокозсідальної дії з 4 культур I. lacteus та визначені їх амінокислотний склад, електрофоретична рухливість, субстратна специфічність.

Апробація роботи. Матеріали дисертації подані на: IV, V Всеукраїнських студентських наукових конференціях "Охорона навколишнього середовища і раціональне використання природних ресурсів"(Донецьк, 1994, 1995); I, II Всеукраїнських студентських наукових конференціях "Україна: людина, суспільство, природа" (Київ, 1995, 1996); VI Конференції молодих вчених "Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики" (Київ, 1996); Ninth International Conference "Root and butt rots" (Carcans, France, 1997); Конференції професорсько-викладацького складу (Донецьк, 1997); I Міжнародній конференції "Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов" (Донецьк, 1997); Міжнародній конференції "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии" (Москва, 1998); Конференції молодих вчених "Актуальні питання ботаніки та екології" (Херсон, 1998); Міжнародній конференції "Питання біоіндикації і екології" (Запоріжжя, 1998); II International Symposium on Plant Biotechnology (Kyiv, 1998); Міжнародній конференції "Проблемы микробиологии и биотехнологии" (Минск, 1998); Конференції молодих вчених "Актуальні питання ботаніки та екології" (Ніжин, 1999); Науковому семінарі "Сучасна екологія і проблеми сталого розвитку суспільства" (Львів, 1999); XVI International botanical congress (St. Louis, 1999); Міжнародній науково-практичній конференції "Геоэкологические и биоэкологические проблемы северного причерноморья" (Тирасполь, 2001); Всеукраїнській конференції студентів, аспірантів та молодих вчених "Біорізноманіття природних і техногенних біотопів України" (Донецьк, 2001).

За підсумками проведеної роботи, на конкурсній основі, відповідно до Постанови Президії Комітету Державних премій України в галузі науки і техніки від 26 жовтня 2000 року № 2, автору присуджено стипендію Кабінету Міністрів України.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 23 роботи, з них 6 статей в періодичних наукових фахових виданнях України (Вісник Донецького університету, Вісник проблем біології і медицини, Науковий вісник "Сучасна екологія і проблеми сталого розвитку суспільства", Збірник наукових праць Луганського державного аграрного університету) та отримано патент України № 34088А.

Структура та обсяг роботи. Дисертаційна робота викладена на 198 сторінках та складається із вступу, 8 розділів, висновків, списку використаних джерел (332 найменування, з них 107 іноземних). Робота ілюстрована 17 таблицями та 60 рисунками.

Автор висловлює подяку всім співробітникам кафедри фізіології рослин Донецького національного університету за сприяння при виконанні даної роботи.

Зміст роботи

Огляд літератури

Огляд літератури складається з трьох розділів, в яких висвітлено питання практичного використання біологічно активних речовин базидіоміцетів та розглянуто їх особливості за протеолітичною активністю, а також наведено дані про пошук та використання ферментних препаратів молокозсідальної дії тваринного та грибного походження.

Об'єкти і методи досліджень

Об'єктами наших досліджень були 20 культур (ВА, ВС, СДВ, БН-3, БН-5, БН-9, БН-10, БН-12, БН-13, БН-17, Д-1, Д-4, Д-7, Д-8, Д-9, С-3, С-5, С-11, С-12, С-15) сапротрофного дереворуйнівного гриба I. lacteus, які зростали на території Донецької області. Культивування проводили на рідкому глюкозо-пептоному живильному середовищі (Федорова, Шиврина, 1974). Стерильне живильне середовище інокулювали 7-ми добовим міцелієм.

Лінійну швидкість росту культур I. lacteus визначали на картопляно-глюкозному агарі при температурі: 25, 27, 30, 32, 35, 37 та 40 °С. Діаметр колонії культур вимірювали раз на добу. Середню радіальну швидкість росту визначали за формулою:

де, Rt - радіус колонії у час t; Ro - радіус колонії у час to.

Під час експериментів визначали загальну та питому активності протеїназ. Субстратом було свіже натуральне молоко, казеїн та тромби крові.

Визначення молокозсідальної активності (МЗА) культурального фільтрату і ферментного препарату здійснювали за допомогою методу Каваі і Мукаі (Kawai, Mukai, 1970). Отримані значення переводили в умовні одиниці (Типограф, Петина, 1966) за формулами:

 од/мл,

од/г,

де, 40 - середній час (у хвилинах) згортання молока, при виробництві сиру; К - коефіцієнт розбавлення культурального фільтрату або кристалічного препарату ферменту; П - час (у хвилинах), за який із 100 мл молока при додаванні 1 мл культурального фільтрату або 1 мл 0,1% розчину ферменту, утворюється щільний згусток; а- наважка ферментного препарату, г.

