Размещено на http://www.allbest.ru/

• Содержание
• Введение
• 1. Общая характеристика молочнокислых бактерий
• 2. Культивирование лактобактерий
• 3. Плазмиды лактобактерий
• 3.1 Функции плазмид
• 3.2 Механизмы репликации плазмид
• 4. Вектора на основе плазмид
• 4.1 Применение векторов
• 5. Молочнокислое брожение
• 6. Значение и применение молочнокислых бактерий
• Заключение
• Список литературы

Введение

В данной работе мною будет рассмотрен литературный обзор по данной теме. Лактобактерии являются естественными обитателями желудочно-кишечного тракта и слизистых оболочек человека и животных. А также встречаются на поверхности растений и в молочных продуктах. Они имеют важное значения для человека и животных, так как создают кислую среду, которая подавляет патогенную микрофлору, поддерживают и оказывают стимулирующее действие на иммунную систему, помогают усвоению витаминов. Но правда среди них встречаются и патогенные формы.

Лактобактерии имеют важное промышленное значение, так как используются для создания молочнокислых продуктов. Также они используются для производства молочной кислоты, которая имеет широкое применение в промышленности, бактериоцинов, которые оказывают угнетающее действие на другие виды бактерий, и экзополисахаридов. Лактобактерии широко применяются в качестве пробиотиков.

В последнее время люди всё более заинтересованы в исследовании этих микроорганизмов. Для того чтобы понять преимущество лактобактерий и выявить новые признаки, полезные свойства нужно изучить их молекулярную биологию. Исследования лактобактерий включает выявление и характеристики нативных плазмид, создание новых векторов, изучение трансформационных систем. Но большинство плазмид являются криптическими, поэтому очень актуально проводить исследования для выявления новых функций плазмид и новых генов, которые можно будет использовать для создания новых векторов.

Мною будут рассмотрена общая характеристика лактобактерий. Также будут рассмотрены плазмиды лактобактерий, их функции, механизмы репликации и вектора на основе лактобактерий.

Цель: изучить литературу по данной проблематике.

Задачи:

1. Привести общий обзор плазмид лактобактерий, рассмотреть их функции и механизмы репликации.

2. Привести общий обзор векторов и их применение. Рассмотреть вектора на основе лактобактерий.

3. Рассмотреть типы молочнокислого брожения.

1. Общая характеристика молочнокислых бактерий

Молочнокислые бактерии представляют собой группу грам-положительных бактерий, включающую роды Lactococcus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus и Bifidobacterium, которые обладают способностью к ферментации сахаров с образованием молочной кислоты [10].

Молочнокислые бактерии включает палочковидные и сферические формы. Это неспорообразующие бактерии, исключение составляет Sporolactobaсillus inulinus, неподвижны, каталазоотрицательные, нитратоотрицательные. Широко распространены в природе и являются промышленно важными [5], [10].

Органические кислоты и метаболиты, продуцируемые лактобактериями играют важную роль в сохранении пищевых продуктов, в поддержании низкокого рН. Выделяемые бактериями бактериоцины подавляют рост болезнетворных организмов и продлевают срок хранения продуктов.[10]

Это факультативные анаэробы. Молочнокислые бактерии ферментируют углеводы с образованием молочной кислотой в качестве конечного продукта. Они не способны синтезировать АТФ за счет дыхания, так как не содержат цитохромы. Молочнокислые бактерии способны только к брожению. [5], [10].

Все молочнокислые бактерии нуждаются в факторах роста, например в витаминах группы В, аминокислотах, пуринах и пиримидинах. И поэтому их называют «метаболическими инвалидами». Молочнокислые бактерии устойчивы к кислоте. [5] В их клетках содержатся флавиновые ферменты, с помощью которых происходит восстановление молекулярного кислорода до Н₂O_2.. Так как они не содержат гемовую группу, то у них отсутствует каталаза. [1]

Молочнокислые бактерии можно разделить на две физиолого-биохимические группы:

1) гомоферментативные молочнокислые бактерии образуют практически одну молочную кислоту. К ним относятся бактерии видов Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lactis и др.

2) гетероферментативные молочнокислые бактерии образуют смесь молочной кислоты, этанола и СО₂ и уксусной кислоты. К ним относятся Leиconostoc mesenteroides, Lactobacillus brevis, Bifidobacterium bifidum и др.

Молочнокислые бактерии не обнаруживаются в почве и водоемах. В естественных условиях они встречаются: в молоке, молочных продуктах (Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus lacti, Streptococcus lactis); на поверхности растений и на разлагающихся растительных остатках (Lactobacillus plantarum, Lactobacillus brevis, Leиconostoc mesenteroides). Также они являются нормальной микрофлорой человека и животных и присутствуют в кишечнике и на слизистых оболочках.[5]

2. Культивирование лактобактерий

Культивируют эти бактерии на сложных средах, содержащих большие количества дрожжевого экстракта, томатного сока, молочной сыворотки и крови. Некоторые молочнокислые бактерии при росте на средах, содержащих кровь, образуют цитохромы. Растут оптимально при температуре от 30 до 40 градусов по Цельсию. [8], [2].

Лактобактерии являются ауксотрофными организмами и очень требовательными к искусственным питательным средам. Успешность использования сред зависит от их качества и состава. Для стимуляции их роста в питательную среду надо добавлять различные добавки: дрожжевой экстракт, твин-80, дрожжевой автолизат. Некоторые пептиды и аминокислоты (L-аргинин солянокислый, цистеин солянокислый) усиливают рост молочнокислых бактерий. Для гидролиза белков, чтобы перевести их в более доступную для лактобактерий форму используются протеолитические ферменты. Для роста лактобактерий требуются не только продукты гидролиза белков, но и нативный белок. Есть много питательных сред, используемых для культивирования лактобактерий, но не всегда искусственная среда отвечает питательным потребностям лактобактерий. Например, классическая МРС-среда, которая широко используется на практике, не всегда подходит в отношении органического азота, источников марганца, магния, фосфора. Для роста молочнокислых бактерий большое значение имеют буферные свойства среды. Буферные натриевые соли лимонной, фосфорной и уксусной кислот, благоприятно влияют на рост молочнокислых бактерий. В обезжиренном молоке и обычных питательных cредах количество молочнокислых бактерий составляет 1,0Ч109 -2,0Ч109 клеток/мл. Но молоко как среду для накопления молочнокислых бактерий нельзя использовать без специальной предварительной обработки из-за коагуляции белка, что затрудняет отделение клеток. Если применять среды, состоящие из триптона, дрожжевого экстракта, глюкозы или лактозы в условиях регулируемого ph можно получть большой урожай клеток. Но эти среды не целесообразно использовать при массовом производстве.

