Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

УДК 577.113.5: 577.152.3

КЛОНУВАННЯ ТА АНАЛІЗ СТРУКТУРИ І ФУНКЦІЙ

ГЕНА ЕКЗОПОЛІГАЛАКТУРОНАЗИ ЕНДОФІТНОЇ

БАКТЕРІЇ Klebsiella oxytoca VN13

03. 00. 22- молекулярна генетика

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Ковтунович Геннадій Леонідович

Київ - 2002

Дисертацією є рукопис.

Роботу виконано у відділі регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України (м. Київ).

Науковий керівник: кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Козировська Наталія Олексіївна,

Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, старший науковий співробітник відділу регуляторних механізмів клітини.

Офіційні опоненти:доктор біологічних наук, член-кореспондент НАН України Мацелюх Богдан Павлович, Інститут мікробіології і вірусології ім. Д. К. Заболотного НАН України, завідувач відділу генетики мікроорганізмів;

кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Черепенко Олена Йосипівна, Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, провідний науковий співробітник відділу молекулярної генетики.

Провідна установа: Інститут агроекології та біотехнології УААН, м. Київ.

Захист дисертації відбудеться “24 ” грудня 2002 року о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.237.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 03143, м. Київ-143, вул. Заболотного, 150.

Автореферат розіслано “ 20 ” листопада 2002 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, кандидат біологічних наук О. В. Підпала

АНОТАЦІЯ

Ковтунович Г. Л. Клонування та аналіз структури і функцій гена екзополігалактуронази ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.22 - молекулярна генетика. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 2002.

У роботі викладено результати досліджень пектолітичної системи ендофітної бактерії K. oxytoca VN13, що застосовується як основа біопрепаратів для рослин. Встановлено зв'язок між рівнем пектолітичної активності цієї бактерії, рівнем внутрішньотканинної колонізації та ефективністю її впливу на рослину-асоціат.

Клоновано та визначено нуклеотидну послідовність гена pehX, що кодує гідролітичний фермент екзополігалактуроназу. Проведено аналіз регуляторних елементів даного гена. Встановлено наявність kdgR-регулона в даній бактерії. Аналіз виведеної амінокислотної послідовності кодованого білка вказує на існування сигнального пептиду в первинному транслянті. Створено неактивний мутант по pehX гену та досліджено його участь у процесах катаболізму пектину та взаємодії з коренями рослин.

Унікальність нуклеотидної послідовності клонованого гена використано для розробки методу ідентифікації K. oxytoca на основі полімеразної ланцюгової реакції.

Ключові слова: Klebsiella oxytoca, пектиназа, полігалактуроназа, pehX.

АННОТАЦИЯ

Ковтунович Г. Л. Клонирование и анализ структуры и функций гена экзополигалактуроназы эндофитной бактерии Klebsiella oxytoca VN13. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.22 - молекулярная генетика. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 2002.

В диссертации изложены результаты исследований пектолитической системы эндофитной бактерии K. oxytoca VN13, которая используется для производства биопрепаратов широкого спектра действия для растений. Эффект положительного влияния данного микроорганизма на рост растений обеспечивается способностью к фиксации атмосферного азота и продукции ауксиноподобных веществ. Ферменты, деградирующие компоненты клеточной стенки растений, рассматриваются как возможные факторы проникновения бактерий во внутренние ткани растений.

Выделены Pel⁺-клоны с повышенным уровнем базовой пектолитической активности K. oxytoca VN13. Исследование этих клонов показало их повышенную способность колонизовать внутренние ткани корней растений. В то же время наблюдается усиление положительного влияния на рост проростков растений по сравнению с исходным типом.

Клонирован один из генов (pehX) пектолитической системы K. oxytoca VN13, который кодирует гидролитический фермент экзополигалактуроназу. Определена полная нуклеотидная последовательность данного гена и примыкающих участков геномной ДНК. Осуществлен компъютерный анализ области регуляции транскрипции данного гена. Анализ регуляторных элементов pehX-гена указывает на существование в K. oxytoca VN13 kdgR-системы глобального регулирования процесса катаболизма пектина и других компонентов клеточной стенки растений. Проанализирован уровень гомологии выведенной аминокислотной последовательности первичного транслянта РehX с известными последовательностями аналогичных белков из других микроорганизмов.

С целью исследования функций pehX-гена был создан неактивный инсерционный мутант. Изучение мутантного штамма показало, что исследуемый ген не является необходимым для процесса усвоения полипектата как источника углерода. Изучена эффективность колонизации внутренних тканей корней растений диким и мутантным типом K. oxytoca VN13 в смешанной популяции. При этом преимущества дикого типа перед мутантным не обнаружено, что может быть связано с несущественностью наличия данного фермента для процесса внутритканевой колонизации. Такой результат можно объяснить периплазматической локализацией данного фермента, а также его екзоспецифичностью по отношению к субстрату. Не исключается также наличие в условиях смешанной популяции полной компенсации утерянной мутантом функции за счет дикого типа бактерий, что требует дальнейших исследований.

Отсутствие существенной гомологии нуклеотидной последовательности клонированного pehX-гена с какими-либо известными последовательностями из других микроорганизмов позволило разработать метод идентификации K. oxytoca на основе полимеразной цепной реакции. Использование четырех подобранных праймеров позволяет идентифицировать данный микроорганизм в чистой культуре и в смешанной популяции, а также дифференцировать K. oxytoca среди близкородственных организмов при уточнении систематического положения природных изолятов бактерий.

Ключевые слова: Klebsiella oxytoca, пектиназа, полигалактуроназа, pehX

SUMMARY

Kovtunovych G. L. Cloning and analysis of structure and function of exopolygalacturonase gene of endophytic bacteria Klebsiella oxytoca VN13. - Manuscript.

The thesis aims a PhD degree in molecular genetics (speciality 03.00.22) to be awarded. - Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Science of Ukraine, Kiev, 2002.

This manuscript presents results of investigation of pectolytic system of K. oxytoca VN13, the endophytic bacterium, which is used for inoculant production. Correlation between the bacterial pectolytic activity value, the level of internal colonisation and the bacterial effect to plants have been detected.

The pehX gene, coding for exopolygalacturonase was cloned and sequenced. Analysis of the regulatory elements of this gene was accomplished, and the presence of the regulatory sites for KdgR was shown for this bacterium. Analysis of the deduced amino acid sequence for PehX enables to predict existence of the signal sequence in the N-terminus of premature protein. The mutant, defective in PehX production has been constructed, and a role it plays in pectin catabolism and in bacterium-plant interaction was investigated. Uniqueness of the DNA sequence of pehX, was used to develop the method of K. oxytoca differentiation.

