Процессы перекисного окисления липидов при токсическом поражении четырёххлористым углеродом

Размещено на http://www.allbest.ru/

Содержание

токсический углерод плазма животное

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

1.2 Биологические последствия пероксидации липидов

1.3 Четырёххлористый углерод

1.4 Детоксикация ксенобиотиков

1.5 Локализация процессов биотрансформации ксенобиотиков

1.6 Цитохром Р450-зависимая монооксигеназная система

1.7 Реакции, катализируемые цитохромом Р-450

1.8 Механизмы воздействия ССl4

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

2.2 Определение содержания диеновых конъюгатов

2.3 Определение содержания малонового диальдегида

2.4 Определение содержания белка

2.5 Статистическая обработка результатов

Глава 3. Результаты и их обсуждение

Выводы

Заключение

Список литературы

Summary

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода

АО - антиоксиданты

ГПЛ - гидроперекиси липидов

ДК - диеновые конъюгаты

ЖК - жирные кислоты

МДА - малоновый диальдегид

ПНЖК - полиненасыщенные жирные кислоты

ПОЛ - перекисное окисление липидов

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободнорадикальное окисление

ТХУ - трихлоруксусная кислота

ФЛ - фосфолипиды

ФХ - фосфотидилхолин

ФТЭ - фосфотидилэтаноламин

ССl4 - четырёххлористый углерод

ССl3 - тетрахлорметил-радикал

Введение

В настоящее время принято считать, что ключевым неспецифическим звеном в развитии ряда заболеваний различной этиологии является возрастание интенсивности образования активных форм кислорода (АФК). Высокореакционноспособные АФК, обладающие высоким окислительным потенциалом и способностью к быстрым превращениям, вызывают цепные свободнорадикальные процессы в клетках, ведущим из которых является пероксидное окисление липидов (ПОЛ) [6]. Субстратами ПОЛ являются липиды с высоким содержанием ненасыщенных жирных кислот, играющие важную роль в структурно-функциональной организации биомембран [8]. В норме ПОЛ способствует обновлению мембран, однако усиленная генерация АФК и интенсификация свободнорадикальных процессов сопровождают развитие различных патологических состояний и процесс биологического старения. При всем многообразии воздействий, оказываемых продуктами пероксидного окисления на клетки, одним из основных эффектов ПОЛ является нарушение функционирования биомембран.

Цель работы - оценить процессы перекисного окисления липидов при токсическом поражении четырёххлористым углеродом.

Исходя из цели, были поставлены следующие задачи:

1. смоделировать состояние токсического окислительного стресса путем введения четырёххлористого углерода;

2. измерить и сравнить концентрацию МДА, ДК и белка в плазме и тканях у контрольной группы животных и у животных подвергшихся воздействию ССl4.

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии, и следует остановиться на ее механизме. Она протекает в несколько стадий, которые получили название инициирование, продолжение, разветвление и обрыв цепи.

Инициирование цепной реакции начинается с того, что в липидный слой мембран и (а не или) липопротеинов внедряется свободный радикал. Чаще всего это радикал гидроксила. Будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, он способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом образуются липидные радикалы [10, 13]:

HO· + LH -> H2O + L

Липидный радикал (L) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом; при этом образуется новый свободный радикал - радикал липоперекиси (LOO):

L· + O2 -> LOO

Этот радикал атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L:

LOO· + LH -> LOOH + L

Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов. Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe2+ c гидроперекисями липидов:

Fe2+ + LOOH -> Fe3+ + HO- + LO

Образующиеся радикалы LO· инициируют новые цепи окисления липидов:

LO· + LH -> LOH + L;

L· + O2 -> LOO· -> и т.д.

В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe2+) или друг с другом [10, 13]:

LOO· + Fe2+ + H+ -> LOOH + Fe3+

LOO· + InH -> In· + LOOH

LOO· + LOO· -> молекулярные продукты + фотон

1.2 Биологические последствия пероксидации липидов

Увеличенное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов (которое иногда называют "оксидативным стрессом") сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток. Повреждаются либо белковые структуры, либо липидный бислой в целом (повреждается и то и то).В последнее время ученые уделяют все большее внимание взаимодействию мембран с нуклеиновыми кислотами в ядре и митохондриях. По-видимому, одним из результатов пероксидации липидов может стать повреждение этих макромолекул со всеми вытекающими последствиями. Наиболее изучены три прямых следствия перекисного окисления липидов [10, 13].