На развитие молочнокислых бактерий влияют различные микроэлементы. Поэтому используется хлорид натрия, ацетат натрия, двузамещенный цитрат аммония, лимоннокислый натрий, марганец, магний фосфор и железо. Также для культивирования лактобактерий используется сухой ферментативный пептон из казеина, мясной экстракт, гидролизат обезжиренного молока, печеночный экстракт.[8]

В качестве примера можно привести среду для культивирования лактобактерий. (Таблица 1) рН (при 25°С) 6,5 ± 0,2

В этой среде протеозопептон и мясной экстракт являются источниками необходимых питательных веществ, глюкоза - ферментируемым субстратом и источником энергии.

Таблица 1- Среда для выделения и культивирования лактобактерий

№	Наименования соединения	Концентрация(г/л)
1	Протеозопептон	10
2	Мясной экстракт	10
3	Дрожжевой экстракт	5
4	Глюкоза	20
5	Твин-80	1
6	Аммония цитрат	2
7	Натрия ацетат	5
8	Магния сульфат	0,1
9	Марганца сульфат	0,05
10	Натрия гидрофосфат	2
11	Агар-агар	12
12	H2O дист	До 1 л

Дрожжевой экстракт обеспечивает витаминами группы В. Твин-80 является источником жирных кислот, необходимых для роста лактобактерий. Ацетат натрия и цитрат аммония подавляют рост стрептококков, плесневых грибов и многих других микроорганизмов. [6]

3. Плазмиды лактобактерий

Плазмиды бактерий представляют собой дополнительные факторы наследственности, распалагаются внехромосомно. Плазмиды - это двухцепочечные, кольцевые молекулы ДНК, которые являются автономными и самореплицирующими структурами. Но также известны и линейные плазмиды. Плазмиды чрезвычайно разнообразны по размерам от 1,5 kb и могут достигать размера более 600 кб. Некоторые плазмиды содержат от 1 до 3 генов, другие могут достигать 10-20% размера бактериальной хромосомы.[10]

Свойства плазмид бактерий:

1. Способны к автономной репликации.

2. Способны передаваться из клетки в клетку при конъюгации (трансмиссивность).

3. Способны к интеграции в бактериальную хромосому.

4. Конъюгативные плазмиды обладают свойством поверхностного исключения.

Плазмиды, которые могут существовать в двух состояниях - автономном и интегрированном называют эписомами.

Плазмиды придают бактериям различные фенотипические признаки, такие как:

1. устойчивость к антибиотикам, ионам тяжелых металлов, мутагенам (R-плазмиды);

2. придают способность вызывать биодеградацию камфоры, ксилола, нафталина (D-плазмиды);

3. придают способность синтезировать антибиотики, бактериоцины, пигменты, инсектициды, гемолизины, токсины, фибринолизины;

4. придают способность использовать в качестве источника углерода различные углеводы и необычные аминокислоты;

5. способность вызывать образование опухолей у растений (Ti-плазмиды);

6. способность конъюгировать с реципиентными штаммами бактерий или донорные свойства

7. способность осуществлять рестрикцию и модификацию ДНК и др.

Но существуют много плазмид фенотипические функции которых неизвестны, такие плазмиды нызываются криптическими.[5]

Среди 65 таксономических видов лактобактерий, по крайней мере 25 видов (около 38% от рода) содержат нативные плазмиды. Плазмиды лактобактерий были впервые выделены из Lactobacillus Casei, а затем из других видов лактобактерий.

Обычно лактобактерии содержат одну или несколько (от 1 до 10) различных плазмид, но L. рlantarum LPC25 содержит 16 плазмид. Размер большинства плазмид лактобактерий меньше 10 кб, но существуют плазмиды размером более 100 кб. Например, размер плазмиды pPM68 L. аcidophilus составляет 110 кб. Плазмиды могут быть встроены в хромосому и не наблюдаться, и таким образом число плазмид может быть недооценено. Плазмиды лактобактерий обычно кольцевые, но были выделены две линейные плазмиды из L. gasseri CNRZ222 размером 150 кб и IP102991 50 кб. Исследования гибридизации ДНК и секвенирования ДНК показали, что в некоторых плазмидах могут существовать определенные гомологи из того же штамма, видов, родов. Например, рLP1 плазмиды были обнаружены не только в L. curvatus, L. lantarum, L. sake, но и в в Carnobacterium spp. и Leuconostoc mesenteroides. Две плазмиды pPM52 и pPM68 из L. johnsonii VPII1088 могут интегрироваться в хромосому.

Было обнаружено много плазмид лактобактерий, но очень мало известно об их структуре. Только у 12 из них была полностью выявлена последовательность ДНК. Информация об этих плазмидах приведена в таблице 2. Последовательность плазмиды pl из L. acidophilus была определена частично. Их размеры варьировали от 1,9 до 5,7 Кб, а по содержанию G / C пар плазмиды из L acidophilus, L. curvatus, L. helveticus, L. Plantarum, L. Reuteri были в диапазоне от 33 до 42%. [11]

Таблица 2- Плазмиды.

