Рассев проводился из трех последних разбавлений. Из каждого отбирали по 0,2 мл суспензии и высевали на чашки Петри поверхностным способом (по три повторности). Пассаж проводился механическим дозатором. Распределение жидкости шпателем не производилось, чтобы не спровоцировать занесение в чашку загрязнителя. Вся схема реализации метода представлена на рисунке 2.2.4.1.

На боковой стенке чашек Петри мы отмечали ее порядковый номер для удобства в контроле. Все чашки Петри помещали в термостат на 48 часов при температуре от 25 до 35 °С с разницей в градус, крышками вниз (во избежание появления конденсата).

Рис. 2.2.4.1. Схема разбавления пробы при рассеве культуры

2.2.5 Подсчет и замер колоний микроорганизмов

Подсчет колоний микроорганизмов производился с помощью счетчика колоний Flash&Go. Изначально с помощью сопутствующей программы производилась калибровка, а затем анализ каждой чашки с ручной корректировкой.

Замер колоний производился вручную с помощью обыкновенной линейку с ценой деления в 1 мм. Из каждой чашки случайным образом выбиралось 5 колоний, которые затем замерялись с точностью до 0,5 мм.

2.2.6 Методы микроскопического исследования микроорганизмов

Метод раздавленной капли. Данный метод был нами использован для определения подвижности бактерий. На середину чистого предметного стекла мы наносили каплю дистиллированной воды, затем стерильной петлей добавляли небольшое количество бактерий, хорошо размешивая. Сверху каплю накрывали покровным стеклом, предварительно подкрасив ее метиленовым синим. Рассматривали препарат под микроскопом при увеличении 400х. При этом в поле зрения можно было наблюдать подвижные формы микроорганизмов.

Фиксированный препарат. Данный метод мы использовали для определения формы бактериальных клеток. Работу начинали с приготовления мазка, который высушивали над пламенем спиртовки. При этом важно было не допустить перегрева мазка, так как при этом может произойти свертывание белков протоплазмы бактериальной клетки. Затем мы производили фиксирование препарата путем быстрого проведения покровного стекла над пламенем горелки, что обеспечивает лучшее прикрепление мазка к стеклу. После этого - окрашивали препарат раствором карболового фуксина, промывали водопроводной водой, высушивали и рассматривали увеличении 400х.

После фотографии фиксированных препаратов колоний, выращенных при каждой конкретной температуре, подвергались анализу программой ScopeTek, где случайно выбиралось и измерялось по 100 клеток.

Метод окраски по Граму. Данный метод основан на способности клеток микроорганизмов удерживать красители трифенилметанового ряда.

Готовили фиксированный мазок на чистом предметном стекле, сверху помещали полоску фильтровальной бумаги и наносили краситель. Через 1-2 минуты снимали бумагу и, не промывая, наносили на мазок каплю йода. Через 1 мин обесцвечивали мазок спиртом и окрашивали красителем (карболовым фуксином). Затем смывали остатки красителя водой, высушивали над пламенем спиртовки и рассматривали под микроскопом при увеличении 400х. При этом грамположительные бактерии окрашивались в сине-фиолетовый цвет, а грамотрицательные - в розовый.

Метод окраски спор по Цилю-Нильсону в модификации Мюллера. Данный метод был использован для определения возможности некоторых видов загрязнителей к спороношению.

Готовили фиксированный мазок на чистом предметном стекле, затем наносили 5% раствор серной кислоты для протравы. Препарат подогревали пять минут (до появления паров), затем сливали кислоту. После мазок промывали водой, покрывали фильтровальной бумагой и наносили на нее карболовый фуксин Циля. Красили препарат в течение семи минут, периодически добавляя раствор красителя и подогревая его до появления пара или же доводя до кипения. По мере испарения растворителя добавляли краситель, не давая ему подсохнуть во время подогревания. Затем снимали фильтровальную бумагу, препарат промывали и обесцвечивали (в течение 15 сек.) 1% раствором серной кислоты, после чего промывали водой. Потом окрашивали препарат метиленовым синим в течение 1 мин. Затем препарат тщательной промывали водой, высушивали над пламенем спиртовки и рассматривали под микроскопом при увеличении 400х.

Споры при этом приобретали характерный красный цвет, а вегетативные клетки - синий.

2.2.7 Статистическая обработка результатов

Математическую статистику, прежде всего, используют для планирования опытов. Ее основной задачей является определение достоверности полученных результатов. В любом опыте должно быть достаточное количество вариантов и повторностей. Все варианты должны находиться в одинаковых условиях. Не менее важным фактором является определение числа образцов для исследования - оптимизация объема выборки.

В проведенных опытах определяют достоверность различий между средними арифметическими исследуемых выборок (образцов). Данные задачи решают с помощью применения критериев достоверности Стьюдента (t) и Фишера (F). Критерий - это показатель, позволяющий судить о надежности выводов, подтверждающих или опровергающих статистическую гипотезу.

Математическую статистику можно применять лишь в правильно спланированных и проведенных опытах. Если опыты не отвечают необходимым условиям, их следует немедленно браковать.

Перед статистической обработкой все данные необходимо соответствующим образом подготовить: округлить, вычислить средние арифметические, а также выбраковать сомнительные данные.

Для статистической обработки цифровых данных мы применили разностный метод.

Обработка полученных данных разностным методом включала несколько этапов, каждый из которых мы вычисляли на Microsoft Office Excel:

- вычисление среднего арифметического значения по всем повторностям (x_ср);

- вычисление разности (d) между данными по повторностям;

- определение среднего арифметического разности (d_ср);

- расчет отклонения между каждой разностью и средним значением (d-d_ср);

- возведение данного отклонения в квадрат и его суммирование (?(d-d_ср)²);

- вычисление ошибок разностей (S_d) по следующим формулам:

S_{d (1 - 2)} =; S_{d (1 - 3)} =.

- Вычисление критерия Стьюдента фактического:

t _(1-2) = (x_2ср - x_1ср)/ S_d(1-2); t _(1-3) = (x_3ср - x_1ср)/ S_d(1-3);

Фактический критерий мы сравнивали с теоретическим и делали выводы, пользуясь следующим правилом: если фактический критерий Стьюдента равен теоретическому значению или больше него, то разность между вариантами существенна.

Теоретические значения критерия t мы брали из таблицы для различных уровней вероятности, которое вычисляли по формуле:

v = (n₁-1) + (n₂-1)

Глава 3. Результаты исследования

3.1 Характеристика загрязнителей