Питому молокозсідальну активність визначали за формулою:

од/мг,

де, МЗАкф - молокозсідальна активність культурального фільтрату (од/мл); Сб - концентрація білку в 1 мл культурального фільтрату.

Розрахунок казеїназної активності препарату проводили за формулою:

,

де, ПА - протеолітична активність в одиницях на 1 г препарату; ОП - оптична густина, визначена на ФЕК; 4 - відношення об'єму реакційної суміші після додавання ТХУ до об'єму розчину ферменту; Р - об'єм води, у якому розчинена вихідна наважка; ТЕ - тирозиновий еквівалент; 15 - час гідролізу субстрату, у хвилинах; а - наважка препарату, в г.

Метод визначення тромболітичної активності заснований на урахуванні лізісу експериментально отриманих тромбів із крові людини (Псурцева, Денисова, 1982). Значення тромболітичної активності в умовних одиницях визначали відповідно до формули:

,

де, t - час лізісу тромбу, у годинах; 50 - нормувальний множник, отриманий із вибору граничних умов.

Зміну рН живильного середовища реєстрували потенціометричним методом. Рівень накопичення біомаси визначали ваговим методом (Петербургский, 1968). Кількість білку у культуральному фільтраті визначали за методом Бредфорда (Bradford, 1976). Визначення цукрів, що редукують, проводили за методом Бертрана (Ермаков, 1987). Фотознімки мікрооб'єктів проводили на мікроскопі "Биолам Р4У4. 2", з'єднаним з фотоапаратом "Zorki-4k", за допомогою спеціального тубуса "МФН-12У4.2".

Продуктивність синтезу білків на 1 г міцелію визначали за формулою:

,

де, Бх - кількість білку (мг) в 1 мл культурального фільтрату; Бконт - кількість білку (мг) в 1 мл стерильного живильного середовища до інокулювання; m - маса сухого міцелію, отримана з 1 мл живильного середовища, у г.

Вивчення дії чинників росту на фізіологічний стан культур проводили при додаванні екстракту паростків картоплі і натурального молока (1-10 мл молока на 1000 мл живильного середовища) до складу живильного середовища.

Оптимізацію складу глюкозо-пептоного живильного середовища здійснювали шляхом зміни кількісного співвідношення компонентів.

Одержання ферментного препарату молокозсідальної дії здійснювали шляхом фракціонування культурального фільтрату сірчанокислим амонієм (Діксон, Уэбб, 1982) та наступним його очищенням від солей та низькомолекулярних білків методом діалізу і ліофільним висушуванням.

Електрофоретичні дослідження білків і ізоферментів пероксидази проводили в поліакриламідному гелі (Сафонов, Сафонова, 1971) на апараті конструкції Трувеллера, Нефедова (Трувеллер, Нефедов, 1974).

Вивчення амінокислотного складу отриманих ферментних препаратів здійснювали за допомогою розподільної хроматографії на папері (Андреева, 1971).

Експерименти проводилися в трьохкратній повторності. Отримані дані піддавалися статистичній обробці (Лакин, 1980, Негруцкий, Фильчаков, 1984, Фильчаков, 1982).

2.Результати досліджень та їх обговорення

1. Морфологічні та фізіолого-біохімічні ознаки культур Irpex lacteus Fr.

Визначено, що культури Irpex lacteus мають діметичну (dimitic) гіфальну систему. Ширина генеративних гіф дорівнює 4 m, а скелетних - 6,4 m.

Встановлено, що для швидкого лінійного росту міцелію, найкращою є температура, для культур ВА, БН-12, Д-1, Д-7 - 27-32°С, для культур СДВ і С-12 - 32-35°С, для культур БН-3, БН-13, С-11 - 27-35°С, для культур БН-10, Д-8 - 30-35°С, для культур БН-5, С-3 - 30-32°С, для культур ВС, БН-9, БН-17, Д-4, Д-9, С-5 - 32°С і для культури С-15 - 35°С.