Плазмида	Вид бактерии	Размер (bp)	Прямые повторы	ORFs	ORFs продукт	Функция
pA1	L.plantanum	2820		ORF1	REPA	Контроль количества копий
				ORF2	REPB	Репликация
				ORF3		Мобилизация
pC30il	L.plantanum	2140	17bpx14	ORFR	REP	Репликация
pLAB1000	L. higardii	3331		ORF1	REP	Репликация
				ORF2	MOB	Мобилизация
pLB4	L.plantanum	3547		ORF1	REPA	Контроль количества копий
				ORF2	REPB	Репликация
				ORF3	PREA	Рекомбинация
pLC2	L.curvatus	2489	17bpx1	ORF1	REP	Репликация
				ORF2
				ORF3
pLH2	L.helveticus	5727	17bpx2	ORF1	REP	Репликация
				ORF2
				ORF3
				ORF4
pLH3	L.helveticus	3414	17bpx1	ORF5	REP	Репликация
				ORF6
pLH4	L.helveticus	2556	17bpx1	ORF6	REP	Репликация
pLJ1	L.helveticus	3292	17bpx1	ORF	?
pLP1	L.plantanum	2093	17bpx13	ORF	REP	Репликация
p353-2	L.pentosus	2422		OFF	REP	Репликация
P8014-2	L.plantanum	1908	17bpx1	OFF		Репликация
			18bpx1

3.1 Функции плазмид

Хотя известно много различных плазмид лактобактерий, но большинство из них являются криптическими. Обычно эти плазмиды небольшие и находятся в клетке в большом количестве. Криптические плазмиды не оказывают сильного влияния на фенотип хозяина. Их размеры варьируют от 1 до более 100 кб, и они были найдены во многих лактобактериях. [10] Методы, используемые для изучения функций нативных плазмид включают в себя выделение плазмиды из клетки, передача плазмиды в подходящего хозяина и сравнение физиологических свойств или фенотипов между выделенными плазмидами. Но этот метод предоставляет косвенные доказательства, связанные с функциями плазмид. В качестве прямого метода для исследования функций плазмид некоторые структурные гены несущие определенные функции были клонированы и изучены. Раньше для изучения плазмид в лактобактериях использовался метод равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлорида цезия, но в последнее время стали использовать электрофорез в геле агарозы. Так как агарозный гель может выявлять плазмиды в диапазоне от 1,7 до 60.

Функции плазмид лактобактерий можно разделить на 4 группы:

1. плазмиды участвующие в гидроле белков.

2. плазмиды участвующие в метаболизме углеводов, аминокислот и цитрата.

3. плазмиды участвующие в продукции бактериоцинов, экзополисахаридов и пигментов.

4. плазмиды придающие бактериям устойчивость к антибиотикам, тяжелым металлам и бактериофагам.

Плазмида pLHJ1 из L. helveticus SSP. Jugurti S36.2 и 5,4 kb плазмида из L. helveticus HLM 1 обладают протеолитеческой активностью.

Плазмиды лактобактерий могут усваивать галактозу, лактозу, мальтозу и сорбит. Более 10 плазмид лактобактерий связаны с метаболизмом лактозы. Например, можно привести такие плазмиды pLA102, pLA421 из L. acidophilus; pLZ15, pLZ18A, pLZ19A, pLZ61, pLZ64 из L. сasei, и плазмида из С3.8 из L. рlantarum. Гены gal, phg и Flll^Lac участвующие в метаболизме лактозы были клонированы. Плазмида pLA101 из L. acidophilus TK8912 участвует в метаболизме галактозы. pML291 из Lactobucillus sp. и a 53,1 kb плазмида из Lactobucillus spp. участвуют в утилизации мальтозы. 60 Kb плазмида Lacnobacillus Sp. участвует в фементации сорбита.

2,7 и 8,3 Кб плазмиды из L. sake L13 участвуют в метаболизме цистеина.

10,8 кб плазмида из L. Plantarum IFО3070 участвует в ферментации цитрата.

Лактобактериии способны продуцировать различные бактериоцины. Сегодня известно 28 видов бактериоцинов выделяемых лактобактериями. Среди них девять бактериоцинов продуцируется плазмидами. К этим бактероцинам относятся асидоцин A, асидоцин B, асидоцин 8912, бревицин 27, курвацин A, лактацин F, лактацин S, плантацин 154, сакацин A. Плазмиды, кодирующие продукцию асидоцина 8912, бревицина 27, лактацина F, лактацина S и сакацина также придают клеткам устойчивость к бактериоцинам. ДНК детерминанты для производства асидоцина A (acdA), курвацина A (curA), лактацина F (laс), and сакацина A (sak) были клонированы и секвенированы.

6,9 Кб плазмида из L. Casei ssp. Casei NCIB4114, 11,2 кб плазмида из Lactobacillus sp., 30 Kb плазмида L. сasei CG11 CG11 продуцируют экзополисахариды.

Плазмида pRL5 12 из L. Plantarum L622 продуцирует оранжевый пигмент.

Плазмиды, связанные с резистенцией к арсенату были найдены в L. helveticus ATCC 15009.

Известно более 10 плазмид лактобактерий, которые придают устойчивость к антибиотикам, таким как хлорамфеникол, эритромицин, канамицин, стрептомицин, тетрациклин. [11] Плазмиды, устойчивости к антибиотмкам приведены в таблице 3.

Таблица 3 - Устойчивость к антибиотикам.

Вид бактерии	Плазмида	Размер плазмиды	Антибиотик	Ген
Lacnobacillus Sp 195	pBS195	4,4	Канамицин и стрептомицин
Lacnobacillus Sp 100-33	pLAR33	18.0	Эритромицин	ernt
L. acidophilus T145		53,9	Хлорамфеникол
L.fermentum LF601	PLY2	15,6	Тетрациклин
	PLY4	57,8	Эритромицин
L.plantanum CaTC2R	PCaT	8,5	Хлорамфеникол
L.reuteri D129		7,2	Хлорамфеникол
L.reuteri 55S		5,9	Хлорамфеникол
L.reuteri 100-63	pGT633	9,8	Эритромицин	ermGTa
L.reuteri 1044	PLuL631	10,2	Эритромицин	erm
L.reuteri 1048		8,5	Эритромицин	erm

3.2 Механизмы репликации плазмид

Минимальным требованием к плазмидам является их способность к репликации. Репликон является важной частью плазмиды. Репликон представляет собой область на плазмиде, которая кодирует гены, необходимые для репликации плазмиды. Он редко превышает 3 kb. Репликон состоит из сайта инициации репликации (Ori), cop/inc генов, участвующих в регуляции инициации репликации и rep генов, кодирующих rep белки, необходимые для репликации. Репликон обеспечивает репликацию плазмиды в клетке хозяине и передачу плазмид между клетками.