Во-первых, перекисное окисление липидов сопровождается окислением тиоловых (сульфгидрильных) групп мембранных белков (Pr), в результате неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов; при этом образуются сульфгидрильные радикалы, которые затем взаимодействуют с образованием дисульфидов либо окисляются кислородом с образованием производных сульфоновой кислоты:

Pr-SH + L· -> LH + Pr-S·

Pr1-S· + Pr2-S· -> Pr1-SS- Pr2

Pr-S· + O2 -> Pr-SO2· -> молекулярные производные

Большую роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очередь Ca2+-АТФазы. Инактивация этого фермента приводит к замедлению "откачивания" ионов кальция из клетки и, наоборот, к входу кальция в клетку, увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки. Наконец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрий - ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембран. Второй результат перекисного окисления липидов связан с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Так показано, что продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция. Это приводит к тому, что в митохондриях окисление и фосфорилирование разобщаются, а клетка оказывается в условиях энергетического голода (т.е. недостатка АТФ). Одновременно в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры. Третий (и быть может, самый важный) результат пероксидации - это уменьшение стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны собственным мембранным потенциалом, т.е. под действием разности электрических потенциалов, существующей на мембранах живой клетки. Электрический пробой приводит к полной потере мембраной ее барьерных функций [10, 12, 26].

Интенсификация свободнорадикальных процессов, перекисного окисления ПНЖК наблюдается при развитии общего неспецифического адаптационного синдрома (стресса), т.е. практически при большинстве острых заболеваний и состояний, обострении хронических заболеваний, ожогах, травмах, операциях, а также при интоксикациях [4, 25].

1.3 Четырёххлористый углерод

Четыреххлористый углерод (химическое название: тетрахлорметан) - это прозрачная, легко испаряющаяся, практически негорючая жидкость со сладковатым напоминающим хлороформ запахом. ССl4 - продукт искусственного происхождения, и в природе естественным путем он не образуется. Это чужеродное для организма соединение, сильнейший токсикант.

Четыреххлористый углерод широко используется как хороший растворитель жиров, лаков, смол, восков, каучука и т.п., а также для удаления жировых пятен и в качестве консервирующего вещества для меховых изделий. Действие четыреххлористого углерода на организм напоминает действие хлороформа, но изменения в органах (печень, почки, сердце) более глубоки (жировое перерождение). Одним из метаболитов является СНСl3 [2].

1.4 Детоксикация ксенобиотиков

Многие ксенобиотики, попав в организм, подвергаются трансформации и выделяются в виде метаболитов.

I фаза метаболизма, в широком смысле, может быть определена, как этап биотрансформации, в ходе которого к молекуле соединения либо присоединяются полярные функциональные группы, либо осуществляется экспрессия таких групп, находящихся в субстрате в скрытой форме. Это достигается либо путем окисления или (значительно реже) восстановления молекул с помощью оксидо-редуктаз, либо путем их гидролиза эстеразами и амидазами [3].

Фаза II - этап биологической конъюгации промежуточных продуктов метаболизма с эндогенными молекулами, такими как глутатион, глюкуроновая кислота, сульфат и т.д. Специфические системы транспорта конъюгированных дериватов обеспечивают их выведение из организма [3, 7].

В ходе биопревращений липофильный и, следовательно, трудновыводимый ксенобиотик становиться гидрофильным продуктом, что обусловливает возможность его быстрой экскреции [3].

В основе биотрансформации по большей части лежат энзиматические преобразования молекул. Биологический смысл явления - превращение химического вещества в форму, удобную для выведения из организма, и тем самым, сокращение времени его действия. Разнообразие каталитических свойств энзимов биотрансформации и их низкая субстратная специфичность позволяет организму метаболизировать вещества самого разного строения.

Однако следствием химической модификации молекулы ксенобиотика помимо ослабления токсичности может стать инициация токсического процесса и усиление токсичности. Процесс образования токсичных продуктов метаболизма называется "токсификация", а продукты биотрансформации, обладающие высокой токсичностью - токсичными метаболитами. Во многих случаях токсичный метаболит является не стабильным продуктом, подвергающимся дальнейшим превращениям. В этом случае он также называется промежуточным или реактивным метаболитом. Реактивные метаболиты это как раз те вещества, которые часто и вызывают повреждение биосистем на молекулярном уровне. Общим свойством практически всех реактивных метаболитов является их электродефицитное состояние, т.е. высокая электрофильность. Эти вещества вступают во взаимодействие с богатыми электронами (нуклеофильными) молекулами, повреждая их. Реактивные метаболиты либо присоединяются к нуклеофильным молекулам, образуя с ними ковалентные связи, либо вызывают их окисление. В обоих случаях структура макромолекул нарушается, следовательно, нарушаются и их функции [3, 7, 9].

Биоактивация далеко не всегда сопровождается повреждением биосубстрата, поскольку одновременно в организме протекают процессы детоксикации и репарации. Интенсивность этих процессов может быть достаточной для компенсации ущерба, связанного с образованием реактивных метаболитов. Тем не менее, при введении высоких доз токсиканта, повторном воздействии защитные механизмы могут оказаться несостоятельными, что и приведет к развитию токсического процесса [3].