Електрофоретичні дослідження білків міцелію і культурального фільтрату 20 культур I. lacteus показали, що внутрішньоклітинний білковий комплекс відрізняється більшою різноманітністю білків і концентрацією у порівнянні з позаклітинними білками. Простежується закономірність, що усі культури мають загальні низькорухливі білки з відносною електрофоретичною рухливістю (ВЕР) 0,08 і 0,12. Для більшості досліджуваних культур характерним є наявність позаклітинних білків з ВЕР 0,30-0,38 (85 %) і ВЕР 0,50-0,60 (80 %).

Порівняння ензимограм пероксидази культур I. lacteus дозволило встановити значну їх схожість за електрофоретичним профілем. Характерно, що в основному ізоферменти мають повільну і середню рухливість. Внутрішньоклітинним пероксидазам притаманна більша кількість форм і вища концентрація білків, ніж позаклітинним ізоферментам.

Таким чином, проведений аналіз позаклітинного та внутрішньоклітинного білкового комплексу культур Irpex lacteus методом електрофорезу свідчить про гетерогенність вивчаємих культур.

2. Вплив умов культивування на фізіолого-біохімічні показники культур Irpex lacteus

Температура, рН живильного середовища, джерело вуглецевого живлення суттєво впливають на фізіологічну активність I. lacteus.

Досліджувані культури I. lacteus ВС, БН-12, Д-4, Д-7, Д-8, С-3, С-15 максимальний рівень МЗ активності показали при температурі 22°С, культури Д-9 та С-11 при 27°С, БН-10 та БН-13 при 32°С, СДВ та Д-1 при 35°С. Температура 37°С найкращою була для культур ВА, БН-3, БН-5, БН-17, С-5, С-12. Для культури БН-9 в інтервалі 22-37°С не було знайдено найбільш сприятливої температури для молокозсідальної активності.

При температурах 27-35°С у всіх культур спостерігається максимальне накопичення біомаси. Ці дані відповідають максимальній швидкості росту культур I. lacteus.

Виявилась закономірність у споживанні глюкози культурами ВС, БН-5, БН-9, БН-10, Д-1, Д-4, Д-8 та С-5, а саме, чим вища температура культивування, тим більша кількість глюкози утилізується культурами. При температурі 40°С рівень споживання глюкози культурами I. lacteus знижувався, це пов'язано з несприятливими умовами для протікання біосинтетичних процесів.

Всі культури проявили вірогідно максимальний рівень молокозсідальної активності на середовищах з рН 3,50 і 4,00 (виняток склала культура С-15 з рН 5,50). Максимальні значення накопичення біомаси відповідають середовищу з кислотністю в діапазоні 5,10-6,00. Це свідчить про те, що оптимальні значення рН для накопичення біомаси і синтезу молокозсідального ферменту культурами I. lacteus не збігаються. Це співпадає з літературними даними (Федотов, 1995; Бойко, 1996; Нікітіна, 1999) для інших дереворуйнівних грибів.

Ступінь споживання глюкози при рН 2,50 не відрізнявся від контролю. Це, можливо, пов'язано з інгібуючою дією низького значення рН і неможливістю проходження відповідних біосинтетичних процесів. Для усіх штамів простежується збільшення ступеню утилізації глюкози із збільшенням лужності живильного середовища.

Подальші дослідження проводили з чотирма найбільш активними за синтезом молокозсідальних протеїназ штамами - БН-3, Д-1, Д-4, Д-9.

Дослідження показали (табл. 1), що для штамів Д-1 та БН-3 найсприятливішим джерелом вуглецю для синтезу МЗ ферментів є глюкоза, для штаму Д-4 - крохмаль та глюкоза, для штаму Д-9 - ксилоза та глюкоза.

Таблиця 1. Питома молокозсідальна активність (од/мг) штамів Irpex lacteus при культивуванні з різними джерелами вуглецевого живлення

Штами Д-1 та БН-3 максимальну кількість біомаси утворювали на середовищі з ксилозою. Штам Д-4 утворював вірогідно однакову кількість біомаси на середовищах з мальтозою, глюкозою, сахарозою, ксилозою. Максимум накопичення біомаси для штаму Д-9 спостерігався на середовищах з глюкозою, ксилозою, мальтозою та крохмалем.

Всі досліджувані штами на живильному середовищі з галактозою різко змінювали кислотність живильного середовища в лужний бік щодо контролю. Ймовірно, це пов'язано з посиленим синтезом білків та інших речовин лужної природи, у результаті чого відбувалося падіння молокозсідальної активності досліджуваних штамів.