Режим репликации плазмид влияет на некоторые характеристики векторов: круг хозяев, стабильность и число копий. В лактобактериях наиболее распространенными механизмами репликации являются сигма-и тета-типы репликации.

Sigma-репликация плазмид (репликация по типу катящегося кольца). Sigma-репликация характерна для плазмид RCR-типа. RCR плазмиды представляют собой группу небольших, мультикопийных плазмид. Они широко распространены среди бактерий. Генетические элементы участвующие в RC- репликации представлены rep геном, который кодирует белок инициации репликации (Rep) и контролирует репрессор и его мишень, [+] нить репликации или dso (double-strand origin). У RCR плазмид есть [-] нить репликации или sso (single strand origin). Белок rep является сайт-специфической нуклеазой.

Ведущая нить репликации генерирует:

1. молекулы dsДНК, образованные родительскими [-] цепями и вновь синтезированными [+] цепями.

2. промежуточные ssДНК, которые соответствует родительской [+] цепи.

В отстающих нитях происходит синтез и преобразавание ssDNA в dsDNA. Последний этап включает сверхспирализаиию ДНК под действием ДНК-гиразы. Клонированные векторы на основе RC репликонов имеют низкую сегрегационную стабильность из-за накопления промежуточных, а вставки чужеродной ДНК могут еще больше уменьшить их устойчивость. Накопление ssДНК из-за отсутствия sso препятствует преобразованию ssДНК в dsДНК. На основании сходства в структуре rep белков и dso, RC репликоны из грамположительных бактерий были объединены в пять семей: pMV158/pE194, pC194, pT181, pSN2 и pTX14-3. RCR плазмиды лактобактерий относятся к рЕ194 и pC194 семьям.

Тета-репликация плазмид.

Предполагалось, что RC-плазмиды были широко распространены в грам-положительных бактериях, но в последнее время выделено и охарактеризовано большое количество тета-плазмид из лактобактерий. Тета-плазмиды бывают средних и больших размеров, кодирующие важные метаболические функции, продукцию ферментов, например лактазу, лактазпротеазу и цитрат пермеазы, устойчивость к бактериофагу, продукцию экзополисахаридов, и продукцию педиоцина. Некоторым криптическим плазмидам также присущ механизм тета репликации. Тета репликация присуща не только большим плазмидам, но некоторым очень маленьким плазмидам, например p4028 (4,4 Кб), pTXL1 (2,7 Кб), и pMB1 (1,9 Кб).

Основное различие между сигма-и тета-репликации в том, что тета-репликация плазмиды не образует промежуточных ssДНК. Это приводит к большей структурной и сегрегационной стабильности. Этот механизм репликации лучше подходит для конструкции векторов. Тета репликация состоит из трех основных компонентов:

1. Инициатор белка (Rep), необходимый для развёртывания нити.

2. Точки начала репликации (ori) со специфической структурой организации ДНК для развёртывания нити и инициатором связывания с белками.

3. Полимеразы для синтезируемой нити.

В тета-механизме ведущие и отстающие нити расположены близко друг к другу. Во время повторов нити ДНК остаются ковалентно замкнутыми, за исключением дочерних молекул. [10]

4. Вектора на основе плазмид

Множество клонированных векторов были построены из криптических плазмид лактобактерий. Большинство векторов имеют широкий круг хозяев.

Они в основном относятся к рЕ194 семье, RC плазмидам. Производные этих плазмид могут распространяться в Lactobacillus ssp., Bacillus ssp. и E.coli. Некоторые вектора, полученные из L. fermentum, L. reuteri, L. helveticus, L. acidiphilus, L. crispatus, L. Delbrueckii обладают узким кругом хозяев. Такие вектора интересны из-за безопасности, связанной с использованием жизнеспособных рекомбинантных организмов или генетически модифицированных микроорганизмов в пищевых продуктах или использование в качестве вакцины. Узкий диапазон хозяев считается болеее безопасным, так как они имеют меньше шансов быть горизонтально переданными в другие виды бактерий, чем векторы на основе широкого диапазона хозяев.

Вектора на основе RC плазмид менее стабильны, чем на основе тета плазмид.

Вектора, использованные для трансформации лактобацилл имеют ген устойчивости к эритромицину от рЕ194 или pAMв1 или ген устойчивости к хлорамфениколу из рС194 или pBR322, в качестве селективных маркеров. Устойчивость к ампициллину используется в селекционных векторах для отбора в E.coli. Пищевые селекционные маркеры были разработаны для лактобактерий , используемых в пищевой промышленности.

Пищевые вектора построены на основе криптических плазмид лактобактерий и не содержат гены устойчивости к антибиотикам в качестве маркеров. Также для клонирования векторов можно использовать то, что лактобактерии могут расщеплять различные сахара.

Выбор маркеров имеет первостепенное значение в технологии рекомбинантной ДНК. Исследования должны сосредоточиться на дальнейшем развитии пищевых селективных маркеров, которые подходят для больших объёмов промышленного применения.[10]

Полезные вектора предназначенные для клонирования должны иметь:

1. репликон для амплификации вектора в клетках хозяина.

2. ауксотрофные или фенотипические маркеры для облегчения идентификации вставок кроме классических генов устойчивости к антибиотикам.

3. маркерные гены с уникальными сайтами рестрикции для одной или нескольких различных рестракционных эндонуклеаз. [11]

Используемые векторы для лактобактерий или других грамположительных бактерий можно разделить на два основных класса. Класс 1 представлен стрептококковым pIP501 и энтерококковыми pAMв1 векторами и их производными, представлены большими конъюгативными плазмидами, которые устойчивы к макролидам, линкозамидам и другим антибиотикам. pIP501 и pAMв1 являются тета-плазмидами.