1.5 Локализация процессов биотрансформации ксенобиотиков

Основным органом метаболизма ксенобиотиков в организме человека и млекопитающих является печень, главным образом благодаря разнообразию и высокой активности здесь ферментов биотрансформации. Кроме того, портальная система обеспечивает прохождение всех веществ, поступивших в желудочно-кишечный тракт, именно через печень, до того, как они проникнут в общий кровоток. Это также определяет функциональное предназначение органа. Тончайшая сеть печеночных капилляров, огромная площадь контакта между кровью и поверхностью гепатоцитов, обеспечивающаяся микроворсинками базальной поверхности печеночных клеток, обусловливают высокую эффективность печеночной элиминации токсиканта на клеточном уровне [3, 11, 28].

Продукты I фазы метаболизма поступают в общий кровоток и могут оказывать действие на органы и системы. Печень выбрасывает в кровь и продукты II фазы метаболизма. Из крови продукты превращения могут захватываться почками, легкими, другими органами, повторно печенью для экскреции с желчью. С желчью метаболиты поступают в кишечник, где частично реабсорбируются и повторно поступать в печень (цикл печеночной рециркуляции) [3].

Несмотря на доминирующую роль печени в метаболизме ксенобиотиков, другие органы также принимают участие в этом процессе. Почки и легкие содержат энзимы и I и II фаз метаболизма. Особенно велика роль почек, поскольку в этом органе имеется специфическая система захвата и катаболизма продуктов конъюгации, образующихся в печени. Активность других органов, таких как кишечник, селезенка, мышечная ткань, плацента, мозг, кровь - значительно ниже, однако наличие энзимов, катализирующих процессы биотрансформации, при отравлении токсифицирующимися ксенобиотиками, имеет ключевое значение в развитии патологических процессов в этих органах. В процессе внепеченочного метаболизма могут образовываться продукты, как аналогичные продуктам печеночного происхождения, так и отличные от них. Иногда в ходе внепеченочного метаболизма может осуществляться активация метаболитов, образующихся в печени [3, 11, 19].

Энзимы, участвующие в метаболизме ксенобиотиков, локализованы в основном внутриклеточно. Небольшое их количество определяется в растворимой фракции циотозоля, митохондриях, большинство же связаны с гладким эндоплазматическим ретикулумом. Методом ультрацентрфугирования гладкий эндоплазматический ретикулум выделяется из исследуемых клеток в виде фрагментов мембранных структур, называемых микросомами. Поэтому основная группа ферментов, участвующих в метаболизме ксенобиотиков, получила название "микросомальные энзимы" [3, 14, 23].

Часть ферментных систем метаболизма ксенобиотиков локализуются в жидкостях организма. Прежде всего, это эстеразы плазмы крови, участвующие в гидролизе целого ряда чужеродных веществ [1].

1.6 Цитохром Р450-зависимая монооксигеназная система

Окислительный метаболизм чужеродных для организма соединений катализируется цитохром Р450-зависимой монооксигеназной системой и другими ферментами. Цитохром-Р450 представлен набором белков (более 100 семейств), близких по строению [15, 27].

Энзимы рассматриваемой группы, цитохромР-450 зависимые оксидазы (Р-450), как правило, обладают низкой субстратной специфичностью, вызывая превращения веществ самого разного строения, и потому часто называются оксидазами смешенной функции (ОСФ). Р-450 относятся к группе гемопротеинов типа цитохромов b - пигментов, активно связывающих монооксид углерода. Название "цитохромР-450" энзимы получили в силу того, что максимум поглощения света пигментом, связанным с СО, осуществляется при длине волны 450 нм [15, 18, 28].

Р-450 представляют собой семейство энзимов, локализующихся в эндоплазматическом ретикулуме, которые могут быть разделены с помощью иммунологических и иных методов на несколько подсемейств. Отдельные ткани содержат несколько различных изоформ Р-450. Встречаются тканеспецифичные формы энзимов. Изоферменты Р-450 часто проявляют перекрестную субстратную специфичность, таким образом, как правило, более чем один изофермент принимает участие в метаболизме ксенобиотика. Наличие специфических форм энзимов обусловлено генетическими механизмами, а повышение содержания в тканях различных изоферментов индуцируется действием на организм различных ксенобиотиков: лекарств, ядов, экотоксикантов. Р-450 подвержены не только активации, но и инактивации, как исходными ксенобиотиками, так и их реактивными метаболитами [3, 18, 20].