Key words: Klebsiella oxytoca, pectinase, polygalacturonase, pehX.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Екологічна криза, що набуває все більш загрозливих масштабів, потребує термінових заходів по зменшенню техногенного навантаження на навколишнє середовище. Серед сфер людської діяльності величезний вплив на довкілля має сільськогосподарське виробництво. Інтенсивне використання мінеральних добрив, пестицидів та гербіцидів негативно впливає на стан довкілля та на загальний стан здоров'я населення.

Одним із шляхів виходу з даної ситуації є використання біопрепаратів комплексної дії на основі живих бактерій. Один із таких препаратів - “Клепс” було розроблено в нашому інституті, він пройшов повномасштабні випробування і добре зарекомендував себе серед сільськогосподарських товаровиробників. Позитивна дія даного препарату забезпечується реалізацією природних властивостей ендофітної бактерії Klebsiella oxytoca VN13, що має здатність до фіксації атмосферного азоту, синтезу гормонів росту рослин. Займаючи унікальну екологічну нішу у внутрішніх тканинах коренів, ці бактерії конкурують із місцевою патогенною мікрофлорою і запобігають ураженню кореневої системи рослин. У зв'язку з цим, актуальним є вивчення механізмів, що забезпечують взаємодію K. oxytoca VN13 з рослинами. Ці знання є необхідною передумовою для створення штучних штамів із заданими корисними властивостями.

K. oxytoca VN13 в кліматичних умовах України не виживає поза асоціацією з рослиною. Тому здатність до проникнення у внутрішні тканини коренів рослин є одним із основних факторів, що забезпечують ефективність даної бактерії. Але пошук біохімічних чинників та їх генетичних детермінант ускладнюється відсутністю чітких фенотипових ознак у бактерій та рослини- хазяїна, які б вказували на сам факт та інтенсивність колонізації, як це спостерігається при симбіотичній взаємодії бульбочкових рослин із представниками родини бобових. Однак, здатність K. oxytoca VN13 взаємодіяти з представниками небобових рослин та позитивний вплив на врожайність значної кількості сільськогосподарських культур робить актуальним дослідження в напрямку пошуку внутрішніх чинників, що впливають на цей процес та їх генетичних детермінант. Проведення досліджень в цьому напрямку надасть можливість направленої зміни властивостей даних бактерій та створення на основі генетично змінених штамів нових біопрепаратів.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Виконана робота відповідає основному плану науково-дослідних робіт відділу регуляторних механізмів клітини Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за бюджетною темою “Вивчення підходів до створення асоціації господарсько-цінних рослин з ендофітними бактеріями” (№ 2.2.4.23).

Мета та завдання дослідження. Метою нашого дослідження було встановлення зв'язку між ефективністю внутрішньої колонізації коренів рослин бактерією K. oxytoca VN13 та функціонуванням системи пектинолізису цієї бактерії, а також окремих її компонентів; вивчення організації одного з генів пектинолізису та з'ясування його ролі в процесах взаємодії з рослинами. Також ми мали на меті розробити зручний та надійний метод ідентифікації K. oxytoca для спрощення виявлення цих бактерій в зразках різного походження. Відповідно до мети було поставлено такі завдання:

1. Виділити форми бактерій K. oxytoca VN13, що мають підвищену пектолітичну активність та визначити їх здатність до внутрішньої колонізації коренів рослин порівнянно з вихідим типом.

2. Створити плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та клонувати ген (гени) пектинолізису в Escherichia coli.

3. Визначити нуклеотидну послідовність клонованого гена та вивчити його структуру. бактерія рослина плаз мідний ген

4. Створити мутант з інактивованим пектиназним геном та дослідити значення клонованого гена в процесах катаболізму пектину та взаємодії K. oxytoca VN13 з коренями рослин.

5. Використовуючи фрагменти клонованої ДНК з унікальною послідовністю нуклеотидів, розробити праймери та відпрацювати методику ідентифікації K. oxytoca за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР).

Об'єктом дослідження були молекулярно-генетичні механізми взаємодії ендофітних бактерій з рослинами, а предметом дослідження-роль екзополігалактуронази в процесах інтеграції цих бактерій у внутрішні тканини кореня рослини.

Для досягнення поставленої мети викостовували такі методи як клонування генів у плазмідному векторі, направлений мутагенез in vitro та заміщення нативного гена на мутантний in vivo, визначення і комп'ютерний аналіз нуклеотидної послідовності гена та виведеної амінокислотної послідовності.

Наукова новизна одержаних результатів полягає в тому, що, в результаті виконання даної роботи, вперше було встановлено зв'язок між рівнем пектиназної активності ендофітних бактерій та інтенсивністю колонізації внутрішніх тканин коренів рислин. Вперше було клоновано ген екзополігалактуронази (pehX) K. oxytoca, визначено його нуклеотидну послідовність та проаналізовано кодований ним поліпептид порівняно з іншими спорідненими білками. Ідентифіковані в промоторній ділянці pehX-гена дві послідовності, що відповідають консенсусу для зв'язування KdgR-репресора, вказують на наявність даного регулона в K. oxytoca VN13. На підставі унікальності послідовності ДНК pehX-гена, вперше було розроблено метод ідентифікації K. oxytoca на основі ПЛР.

Практичне значення одержаних результатів полягає в можливості використання відібраних Pel⁺-форм як основи для виробництва біопрепаратів комплексної дії для використання в рослинництві. За результатами наших досліджень встановлено, що дана форма краще колонізує корені рослин з поверхні та із середини, а також має більший позитивний вплив на ростові характеристики рослин. Розроблений метод ідентифікації на основі ПЛР має велике практичне значення через його швидкість, надійність та можливість ідентифікувати K. oxytoca у складних популяціях бактерій.

Особистий внесок здобувача. Результати, які викладено в дисертації, отримано особисто автором або за його безпосередньої участі у плануванні та проведенні експериментів.

Апробація результатів. Матеріали дисертації пройшли апробацію на 10-му Міжнародному конгресі з азотфіксації (Санкт-Петербург, Росія, 1995), 7-му Конгресі з біотехнології (Ніца, Франція, 1995), 1-4-й Європейських конференціях з азотфіксації (Сегед, Угорщина, 1994; Познань, Польща, 1996; Люнтерен, Нідерланди, 1998; Севілья, Іспанія, 2000), Міжнародному науковому семінарі з охорони довкілля (Ужгород, 2001) та інших наукових зібраннях.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 статей та тези 10 доповідей у збірниках міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, матеріалів і методів, трьох розділів, в яких подано отримані результати та їх обговорення, висновків та списку використаних джерел. Дисертацію викладено на 118 сторінках машинописного тексту. Вона містить 22 рисунки та 15 таблиць. Список використаної літератури охоплює 134 джерела.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали і методи дослідження.