Второй класс векторов полученныый из небольших криптических плазмид из нескольких видов lactococcal. Эти векторы имеют структурную и сегрегационную нестабильность в связи с их механизмом репликации (RCR) и редко поддерживают большие фрагменты ДНК. Они могут использоваться только для клонирования малых генов. Но вектора pSH71 pWV01, относящиеся к данному классу и их производные полезны, так как они имеют широкий диапазон хозяев.

Исследования в настоящее время сосредоточены на создание стабильных клонированных векторов полученных из плазмид с GRAS происхождением. [10]

Наиболее известные клонированные векторы для лактобактерий колеблются от 3 до 10 кб, исключение pVA797, который достигает размера до 30,7 Кб. Источники реплицирующих векторов лактобактерий могут содержать нативную плазмиду из лактобактерий или из других грамположительных бактерий: Bacillus (pBCl), Enterococcus (pAMPl), lactococccus(Psh71, Pwv-01), Staphylococcus (pC194, pCA43), Streptococcus (pIP501, pMV163) и транспозон Tn919 из Streptococcus. Среди них, pC 194, pE194, pSH7 1, PUB 110 и pVA380- 1 RCR типа плазмиды, хотя pAMPl, pIP501, и их производные реплецируется по тета модели.

Генетические маркеры, содержащиеся в векторах лактобактерий, можно разделить на три типа:

1) маркёры лекарственной устойчивости.

2) маркёры утилизации углеводов.

3) маркёры биосинтетических особенностей.

Так как большинство штаммов лактобактерий устойчивы к ампициллину, клоксациллин, гентамицин, канамицин, неомицин, пенициллин, стрептомицин, тетрациклин и др, то эти маркеры редко используются для построения векторов лактобактерий.

Маркеры лекарственной устойчивости не могут функционировать в большинстве лактобактерий например pSA3 с сопротивлением к эритромицину может обеспечить устойчивость к эритромицину трансформантов L. Casei 393, но не L. Casei MSK248.

Некоторые вектора лактобактерий имеют специфические функции, помимо общей функции клонирования. Вектора лактобактерий можно классифицировать:

1) интегрированные векторы.

2) векторы экспрессии.

3) многовекторные сайты клонирования.

4) репликон- клонированные векторы.

5) позитивные векторы селекции.

6) промоутерные клонированные векторы.

7)векторы- промоторы секреции сигнальной последовательности.

8) чувствительные к температуре векторы и т.д.

Вектора были построены путем выделения фрагментов ДНК из хромосомы, плазмиды или фага лактобактерий и лигированием фрагмента в вектор. Фрагмент ДНК, содержащий весь вектор обычно интегрируется в хромосому хозяина, плазмиду или геном фага гомологичной рекомбинации.

Таблица 4- Круг хозяев репликонов лактобактерий и других бактерий, методы трансформации.

Вид	Круг хозяев, где репликон экспрессируется	Другие бактериальные репликоны, которые экспрессируются в Lactobacillus spp	Методы трансформации
L. acidophilus	L. acidophilus, L. casei	L: p353-2, p8014-2, 7-kb plasmid	Cnj, Elp, Mob, Tdc
		En: pAMв1
		Lc: pSH71, pWVO1
		Sp: pC194, pE194, PUB110
		St: plP501, pMVl63, pVA380-1, Tn919
L. casei	L. casei, L. delbrueckii, Lc. lactis	L: pCaT, pLA105, pLAB1000, pLC2, p353-1, p353-2, p8014-2	Cnj, Elp
		B:N
		En: pAMв1
		Lc: pSH71, pWVOl
		St: PIP501
L. helveticus	L. helveticus	L:p8014-2, 7-kb плазмида	Cnj, Elp, Mob, Tdc
		En: pAMвl
		Lc: pWV0l
		St:plP501, pVA380-1
		Sp: pE194
L. hilgardii	B. subtilis, En. Faecalis, L. casei, L. plantarum
L. plantarum	G-(-):E.coli	L: pLAB1000, p353-1, p353-1, p352-2	Cnj, Elp, Mob, Ppt
	G-(+):	En: pAMв1
	B. subtilis, C. divergens,	Lc: pSH71, pWVO1
	L. acidophilus	St: plP501, pVA380-1, Tn919
	L. brevis, L. casei,	Sp: pCl94, pE194
	L.delbrueckii,
	L. fermentum,
	L. helveticus,
	L. pentosus, t.
	lantarum,
	L. reuteri, L. sake,
	Lc. lactis
	L. plantarum
	C.piscicolа

На основе различных источников и структур интеграционные последовательности могут быть классифицированы на семь групп:

1) случайно клонированные фрагменты хромосом,

2) случайно клонированные фрагменты плазмид,

Примерами этих двух групп являются pCITI104, pCIT 1105, pGIP2 12X, pH42 1, pJRl и pEI1400. Они были интегрированы в хромосому или плазмиду на неизвестные сайты благодаря неспецифической интеграции фрагментов ДНК.

3)инсерционные последовательности, например pTRK327 содержит вставки последовательностей (IS3) из хромосомы L. jahnsonii и может интегрироваться случайно в хромосому хозяина.

4) клонированные гены из хромосомы, к этой группе относятся pGAF00l, pGIw3, pSUWlO4, pSUW200, pSUW20 1, pSUW202, pTHC1. Они состоят из cbh (коньюгативные гидролазы желчные соли гидролазы) или pepXP (X-пролил-дипептидил аминопептидаза) генов из лактобактерий. Вставляется в хромосому на специфических сайтах.

5) ДНК фрагменты фага. К этой группе относится вектор pTRK170.

6) ДНК фрагмент фага, содержащий сайты связывания (attP) и интегразные гены (intG) и другие.

Примерами группы 6 являются pMC1, pTRKlS2, pTRK209, pTRK318.

