Биотехнологический синтез БАВ, как альтернатива химической технологии. Преимущества биотехнологических методов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биотехнологический синтез БАВ, как альтернатива химической технологии. Преимущества биотехнологических методов

Биотехнологический синтез биологически активных веществ продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, культур клеток и тканей, растений и животных - приобрел в последнее время большое значение и продолжает развиваться чрезвычайно быстрыми темпами.

Наряду с биосинтезом многие биологически активные вещества могут быть получены методами тонкого органического синтеза, поэтому выбор конкретного пути получения продукта определяется сравнительной экономической эффективностью биологического и химического способов производства. Часто на практике используют технологию, включающую и химические, и биологические стадии, которые взаимно дополняют друг друга. В результате промышленный биосинтез немыслим без применения (как на стадиях подготовки, так и при переработке продуктов) методов химической технологии, опробованных и нашедших широкое распространение в тонком органическом синтезе. В свою очередь последний все чаще не может обойтись без некоторых технологических стадий, осуществляемых с помощью микроорганизмов или выделенных из них ферментов и ферментных систем.

Наглядное представление о выше сказанном может быть проиллюстрировано на примере технологии аминокислот. Все 20 представителей этого класса органических соединений, являющихся мономерами для построения природных полипептидов и белков, достаточно глубоко изучены в химическом смысле, а методы их синтеза описаны во всех учебниках органической химии.

Известно также, что, в частности, белки млекопитающих построены исключительно из одного типа аминокислот, так называемых левовращающих, обозначаемых буквой L.

Современными методами тонкого органического синтеза можно синтезировать D- и L-формы аминокислот в любых количествах, однако все реальные способы их производства приводят лишь к образованию рацематов.

Альтернативой химическому синтезу оказывается микробиологический процесс, в котором специально подобранные, отселекционированные, а иногда и сконструированные методами генетической инженерии штаммы-продуценты в процессе жизнедеятельности, обычно на поздних стадиях развития, осуществляют так называемый сверхсинтез аминокислот, то есть производят их в количествах, намного превышающих потребности самих клеток. Поэтому все аминокислоты, D-изомеры которых не приемлемы для употребления, получают в промышленном масштабе только биотехнологическими методами. биотехнологический биосинтез метаболизм продуктивность

Необходимо отметить однако, что промышленный биосинтез аминокислот требует их выделения из весьма сложных по составу и разбавленных раствором - получающихся после отделения клеточной биомассы. Здесь и находит применение совокупность приемов, характерных для тонкого органического синтеза и предназначенных для получения товарных форм L-аминокислот, пригодных для кормового, пищевого или медицинского применения.

Похожая ситуация сложилась и в области производства антибиотиков. Несмотря на точное знание структуры практически всех известных веществ, обладающих антибиотическим действием, их чисто химический синтез громоздок и неэффективен. В промышленности получают антибиотики медицинского или ветеринарного назначения, используя способность соответствующих штаммов - продуцентов - генерировать данный антибиотик в определенной фазе роста и заданном режиме культивирования.

Однако за несколько десятилетий медицинского применения антибиотиков накопилось большое количество болезнетворных микроорганизмов, приобретших наследственную устойчивость к препаратам, ранее вызывавших их гибель. Выход из этой ситуации был достигнут путем химической трансформации природных антибиотиков: стали получать так называемые полусинтетические препараты, в структуру которых внесены некоторые изменения, не затрагивающие основной группировки атомов, ответственной за антибиотический эффект. Таким образом с помощью химических и биохимических (ферментативных) методов удается трансформировать природные пенициллины, цефалоспорины и т.п., опережая приспособление болезнетворных микроорганизмов к новым лекарственным препаратам.

Применение бактериальных препаратов, таких, как удобрения и средства защиты растений, также представляет собой альтернативу химическим веществам, используемым в земледелии. Однако здесь взаимоотношения биотехнологии и химической технологии оказываются иными. В отличие от минеральных удобрений и химических средств защиты растений, представляющих при неправильном или неумеренном потреблении очевидную опасность для окружающей среды, бакпрепараты значительно менее опасны, характеризуются более высокой избирательностью и, как правило, эффективностью действия. Таким образом, в данном вопросе речь идет о принципиально ином подходе к решению проблемы повышения урожайности сельскохозяйственных растений за счет применения биологических, а не химических методов обогащения почвы азотом и фосфором или устранения вредителей. В этом случае оказывается, что оптимальное сочетание биологических и химических средств позволяет добиться синергизма - усиления суммарного результата - и надежно избавить земледелие от целого ряда проблем.