У роботі використовували штами: Klebsiella oxytoca VN13, K. oxytoca ATCC 13183, K. pneumoniae ATCC 13883, K. planticola ATCC 33531, Escherichia coli JM109, E. coli DH5б, E. coli JM109 pir, E. coli S17-1 pir, Erwinia carotovora subsp. carotovora 8982, E. carotovora subsp. atroceptica 9027, E. chrysanthemi 8183. Як поживне середовище для вирощування бактерій використовували LB. При дослідженні пектолітичних функцій використовували мінімальне середовище М9 з 0,2% гліцерином. При необхідності додавали полігалактуронат натрію (ПГН) або глюкозу до концентрації 0,2% та вітамін В₁ до 0,0005% при вирощуванні штамів E. coli. Для виявлення пектиназної активності використовували чашки з середовищем Логана або з кальційстабілізованим поліпектатним гелем (Starr, 1977).

Ферменти рестрикції BamHI, BglI, NotI, EcoRI, HindIII, PstI, XbaI, SalI, MluI фірми “Fermentas” та SacI, Sau3A, HpaII фірми “Pharmacia Biotech”, ДНК-полімеразу І, ДНК-лігазу фага T4, лужну фосфатазу фірми “Boehringer Mannheim”, фрагмент Кльонова ДНК-полімерази І, Taq-полімеразу та екзонуклеазу Bal31 фірми “Fermentas” використовували за приписом виробника. Гель-електрофорез, елюцію ДНК з гелю та перенос фрагментів ДНК з агарозного гелю на нейлонову мембрану для блот-гібридизації здійснювали за стандартними методиками (Sambrook et al., 1988). Гібридизацію здійснювали з використанням набору для мічення та детекції фірми “Boehringer Mannheim”, в якому використовується дигоксигенінова мітка.

Приготування і зберігання компетентних клітин, а також трансформацію, здійснювали за методом Нішімура (Nishimura, 1990).

Підбір праймерів для ідентифікації K. oxytoca VN13 методом ПЛР та аналіз термодинамічних характеристик олігомерів здійснювали за допомогою програми “Gene Runner 3.00”. В реакційній суміші використовували стандартний буфер для Taq-полімерази, додаючи дезоксинуклеотидтрифосфати до концентрації 0,2 мМ та MgCl₂ до 2,5 мM. Зміна концентрації іонів Мg⁺⁺ в діапазоні 1-4 мМ не впливала на вихід і чистоту продуктів реакції. Ампліфікацію виконували на приладі “Gene ATAQ Controller”. Оптимальні параметри програми: попередня денатурація - 95 С - 2 хв, потім цикл: 94 С - 20 с, 59 С - 30 с, 72 С - 20 с, що повторювався 25 - 35 разів, залежно від концентрації ДНК в пробі. За зразки для ПЛР-аналізу використовували очищені препарати ДНК та температурні лізати бактерій, що отримували інкубуванням відмитої бактеріальної суспензії на водяній бані при 100 С протягом 3 - 4 хв.

Нуклеотидну послідовність ДНК визначали за методом Сенгера (Sanger et al., 1977) з використанням автоматичного секвенатора ALF Express та набору для секвенування “Cy5 AutoCycle” (“Pharmacia Biotech”) Для аналізу визначеної нуклеотидної послідовності та виведеної амінокислотної послідовності полігалактуронази використовували програму “Gene Runner 3.00”. Аналіз гомології ДНК та поліпептидного продукту здійснювали, використовуючи комп'ютерні програми blastn та blastx електронної служби Blast 2.0 Національного центру біотехнологічної інформації (NCBI) США. Пошук промоторів здійснювали за допомогою програми NNPP (Neural Network Promoter Prediction) (http://www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html). Аналіз N-кінця первинного транслянта проводили за допомогою програми SignalP-HMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0).

Полігалактуроназну активність визначали за збільшенням концентрації вільних альдегідних груп, яку визначали фериціанідним методом (Starr, 1977). За одиницю активності брали таку кількість ферменту, що вивільняє 1 мМ альдегідних груп при 37 С за 1 хв. в реакційній суміші такого складу: 0,5 % ПГН; 0,05 М Na(CH₃COO) (pH 5,2); 0,2 M NaCl. Пектатліазну активність визначали за поглинанням ненасичених продуктів реакції при довжині хвилі 235 нм у реакційній суміші: 0,23 % ПГН; 0,1 М трис-HCl (pH 8,5); 0,3 M CaCl₂. За одиницю активності брали кількість пектатліази, що збільшувала оптичну густину реакційної суміші на 1,0 опт. од. при 235 нм за 1 хв при 37 С.

Зернівки пшениці стерилізували препаратом “Білизна” протягом 20 хв, поверхню корінців проростків - 5 хв. Для визначення кількості асоційованих бактерій наважку кореня розтирали в керамічній ступці з невеликою кількістю 0,8 % NaCl і висівали різні розведення на чашки із селективним середовищем.

Результати дослідження та їх обговорення.

1. Пектолітичні ферменти K. oxytoca VN13. Характеристика Pel⁺-клонів. Наявність пектолітичних ферментів у K. oxytoca VN13 було показано за допомогою тесту з використанням середовища Логана та підтверджено кількісним методом. Як субстрат використовували полігалактуронат натрію (ПГН), що є основою пектинових полімерів. Використовуючи фериціанідний метод визначення відновлювальної здатності розчинів, що дає можливість визначення концентрації вільних альдегідних груп як міри ступеня деградації ПГН, встановлено, що лізат K. oxytoca VN13 має два піки пектолітичної активності - в кислій та лужній ділянках рН (рис.1). Це вказує на наявність як полігалактуроназної (ПГ), так і пектатліазної (ПЛ) активностей.

Метод визначення ПЛ-активності, що базується на поглинанні продуктів деградації субстрату цим ферментом при =235 нм, підтвердив, що тільки пік в лужній ділянці рН є результатом дії пектатліаз. Таким чином K. oxytoca VN13 має дві основні групи ферментів, що деполімеризують ПГН.