Таблица 5- Вектора лактобактерий, обладающие специальными функциями

Вектор	Характеристика
PAZ8	Клонированный репликон
PGIP212	Клонированнный промотер, сайт поликлонирования, позитивная селекция.
PGIP331	Клонированный промотер
PH2311	Картирование, сайт поликлонирования
PSA3	Температурная чувствительность
PTV1	Температурная чувствительность
PMG36e	Экспрессия
PNZ272	Клонированный промотер
PSA34	Клонированный репликон

Векторы экспрессии содержат не только чужеродный ген, но и промотер, оператор, и терминаторную последовательность, что требуется для эффективно транскрипции. Векторы экспрессии также содержат сайт связывания рибосом, который необходим для эффективной трансляции. Вектор, содержащий функциональный промотор, который может экспресировать клонированные гены должен быть соединен с промотером.

Методы введения векторов в лактобактериях делятся на шесть категорий: коньюгация, электропорации, мобилизация, слияние протопластов, трансформации протопластов, и трансдукции. Эти методы были применены в 17 видах лактобактерий, но не для одного из видов лактобацилл нет разработок, чтобы использовать все эти методы переноса ДНК.

При переносе вектора в клетку хозяина, существующие плазмиды содержат те же или аналогичные репликоны и поэтому они могут быть несовместимы. Нативные плазмиды и трансформированные вектора могут конкурировать за компоненты, необходимые для репликации. Многие случаи несовместимости плазмид в лактобактериях не известны. Нативная плазмиды pWS97 L. delbruckii SSP. Lactis WS97 была удалена, когда штамм был введен с вектором pJK300, содержащем репликон из плазмиды.

Вектор может устойчиво поддерживаться в культуре клеток путем интегрирования в гомологические сайты в хромосоме хозяина (меньшее количество копий), чем она существует в цитоплазме внехромосомно (более высокое количество копий).

Примеры интегрированных векторов применяемых в лактобактериях приведены в таблице 6.

Таблица 6 - Интегрированные вектора лактобактерий.

Вектор	Размер (kb)	Генетический маркёр	Источник интегрированной последовательности	Основа вектора
PCIT1104		Ap/, Cm/	Фрагмент хромосомы L. plantanum	pHV60
PEI1400	5,3	Ap/, Em/	Фрагмент плазмиды L.acidophilus	pEI2
pSUW104	11,0	Cm/, Em/	Внутренний фрагмент гена лактатдегидрогеназы из хромосомы L. helveticus	pSA3
pTRK182	10,5	Cm/, Em/	attP b intG из фага цadh L. gasseri	pSA34
PTRK327	8.2	Cm/, Em/	Вставки последовательности (IS3) из хромосомы L.johnsonii	pSA3
PGAF001		Em/	Ген cbh из хромосомы L. plantanum	pGIP73

4.1 Применение векторов

Хотя большинство плазмид лактобактерий являются криптическими, некоторые свойства и функции плазмид были применены на практике.

Конструкция пищевых векторов для интеграции ДНК только от микроорганизмов GRAS в лактобактерии является очень важным для улучшения этой бактерии во многих применениях в питании. Кроме того лактобактерии могут быть использованы для производства гетерологичных белков. В результате, все большее внимание уделяется перспективам разработки векторов экспрессии, векторов секреции или других специфических векторов для клонирования генов.

Примеры является стабилизация плазмид кодирующих гены гидролиза белка и лактозы, продукцию бактериоцинов, экзополисахаридов и пигментов и развитие резистентности к бактериофагам. Усовершенствование протеолиза может помочь в гидролизе молочного белка и улучшении продукции молочной кислоты бактериями в молочных продуктах. Способность к разрушению лактозы в молочных продуктах может привести к увеличению сладости, предотвращению кристаллизации лактозы и облегчить непереносимость лактозы у человека. Экзополисахариды могут улучшить качество текстур в ферментированных молочных продуктов. ДНК детерминанты лекарственной устойчивости могут быть использованы для построения векторов в качестве селективного маркера. Плазмиды кодирующие бактериоцины могут представлять интерес в пищевой промышленности для ингибирования роста бактерий приводящих к порче продуктов и патогенных микроорганизмов.

Плазмиды, кодирующие продукцию экзополисахаридов и бактериоцинов представлены в таблице 7.

Таблица 7 - Плазмиды продуцирующие экзополисахариды и бактериоцины и слизь.

Вид бактерии	Плазмида	Функция
Lactobacillus sp.		Продукция экзополисахаридов
L. acidophillus M46	pCV461	Продукция ацидоцина В
L. acidophilus TK8912	pLA103	Продукция ацидоцина 8912
L. acidophilus TK9201	pLA 9201	Продукция ацидоцина A
L.brevis SB27	4,6 kb	Продукция бревицина 27
L. casei CG11	30 kb	Продукция экзополисахаридов
L. casei NCIB4114	6,9 kb	Продукция слизи
L. curvatus LTH1174	60 kb	Продукция курвацина А
L. johnsonii VPI11088	pPM68	Продукция лактацина F
L.sake L45	pCIM1	Продукция лактацина S
L.sake Lb706	60 kb	Продукция сакацинаА

Некоторые нативные плазмиды из Lactobacillus было трудно извлечь путем сублетальных температур или с помощью акрифлавина, этидия бромида и новобиоцина и т.д. Однако, несовместимость может помочь извлечь эти плазмиды из лактобактерий. Например, плазмиды в 1,7 кб и 2,3 кб из L. pentosus не могут быть удалены используя общие подходы удаления, но они были извлечены путем трансформации векторов клетки, построенных из этих двух плазмид. [11]

молочнокислый лактобактерия плазмида

5. Молочнокислое брожение

Молочнокислое брожение - процесс анаэробного окисления углеводов, конечным продуктом которого является молочная кислота. Для молочнокислых бактерий - основный путь катаболизма углеводов и основный источник энергии в виде АТФ. Так как они не содержат цитохромов и неспособны синтезировать АТФ с помощью дыхания.[1]

Этот тип брожения был изучен Л. Пастером в 1857 г. Чистую культуру молочнокислых бактерий впервые выделил Д. Листер в 1877 г. из кислого молока. [9]

Есть два типа молочнокислого брожения: гомоферментативное и гетероферментативное.