Реакции микросомального окисления, протекающие при участии Р-450, как правило, зависят от содержания O2 и НАДФН в среде. Молекулярный кислород активируется цитохромомР-450 (или другими цитохормами, например, Р-448). Активация осуществляется с помощью НАДФН при участии флавин-содержащего энзима НАДФН-цитохромР-450 редуктазы. Поскольку донором электронов в превращениях субстратов, катализируемых этими энзимами, является НАДФН, суммарное уравнение реакции может быть записано следующим образом:

ЦитохромР-450, НАДФН-цитохромР-450 редуктаза и фосфолипиды биологических мембран, в которые встроены оба энзима, образуют микросомальный монооксигеназный комплекс. Несмотря на то, что энзимы комплекса связаны с биологическими мембранами, их свойства могут быть изучены in vitro [3, 20].

Установлены основные закономерности протекания ферментативных процессов с участием микросомального монооксигеназного комплекса:



Как видно из рисунка на начальном этапе ксенобиотик (S) вступает во взаимодействие с окисленной формой цитохрома Р-450. Затем к этому комплексу с помощью НАДФН-зависимой цитохромР-450 редуктазы присоединяется электрон, донором которого является восстановленный НАДФН. После этого комплекс взаимодействует с кислородом.

После взаимодействия со вторым электроном (донор - НАДФН) происходит активация связанного с цитохромом кислорода, который приобретает способность связывать протоны и образовывать воду. Образовавшаяся при этом форма цитохромаР-450 гидроксилирует субстрат [3].

Метаболизируемое вещество не связывается непосредственно с геминовой группой цитохромаР-450. Оно присоединяется к белковой части цитохрома. Процесс превращения ксенобиотиков чувствителен к СО, поскольку это вещество вытесняет кислород из связи с железом геминовой группы цитохромаР-450. Некоторые оксидазы резистентны к СО (образование N-оксидов) [3, 15, 27].

Поскольку Р-450 - гемопротеины, их активность отчасти регулируется процессами синтеза гема, т.е. связана с метаболизмом железа. Нарушение метаболизма, голодание, понижение соотношения НАДФН/НАДФ+ могут приводить к снижению активности Р-450 [3, 15, 18].

1.7 Реакции, катализируемые цитохромом Р-450

Окисление ксенобиотиков при участии Р-450 - основной механизм их биотрансформации в I фазе метаболизма. Р-450 катализирует окисление практически всех классов органических молекул. Субстратом для энзимов являются и простые молекулы типа хлороформа и стероиды и сложные гетероциклические соединения, например антибиотик циклоспорин. Р-450 могут катализировать не только окисление, но и восстановление некоторых биосубстратов, например четыреххлористого углерода, галотана, некоторых других галогенированных углеводородов с образованием свободных радикалов. Такое необычное превращение реализуется в условия пониженного парциального давления кислорода в тканях [16, 22].

1.8 Механизмы воздействия ССl4

В опытах по изучению путей превращения четыреххлористого углерода в организме животных было доказано, что основным местом его метаболизма является печень.

Четыреххлористый углерод - гепатотропный яд. Тетрахлорметан вызывает дозозависимые поражения печени, но кроме специфического действия на печень он оказывают токсическое влияние на форменные элементы крови, соединительную ткань, морфофункциональное состояние ряда органов и систем [1].

Процессы трансформации данного вещества в печени протекают в мембранах эндоплазматического ретикулума и нуждаются в восстановленном НАДФ [1]. Действие четыреххлористого углерода на организм напоминает действие хлороформа, но изменения в органах (печень, почки, сердце) более глубокие (жировое перерождение) [2].

Повреждение печени, главным образом центральных зон дольки печени, происходит из-за локализации в гепатоцитах систем детоксикации, превращающих ССl4 в высокотоксичные радикалы [Slater, 1972; Zimmerman, 1978; Britton, Bacon, 1994]. Механизм токсического действия четырёххлористого углерода состоит в высвобождении свободных радикалов ССl3* (тетрахлорметил-радикал), ССl2** и др., относящихся к классу алкильных радикалов, которые образуются в гепатоцитах в результате расщепления ССl4 микросомальными ферментами. Четырёххлористый углерод подвергается дегалогенированию при участии цитохрома Р-450. Таким образом, ССl4 подвергается биотрансформации, приводящей к образованию реактивных продуктов в ходе первой фазы метаболизма ксенобиотика [16, 17].

Воздействие радикалов приводит к переокислению ненасыщенных липидов ЭПР, в связи с чем происходит инактивация глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и цитохрома Р450 . Перекисное окисление мембранных липидов приводит к деструкции мембран, в результате цепной реакции из липидов мембраны образуются новые свободные радикалы, уже вторично повреждающие другие органеллы клетки. В конечном итоге это приводит к некрозу гепатоцитов [Slater, 1972; Recknagel, Grende, 1973] [3].