Встановлено, що більшість клітин лабораторного штаму K. oxytoca VN13 не має здатності засвоювати ПГН як єдине джерело вуглецю. Але з частотою 10^-7 - 10 ^-5 в популяціях K. oxytoca VN13 виявлялись клітини, які здатні до росту з утворенням клонів на мінімальному середовищі з ПГН. Даний фенотип, позначений нами як Рel⁺, вказує на наявність в K. oxytoca VN13 всього комплексу генів катаболізму ПГН, але деякі з них знаходяться в криптичному стані, а їх активація відбувається внаслідок певних генетичних змін. При культивуванні Рel⁺-клонів на середовищі LB в популяції з'являються клітини дикого типу, які швидко витісняють Рel⁺-форми в процесі росту культури. При дослідженні властивостей Рel⁺-клонів K. oxytoca VN13, увагу привернули три особливості цих бактерій: 1) Рel⁺-клони мали втричі вищий рівень ПЛ- активності; 2) при обробці такими бактеріями насіння пшениці ефективність колонізації внутрішніх тканин коренів проростків була значно вищою, порівняно з диким типом; 3) Рel⁺-клони мали більший позитивний вплив на ріст проростків (табл.1).

Таблиця 1

Властивості Рel⁺-клонів Klebsiella oxytoca VN13

Штам K. oxytoca VN13	Активність ПЛ	Вміст всередині коренів, куо/г	Маса проростків пшениці, г
Pel-	0,113	2,8 · 103	12,73 ± 0,37
Pel+	0,328	3,1 · 104	13,13 ± 0,41
Необроблений бактеріями контроль	10,85 ± 0,05

З наведених результатів випливає, що існує певний зв'язок між рівнем пектолітичної активності, здатністю бактерій до колонізації внутрішніх тканин коренів та стимуляцією росту рослин.

2. Клонування та визначення нуклеотидної послідовності pehX-гена. Банк генів K. oxytoca VN13 створювали на основі плазміди pBluescriptSKM. Для цього проводили неповний гідроліз хромосомної ДНК рестриктазою Sau3A, елюювали з агарозного гелю фрагменти розміром від 3 до 10 тис. п. н. та лігували з вектором, лінеаризованим BamHI. Сумішшю трансформували компетентні клітини E. coli JM109. Серед 4500 рекомбінантних клонів виявлено один, що занурювався на чашках з кальційстабілізованим поліпектатним гелем, а отже мав пектолітичну активність.

Виділена з даного клону плазміда pBluS2 містила вставку близько 3,5 тис. п. н. геномної ДНК K. oxytoca VN13. При додаванні ізопропілтіогалактозиду як індуктора векторного промотора рівень експресії пектолітичної функції не підвищувався, що вказувало на експресію гена з власного промотора. Пектолітична функція не проявлялась при наявності глюкози в середовищі, що вказувало на катаболітну репресію. Експресія клонованого гена в E. coli мала прояви токсичної дії продукту на цю бактерію, тому, для забезпечення стабільності наслідування, фрагмент було переклоновано в плазміду pK18, що несе ген резистентності до канаміцину, з утворенням плазміди pKS2. Кількісне визначення пектолітичної активності показало відсутність ПЛ-активності і наявність ПГ-активності. Дані вимірювання, які подано в табл. 2, показують, що K. oxytoca VN13, як і E. coli DH5, з даною плазмідою мають в 5 разів вищий рівень ПГ-активності, ніж дикий тип K. oxytoca VN13.

Таблиця 2

Активність полігалактуронази, мМ · хв^-1 · мл^-1

Штам	Загальна	У супернатанті
E. coli DH5 (pKS2)	0,0164	0,0011
K. oxytoca VN13 (pK18)	0,0031	-
K. oxytoca VN13 (pKS2)	0,0149	0,0034

Субклони клонованого фрагмента (рис. 2), створені відповідно до встановлених сайтів рестрикції (pBluS2H, pBluS2R, pKRS2, pKPS2, pKS2ДP, pUCMHS2, pKRMS2) та з використанням екзонуклеази Bal31 для вкорочення MluI-HindIII фрагмента (pBlu0.7Bal, pBlu0.9Bal, pBlu1.0Bal, pBlu1.4Bal), використовували для визначення нуклеотидної послідовності клонованого гена. Визначену нуклеотидну послідовність (2541 п. н.), що містить відкриту рамку зчитування (1974 п. н.), промоторну (237 п. н.) та прилеглу до 3'-кінця (330 п.н.) ділянки, зображено на рис. 3.

3. Аналіз первинної послідовності кодованого білка. Виведена з послідовності ДНК клонованого фрагмента амінокислотна послідовність становить 658 амінокислотних залишків (рис. 3), а розрахована молекулярна маса 71,9 кДа. Аналіз N-кінця показав наявність типової для сигнального пептиду послідовності амінокислот. Аспарагін в позиції 3 та аргінін в позиціях 2, 6, 9 формують позитивно заряджену голівку сигнального пептиду, за якою йде гідрофобне ядро з 16 нейтральних амінокислот та кілька потенційних сайтів розщеплення для sec-системи. Ймовірність існування сигнального пептиду, що оцінено програмою SignalP-HMM, становить 0,998. Найбільш ймовірним сайтом розщеплення є зв'язок між гліцином та цистеїном в позиціях 24, 25. Передбачена послідовність зрілого білка становить 634 амінокислотних залишків, а молекулярна маса - 69,5 кДа. Враховуючи той факт, що даний фермент майже не спостерігався в культуральній рідині, можна зробити висновок про його периплазматичну локалізацію.