3. Зміна фізіолого-біохімічних показників штамів I. lacteus під час тривалого культивування

Синтез ферментів залежить від фізіологічних особливостей гриба і відповідає певним фазам його росту.

Штам Д-1 виявив високу здатність у синтезі МЗ протеїназ. Вже на 6-у добу його активність складає 89,4 од/мг, а на 12-15 доби - 102 од/мг. Далі йде різке падіння активності і на 21 добу вона становить 3,2 од/мг. Пік питомої МЗ активності штаму БН-3 прийшовся на 21 добу і становив 185,8 од/мг. Необхідно відзначити високу синтетичну активність штаму БН-3 і високу швидкість накопичення МЗ протеїнази штамом Д-1.

Пік накопичення біомаси штамами Д-4 та Д-9 спостерігався в період 27-30 доби. Штам Д-1 показав максимальне значення біомаси на 21 добу культивування, а на 30-ту добу спостерігалось падіння рівня біомаси. Штам БН-3 мав 2 максимуми накопичення біомаси, перший - на 18 добу - 2,27 г/л, на 21 добу спостерігалось різке падіння біомаси до 1,90 г/л, на 24 добу - підйом до значення 2,30 г/л, а на 30-ту добу - знову падіння.

Різке підвищення продуктивності синтезу білків на 1 г міцелію для всіх штамів припадає на період з 9 по 12-ту добу. Для штамів Д-1 та БН-3 другий пік продуктивності синтезу білків припадає на 30 добу. З цим підвищенням ми зв'язуємо автоліз клітин і вихід великої кількості внутріклітинних білків в середовище.

До 15-ї доби культивування усі штами споживали глюкозу приблизно на одному рівні. На 18 добу різко збільшилося споживання глюкози штамом Д-4 (у КФ залишилось 0,5 мг/мл із 10 мг/мл початкових) і штамом Д-1 (2 мг/мл із 10 мг/мл). На 24 добу кількість глюкози, що залишилася в середовищі, у штамів Д-1, Д-4 і БН-3 була в інтервалі 0,4-0,9 мг/мл. Штам Д-9 економічніше використовував джерело вуглецевого живлення (5,6 мг/мл залишалося в КФ).

У ході вивчення впливу 14, 108, 202 добового віку посівного міцелію культур БН-9, БН-17, С-11, С-12 на їх синтетичну здатність було виявлено, що вірогідної різниці в накопиченні протеїназ молокозсідальної дії не існує. Проте дисперсійний аналіз показав вірогідний вплив віку міцелію на синтез біомаси.

4. Оптимізація живильного середовища для культивування Irpex lacteus з метою збільшення виходу протеїназ сичужної дії

Штами БН-3, Д-1, Д-4 та Д-9 культивували на глюкозо-пептоному живильному середовищі, де розчинником служили 30 і 60 % розчини екстракту паростків картоплі. Додавання 60 % розчину екстракту паростків картоплі до живильного середовища викликає збільшення молокозсідальної активності штамів I. lacteus. Під впливом екстрактів паростків картоплі збільшується накопичення біомаси у всіх штамів, приблизно, в 2 рази в порівнянні з контролем.

Встановлено, що кількість білку в культуральних фільтратах штамів вірогідно нижче, ніж у контрольному глюкозо-пептоному середовищі.

Поряд з цим встановлено, що для штамів Д-9 та БН-3 наявність молока в середовищі впливає позитивно на активність МЗ протеїназ. Причому, для штаму Д-9 не було знайдено вірогідної різниці між кількістю та часом додавання молока в середовище, а для штаму БН-3 додавання після стерилізації 1-5 мл молока на 1000 мл живильного середовища викликало вірогідне збільшення активності протеїнази. У штаму Д-1 на різних живильних середовищах практично ніякої зміни в активності МЗ протеїназ не спостерігалося. Для штаму Д-4 додавання молока в середовище до стерилізації негативно відбивалося на його МЗ активності. Додавання ж після стерилізації вірогідної різниці від контролю не давало.

Для усіх штамів додавання молока в живильне середовище до стерилізації викликає поступове збільшення біомаси. Додавання ж молока після стерилізації в мінімальній кількості веде до більш значного зростання біомаси, що можна показати на прикладі штаму Д-1.

Для усіх штамів можна виділити єдине оптимальне живильне середовище для накопичення біомаси - глюкозо-пептоне середовище з додаванням 1 мл молока на 1000 мл середовища після його стерилізації.