Традиционно считается, что некроз инициируется нефизиологическими агентами, а апоптоз преимущественно физиологическими. Однако последние исследования показали, что различия между некрозом и апоптозом на стадии их инициации не столь очевидны, и одни и те же факторы (например, активные формы кислорода, оксид азота) могут стимулировать оба процесса. Гепатотоксины вызывают гибель клеток как по механизмам некроза, так и апоптоза, что показано на примере тетрахлорметана, парацетамола и других ксенобиотиков, а соотношение между этими процессами определяется дозой, применением протекторов и другими факторами [5, 21, 30].

Повреждения печени имеют определенные топографические особенности, что отображает структурную и функциональную неоднородность этого органа. В первой зоне ацинуса гепатоциты прилежат к портальному тракту и получают больше кислорода и питательных веществ, в сравнении с гепатоцитами второй и особенно третьей зоны. Перипортальные гепатоциты (зона 1) содержат больше митохондрий и в них более интенсивно протекают энергетические процессы, бета-окисление жирных кислот, обмен аминокислот и синтез мочевины, глюконеогенез. В перивенозных гепатоцитах (зона 3) в большей мере представлены процессы окислительного метаболизма ксенобиотиков при относительном дефиците антиоксидантных и конъюгирующих ферментов. Вследствие этого в гепатоцитах 3 зоны образуется большее количество реакционноспособных метаболитов и они хуже обезвреживаются. Поэтому повреждение печени ксенобиотиками, как впрочем и воспалительное, ишемическое, вирусное повреждение, чаще имеют центролобулярную локализацию, затрагивая гепатоциты перивенозной зоны [5, 17, 24].

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Объект исследования

В качестве объекта исследования использовались самки белых лабораторных крыс, массой 200-240г. Исследовали 2 группы животных: контрольную группу и группу животных с введённым СCl4.

Экспериментальную модель окислительного стресса создавали следующим образом: крысе с помощь специального зонда в желудок вводили раствор СCl4 в вазелиновом масле (1 мл/кг веса).

Показатели ПОЛ оценивали спектрофотометрически через 24 часа после введения ССl4 по содержанию малонового диальдегида (МДА) и диеновых конъюгатов (ДК) в плазме крови и гомогенатах тканей: печени, почек и мозге. Также в ходе работы определяли содержание белка в тканях и активность аланинаминотрансферазы (АлАт) у обеих групп животных.

2.2 Определение содержания диеновых конъюгатов

Определение содержания первичных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов, осуществляли спектрофотометрически в экстрагированной гептановой фазе липидов при 233 нм.

Принцип метода:

Вследствие р-р переходов спектры коньюгированных гидроперекисей полиненасыщенных жирных кислот характеризуются интенсивным поглощением в ультрафиолетовой области спектра с максимумом при 232-234 нм (Каган и др., 1986).

Реактивы:

1. гептан-изопропанольная смесь в соотношении 1:1;

2. 0,74%-ный водный раствора KCl.

Оборудование: спектрофотометр СФ-46.

Ход определения:

Определение содержания диеновых коньюгатов (ДК) проводили в плазме крови и гомогенатах тканей внутренних органов: печени, почках и мозге. Для этого липиды экстрагируют стократным избытком смеси растворителей. В гомогенизатор вносят 0,1 мл плазмы или гомогената, добавляют 5 мл изопропилового спирта и тщательно растирают до получения гомогенной суспензии. Содержимое гомогенизатора количественно переносят в мерную центрифужную пробирку, в которую затем добавляют 5 мл гептана.

Экстракт центрифугируют в течение 10 мин при при 3000 об/мин. (1700g). Надосадочную фракцию переносят в градуированную пробирку и добавляют 1/5 объема раствора KCl для отмывки липидного экстракта от нелипидных примесей. После тщательного встряхивания образовавшаяся эмульсия расслаивалась на две прозрачные фазы. В гептановом экстракте (верхняя фаза) измеряют спектрофотометрически содержание сопряженных диенов в кювете с длиной оптического пути 1,0 см против гептана. Расчёт количества ДК производят с учетом молярного коэффициента экстинкции:

С (моль / г ткани) = D · F · / K · m

C (моль / л плазмы) = D · F · / K,

где

С - содержание ДК;

D - оптическая плотность гептанового экстракта;

F - фактор разведения, равный 121,2;

K - коэффициент молярной экстинкции для ДК при длине волны 233 нм, равный 27000 М-1см-1 (Паранич и др., 1993);

m - масса образца, г;

2.3 Определение содержания малонового диальдегида

Определение вторичного продукта ПОЛ - малонового диальдегида, проводили по качественной реакции с тиобарбитуровой кислотой.

Принцип метода:

В липидных системах в результате процессов перекисного окисления липидов образуется малоновый диальдегид (МДА), взаимодействие которого с 2-тиобарбитуровой кислотой приводит к образованию хромогена с максимумом поглощения в красной области видимого спектра при длине волны 532 нм (Ko, Godin, 1990).