1 GATCGGGGTTTGCCCATATCGTACCGACTTCGTGCGGCTATCGTATCGATGATTCTCAGCAGTAGAAGGGAAGCTGGGCGGTGAGGTCCG

91 CCTTTGCTTATCTGATTAAGTTTTTTTTCGCCTGATGAAAGATTGAACTGACTCGCGTTTATTTTCCCACATAAATATAAAATGATGTTT

| сигнальний

1СЗР MetArgAsnThrPheArgProAlaArgGlyMet

181 TATTTTAAATGAATTTGAATTTTATTTTCTCATAAAATATGACATTAAGGAAAATCTATGCGCAATACCTTCAGACCTGCACGCGGCATG

пептид |

12 LeuAlaLeuAlaIleAlaLeuAlaGlyLeuAlaGlyGlyCysAsnAspSerGlyGlyThrValAspAsnGlnHisAspAlaProAlaSer

271 CTGGCGTTGGCAATCGCACTAGCCGGGCTCGCAGGCGGCTGTAATGACAGCGGCGGAACCGTCGATAACCAGCACGATGCGCCCGCCTCC

42 AlaProGlnAsnValMetValProIleLeuSerAlaAspGluAsnSerLeuValLeuValTrpGluLysProGluSerGluThrGluGln

361 GCGCCACAAAATGTCATGGTTCCGATACTGTCTGCCGATGAAAACAGCCTGGTGCTGGTCTGGGAAAAACCGGAGTCTGAGACCGAGCAG

72 ValValAspTyrAlaValTyrArgGlnGlyGluArgLeuGlyLeuAlaArgGluAsnGlnAsnHisPheSerProAlaLysProTyrIle

451 GTGGTGGACTACGCCGTCTATCGTCAAGGCGAGCGGCTGGGCCTGGCGCGTGAAAATCAAAACCATTTTTCCCCGGCAAAGCCCTATATT

102 AspAsnPheTyrGlnArgIleAlaSerAspGlyTrpGlnGlnLysIleAspLeuArgSerPheThrAlaThrAsnLeuGlnProAspThr

541 GATAACTTCTATCAGCGGATCGCCAGCGACGGCTGGCAGCAGAAAATCGATCTGCGCAGCTTCACGGCCACCAACCTGCAGCCGGATACG

132 GluTyrAlaPheThrValArgAlaValTyrAlaAsnGlyGlnGluSerProAspSerAlaValValLysAlaGlnThrArgLysThrPro

631 GAGTATGCCTTTACGGTGCGCGCGGTCTACGCCAATGGCCAGGAATCTCCGGACAGCGCGGTGGTTAAAGCGCAAACCCGCAAAACGCCG

162 HisValIleGluAlaSerThrPheGlyAlaLysGlyAspGlyThrThrLeuAsnThrGlnAlaLeuGlnArgAlaIleAspSerCysThr

721 CACGTCATCGAAGCCAGCACATTCGGCGCGAAGGGTGACGGCACCACGCTGAATACCCAGGCGCTGCAGCGGGCCATTGATAGCTGTACC

192 ValThrHisTyrProGlnGlyCysLysValLeuIleSerGlyGlyGluPheLysThrGlyAlaLeuPheLeuHisSerAspMetThrLeu

811 GTCACGCACTATCCTCAGGGCTGCAAGGTGCTGATTTCCGGCGGCGAATTCAAAACTGGCGCGTTGTTCCTGCACAGCGATATGACCCTG

222 AspIleAlaAlaGlyAlaThrLeuLeuGlySerAspAspProAlaGlnTyrProLeuAspLysGlyTyrTyrLeuTyrProTyrSerAsp

901 GATATTGCGGCTGGCGCCACCCTGCTGGGTTCGGACGATCCGGCCCAGTATCCGCTTGATAAAGGCTATTACCTCTATCCCTATAGCGAT

252 HisProGlnProArgArgProProSerLeuIleAsnValLeuGlyAlaAspAspLysGlyGluSerProAlaGlyThrPheArgAsnIle

991 CATCCGCAGCCTCGCCGCCCGCCATCATTAATTAACGTGCTGGGCGCGGACGATAAGGGCGAGTCTCCGGCCGGAACGTTTCGTAATATT

282 ArgIleValGlyLysGlyThrIleAspGlyAsnGlyTrpThrArgGlyValLysSerGlyGlyAspAlaThrIleSerAspGluLeuGly

1081 CGCATCGTTGGGAAAGGCACGATTGACGGCAACGGCTGGACCCGCGGCGTCAAAAGCGGCGGCGATGCGACAATTAGCGACGAATTGGGC

312 AsnAlaLeuProGlnTyrArgAlaSerAsnAlaLysLysValGlyAlaAspGlyIleLeuAlaLysHisGlnThrGluAlaAlaIleAla

1171 AACGCGCTGCCGCAGTACCGGGCCAGCAATGCCAAAAAAGTCGGCGCGGACGGTATTCTGGCAAAGCATCAGACCGAAGCGGCTATCGCG

342 GluGlyIleGluAsnAsnSerAlaTyrLysAsnArgArgSerSerLeuMetThrLeuArgGlyValGlnAsnLeuTyrLeuAlaGlyLeu

1261 GAAGGGATTGAAAACAATAGCGCCTATAAAAACCGCCGCTCCAGCCTGATGACCTTGCGCGGCGTGCAAAATCTCTACCTTGCCGGACTG

372 ThrIleArgAsnProAlaPheHisGlyValMetValLeuGluLeuGluAsnIleThrLeuAsnGlyLeuValHisGlnThrPheAspGly

1351 ACTATTCGTAATCCCGCTTTCCACGGGGTGATGGTGCTGGAGTTAGAAAATATTACCCTGAATGGGCTTGTGCATCAGACCTTTGACGGC

402 AsnAsnAlaAspGlyValGluPheGlyAsnSerLysAsnAlaLeuValPheAsnAsnPhePheAspThrGlyAspAspCysValAsnPhe

1441 AATAACGCCGACGGCGTCGAGTTCGGCAATAGCAAAAACGCGTTGGTCTTCAATAACTTCTTTGATACCGGAGATGATTGCGTTAATTTT

432 AlaAlaGlyPheGlyLysGlyAlaLysThrPheHisGlnGlnProGlnSerAlaAlaTrpIlePheAsnAsnTyrPheArgLysGlyHis

1531 GCCGCCGGGTTTGGTAAAGGCGCGAAAACGTTTCATCAGCAGCCGCAAAGCGCGGCGTGGATTTTTAATAACTATTTCCGTAAAGGCCAC

462 GlyAlaValValThrGlySerHisThrGlyAlaTrpIleGluAsnValArgAlaGluAspAsnValMetTyrMetThrAspValGlyLeu

1621 GGCGCCGTGGTGACGGGTAGCCATACCGGCGCGTGGATCGAAAACGTTCGCGCCGAGGATAACGTCATGTATATGACCGACGTTGGCCTG

492 ArgMetLysSerArgProTyrTyrGlyGlyGlyValArgGluValLeuPheArgHisAsnAlaMetLysAspIleAlaLysGluProPhe

1711 CGCATGAAGAGCCGCCCCTACTATGGCGGTGGCGTGCGGGAGGTGCTGTTCCGTCATAACGCGATGAAAGATATCGCCAAAGAGCCGTTT

522 ValPheThrIleLysTyrSerAlaAspValAsnAspThrThrProAlaAspGluProAlaGlnPheArgAspValGlnValGlnAspVal

1801 GTTTTTACTATCAAATACAGCGCCGACGTAAATGATACGACCCCTGCCGACGAGCCCGCTCAGTTCCGCGACGTTCAGGTGCAGGATGTG

552 ThrValAspGlyThrSerAlaLysHisSerIleLeuIleAspGlyMetThrValAlaGluMetAlaGluSerPheGlyIleHisTyrSer

1891 ACCGTCGATGGTACTTCGGCTAAGCACAGCATCCTGATTGACGGCATGACGGTAGCCGAAATGGCGGAGTCGTTTGGTATTCACTATTCT

582 ArgAspAlaTyrHisGlnAsnLeuArgPheSerAsnValSerPheArgAsnThrLysAlaThrAsnIleSerPheLeuHisAspSerGln

1981 CGCGATGCCTATCATCAGAATCTGCGTTTTTCCAACGTCAGCTTCCGTAACACCAAAGCAACCAATATCTCTTTCCTGCACGACAGTCAG