Отримані дані свідчать, що за своєю фізіологією штами I. lacteus гетерогенні і рівень молокозсідальної активності залежить від їх індивідуальних особливостей.

Після проведення експериментів щодо складу живильного середовища, з метою збільшення рівня молокозсідальної активності культурального фільтрату штаму БН-3, запропонований такий склад інгредієнтів, (г/л): глюкоза - 14,0; пептон - 5,0; KH2PO4 - 0,2; K2HPO4 - 0,6; MgSO4*7H2O - 0,1; ZnSO4*7H2O - 0,0006; CaCl2 - 0,01. Це дозволяє нам зменшити витрати KH2PO4, MgSO4*7H2O, ZnSO4*7H2O, CaCl2, а головне підняти рівень питомої МЗ активності в 2,2 рази.

5. Отримання та характеристика ферментних препаратів молокозсідальної дії

Штами Д-1, Д-4, Д-9 і БН-3 I. lacteus культивували при оптимальних значеннях температури і рН живильного середовища протягом 30 діб. Отриманий культуральний фільтрат грибів використовували для одержання 40, 60, 80 та 100 % фракцій білків, осаджених сірчанокислим амонієм та визначення їх молокозсідальної активності. Статистично оброблені результати подані в таблиці 2.

Таблиця 2. Активність молокозсідальних протеїназ, отриманих шляхом насичення культуральних фільтратів штамів I. lacteus сірчанокислим амонієм, подальшим їх очищенням діалізом, та ліофілізацією

Матеріали таблиці показують, що білкові фракції, отримані при 80 %-ому насиченні культуральних фільтратів штамів I. lacteus сірчанокислим амонієм, мають найвищий рівень питомої молокозсідальної активності та перевищують початковий у більш ніж 16 разів.

Тестування молокозсідальних препаратів штамів I. lacteus щодо інших субстратів показало, що досліджувані препарати мають високу тромболітичну (94-114 у.о.) і низьку казеїназну активності. Необхідно відзначити, що високий рівень МЗА і ТА пов'язаний з тим, що первинна структура казеїну та фібриногену мають великий відсоток ділянок з гомологічною амінокислотною послідовністю (Jolles et al., 1982).

Таким чином, отримані дані свідчать про те, що досліджені культури Irpex lacteus здатні атакувати різноманітні пептидні зв'язки, що підтверджує пристосованість цих організмів до руйнування різноманітних білкових субстратів навколишнього середовища.

Отримані кристали молокозсідального ферменту грибної природи показали схожість із кристалами реніну, ферменту тваринного походження, а це є додатковим доказом перспективності пошуку і відбору ферментів сичужної дії грибної природи.

При одержанні протеїназ молокозсідальної дії з культуральних фільтратів штамів гриба I. lacteus нами вперше, для цього виду, визначені: процентне співвідношення фракцій ферментних препаратів, вихід МЗ протеїназ в розрахунку на 1 л живильного середовища. Показано, що найбільша за масою кількість білків знаходиться у 80 і 100 % фракціях. Найбільший вихід ферментного препарату молокозсідальної дії у розрахунку на 1 л живильного середовища характерний для культурального фільтрату штаму БН-3 (80 % фракція) і становить 0,08 г, у інших штамів він дорівнює 0,07 г. Як свідчать літературні дані, із сичугу теляти одержують до 10 г порошку стандартної активності (100 000 одиниць), а із сичугу ягняти - до 2 г. Для того, щоб одержати 10 г порошку стандартної активності зі штаму БН-3, необхідно усього 10,5 літрів культурального фільтрату.

Електрофоретично 80 %-ва білкова фракція культурального фільтрату штаму Д-1 розділилась на 5 білкових зон з ВЕР 0,10; 0,31; 0,45; 0,51; 0,78; штаму Д-4 на 5 компонентів з ВЕР 0,17; 0,31; 0,39; 0,45; 0,51; штаму Д-9 на 6 компонентів з ВЕР 0,07; 0,16; 0,20; 0,30; 0,51; 0,65 і штаму БН-3 на 7 з ВЕР 0,06; 0,16; 0,30; 0,39; 0,51; 0,65 і 0,77. Ферментні препарати тваринного походження мали в своєму складі білки з подібною ВЕР 0,16; 0,30; 0,52, 0,65.