Реактивы:

1. 0,9%-ный раствор NaCl (физиологический раствор);

2. 30%-ный раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ);

3. 0,1М раствор динатриевой соли этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) (С10Н14N2Na2O8 * 2H2O, Mr = 372,24г/моль).

4. 1%-ный раствор 2-тиобарбитуровой кислоты (ТБК);

5. 0,05 н раствор NаОН;

Оборудование: спектрофотометр СФ-46.

Ход определения:

К 0,2 мл плазмы добавляют 0,8 мл физиологического раствора и 0,5 мл раствора ТХУ, перемешивают и ставят в ледяную баню на 2 часа. Затем центрифугируют 15 мин при 3000 об/мин. (1700g). Аналогичным образом готовят контрольную пробу, в которой эритроциты заменяют равным объемом дистиллированной Н2О. 1 мл супернатанта переносят в другую пробирку, добавляют 0,075 мл ЭДТА и 0,25 мл раствора ТБК, приготовленного на 0,05 н растворе NаОН. Содержимое перемешивают и ставят пробирки в кипящую водяную баню на 15 мин. Затем пробирки охлаждают до комнатной температуры.

Для определения концентрации МДА в ткани печени, почек и мозга использовали 3 мл гомогената и 1,5 мл раствора ТХУ, соответственно объём остальных реактивов увеличивали в 3 раза.

Измеряют поглощение опытной пробы против контрольной на спектрофотометре при 532 нм 600 нм в кюветах с толщиной слоя 1,0 см. Расчёт содержания МДА производят с учётом коэффициента молярной экстинкции образовавшегося хромогена, равного 1,56*105 М-1см-1 (Стальная И.Д., 1977):

С (моль / г ткани) = D532 - D600 · F / К · m

C (моль / л плазмы) = D532 - D600 · F / К,

где

С - содержание МДА;

D532 - оптическая плотность опытной пробы при длине волны 532 нм;

D600 - оптическая плотность опытной пробы при длине волны 600 нм;

F - фактор разведения, равный 9,94;

К - коэффициент молярной экстинкции образовавшегося хромогена, равный 1,56·105 М-1см-1;

m - масса образца, г.

2.4 Определение содержания белка

Для определения содержания белка использовали микробиуретовый метод (Кочетков, 1971).

Реактивы:

1. Стандартный раствор белка (сывороточного альбумина);

2. Биуретовый реактив (реактив Бенедикта) - 17,3 г цитрата натрия и 10 г карбоната натрия растворяют при подогревании в небольшом количестве воды, в раствор добавляют 1,73 г сульфата меди, растворённого в 10 мл воды, и доводят водой до 100 мл.

3. 6%-ный раствор NaOH.

Оборудование: спектрофотометр СФ-26.

Ход определения:

К 2 мл физиологического раствора, содержащего 10 мкл гомогената, добавляют 2 мл 6%-ного NaOH и 0,2 мл реактива Бенедикта. Раствор хорошо перемешивают и через 15 мин фотометрируют при 330 нм на спектрофотометре. Предварительно строят график по стандартному раствору белка, по которому, построив линию Тренда, и определяют концентрацию белка в растворе.

2.5 Статистическая обработка результатов

Результаты обрабатывались статистически с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0 по t-критерию достоверности Стьюдента при уровне значимости p < 0.05.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

Исследования показали, что в опытной группе животных, подвергшихся воздействию ССl4 активность фермента аланинаминотрансферазы достоверно повышается в 3,1 раза по сравнению с контрольной группой (р < 0,05) (рис. 1.).

Рис. 1. Активность АлАт в контрольной и опытной группе, ммоль/(ч*л).

Аланинаминотрансфераза синтезируется внутриклеточно, и в норме лишь небольшая часть этого фермента попадает в кровь. При повреждении печени (при гепатитах, циррозе печени) в результате цитолиза (разрушения клеток) этот фермент попадает в кровь, что выявляется лабораторными методами. Таким образом, полученные результаты подтверждают токсическое влияние ССl4 на гепатоциты, т.е. в ходе работы удалось смоделировать окислительный стресс (нельзя так категорично утверждать, нельзя судить только по одному ферменту!!!).

Уровень МДА в печени и мозге увеличился в 3,1 и 2,1 раза соответственно, тогда как в почках и плазме не изменялся (рис. 2.).



Рис. 2. Концентрация МДА в контрольной и опытной группе в мозге, печени, плазме, почке.

Концентрация ДК в плазме и тканях, а также белка в тканях, согласно полученным результатам, не изменялась (рис. 3.).