Все сказанное иллюстрирует сложную систему взаимосвязи и конкуренции, установившуюся к настоящему времени между промышленной биотехнологией и химической технологией. Наиболее наглядное представление о современных биотехнологических методах получения биологически активных веществ дают изложенные в этом пособии основы получения технологии отдельных биопрепаратов.

Пути биосинтеза и методы селекции продуцентов БАВ. Метаболизм и метаболиты. Промышленные продуценты и пути повышения их продуктивности

Микроорганизмы, применяемые в микробиологической промышленности, принадлежат к разным таксономическим группам (бактерии, сумчатые грибы, фикомицеты, актиномицеты и т.д.) и существенно отличаются друг от друга по морфологии, размерам клеток, отношению к кислороду, по потребностям к ростовым факторам, по способности ассимилировать разные компоненты субстрата и т.д.

Некоторые группы микроорганизмов, используемые для промышленного биосинтеза химикатов, приведены ниже.

Продуцент Продукт

Дрожжи

Saccharomyces cerevisiae Этанол, глицерин

Kluyveromyces flagilis Этанол

Kl.Laktis Этанол

Schizosaccharomycts pombe Этанол

Clostridium acetobutylicum Этанол, уксусная,

Cl. Thermosaccharolynicum Глюкоза, ксилоза, этанол

Cl. Thermohydrosulfuricum Этанол, уксусная кислота

Cl. Auranticum Ацетон, бутанол, изопропанол

Cl. Thermoacticum Уксусная кислота

Cl. Propionicum Пропионовая, акриловые кислоты

Xanthomonas campestris Полисахариды

Zymjmjnas mobilis Сорбит, Леван, глюконовая кислота

Thermoanaerobacter ethanolicus Этанол, уксусная, молочная кислоты

Dunaliella sp. Глицерин

Aerobakter aerogenes 2,3 - бутандиол

Bacillus polumuxa 2,3 - бутандиол

Lactobacillus deldrueckii Молочная кислота

Acetobakter curvum Уксусная кислота

Микромицеты (плесневелые грибы)

Aspergillus niger Лимонная, щавелевая кислоты

As. Terreus Итаконовая кислота

As. Oryzae Ферментные препараты (амилаза)

As. Awamori Ферментные препараты (пектиназа)

Yarrovia lipolytika Ферментные препараты (липаза)

Candida lipolytica Лимонная, изолимонная,

пировиноградная кислоты

Бактерии

Из более чем 100 000 известных видов микроорганизмов в промышленности используют относительно мало - около 100 видов, к которым принадлежат несколько тысяч штаммов. По определению Л. И. Воробьевой (1987), промышленный штамм должен соответствовать следующим требованиям:

- расти на дешевых и доступных субстратах;

- обладать высокой скоростью роста биомассы (м) и давать высокую продуктивность целевого продукта (D,P) при экономичном потреблении питательного субстрата (Yx/s, Yp/s);

- проявлять направленную биосинтетическую активность при минимальном образовании побочных продуктов;

- быть генетически однородным, стабильным в отношении продуктивности и требований к питательному субстрату и условиям культивирования;

- быть устойчивым к фагам и другой посторонней микрофлоре;

- быть безвредным (не обладать патогенными свойствами) для людей и окружающей среды;

- желательно, чтобы продуценты были термофильными и ацидофильными (или алкалофильными), так как в этом случае легче предохранить ферментируемый субстрат от инвазии посторонней микрофлоры;

- целевой продукт биосинтеза должен иметь экономическую и народнохозяйственную ценность и должен легко выделяться из сбраженного субстрата.

Возрастающий интерес представляют анаэробные микроорганизмы, поскольку при культивировании не требуют энергоемких аэрирующих устройств.