Таким чином, отримані дані показують, що позаклітинні ферментні препарати молокозсідальної дії досліджуваних штамів I. lacteus в основному представлені білками з повільною, середньою та 1-2 зонами зі швидкою електрофоретичною рухливістю.

У фракції білків, отриманої при 80 % насиченні культурального фільтрату сірчанокислим амонієм, штамів Д-1, Д-4, Д-9, БН-3, а також в ферментних препаратах тваринного походження, які застосовуються у сировиробництві, було визначено якісний амінокислотний склад за допомогою методу розподільної хроматографії на папері. Використання амінокислот-свідків дозволило визначити ряд амінокислот, що входять до складу ферментних препаратів як грибного, так і тваринного походження: цистин, лізин, аспарагінову кислоту, глутамінову кислоту, аланін, пролін, тирозин, валін, фенілаланін, лейцин. Частина амінокислот не була визначена в силу їх незначних концентрацій. Звертає на себе увагу висока концентрація негативно заряджених амінокислот (аспарагінової та глутамінової кислот), що визначають кислу природу отриманих протеїназ "сичужної" дії.

Таким чином, отримані дані свідчать про належність екзоферменту молокозсідальної дії штамів I. lacteus до кислих протеїназ.

Для визначення оптимальних значень рН дії молокозсідальних протеїназ I. lacteus Д-1, Д-4, Д-9, БН-3 було використано боратний буферний розчин, значення рН якого змінювалося в діапазоні 3,05-7,30. Встановлено, що зі збільшенням значення рН відбувається зменшення активності протеїнази. Отримані дані свідчать про те, що ферментні препарати молокозсідальної дії штамів I. lacteus відносяться до кислих протеїназ і за оптимумом рН дії на субстрат схожі з ферментами тваринного походження: ренін рН оптимум 3,7.

Вивчення термостійкості молокозсідальних протеїназ показало, що в інтервалі температур 7-37°С досліджувані препарати проявили стабільну активність. Температура 47°С у всіх досліджуваних препаратів викликала падіння активності, а при 57°С спостерігалася повна інактивація протеїназ молокозсідальної дії штамів I. lacteus.

Таким чином на підставі отриманих даних можна зробити висновки про те, що отримані препарати з культуральних фільтратів штамів I. lacteus не відносяться до термофільних, але мають стабільність білкової молекули у діапазоні температур 7-37°С.

Висновки

1. З дикорослих плодових тіл Irpex lacteus отримано чисті культури, досліджено їх біологічні особливості та відібрано штами Д-1, Д-4, Д-9 і БН-3 - перспективні продуценти протеїназ молокозсідальної дії; оптимізовано живильне середовище та одержано ферментний препарат, який за своїми властивостями може бути замінником сичужного ферменту тваринного походження.

2. Встановлено, що для продукування молокозсідальних протеїназ штамами Д-1 і БН-3 оптимальним джерелом вуглецевого живлення є глюкоза, для штаму Д-4 глюкоза та крохмаль, для штаму Д-9 глюкоза та ксилоза.

3. Досліджено динаміку накопичення протеїназ молокозсідальної дії: максимальна питома активність молокозсідальних ферментів у штамів Д-4 і Д-9 зареєстрована на 18 добу (72 та 79 од/мг), у штаму Д-1 - на 12 добу (102 од/мг), а у штаму БН-3 - на 21 добу (185 од/мг). Відзначено високу біосинтетичну активність штаму БН-3 I. lacteus у плані накопичення протеїназ молокозсідальної дії та висока швидкість їх накопичення штамом Д-1.

4. Визначено, що 60 % екстракт паростків картоплі доданий до живильного середовища позитивно впливає як на накопичення біомаси (зростає від 18 до 280 %), так і на синтез протеїназ молокозсідальної дії штамів Д-1, Д-4, Д-9 та БН-3. Додавання молока до складу живильного середовища, як до, так і після стерилізації, викликало збільшення активності молокозсідальних протеїназ у штамів Д-9 та БН-3, та зниження у штаму Д-4 при додаванні молока до стерилізації. Активність протеїназ молокозсідальної дії штаму Д-1 залишалась без змін. Додавання молока в середовище після стерилізації в кількості 1 мл на 1000 мл живильного середовища призводило до збільшення накопичення біомаси штамом Д-1 на 29 %, штамом Д-4 на 52 %, штамом Д-9 на 70 % та штамом БН-3 на 63%.