Согласно данным литературы, воздействие токсического окислительного стресса на организм характеризуется усилением реакции ПОЛ, о чём свидетельствует повышение концентрации продуктов перекисного окисления. Полученные результаты не противоречат этим данным. Однако отсутствие изменения уровня ДК и МДА в плазме и почках, вероятнее всего, связано с малой выборкой исследуемых животных, что не даёт достоверно проанализировать данные.



Рис. 3. Концентрация ДК в контрольной и опытной группе в мозге, печени, плазме, почке.

Выводы

1. Удалось смоделировать окислительный стресс, что подтверждается увеличением активности АлАт в 3,1 раза по сравнению с контролем;

2. Уровень МДА в печени и мозге увеличился в 3,1 и 2,1 раза соответственно, тогда как в почках и плазме не изменялся;

3. Уровень ДК в плазме и тканях не изменялся;

4. Концентрация белка в тканях не изменялась.

Заключение

Активация ПОЛ (так называемый синдром липидной пероксидации) является общим ключевым фактором, опосредующим повреждение мембранных структур органов и тканей при многих заболеваниях. Активация перекисного окисления и роль в патогенезе показана при многих заболеваниях печени, артритах, атеросклерозе, ряде инфекций, вызываемых паразитами (например, малярии), заболеваниях легких, гипоксических, гипероксических и реперфузионных повреждениях органов и тканей, злокачественных опухолях, травмах, ожогах, катаракте и др. За рубежом для таких заболеваний принят термин "свободнорадикальная патология".

Для профилактики и терапии состояний, связанных с чрезмерной активацией ПОЛ, могут быть использованы антиоксиданты, вещества, специфически реагирующие с определенными свободными радикалами (ловушки или перехватчики), специфические вещества, образующие комплексные соединения с металлами переменной валентности, а также различные пути активации эндогенных систем антирадикальной защиты организма (например, постепенная адаптация к гипоксии или другим факторам).

В связи с важной ролью ПОЛ в патогенезе различных заболеваний определение продуктов этого процесса (главным образом конъюгированных диенов, малонового диальдегида), спонтанной и индуцированной хемилюминесценции в биологическом материале (сыворотке и плазме крови, эритроцитах, моче, конденсате выдыхаемого воздуха и т.д.) имеет все возрастающее диагностическое и прогностическое значение.

Список литературы

1. Бокучава А.Н. Патоморфологические изменения в организме свиней после введения четырёххлористого углерода / А.Н. Бокучава // Грузинский государственный сельскохозяйственный университет, 2005 г.

2. Пурыгин П.П., Основы химической токсикологии / П.П. Пурыгин, З.П. Белоусова // Учебное пособие, изд-во "Самарский университет". - 2003 г.

3. Куценко С.А. Основы токсикологии / С.А. Куценко // С-Пб, 2002 г.

4. Барабой В.А. Механизмы стресса и перекисное окисление липидов/ В.А. Барабой // Успехи современной биологии. - 1991. - Т. 3. - Вып. 6. - С. 923-932.

5. Пентюк А.А, Поражение печени ксенобиотиками / А.А. Пентюк, Л.В. Морозов, О.В. Паламарчук // Винницкий государственный медицинский университет им. М.И. Пирогова. - 2004 г.

6. Бурлакова Е.Б. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты / Е.Б. Бурлакова, Н.Г. Храпова // Успехи химии. - 1998. - Т. 52. - №9. - С. 540-558.

7. Лим В.Г. Влияние четыреххлористого углерода на перекисное окисление липидов и показатели системы иммунитета / В.Г. Лим, П.Ф. Забродский, В.В. Васильев // Химическая и биологическая безопасность, Саратов. воен.-мед. ин-т.,- №3 (27),2006 г.

8. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю.А. Владимиров // Соросовский образовательный журнал. - 2000. - Т. 6. - №12. - С. 13-19.

9. Михалкина Н.И. Интенсивность перекисного окисления липидов в микросомах внутренних органов при стрессе после гипоксических тренировок / Н.И. Михалкина, М.К. Мурзахметова, В.К. Турмухамбетова, Р.С. Утегалиева // Вестник КазНУ им.аль-Фараби, серия биол., 2006, №20, С. 110-115.

10. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологических процессов / Ю.А. Владимиров // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 1989. - №4. - С. 7-19.

11. Виноградова Л.Ф. Экспериментальная терапия антиоксидантами при токсическом повреждении печени четы-реххлористым углеродом и хлоксиколом / Л.Ф. Виноградова, Ж.А. Мирзоян, Е.В. Хармицкая с соавт. // Пат. физиология и экспериментальная терапия. - 1989. - №4. - 52-56.

12. Савоненко А.В. Характеристика Nа-К-АТФазы эритроцитов крыс с разным отношением к этанолу в норме и после хронической алкоголизации / А.В. Савоненко, В.Д. Прокопьева // Бюлл. экспер. биол. и мед., 1993, №6, С.631-632.