Сверхсинтез, т.е. способность микроорганизма синтезировать определенный продукт в количествах, превосходящих физиологические потребности, довольно часто встречается в природе. Нередко тот или иной продукт обмена веществ (органические кислоты, спирты, антибактериальные вещества), выделяемый микроорганизмом в окружающую среду, является токсичным для других видов и служит продуценту как средство защиты обитаемого пространства или как резерв питательного вещества. Микроорганизмы с такими свойствами первыми использовали в хозяйственной деятельности человека в тысячелетней давности, и был проведен стихийный отбор наиболее продуктивных форм. Сейчас такие природные штаммы микроорганизмов, иногда после сознательного отбора, применяют для производства микробной биомассы (микробного белка) в качестве бактериальных азотистых удобрений, биопестицидов, в производстве пищевых продуктов, в других отраслях народного хозяйства. Однако основной контингент промышленных микроорганизмов представлен искусственно селектированными штаммами. Таким образом, в промышленности применяют три вида штаммов: природные штаммы, нередко улучшенные естественным или искусственным отбором; штаммы, измененные в результате индуцированных мутаций, и штаммы культуры, полученные методами генной или клеточной инженерии.

В связи с широким использованием микроорганизмов - продуцентов разнообразных продуктов их жизнедеятельности - первоначальными следует назвать задачи получения их высокопродуктивных штаммов, обладающих ценными биосинтетическими свойствами. Эти задачи в тесном контакте с микробиологами решают генетики, а также специалисты, владеющие методами генетической инженерии.

С возникновением генной инженерии появилась возможность направленно создавать для промышленности микроорганизмы с заданными свойствами. Это значительно расширяет области практического использования микроорганизмов.

Промышленно важные продукты жизнедеятельности микроорганизмов по их природе и значению для самой микробной клетки делят на три основные группы:

1) крупные молекулы (ферменты, полисахариды с молекулярной массой от 10 тыс. до нескольких миллионов);

2) первичные метаболиты (соединения, необходимые микроорганизмам для роста: аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые нуклеотиды, витамины);

3) вторичные метаболиты (соединения, ненужные микроорганизмам для роста: антибиотики, токсины, алкалоиды, факторы роста растений).

Первичные и вторичные метаболиты микробного происхождения обычно имеют довольно низкую по сравнению с ферментами молекулярную массу - менее 1,5 тыс.

Биологическую активность эти вещества проявляют различно: удовлетворяют потребности человека и животных, взаимодействуют с микроорганизмами, участвуют в разложении различных органических субстратов. Кроме того, некоторые аминокислоты могут служить сырьем для дальнейших превращений на основе химического синтеза.

Продукты микробного синтеза, чтобы стать объектом рентабельного промышленного производства, должны выделяться микробной клеткой в питательную среду и накапливаться в среде в количествах, которые оправдали бы сырьевые и энергетические затраты на культивирование микроорганизма и выделение продукта в необходимой для дальнейшего использования форме. В большинстве случаев выбор микробиологического способа получения того или иного вещества обусловлен полным отсутствием или весьма ограниченной возможностью получения его другими способами, в первую очередь - путем химического синтеза. Многие антибиотики, ферменты, биологически активные изомеры ряда аминокислот, пуриновые нуклеотиды, токсины, факторы роста растений в настоящее время возможно или, по крайней мере, гораздо проще получать с помощью микроорганизмов из доступного и дешевого сырья, чем осуществлять сложный, многоэтапный химический синтез или даже 1-2 этапа ферментативного синтеза, но на основе сложного и часто малодоступного сырья.

Однако природные штаммы микроорганизмов, как правило, не обладают способностью выделять и накапливать в питательной среде, т.е. продуцировать, такое количество нужного продукта, которое обеспечило бы достаточно низкую его стоимость и требуемый народному хозяйству или медицине объем производства. Природные штаммы некоторых групп микроорганизмов (несовершенные грибы, актиномицеты, бациллы) способны выделять в окружающую среду сравнительно небольшие количества антибиотиков, токсинов или гидролитических ферментов. Первичные метаболиты, как правило, микроорганизмами не выделяются в значительном количестве (синтезируемое количество этих веществ строго ограничено и рассчитано на потребности самой клетки). Исключение из этого правила - выделение глутаминовой кислоты природными штаммами (так называемой группы глутаматпродуцирующих коринебактерий) - не распространяется на подавляющее большинство других аминокислот.

В связи с этим задача селекционера - не только усиление природной способности микроорганизма продуцировать определенное вещество (антибиотик, фермент, токсин и др.), но во многих случаях и создание продуцента «заново» из штамма дикого типа, способного синтезировать вещество (например, аминокислоту), но не способного его продуцировать.

Дальнейшее повышение уровня продукции того или иного вещества у микроорганизма - это постоянная цель работы селекционеров, так как наиболее эффективный способ интенсификации микробиологического производства, не требующий дополнительных капиталовложений, заключается в использовании более продуктивного штамма.