5. Встановлено оптимальне співвідношення компонентів живильного середовища для штаму БН-3, що дозволило збільшити у 2,2 рази питому активність протеїназ молокозсідальної дії у порівнянні з вихідним глюкозо-пептоним середовищем.

6. Максимальний рівень питомої молокозсідальної активності мали білкові фракції, що були отримані при 80 % насиченні культурального фільтрату штамів I. lacteus сірчанокислим амонієм.

7. Визначена кисла природа ферментних препаратів молокозсідальної дії, що були отримані з КФ штамів БН-3, Д-1, Д-4 і Д-9, які містять у великій кількості аспарагінову та глутамінову кислоти.

8. Препарати молокозсідальної дії штамів Irpex lacteus залишаються стабільними у діапазоні температур від 7 до 37°С та за оптимумом рН схожі з ферментними препаратами тваринного походження.

9. Електрофоретичні дослідження білків і ізоферментів пероксидази міцелію і культурального фільтрату дозволили виявити спільні білкові зони з ВЕР 0,08; 0,12 у міцелії і спільні форми внутрішньоклітинних ізоферментів пероксидази з ВЕР 0,20-0,22; 0,30-0,31.

10. Вивчення температурного режиму культивування штамів I. lacteus, дозволило встановити широкий оптимум (22-37°С), при якому спостерігається максимальна молокозсідальна активність. При зростанні культур на середовищах з різними значеннями рН максимальний рівень активності протеїназ "сичужної" дії спостерігався при рН 3,5-4,0. Кислотність живильного середовища в діапазоні 5,1-6,0 сприятливо діє на накопичення біомаси штамами I. lacteus.

Список робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Бойко С.М. Характеристика молокозсідальної активності та накопичення біомаси штамами гриба Irpex lacteus // Вісник Донецьк. університету. - 1998. -№1. -С. 122-126.

2. Бойко С.М. Одержання та визначення впливу рН на активність ферментного препарату молокозсідальної дії гриба Irpex lacteus Fr. // Вісник проблем біології і медицини. -1999. -№2. -С. 72-76.

3. Бойко С.М., Бойко М.И. Особенности образования молокосвертывающих ферментов штаммами Irpex lacteus Fr. в зависимости от рН питательной среды // Вісник проблем біології і медицини. -1999. -№7. -С. 51-54.

4. Бойко С.М. Вплив температури на синтез протеїназ молокозсідальної дії та ріст штамів Irpex lacteus Fr. // Вісник проблем біології і медицини. -1999. -№8. -С. 59-63.

5. Бойко С.М. Електрофоретична характеристика екзобілкових комплексів штамів гриба Irpex lacteus Fr. - продуцента протеїназ молокозсідальної дії // Науковий вісник: Сучасна екологія і проблеми сталого розвитку суспільства / Збірник науково-технічних праць. -Львів: УкрДЛТУ. -1999. -Вип. 9.7. -С. 17-21.

6. Бойко С.М. Зависимость биосинтеза протеина молокосвертывающего действия Irpex lacteus Fr. от источника углеродного питания // Збірник наукових праць Луганського державного аграрного університету. -2001. -№ 9(21). -С. 66-70.

7. Пат. 34088А Україна, МКВ С 12N 9/50, А 23С 19/032. Штам соматичних культур макроміцету Irpex lacteus Fr. - Д-4 продуцент молокозсідального ферменту: Пат. 34088А Україна, МКВ С 12N 9/50, А 23С 19/032 / Бойко С.М., Бойко М.І., Єфанова І.Л. -№ 99063016; Заяв. 02.06.99; Опубл. 15.02.01.

8. Бойко С.М., Негруцкий С.Ф. Рост и молокосвертывающая активность штаммов Irpex lacteus Fr. Elenh., произроставших на различных средах // Тез. докл. IV Всеукр. студ. науч. конф. "Охрана окруж. среды и рациональное исп. природ. ресурсов.", (19-21 апр. 1994). -Донецк, 1994. -С.146.

9. Бойко С.М. Роль дереворуйнівних грибів у природі та житті людини // Тез. доп. Міжн. студ. наук. конф. "Україна: людина, суспільство, природа.", (29-31 березня, 1995). -Київ, 1995. -С. 37-38.