612 PheAspGluValThrPheAlaAsnThrProGlnAlaTrpGluPhePheAlaValAsnAspValMetLeuAlaAspSerLeuHisGlnGln

2071 TTCGATGAGGTAACCTTCGCCAACACGCCGCAGGCCTGGGAATTTTTCGCCGTCAATGACGTAATGCTCGCCGACAGCCTTCATCAGCAG

642 SerIleThrArgGlyGluAsnAspLysValIleLeuGluGlyAlaThrLysOch

2161 AGCATCACCCGTGGGGAGAACGACAAGGTTATCCTTGAGGGCGCAACGAAGTAATGCCGTTTCCGGCGGCTCCGGTCGCCGGGAATTAAC

2251 CCGTAAGTCACATCAGAACAAATATATGGCGTTTATCTATCCATAGTAAATACGCAGGTCATCACCGGTGAATTGAGCGTTCCCCAGACA

2341 ATGTAGTCCCTGTTCCGGGTAAAAATAAAGATGGGTGATTTTCCGGACAATCCCATGATATCATAAATAGGTATAATGAGATCATCAGGA

2431 ATACTTCCATATCTATTATCGATTTTATCACCCGGTAATATTTTGTATCGTCCCTCACCATCGGCCATATAATCAAAGGCTATATCCTGC

2521 GAAAGATAGTACGATTCATCA

Рис. 3. Послідовність ДНК pehX-гена та амінокислотна послідовність первинного транслянта

Аналіз гомології амінокислотної послідовності даного білка за допомогою програми blastp виявив значну кількість гомологічних послідовностей з різним рівнем гомології. Найбільш значимі результати даного аналізу відображені в таблиці 3. Досліджувана амінокислотна послідовність має найвищий рівень гомології з первинними послідовностями екзо-ПГ представників родини Enterobacteriaceae. Дещо нижчий рівень подібності з досліджуваною послідовністю мають аналогічні ферменти більш віддалених з філогенетичної точки зору видів. Значно нижчою є гомологія з ендо-ПГ. До того ж, протяжність гомологічних відрізків зменшується до 400 амінокислотних залишків порівняно з 590 для екзо-ПГ. Дані факти дозволяють стверджувати, що клонований нами ген кодує пектолітичну гідролазу з екзосубстратною специфічністю. За аналогією до відповідного ферменту E. chrysanthemi даний ген названо pehX.

Таблиця 3

Подібність амінокислотної послідовності полігалактуронази K. oxytoca VN13 до відповідних білків інших бактерій

Мікроорганізм	Характер розщепл. субстрату	Величина гомол. послід. (амінокислот)	Рівень подібності, %
Yersinia enterocolitica	екзо-	587	66
Erwinia chrysanthemi	екзо-	594	65
Pectobacterium chrysanthemi	екзо-	594	65
Ralstonia solanacearum	екзо-	591	57
Thermoanaerobacterium thermosulfurigenes	екзо-	588	49
Erwinia carotovora subsp. сarotovora	ендо-	403	38
Rhizobium vitis	ендо-	386	37

4. Аналіз регуляторних елементів pehX-гена. У визначеній нами ДНК послідовності, кодуючій частині pehX-гена передує 237 п. н., GC-вміст у даному фрагменті ДНК низький, що характерно для промоторних ділянок прокаріотів, і становить 37 %. На рис. 4 зображено промоторну ділянку і відносне розташування трьох ймовірних промоторів, що визначені за допомогою програми NNPP, при цьому з рисунка видно, що тільки перші два з них ініціюють утворення транскрипту, що містить сайт зв'язування з рибосомою UAAGGA на 5'-кінці. Ініціація синтезу мРНК з третього промотора була б недоцільною.

На даному відрізку ДНК нами було виявлено дві операторні ділянки для зв'язування регулятора транскрипції KdgR (див. рис. 4), що є основним регулятором пектинолізису E. chrysanthemi. Аналогічний білок є репресором при катаболізмі гексуронових кислот і у E. coli. При цьому модуляція транскрипції з промоторів пектиназних генів E. chrysanthemi зберігається в E.coli, а амінокислотні послідовності KdgR з цих двох організмів ідентичні на 90%. Все це вказує на високу консервативність KdgR, а отже, і консервативність послідовності сайта-мішені. Тому ми порівнювали послідовність промоторної ділянки досліджуваного гена з консенсусною послідовністю для зв'язування KdgR E. chrysanthemi (рис.5). Положення KdgR-операторів щодо старту транскрипції та трансляції вказує на зарепресованість даного оперона у разі відсутності індукторів.

5. Створення та вивчення властивостей pehX^--мутанта. Неактивний мутант K. oxytoca VN13 по pehX-гену отримували заміщенням методом гомологічної рекомбінації in vivo природньої послідовності pehX-гена на інсерційний мутант, отриманий in vitro інсерцією гена резистентності до хлорамфеніколу cat. Для цього в ЕсоRІ сайт, що лежить у першій половині кодуючої частини pehX-гена плазміди рBluS2H (див. рис. 2), було клоновано ЕсоRІ фрагмент плазміди рНР45Сm, розміром 3,4 тис. п. н., який кодує ген саt. У клонах E. coli DH5б з новоутвореною плазмідою рBluS2::Сm (рис. 6) ПГ-активність не було виявлено. Отже, pehX було інактивовано.