13. Андреещева Е.М. Оксидативный статус и активности аконитатгидратазы и NADP-изоцитратдегидрогеназы в гепатоцитах крыс в норме и при токсическом гепатите / Е.М. Андреещева, Т.Н. Попова, В.Г. Артюхов, Л.В. Матасова // Вестник ВГУ, Серия химия, биология. - 2008 г. - №2.с. 74-77.

14. Забродский П.Ф. Влияние дихлорэтана на показатели системы иммунитета и перекисного окисления липидов / П.Ф. Забродский, В.Г. Лим, Н.М. Трошкин // Вестник новых медицинских технологий. - 2005 - Т. ХII, №2, С. 16.

15. Головенко Н.Я. Некоторые аспекты биохимии, химии, молекулярной биологии и генетики цитохрома Р-450 / Н.Я. Головенко // Физико-химический институт им. А.В. Богатского НАН Украины, Одесса, 2006 г.

16. Мясоедова К.Н. Новое в изучении цитохромовм Р - 450 / К.Н. Мясоедова // Биохимия, 2008, вып. 9, с. 1199 - 1205.

17. Воробьёва О.В. Влияние экспериментального цирроза печени у самок крыс на патологию и регенерацию печени у потомства / О.В. Воробьёва // Автореферат. - Ульяновск. - 2007 г.

18. Костюк В.А. Роль ковалентного связывания и перекисного окисления липидов в повреждении печени четыреххлористым углеродом / В.А. Костюк // Биохимия, 1991, т. 56, вып. 10, С. 1878-1885.

19. Zhao Y., Sun L., Muralidhara B.K., Kumar S., Stout C.D., and Halpert, J.R. / Biochem. Mol. Biol, 46-46, 11559-11567.

20. Nelson D., Koymans Z., Kamataki T., et al. P 450 superfamily: update on new sequence, gene mapping, accesion numbers and nomenclature // Pharmacogenetics. --1996. -- №6. --P. 1-42.

21. Zorbas Y.G., Petrov K.L., Yarullin V.L., Kakurin V.I. еt.al. Effect of fluid and salt supplementation on body hydration of athletes during prolonged hypokinesia // Acta Astronaut, 2002, 50 (10), Р. 641-651.

22. Archakov A. Censterization of P 450 superfamily using the objective pair alignment method and UPGMA program / A. Archakov, A. Zisitsa, V. Zgoda et al. // J. Mol. Model. 1998. -- №4. --P. 153-158.

23. Lahiri Sukhamay. Historical perspectives of cellular oxygen sensing and responses to hypoxia. // J.Appl. Physiol., 2000, №А3-0, Р. 1865-1871.

24. Ames B.N., Shigenaga M.K. Oxid // Ann. N.Y. Acad. Sci. - 1992. - Vol. 663.- P.85-96.

25. Girotti A.W. Lipid hydroperoxide generation, turnover and effector action in biological systems. // The Journal of Lipid Research, 1998, vol. 39, Р. 1529-1542.

26. Manuela Gago-Dominguez, Xuejuan Jiang and J Esteban Castelao, Lipid peroxidation, oxidative stress genes and dietary factors inbreast cancer protection: a hypothesis / his article is online at http://breast-cancer-research.com/content/9/1/201, BioMed Central Ltd, 2007.

27. Lahiri, Sukhamay. Historical perspectives of cellular oxygen sensing and responses to hypoxia. // J.Appl. Physiol., 2000, №А3-0, Р. 1865-1871.

28. Li, Chuanuu, R.M.Jackson . Reactive species mechanisms of cellular hypoxia-reoxygenation injury. // Am.J. Phsiol., 2001, №C 112-1, Р. 1121-1129.

29. Zhang, Hong Yan, Bradly C.P., Huiping L., Timir S.B. et al. H2O2 opens mitochondrial KATP channels and inhibits GABA receptors via protein kinase C-e in cardiomyocytes. // Am.J. Physiol. Heart Circ. Physiol,., 2001, №Н683-1, Р.1080-1085.

30. Mc Leod L.L., Sevanian A. Lipid peroxidation and modification of lipid composition in an endothelial cell model of ischemia and reperfsion. // Free Radic. Biol. Med., 1997, 23 (4), Р. 680-694.

Summary

Intensifikaciya free radical of the processes, lipid peroxidation exists at development general nonspecific adaptative syndrome - a stress i.e. at majority of the sharp diseases practically and conditions, intensification of the chronic diseases, burn, trauma, operation, as well as at интоксикациях. In given work are valued processes lipid peroxidation at toxic effect of carbon tetrafluoride on product level lipid peroxidation. Thereby, modeled oxidative stress and is confirmed increasing to concentrations of the products lipid peroxidation - an malondialdehyde (MDA) and diene conjugant.

Размещено на Allbest.ru

...