При гомоферментативном молочнокислом брожении синтезируется практически одна молочная кислота (? 90 % всех продуктов брожения). Катаболизм глюкозы происходит по гликолитическому пути. Пировиноградная кислота не подвергается декарбоксилированию, а под действием лактатдегидрогеназы восстанавливается до молочной кислоты. Конечный акцептор водорода пировиноградная кислота.

Суммарное уравнение гомоферментативного молочнокислого брожения:

С₆Н₁₂О₆ + 2АДФ + 2Фн 2СН₃ - СНОН - СООН + 2АТФ.

Гомоферментативное молочнокислое брожение осуществляют бактерии Streptococcus cremoris, S. lactis, Lactobacillus bulgaricus, L. lactis и др.

При гетероферментативном молочнокислом брожении образуются разнообразные продукты: молочная и уксусная кислоты, этиловый спирт, углекислый газ и глицерин. Углеводы расщепляются по пентозофосфатному пути. Конечным акцептором водорода являются пировиноградная кислота и ацетальдегид. Гетероферментативное молочнокислое брожение осуществляют бактерии видов Leuconostoc mesenteroides, Bifidobacterium bifidum, Lactobacillus brevis, L. fermentum, Oenococcus oeni. и др.[5]

Образование D, L или DL-молочной кислоты зависит от стереоспецифичности лактатдегидрогеназы и от наличия лак-татрацемазы. От доступа кислорода зависит количество образующихся побочных продуктов. [7]

Теперь рассмотрим более подробно каждый из типов молочнокислого брожения.

Гомоферментативное брожение.

Гомоферментативное молочнонокислое брожение как уже говорилось ранее осуществляется с помощью гликолиза.

Субстратом для этого типа брожения служат моносахариды (глюкоза) и дисахариды (мальтоза, лактоза).

На первом этапе происходит фосфорилирование глюкозы с образованием глюкозо-6-фосфат. Лактоза прежде чем фосфорилироваться расщепляется с помощью бета-галактозидазы на D-галактозу и D-глюкозу. D-галактоза подвергается фосфорилированию с образованием D-галактозо-1-фосфата. Последний превращается в глюкозо-1-фосфат.

У некоторых бактерий есть фермент мальтозофосфорилаза, катализирующий превращение мальтозы в глюкозо-1-фосфат и глюкозу.

Если используется гликоген или крахмала, то сначала происходит фосфоролитическое отщепление глюкозного остатка.

Дальше глюкозо-6-фосфат изомеризуется в молекулу фруктозо-6-фосфата. Донором фосфата служит АТФ. Вторичное фосфорилирование молекулы фруктозы приводит к образованию фруктозо-1,6-дифосфата, который с помощью фруктозо-1,6-дифосфатальдолазы распадается на фосфодиоксиацетон и 3-ФГА. В дальнейшем фосфодиоксиацетон с помощью триозофосфатизомеразы превращается в 3-ФГА. На образовании 3-ФГА заканчивается подготовительный этап гликолиза.

3-ФГА с помощью 3-ФГА-дегидрогеназы окисляется до 1,3-дифосфоглицериновой, в котором запасается энергия. 3-ФГА с помощью НАД-зависимой 3-ФГА-дегидрогеназы превращается в 1,3-ФГК.

После образования 3-ФГК фосфатная группа из третьего положения переносится во второе с образованием 2-ФГК. Далее от 2-ФГК отщепляются молекулы воды от второго и третьего атомов углерода, эта реакция катализируется ферментом енолазой, и образуется фосфоенолпировиноградная кислота. ФЕП с помощью пируваткиназы превращается в пируват. Пировиноградная кислота под действием лактатдегидрогеназы восстанавливается до молочной кислоты.

Энергетический выход процесса: 2 молекул АТФ на одну молекулу глюкозы. Если исходный субстрат - полисахарид, образуются 3 молекулы АТФ на 1 молекулу глюкозы. [1]

Схема гомоферметативного молочнокислого брожения представлена на рисунке 1.

Рисунок 1-Гомоферментативное молочнокислое брожение: Ф1-гексокиназа; Ф2-глюкозофосфатизомераза; Ф3-фосфофруктокиназа; Ф4-фруктозо-1,6-дифосфат-альдолаза; Ф5-триозофосфатизомераза; Ф6-ЗФГА-дегидрогеназа; Ф7-фосфоглицераткиназа; Ф8-фосфоглицеромутаза; Ф9-енолаза; Ф10-пируваткиназа; Ф11-лактатдегидрогеназа.

Гетероферментативное молочнокислое брожение - процесс более сложный, чем гомоферментативное.

Гетероферментативное молочнокислое брожение вызывают бактерии рода Lactobacterium и рода Streptococcus. Химизм этих брожений изучен не так хорошо, как спиртового или гомоферментативного молочнокислого брожения. [4]

Гетероферментативные бактерии сбраживают ограниченное число веществ: некоторые гексозы, пентозы, сахароспирты и кислоты.[3]

У гетероферментативных молочнокислых бактерий нет главных ферментов фруктозобисфосфатного пути - альдолазы и триозофосфатизомеразы. Начальное превращение глюкозы идет по пентозофосфатному пути, т.е. через глюкозо-6-фосфат, 6-фосфоглюконат и рибулозо-5-фосфат. Рибулозо-5-фосфат под действием эпимеразы превращается в ксилулозо-5-фосфат, который под действием пентозофосфокетолазы расщепляется до глицеральдегидфосфата и ацетилфосфата.

Нерастущие, отмытые клетки Leuconostoc mesenteroides сбраживают глюкозу до лактата, этанола и двуокиси углерода.

У этих бактерий ацетилфосфат восстанавливается через ацетил-СоА и ацетальдегид в этанол. Другие гетероферментативные молочнокислые бактерии переводят ацетилфосфат частично или целиком в уксусную кислоту. Глицеральдегидфосфат через пируват превращается в лактат. Рибозу Leuconostoc mesenteroides сбраживает в лактат и ацетат.

При сбраживании фруктозы гетероферментативными бактериями образуются лактат, ацетат, СО₂ и маннитол.