Як вектор для доставки мутантного гена в хромосому було використано плазміду рJP5603, що потребує для реплікації допоміжного білка р, і підтримується тільки в спеціальних штамах E. coli. У полілінкер цієї плазміди було перенесено SalІ/SacІ фрагмент плазміди рBluS2::Сm, що містить pehX-ген з інсерцією. Отриману плазміду рJPpeh::Сm використовували для створення pehX^--мутанта K. oxytoca VN13 in vivo (див. рис. 6).

З штаму E.coli S17-1 pir плазміду рJPpeh::Сm було перенесено кон'югацією в K. oxytoca VN13. Даний реплікон не підтримується в цій бактерії, тому всі транскон'юганти містили інсерцію плазміди в сайті локалізації гена pehX. Плазмідної ДНК в даних клонах виявлено не було. Нативна копія втрачається при внутрішній рекомбінації між частинами різних копій гена із втратою векторного маркера резистентності до канаміцину та збереженні резистентності до хлорамфеніколу. Три таких клони було відібрано та перевірено їх генетичну конструкцію методом блот-гібридизації.

Для виявлення гена стійкості до хлорамфеніколу як зонд використовували SmaI-фрагмент плазміди рНР45Сm розміром 1,7 тис. п. н. Для ідентифікації гена pehX використовували PstI/EcoRV-фрагмент цього гена розміром 1,0 тис. п. н. Гібридизація з геном cat показала, що тільки один з вірогідних мутантів, а саме №2, має цей ген в хромосомі. Клони №1 і №3 мали значно нижчий рівень стійкості до хлорамфеніколу, що можна пояснити спонтанними мутаціями. З рис. 7 видно, що cat-ген представлений у даного мутанта однією копією. Гібридизаційна смуга у варіанті № 2/BamHI відповідає розміру фрагмента вставки з cat-геном в pehX, що вищеплюється даною рестриктазою. Це надає цілковитої впевненості в походженні фрагмента, з яким прогібридизував зонд. Після відповідної обробки дану мембрану було використано повторно для гібридизації з фрагментом pehX-гена. Гібридизація показала, що клони №1 і №3 не відрізняються в даному локусі від дикого типу. Гібридизаційна смуга з ДНК клону №2, розщепленої рестриктазою SalI, міститься вище, що відповідає важчому фрагменту через інсерцію cat-гена (3,4 тис. п. н.). Гібридизаційна смуга у варіанті з рестриктазою BamHI знаходиться нижче у клону №2, ніж у дикого типу. Це пояснюється тим, що фермент BamHI вищеплює вставку та розбиває фрагмент з pehX-геном мутанта на дві частини, з однією з яких і гібридизується даний зонд.

Цей експеримент доводить, що: по-перше, клон №2 є неактивним мутантом по pehX-гену з інсерцією в кодуючій частині даного гена і не містить його нативної копії; по-друге, дана інсерція є єдиною індукованою нами зміною геному K. oxytoca VN13; по-третє, K. oxytoca VN13 має одну копію pehX-гена з даною нуклеотидною послідовністю.

Дослідження здатності pehX^--мутанта засвоювати ПГН як єдине джерело вуглецю показали його повну тотожність, за цією ознакою, до дикого типу K. oxytoca VN13. Pel⁺-форми виникали з тією ж частотою, що й у дикого типу. Pel⁺-клони мутанта ефективно засвоювали ПГН у разі відсутності інших джерел органічного живлення. Отже експресія клонованого pehX-гена не є необхідною для засвоєння ПГН, що добре узгоджується з літературними даними.

Мутант перевіряли на ефективність колонізації внутрішніх тканин коренів рослин. Насіння пшениці обробляли сумішшю мутантного та дикого типів K. oxytoca VN13 в наближено рівних пропорціях. Фактичне співвідношення визначене експериментально склало 49 до 51. Протягом чотирьох тижнів спостерігали за співвідношенням дикого та мутантного штамів на поверхні, а також усередині коренів рослин. Клітини мутанта легко відрізнити завдяки їх резистентності до хлорамфеніколу. Дослід проводили в стерильних умовах. Отримані результати, які подано в табл. 4, свідчать, що продукт клонованого гена не впливає на ефективність колонізації. Так співвідношення загальної кількості клітин дикого і мутантного штамів після 10 днів вегетації суттєво не змінилося. Всередину коренів обидва типи клітин проникали однаково ефективно. Природньо, що у разі значимості досліджуваної пектинази для процесу проникнення всередину тканин коренів рослин, співвідношення змінювалося б на користь дикого типу бактерій. З табл. 4 видно, що цього не відбувається і через 3 тижні вегетації. Відсоток клітин мутантного штаму навіть збільшився з 49 % до 57,5 %. Поряд з цим, частка мутантних клітин від загальної кількості бактерій в асоціації теж збільшилась до 57 %.

Таблиця 4

Порівняння ефективності колонізації коренів проростків пшениці диким типом та pehX^- -мутантом

Зразок для аналізу	Відсоток клітин мутанта (Cmr) від загальної кількості бактерій
	10 днів	21 день	28 днів
Необрооблені стерилантом корені	49,5	57,5	39,0
Оброблені з поверхні стерилантом корені	50,0	57,0	49,0

Примітка. В інокуляті містилось 49% мутантних клітин

Дані про співвідношення клітин дикого і мутантного типів K. oxytoca VN13 при колонізації рослин у змішаній популяції вказують на відсутність впливу pehX-гена на процес взаємодії з рослинами в умовах даного досліду. Такий результат можна пояснити екзоспецифічністю даного ферменту щодо характеру розщеплення субстрату та його периплазматичною локалізацією. Проте, характер даного досліду не дає можливості стверджувати, що досліджуваний ген зовсім не бере участі в даних процесах. Існує певна ймовірність компенсації функції диким штамом K. oxytoca VN13. Дослід з варіантами, де рослини були б оброблені окремо різними штамами, не дав достовірних результатів через відносність визначення внутрішньотканинної частки бактерій в асоціації. Тому дане питання потребує подальшого вивчення.

6. Використання послідовності pehX-гена для розробки методу ідентифікації K. oxytoca на основі ПЛР. Унікальність послідовності pehX-гена K. oxytoca VN13, відсутність значної гомології його нуклеотидної послідовності з будь-якими іншими ДНК-послідовностями, що депоновані в електронних базах даних, дали можливість використати дану послідовність для розробки праймерів для ідентифікації цієї бактерії методом полімеразної ланцюгової реакції.