Эти задачи осуществляются получением у природных штаммов наследственных изменений - мутаций, приводящих к усилению природной способности микроорганизма синтезировать и продуцировать определенное вещество, а также появлению новой способности - синтезировать вещество в избытке, сверх своих потребностей, и продуцировать его.

Все рассмотренные выше методы селекции продуцентов биологически активных веществ сегодня, в период интенсивного развития методов генной инженерии, называют традиционными. Эти методы в прошедшие 50 лет в огромной мере содействовали микробиологической промышленности антибиотиков, аминокислот, ферментов, витаминов и других практически важных веществ. Исчерпали ли традиционные методы свои возможности? Нам кажется, думать так преждевременно, как и надеяться на то, что генная инженерия в ближайшее время сможет быть применена для создания и улучшения обширного круга принадлежащих к разным таксономическим группам продуцентов, которыми располагает сейчас микробиологическая промышленность. Даже более реальная возможность использовать на основе генноинженерных методов в качестве продуцентов микроорганизмы, для которых эти методы наиболее отработаны, например Ecsherichia coli, едва ли удовлетворит промышленность числом продуктов микробного синтеза. В связи с этим очень важно для «старых» перспективных в промышленном отношении микроорганизмов, помимо совершенствования методов отбора нужного типа мутантов, развивать методы генетического обмена на основе слияния протопластов, трансдукций, трансформации хромосомной и плазмидной ДНК, которые расширяют возможности традиционных методов селекции.

Вместе с тем у промышленных микроорганизмов все шире проводится поиск плазмид и предпринимаются попытки их использования в качестве векторов при переносе генетического материала, его клонировании и амплификации. Эти исследования важны для понимания генетического контроля сложных процессов синтеза, таких, например, как синтез антибиотиков, для выявления «узких мест» в биосинтезе многих других продуктов. Одновременно они приближают промышленные микроорганизмы к объектам генной инженерии. Методология генной инженерии постоянно совершенствуется и расширяет свои возможности. В таком успешном встречном развитии разных методов и их «слиянии» на все большем числе продуцентов можно представить себе ближайшее будущее селекции микроорганизмов, призванной обеспечить промышленность высокопродуктивными штаммами.

В первой половине 70-х годов XX века развитие молекулярной биологии привело к возникновению новой экспериментальной техники, которая получила в СССР название «генной инженерии», а в западной литературе именуется «работой с рекомбинантными молекулами ДНК». Суть этой технологии заключается в фрагментировании молекул ДНК в строго определенных участках, воссоединении таких фрагментов, т.е. в создании новых рекомбинантных молекул ДНК in vitro. Замечательным является то обстоятельство, что все матричные процессы основаны на узнавании ферментами клетки только участков начала и конца процесса. Для копирующих матрицу или работающих на матрицу ферментов последовательность нуклеотидов между сигналами начала и конца процесса безразлична. Ситуация, при которой в структурный ген внедрена дополнительная чужеродная ДНК, способная реплицировать, транскрибироваться и транслироваться в виде нового гибридного белка. Так как ДНК различных организмов однотипна, вышеописанная техника не имеет ограничений, связанных с видом и родом организма. Иными словами, сегодня возможен перенос генов любого организма в любой другой организм.

Перспективы применения генной инженерии для совершенствования штаммов микроорганизмов сегодня кажится почти неограниченными. Безусловно, будет развиваться такое направление, как создание штаммов - продуцентов белков человека, сельскохозяйственных животных и растений.

Что открывает огромные возможности не только для медицины и ветеринарии, но и пищевой промышленности.

Камнем преткновения часто является не методология генной инженерии, а неполное знание биохимических путей синтеза того или иного соединения и недостаточная разработанность генетики многих промышленных штаммов. Именно поэтому до сих пор не создан указанным методом ни один штамм - продуцент антибиотиков, очень ограничено число штаммов - продуцентов первичных и вторичных метаболитов.

В заключение следует сказать, что техника генной инженерии - это не только инструмент для практического «улучшения» штаммов, но и мощный способ познания механизмов биосинтеза и регуляции метаболизма микроорганизма. Дальнейшие успехи в конструировании высокопродуктивных штаммов микроорганизмов зависят от совместной работы микробиологов, генетиков, биохимиков и генных инженеров.

Размещено на Allbest.ru