10. Бойко С.М., Негруцкий С.Ф. Влияние температуры на рост штаммов Irpex lacteus Fr. - продуцентов протеиназ молокосвертывающего действия // Тез. докл. V Всеукр. студ. науч. конф. "Охрана окруж. среды и рациональное исп. природ. ресурсов.", (18-20 апр. 1995). -Донецк, 1995. -С. 131.

11. Бойко С.М. Вплив рН середовища на активність молокозгортаючого ферменту й утворення біомаси Irpex lacteus Fr. // Тез. доп. Міжн. студ. наук. конф. "Україна: людина, суспільство, природа.", (25-29 березня, 1996). -Київ, 1996. -С. 92-93.

12. Бойко С.М. Фракционирование внеклеточных белков молокосвертывающего действия штаммов Irpex lacteus Fr. и определение их электрофоретической подвижности // Тез. доп. VI Конф. молод. вчених "Актуальні проблеми фізіології рослин і генетики.", (9-11 жовтня, 1996). -Київ, 1996. -С. 109-110.

13. Бойко С.М., Негруцкий С.Ф. Влияние различных углеводов на образование экзобелков штаммов Irpex lacteus Fr. - продуцентов протеиназ молокосвертывающего действия // Тез. докл. вузовской науч. конф. профессорско-препод. состава по итогам науч.-исслед. работы. Естественные дисциплины. - Донецк: ДонГу, 1997. - С. 55-56.

14. Бойко С.М., Негруцкий С.Ф. Особенности образования молокосвертывающего фермента штаммами Irpex lacteus Fr. // Мат. I Международной конф: "Методологические основы познания биологических особенностей грибов - продуцентов физиологически активных соединений и пищевых продуктов". - Донецк, 1997. - С. 27-29.

15. Бойко С.М., Стадничук В.М., Федотов О.В. Штаммы гриба Irpex lacteus - продуценты протеиназ молокосвертывающего и тромболитического действия // Сб. тр. Межд. конф. "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии.", (Москва, апрель 1998). -Москва, 1998. -С. 160-161.

16. Бойко С.М. Дія температурного фактору на фізіологічні особливості штаммів гриба Irpex lacteus Fr. продуцентів протеїназ молокозсідальної дії // Конф. молод. вчен. "Актуальні питання ботаніки та екології", (7-11 вересня, Херсон-Лазурне). -Херсон, 1998. -С. 93-94.

17. Бойко С.М. Зміна активності молокозсідального ферменту гриба Irpex lacteus в залежності від температури культивування // Тез. міжн. конф. "Питання біоіндикації і єкології", (21-24 вересня, 1998). -Запоріжжя, 1998. -С. 78.

18. Бойко С.М. Влияние рН питательной среды на биосинтез протеиназ молокосвертывающего действия у штаммов гриба Irpex lacteus Fr. // Мат. межд. конф. "Проблемы микробиологии и биотехнологии", (25-27 ноября, 1998). -Минск, 1998. -С.17-18.

19. Бойко С.М. Динаміка синтезу протеїназ молокозсідальної дії штамами гриба Irpex lacteus Fr. // Матеріали конф. молод. вчених "Актуальні питання ботаніки та екології", (14-17 вересня, 1999). -Ніжин. -1999. -С. 105.

20. Бойко С.М. Влияние возраста посевного мицелия на синтез протеиназ молокосвертывающего действия культурами Irpex lacteus Fr. // Мат. Междунар. науч.-практич. конф.: "Геоэкологические и биоэкологические проблемы северного причерноморья". -Тирасполь, 2001. -С. 33-34.

21. Бойко С.М. Биосинтетическая активность дереворазрушающего базидиомицета Irpex lacteus Fr. при добавлении в среду экстракта ростков картофеля // Материалы конф. молод. ученых "Біорізноманіття природних і техногенних біотопів України". -Донецк, 2001. -С. 4-8.

22. Boyko S.M. Influence pH of nutritious environment on synthesis milk-coagulative ferments at fungus of Irpex lacteus Fr. // II International Symposium on Plant Biotechnology. -Kyiv. -1998. -P. 25.

23. Boyko S. Strains Irpex lacteus Fr. - producers of milk-clotting proteinases // XVI International botanical congress. -St. Louis (USA). -1999. -P. 649.

24. Negruzky S.F., Nikitina O.A., Boyko S.M. Effect of various sugars upon biosynthesis of milk-coagulative ferments and growth of Hirschioporus laricinus and Irpex lacteus white rot // Ninth International conference. -Carcans (France). -1997. -poster №41.

Размещено на Allbest.ru

...