Для розробки праймерів використовували програму “Gene Runner 3.00”, де аналізували нуклеотидну послідовність першої частини pehX-гена, що була визначена на той час. Пари праймерів були підібрані за такими критеріями: 1) близька за значенням температура плавлення та гібридизації всіх чотирьох олігомерів для можливості формування чотирьох пар праймерів; 2) підвищена стабільність 3'-кінця праймера в дуплексі з матричною ДНК для ефективної ініціації елонгації олігомера Taq-полімеразою; 3) відсутність стабільних дуплексів між праймерами та внутрішніх вторинних структур олігомерів при кімнатній температурі; 4) розмір ампліконів повинен бути зручним для їх розділення та ідентифікації в агарозному гелі. Відібрані за цими критеріями олігонуклеотиди PEH-A (5'-ggactacgccgtctatcgtcaag-3'), PEH-B (5'-aatatccagggtcatatcgctgtg-3'), PEH-C (5'-gatacggagtatgcctttacggtg-3'), PEH-D (5'-tagcctttatcaagcggatactgg-3') давали можливість отримувати чотири різні продукти, оскільки вони мають близькі термодинамічні характеристики.

Розміщення послідовності даних нуклеотидів на ДНК pehX-гена стосовно один одного зображено на рис. 8. Розміри продуктів ПЛР у реакції з хромосомною ДНК K. oxytoca VN13, обраховані в “Gene Runner 3.00” становлять для пар: РЕН-А, РЕН-В - 451 п. н.; РЕН-С, PEH-D - 344 п. н.; РЕН-А, PEH-D - 513 п. н.; РЕН-С, РЕН- В - 282 п. н.

Продукти такого розміру легко ідентифікувати електрофорезом в агарозному гелі (рис. 9). З цього рисунка видно, що продукти ПЛР відповідають за розміром прогнозованим, добре розподіляються в 1,6 % агарозному гелі, а, отже, дані олігонуклеотиди придатні для ідентифікації K. oxytoca VN13. Для перевірки можливості визначення K. oxytoca в суміші бактерій використовували для ПЛР зразки ДНК, отримані з суміші K. oxytoca та E. coli у співвідношенні 1:500. При цьому вихід продуктів фактично не відрізнявся від позитивного контролю, де використовували чисту культуру K. oxytocа.

Пари праймерів РЕН-А, PEH-D (513 п. н.) та РЕН-С, PEH-D (344 п. н.) застосовували для проведення ПЛР з ДНК інших представників роду Klebsiella та роду Erwinia. При електрофорезі продукти реакції були виявлені тільки у варіантах з K. oxytoca (рис. 10). Цей результат вказує на видоспецифічність даних праймерів, а тому розроблений метод придатний для ідентифікації K. oxytoca.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено позитивну кореляцію між рівнем пектолітичної активності K. oxytoca VN13, ефективністю колонізації цією бактерією коренів рослин та рівнем її впливу на ріст проростків пшениці.

2. Виділено Pel⁺-форми K. oxytoca VN13 з підвищеною пектолітичною активністю та ефективністю колонізації коренів пшениці. Підвищена концентрація бактерій на поверхні та всередині коренів позитивно впливає на ріст проростків пшениці, що робить перспективним використання даних форм бактерій для виготовлення біопрепаратів.

3. Створено плазмідний банк генів K. oxytoca VN13 та ідентифіковано клон з екзополігалактуроназною активністю. Визначено повну нуклеотидну послідовність клонованого та прилеглих ділянок ДНК, що, в цілому, становить 2541 н. п.

4. Проаналізовано промоторну ділянку гена pehX та визначено регуляторні елементи, які вказують на існування KdgR -регулона в K. oxytoca VN13.

5. Створено мутант з інактивованим pehX-геном, який зберігав здатність до колонізації внутрішніх тканин коренів рослин, що можна пояснити екзосубстратною специфічністю відповідного ферменту та його периплазматичною локалізацією. Даний мутант також зберігав здатність до засвоєння полігалактуронату натрію.

6. На основі унікальності визначеної послідовності ДНК pehX-гена, розроблено праймери та відпрацьовано методику ідентифікації K. oxytoca методом ПЛР.

Перелік наукових праць, опублікованих за темою дисертаціЇ

1. Петак А.М., Ковтунович Г.Л., Козыровская Н.А., Туряница А.И., Кордюм В.А. Взаимоотношения бактерий рода Klebsiella с растением. 2. Локализация бактерий Klebsiella oxytoca и K. terrigena в тканях табака и пшеницы // Биополимеры и клетка. - 1995. - Т. 11, № 6. - C. 75-79.

2. Kozyrovska N., Kovtunovych G., Gromosova E., Kuharchuk P., Kordyum V. Novel inoculants for an environmentally-friendly crop production // Resources, Conservation and Recycling. - 1996. - Vol. 18. - P. 79-85.

3. Kovtunovych G., Lar O., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Enhancing the internal plant colonization rate with endophytic nitrogen-fixing bacteria // Биополимеры и клетка. - 1999. - Т. 15, № 4. - С. 300-305.

4. Kovtunovych G., Lar O., Kamalova S., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N.. Correlation between pectate lyase activity and ability of diazotrophic Klebsiella oxytoca VN13 to penetrate into Plant Tissues by // Plant and Soil. - 1999. - Vol. 215.- P. 1-6.

5. Ковтунович Г.Л., Лар О.В., Козировська Н.О. Клонування та структурний аналіз peh-гена Klebsiella oxytoca VN13 // Биополимеры и клетка. - 2000. - Т.16, № 5. - С. 356-362.

6. Kovtunovych G. L., Lar О. V.,. Kozyrovska N. О. Ecologicaly-frendly crop production with microbial inoculаnts. III. Molecular detection of Klebsiella oxytoca in the environment // Науковий вісник Ужгородського національного університету. Серія біологія. - 2001. - № 9. - С. 79-80.

7. Ковтунович Г.Л., Лар О.В., Козировська Н.О. Роль гена екзополігалактуронази у процесах взаємодії Klebsiella.oxytoca VN13 з коренями проростків пшениці // Біополімери і клітина. - 2002. - Т. 18, № 4. - С. 319-323.

8. Kovtunovych G., Kordyum V., Kleiner D., Kozyrovska N. Correlation between pectate lyase activity and penetration inside the plant tissue in diazotrophic klebsiellas // Third European Nitrogen Fixation Conference. - Lunteren (The Netherland). - 1998. - P. 181.

9. Kovtunovych G., Lar О., Kozyrovska N. Molecular mechanisms of diazotrofic Klebsiella oxytoca enter inside the plant tissue: the role of polygalacturonase and pectate lyase // Fourth European Nitrogen Fixation Conference. - Seville (Spain). - 2000. - P. 151.

...