Lactobacillus plantarum сбраживает глюкозу по гомоферментативному пути, а пентозы расщепляет с помощью фосфокетолазы, превращая их лактат и ацетат. Lactobacillus casei, хотя и сбраживает глюкозу по гомоферментативному, пути, но рибозу превращает в ацетат и лактат гетероферментативным путем. Рибоза индуцирует у нее синтез фосфокетолазы.

Гетероферментативная молочнокислая бактерия Bifidobacterium bifidum получила название за свою V- или Y-образную форму (лат. bifidus-раздвоенный). Все представители рода Bifidobacterium-строгие анаэробы; они не переносят присутствия кислорода, и для их роста нужна атмосфера, содержащая 10% С0₂. Бифидобактерии расщепляют глюкозу по фосфокетолазному побочному пути. Они не имеют ни альдолазы, ни глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, но содержат активные фосфокетолазы, расщепляющие фруктозо-6-фосфат и ксилуло-зо-5-фосфат на ацетилфосфат и эритрозо-4-фосфат или глицеральдегид-3-фосфат. [7]

Лактозу и глюкозу по гетероферментативному пути образуют только бифидобактерии. При катаболизме глюкозы СО₂ не образуется, так как отсутствует начальный этап-декарбоксилирование. Лактоза транспортируется в клетку с помощью пермеаз, а затем гидролизуется в глюкозу и галактозу. Гексозы подвергают катаболизму путём гексозомонофосфатного шунта с участием фруктозо-6-фосфат-фосфокетолазы. Продуктами ферментации Bifidobacterium являются лактат и ацетат, а ферментация двух молекул глюкозы даёт три молекулы ацетата и две молекулы лактата. Побочными продуктами являются: уксусная кислота, этанол. Последняя стадия -- восстановление пировиноградной кислоты до молочной та же самая, что и при гомоферментативным брожении. Выход энергии гораздо меньше, чем при спиртовом брожении.[3]

Схема гетероферментативного молочнокислого брожения представлена на рисунке 2.

Гены, кодирующие синтез ЛДГ приведены в таблице 8.

Таблица 8. Гены, кодирующие синтез ЛДГ.

Бактерия	Ген	Координаты	Длина	G/C	Тип гена	Продукт
L. plantanum	LoxD	201-1595	1792	44,4	Кодирущий белок	D-форма
L.casei	ldh	1-526	5266	46,6	Кодирущий белок
L.helveticus	ldhL	293-1264	1350	36,8	Кодирущий белок	L-форма
L.delbrueckii subsp bulgaricus	ldh	155-1078	1292	49,6	Кодирущий белок	L-форма
L. bulgaricus DBLB28	D-ЛДГ	17-1037	1037	49.6	Кодирущий белок	D-форма
L.plantanum	loxL	11-1127	1127	44,4	Кодирущий белок	L-форма
Lactobacillus spRKY2	ldh	114-1076	1232		Кодирущий белок	L-форма

• Рисунок 2 - Гетероферментативное молочнокислое брожение: Ф1-пентозофосфокетолаза; Ф2-3-ФГА-дегидрогеназа; Ф3-фосфоглицераткиназа; Ф4-фосфоглицеромутаза; Ф5-енолаза; Ф6-пируваткиназа; Ф7-лактатдегидрогеназа; Ф8-ацетальдегиддегидрогеназа; Ф9-алкогольдегидрогеназа; Ф10-ацетаткиназа.

6. Значение и применение молочнокислых бактерий

Лактобактерии являются естественной и обязательной составляющей нормальной микрофлоры человека и животных. В норме они имеются в желудочно-кишечном тракте. Как естественный фон микрофлоры лактобактерии выполняют ряд полезных функций, включая иммуномодуляцию, подавление кишечных патогенных микроорганизмов, а также поддержание здоровой микрофлоры кишечника. [2]

Но молочнокислые бактерии играют и отрицательную роль. Они могут вызывать порчу пива, фруктовых соков, мяса и других продуктов. Также среди этих бактерий присутствуют и патогенные формы для животных и человека. Например, Streptococcus pneumoniae. вызывает пневмонию, септицемию, ангину, гайморит. Streptococcus pyogenes вызывают рожу, абсцессы при раневых инфекциях. [5]

Самопроизвольно возникающее молочнокислое брожение в продуктах (молоке, вине, пиве, безалкогольных напитках и др.) приводит к их порче.

Молочная кислота широко применяется в кожевенной, текстильной, фармацевтической, пищевой промышленности и для получения биодеградируемых полилактидов, используемых для упаковки пищевых продуктов.[5]

Молочная кислота также используется для приготовления безалкогольных напитков. [3]

Молочнокислое брожение используется в молочной промышленности для изготовления простокваши, творога, сметаны, кефира, сливочного масла, ацидофильного молока и ацидофильной простокваши, сыров, квашеных овощей. Молочнокислые бактерии широко применяют также при силосовании кормов, при выделке меховых шкурок и в производстве молочной кислоты. [3]

Таблица 9. Бактерии, используемые для приготовления молочнокислых продуктов.

Молочный продукт	Используемые бактерии
Сметана	Lactococcus cremoris, Lactococcus lactis, Leuconostoc lactis и Leuconostoc mesenteroides subsp. cremoris
Йогурт	Streptococcus thermophilus и Lactobacillus bulgaricus
Кефир	Lactococcus lactis, Lactobacillus kefir, Lactobacillus kefiranofaciens
Творог	Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Lactococcus cremoris

Используется в производстве сырокопченых колбас. Так как образующаяся молочная кислота придает определенный вкус и снижает рН, что предохраняет от порчи. Используется для приготовления кислого теста в хлебопечении. Образующаяся молочная кислота используется для подъема теста, а также придает хлебу специфический кислый вкус.[5]

Заключение

1. Мною были рассмотрены плазмиды лактобактерий. Их размер чаще всего меньше 10 kb. Обнаружено много плазмид лактобактерий, но мало известно об их структуре. Плазмиды выполняют разнообразные функции: расщепление белков, синтез бактериоцинов, экзополисахаридов; участвуют в метаболизме углеводов, аминокислот; прида...